Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакотерапевтическая эффективность растительного средства "Аркосител" при ишемических повреждениях почек

На правах рукописи

МАКУШКИНА ЮЛИЯ ЭДУАРДОВНА

ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА «АРКОСИТЕЛ» ПРИ ИШЕМИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ПОЧЕК

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

' " ПАЙ 2013

Улан-Удэ-2013

005058090

005058090

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт общей и экспериментальной биологии» Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель:

Лемза Сергей Васильевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

Убеева Ираида Поликарповна - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Бурятский государственный университет» Министерства образования и науки РФ / кафедра инфекционных болезней, заведующий

Банзаракшеев Виталий Гамбалович - кандидат медицинских наук, Негосударственное учреждение здравоохранения «Отделенческая клиническая больница на станции Улан-Удэ ОАО «Российские железные дороги» / клинико-диагностическая лаборатория, заведующий

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится «18» апреля 2013 г. в 1022 часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02. при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан «18» марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

>-//, — В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. В России по статистическим данным с 2000 по 2009 гг. на 100 тыс. взрослого населения увеличилось число больных с заболеваниями мочеполовой системы с 7,6 до 9,2% в структуре первичной заболеваемости (Будаев, 2009; Иванова и соавт., 2011). Кроме того, отмечено значительное «омоложение» нефрологической патологии за последние десятилетия (Сигел, 2006). Заболевания мочевыделительной системы характеризуются, как правило, поздним выявлением, тяжелым течением, хронизацией и последующей инвалидизацией. Во всех странах мира отмечается быстрый рост численности больных, которые нуждаются в почечной терапии. Причинами этого является увеличение тяжести заболеваний, приводящих к необратимой патологии почек. Прежде всего, это сахарный диабет и артериальная гипертензия (Наточин и соавт., 2010; Va-ragic et al., 2010). Причинами прогрессирования хронических заболеваний почек являются нарушение здорового образа жизни: курение, избыточное потребление поваренной соли, нарушение режима питания, неконтролируемое употребление лекарственных препаратов, а также другие факторы (Варшавский и соавт., 2009; Кутырина и соавт., 2010; Levey et al. 2011). Среди лекарственных препаратов, оказывающих нефротоксическое действие, следует выделить антибиотики, нестероидные противовоспалительные средства, рентгеноконтрастные вещества, цитостатики, туберкулостатики, Н2-блокаторы, психотропные препараты (Полонский, 2001; Ушкалова, 2001; Morales et al., 2010). Наиболее опасны комбинированные препараты ненаркотических анальгетиков с кофеином и кодеином (Варшавский и соавт., 2009). Иногда сама фармакотерапия нефропатий может спровоцировать рецидив и обострение заболевания. Поэтому основным требованием к нефропротекторным средствам является отсутствие токсичности и побочных реакций при их применении. Кроме того, такие препараты должны действовать на разные звенья патологического процесса, в том числе и на те, которые затрагивают энергетический метаболизм клеток. Этим критериям соответствуют препараты растительного происхождения. В связи с этим, наблюдается повышенный интерес к использованию растительных средств.

Известно, что большинство патологических процессов сопровождается нарушением энергетического статуса клеток и тканей (Васильев, 2005; Smetink et al., 2005; Cavangh et al., 2007; Bakeeva et al., 2008; Saks et al., 2010) что, прежде всего, связано с дисфункцией митохондрий. Поэтому на данный момент существует отдельное направление в медицине - биоэнергетическая фармакология (Мазина, 2007). Изучения патологии почек показали, что одним из центральных звеньев их повреждения является «окис-

лительный стресс», необратимость которого ведет к деструкции нефронов и функциональной несостоятельности органа (Basnakian et al., 2002). Поэтому принимаемые меры по лечению и предупреждению поражения почек различной этиологии должны быть направлены на антиоксидантную защиту органа в целом и митохондрий, в частности. Фармакологические средства, предназначенные для лечения заболеваний почек, помимо анти-оксидантных свойств должны обладать антигипоксическими и мембрано-стабилизирующими свойствами, так как в основе дисфункции митохондрий лежит нарушение целостности и повышение проницаемости их мембран.

Таким образом, все вышеуказанные факторы, а также тенденция к прогрессированию течения с развитием почечной недостаточности, тяжелый медико-социальный прогноз, отсутствие достаточного количества нефропротекторных препаратов растительного происхождения, на наш взгляд, определяют актуальность предпринятого нами исследования.

В связи с этим, нами было разработано новое растительное нефропро-текторное средство, условно названное «Аркосител», состоящее из сухих экстрактов корней Scutellaria baicalensis Georgi, надземной части Arnica montana L., листьев Orthosiphon stamineus Benth., корней Comarum palustre L., корней Arctium lappa L. в соотношении 20 : 20 : 30 : 10 : 20 (в %).

Цель настоящей работы - определить фармакологические свойства и фармакотерапевтическую эффективность растительного экстракта «Аркосител» при ишемических повреждениях почек.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить основные фармакологические свойства фитоэкстракта «Аркосител»;

- установить фармакотерапевтическую эффективность фитоэкстракта «Аркосител» при ишемических повреждениях почек;

- оценить влияние фитоэкстракта «Аркосител» на энергетическое состояние почек при их ишемии с последующей реперфузией;

- выявить основные механизмы нефропротекторного действия фитоэкстракта «Аркосител».

Научная новизна. В настоящей работе впервые определены фармакологические свойства фитоэкстракта «Аркосител». Установлено, что исследуемое средство в экспериментально-терапевтических дозах обладает диуретической, гипопротеинурической, гипоазотемической, мембраноста-билизирующей, противовоспалительной, иммуномодулирующей и антиок-сидантной активностью. Показано, что «Аркосител» отличается выраженной фармакотерапевтической эффективностью при ишемическом повреждении почек крыс, которая заключается в нормализации диуреза, фильтра-

ционной функции почек, снижении протеинурии, гипоазотемическом действии и увеличении активности ферментов антиоксидантной защиты. В основе нефропротекторного действия «Аркоситела» лежат способности ингибировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), укреплять мембранные образования клеток, стимулировать окислительное фосфори-лирование и повышать активность антиоксидантной защиты.

Практическое значение. Материалы по проведенным фармакологическим исследованиям включены в заключительный отчет Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по базовому проекту «Молекулярно-клеточные механизмы стресс-индуцированных патологических состояний и коррекция их средствами природного происхождения» (2009 - 2011 гг).

Полученные в работе данные используются в учебном процессе на кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета Бурятского государственного университета (Акт внедрения № 1 от 18.01.2013 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фитоэкстракт «Аркосител» проявляет широкий спектр фармакологической активности (противовоспалительную антиоксидантную, мембрано-стабилизирующую, иммуномодулирующую), а также поддерживает окислительное фосфорилирование при ишемии/реперфузии (И/Р) почек, повышает диуретическую, концентрационную, салуретическую и фильтрационную функции этого органа у белых крыс.

2. Фитоэкстракт «Аркосител» обладает выраженной фармакотерапевтиче-ской эффективностью при ишемии/реперфузии почек крыс: нормализует диурез, фильтрационную функцию, снижает протеинурию, оказывает ги-поазотемическое действие, а также повышает активность ферментов антиоксидантной защиты.

3.В основе нефропротекторного действия «Аркоситела» лежит его способность ингибировать процессы перекисного окисления липидов, повышать активность антиоксидантной защиты, дыхание митохондрий и стабилизировать мембранные структуры клеток почек.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на международных, всероссийских научных конференциях, симпозиумах:

- Международной научной конференции "Current situation and future trend of drug research and development from natural sources" (Ulaanbaatar, 2010);

- Ill Всероссийской научной конференции «Развитие традиционной медицины в России» (Улан-Удэ, 2010);

- II Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011);

- V Международном симпозиуме "Present Situation and Future Status of Mongolian Traditional Medicine Development"(Ulaanbaatar, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из которых 3 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 277 источников, из которых 141 иностранных. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 19 рисунками в виде графиков, диаграмм и микрофотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служил комплекс из сухих экстрактов корней S. baicalensis Georgi, надземной части A. montana L., листьев O.stamineus Benth., корней С. palustre L., корней A.lappa L. в соотношении: 20 : 20 : 30 : 10 : 20 (в %). Технология получения экстрактов сухих заключалась в измельчении отдельных компонентов до размера частиц 1-3 мм, экстракции спиртом этиловым (70% - S. baicalensis; 60% - A. montana, - O.stamineus, -С. palustre; 50% - A.lappa L.) с последующим концентрированием и вакуумной сушкой.

В качестве препарата сравнения использовали канефрон (Германия) в дозе 30 мг/кг.

Эксперименты выполнены на 270 белых крысах - самцах линии Wistar массой 180-210 г и 54 мышах линии СВА и F1 (СВАхС57В1/6) массой 18 -20 г. Животные находились в стандартных условиях содержания и кормления в виварии (Приказ МЗ № 1179 от 10.10.83 г.). Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.). Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом. Протокол исследования согласован с этическим комитетом Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (протокол № 3 от 03.02.2009).

Острую токсичность определяли на крысах линии Wistar массой 180

- 200 г. по методу Кербера (Токсикологическая оценка ... , 1992). Влияние «Аркоситела» на функциональное состояние почек животных оценивали по состоянию диуреза, который определяли по общепринятому методу с 2,5 % водной нагрузкой (Берхин, Иванов, 1972). Влияние исследуемого средства на осморегулирующую (концентрационную) функцию определяли по концентрации катионов натрия и калия в моче методом пламенной фотометрии на приборе «Flapho 4» и по концентрации мочевины в моче, определяемой с использованием набора реактивов «Вектор БЕСТ Мочевина-Ново». Величину осмотической концентрации мочи рассчитывали по

модифицированной формуле Дорварта. Определение скорости клубочко-вой фильтрации (СКФ) проводили по клиренсу эндогенного креатинина и рассчитывали по формуле (Вандер и соавт., 2000). Концентрацию креатинина в сыворотке крови и в моче определяли с использованием набора реактивов «Вектор БЕСТ Креатинин-Ново». Интенсивность канальцевой ре-абсорбции рассчитывали по формуле (Вандер и соавт., 2000). Концентрацию белка в моче определяли с использованием набора реактивов «Вектор БЕСТ Протеин-Ново». Иммуномодулирующее действие «Аркоситела» устанавливали по его влиянию на состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета на фоне иммунодефицита, вызванного введением иммунодепрессанта азатиоприна (Петров и соавт., 2000; Руководство ..., 2005; Cunningham, 1965). Оценку мембраностабилизи-рующей активности указанного растительного средства проводили с использованием перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов (Ковалев и соавт., 1986). Общую антиоксидантную емкость определяли по методу (Govindarajan et al., 2003); антиоксидантную активность - по методу пе-рекисной деструкции Р-каротина (Olennikov et al., 2007). Антирадикальную активность «Аркоситела» определяли с применением стабильных радикалов DPPH * (ДФПГ) и ABTS*+ (АБТС) (Seyom et al., 2006). Связывание молекул оксида азота NO определяли по методу с нитропруссидом натрия (Govindarajan et al., 2003), Fe-связывающую активность — фенантролино-вым методом (Olennikov et al., 2008). Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) в сыворотке крови и в гомогенате почек оценивали молибденовым методом (Биоэнергетика ... , 2008). Концентрацию малонового диальдегида в гомогенате почек определяли колориметрическим методом с 2-тиобарбитуровой кислотой (Темирбулатов, Селезнев, 1988), количество восстановленного глутатиона (ВГ) в гомогенате почек — с использованием 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (Методы биохимических ... , 1982). Оптическую плотность супернатанта измеряли с использованием спектрофотометра «СЕ 2011» фирмы CECIL (Великобритания). Изучение антиэкссудативной активности указанного средства проводили на модели острого асептического воспаления задней конечности животного (Стрельников, 1960; Лещинский, 1976; Александров и соавт., 1986; Руководство ... , 2005). Для определения влияния исследуемого средства на альтеративную стадию воспаления осуществляли подкожное введение крысам в области спинки 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты (Ойвин, Шетель, 1961). Влияние «Аркоситела» на образование фиброзно-грануляционной ткани оценивали методом подкожной имплантации стерильных ватных шариков (Тринус, 1975). Ишемию/реперфузию почек крыс воспроизводили 40-минутной окклюзией почечной артерии, кровоток восстанавливали снятием зажимов; продолжительность реперфузии составляла 1 час (Kaushal

G.P. et al., 1998). Влияние фитосредства «Аркосител» на энергетику почек при экспериментальной И/Р почек белых крыс определяли по уровню АТФ, пировиноградной, молочной кислоты (Методы биохимических ... , 1982) и активности фермента пируваткиназы в гомогенате почек (ЕС 2.7.1.40) (Северин, Соловьева, 1989).

Выделение митохондрий и определение активности митохондриаль-ного дыхания проводили методом полярографического измерения потребления кислорода митохондриями (Панов и соавт., 2010). Митохондрии очищались от среды выделения с использованием центрифуги Avanti J-30I (Beckman Coulter, США) при 8000 об/мин, ротор JA-25.50 и микроцентрифуги «MIKRO 22R» (Hettich, Германия) при 8000 об/мин, ротор SW-28. Содержание белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) с использованием Кумасси G-25 (BioRad Laboratories, Inc., Россия). Измерение дыхательной активности митохондрий проводили при помощи полярографа «Эксперт-001 MTX» (Россия, Эконикс), оснащенного миниэлектродом Кларка YSI (Yellow Spring Instrument Co., Inc.). Субстраты дыхания использовали в конечной концентрации 10 мМ сукцината. Окислительное фосфорилирование инициировали добавлением 300 цМ АДФ. Для пато-морфологических исследований почки животных фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и фиксаторе Буэна (Микроскопическая техника ... , 1996). Гистологические срезы, полученные на санном микротоме, окрашивали гематоксилином и эозином по Массону (Киселева и соавт., 1983). Микроскопирование гистологических препаратов осуществляли на микроскопе «Motic В1» фирмы Motic (Германия).

"Полученные в ходе экспериментов данные статистически обработаны общепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины (М) и средней арифметической ошибки (ш). Достоверность результатов (р) оценивалась с использованием критерия (t) Стьюдента с использованием пакета прикладных программ «Biostat - 2006». Данные по исследованию антиоксидантной и антирадикальной активности подвергали корреляционному анализу с применением пакета программы Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), а статистическую обработку -согласно рекомендациям (Дёрффель, 1994).

Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В предварительных экспериментах было установлено, что показатели острой токсичности «Аркоситела» (DL50) при внутрибрюшинном введении белым крысам составили 4441±346 мг/кг. При вскрытии погибших животных находили кровоизлияния на слизистой желудка и двенадцатиперстной

кишки, кровенаполнение в печени, эмфизему легких. При внутрижелудоч-ном введении «Аркоситела» в максимально возможном объеме 6000 мг/кг крысам гибели животных не наблюдали. Лишь в первые дни введения крысам больших доз «Аркоситела» наблюдали ограничение двигательной активности, отказ от корма, слабую реакцию на раздражители, а затем поведение, внешний вид их не отличались от группы контроля (интактные крысы с введением эквиобъемного количества дистиллированной воды). Таким образом, полученные данные позволяют отнести фитоэкстракт «Арко-сител» к группе малотоксичных веществ (Руководство ..., 2005).

Исследование фармакологических свойств «Аркоситела»

Установлено, что «Аркосител» в экспериментально-терапевтических дозах 100, 200 и 300 мг/кг при его однократном внутрижелудочном введении интактным крысам оказывает мочегонное, салуретическое (Na -уретическое) действие, повышает СКФ и осмоляльность мочи.

Полученные данные показали, что при введении крысам «Аркоситела» в дозе 200 мг/кг показатели диуреза превосходили таковые при его введении в дозах 100 и 300 мг/кг. В связи с этим, наиболее эффективная доза 200 мг/кг была использована в дальнейших экспериментах в качестве экспериментально-терапевтической (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние «Аркоситела» и канефрона на диуретическую функцию почек у интактных белых крыс

Группы животных Доза, мг/кг п Объем мочи, мл/100 г час Увеличение диуреза, %

Контрольная (Н20) - 8 1,28±0,04 -

Опытная 1 («Аркосител») 100 8 1,62±0,07 27

Опытная 2 («Аркосител») 200 8 1,93±0,07* 51

Опытная 3 («Аркосител») 300 8 1,82±0,08* 42

Опытная 4 (канефрон) 30 8 1,79±0,08* 40

Примечание: * - здесь и далее различия статистически значимы по сравнению с данными у животных контрольной группы при р<0,05; п - здесь и далее количество животных в фуппе.

Повышение диуретической функции ночек под влиянием «Аркоситела» обусловлено, в основном, увеличением скорости клубочковой фильтрации на 66% и ускорением натрийуреза - на 45% по сравнению с данными у животных контрольной группы. Кроме того, при введении исследуемого

средства концентрация мочевины в моче увеличилась на 55%, а осмотическая концентрация мочи возросла на 33%, минутный диурез увеличился на 26% по сравнению с данными в контрольной группе (р<0,05) (табл. 2 и 3).

Таблица 2 - Влияние «Аркоситела» на салуретическую и концентрационную функцию почек у интактных белых крыс

Группы животных п 1С, мг/мл мг/мл Мочевина, ммоль/л ио5Ш, ммоль/л

Контрольная (НгО) 8 1,13±0,01 0,32±0,01 5,72±0,20 99,89±4,29

Опытная («Ар-косител») 8 1,36±0,01* 0,58±0,01* 12,76±0,53* 132,56±4,43*

Примечание: К+ - концентрация калия в моче; Ыа+ - концентрация натрия в моче; мочевина - концентрация мочевины в моче; ио5т - осмотическая концентрация мочи.

Таблица 3 - Влияние «Аркоситела» на содержание креатинина в сыворотке крови и моче, скорость клубочковой фильтрации и интенсивность каналь-цевой реабсорбции у интактных белых крыс

Показатели Группы животных

Контрольная (Н20), п = 8 Опытная («Аркоси-тел»), п = 9

Креатинин в сыворотке крови, мкмоль/л 65,21 ±2,05 50,52 ±2,01*

Креатинин в моче, мкмоль/л 1732,23 ±64,75 1762,51 ±75,60

Минутный диурез, мкл/ЮОг/мин 3,83 ± 0,22 4,83 ± 0,24*

СКФ, мкл/ЮОг/мин 101,73 ±6,23 168,46 ±8,36*

Интенсивность канальцевой реабсорбции, % 96,23 ± 3,26 97,13 ±4,25

Исследуемое средство в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг проявило выраженную противовоспалительную активность, значительно снижая степень экссудации, альтерации и умеренно активируя процессы регенерации. Так, при формалиновой модели отека объем лапки уменьшился на 30%, при декстрановой - на 25%, при гистаминовой - на 23% относительно контрольных величин. Введение крысам канефрона в дозе 30 мг/кг способствовало уменьшению отека на 22, 20 и 20% соответственно (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние «Аркоситела» и канефрона на экссудативную фазу воспалительной реакции у белых крыс

Группы животных Разность между объемами воспаленной и невоспаленной лапок, мл % угнетения отека

Формалиновый отек

Контрольная (формалин+ Н20), п=8 0,640±0,02 -

Опытам 1 (формалин + «Аркосител»), п=8 0,448±0,02* 30

Опытная 2 (формалин + ка-нефрон), п=8 0,499±0,03 22

Декстрановый отек

Контрольная (декстран+ Н20), п=8 0,430±0,02 -

Опытная 1 (декстран + «Аркосител»), п=8 0,322±0,06* 25

Опытная 2 (декстран+ ка-нефрон), п=8 0,344±0,02 20

Гистаминовый отек

Контрольная (гистамин+Н20) п=8 0,320±0,05 -

Опытная 1 (гистамин + «Аркосител»), п=8 0,246±0,07* 23

Опытная 2 (гистамин + ка-нефрон), п=8 0,256±0,01 20

При исследовании антиальтеративного действия «Аркоситела» было установлено, что на 2, 9 и 25 сутки наблюдения площадь некротизирован-ной ткани у животных, получавших «Аркосител», была ниже таковой у животных контрольной группы на 27%, 20% и 14% соответственно. Противовоспалительная активность «Аркоситела» во все сроки наблюдения превосходила таковую у препарата сравнения.

Также установлено, что фитоэкстракт «Аркосител» в дозе 200 мг/кг мало влияет на образование грануляционно-фиброзной ткани, также как и препарат сравнения.

Патология почек с ишемическим патогенезом может иметь различную этиологию, в том числе и иммунопатологическую (Мазо и соавт., 2007). В связи с этим, мы провели исследование иммуномодулирующих свойств «Аркоситела» с использованием модели экспериментальной иммуносу-прессии азатиоприном у мышей.

При изучении иммуномодулирующих свойств «Аркоситела» нами было установлено, что курсовое введение мышам исследуемого фитоэкстрак-

та повышает фагоцитарную активность макрофагов при азатиоприновой супрессии в 2,46 раза относительно контрольного значения. Кроме того, экстракт «Аркосител» способен ослаблять супрессивное действие азатио-прина на показатели клеточного, гуморального звеньев иммунного ответа. Так, при азатиоприновой супрессии курсовое введение мышам «Аркосите-ла» приводило к увеличению количества антителообразующих клеток на 60% в абсолютных значениях и на 58% при расчете на 106 спленоцитов по сравнению с контрольными значениями. Также на фоне иммуносупрессии мы наблюдали повышение индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа в 2 раза у опытных животных по сравнению с контрольным значением.

Ишемическое поражение почек ведет к активации свободнорадикаль-ных процессов, что, в свою очередь, приводит к нарушению целостности мембран клеток (Биленко, 1989; Окислительный ... , 2008; Мондодоев, 2009). В связи с чем, нами исследовано мембраностабилизирующее действие растительного средства «Аркосител» при перекисном и осмотическом гемолизе эритроцитов (табл. 5), а также его антиоксидантная и антирадикальная активности.

Таблица 5 - Влияние «Аркоситела» на перекисный и осмотический гемолиз эритроцитов

Условия опыта Концентрация, мг/мл Перекисный гемолиз, % Осмотический гемолиз, %

Контроль (гемолиз) - 95,04±2,51 82,05±2,28

0,001 1,31±0,04* 41,46±1,75*

Опыт (гемолиз + 0,01 6,38±0,26* 84,47±3,12

«Аркосител») 0,1 9,13±0,31* 75,91±2,42

1 13,42±0,55* 72,67±2,76

Установлено, что введение «Аркоситела» снижает гемолиз эритроцитов, индуцированный реактивом Фентона и осмотическим компонентом. При перекисном гемолизе 1С50 «Аркоситела» составляет 7,32 мг/мл. Наиболее активен в данном комплексном средстве экстракт Л. lappa (1С5о=4,96 мг/мл). При осмотическом гемолизе 1С50 «Аркоситела» составляет 1,017 мг/мл. В отношении осмотического гемолиза наиболее активным в данном сборе является экстракт О. stamineus (1С50=0,003 мг/мг).

«Аркосител» обладает наибольшей мембраностабилизирующей активностью в концентрации 0,001 мг/мл при перекисном и осмотическом

гемолизе, повышая устойчивость мембран к окислению на 94% и 41% соответственно, по сравнению с контролем.

Полученные результаты по исследованию антиоксидантной и антирадикальной активности «Аркоситела» и его компонентов показали умеренную общую антиоксидантную емкость 315,14 мг/г, причем на проявление данного вида активности наибольшее влияние оказывает экстракт О. sta-mineus (403,3 мг/г), а наименьшее - экстракт S. baicalensis (143 мг/г). Более выраженной антирадикальной активностью в отношении радикала АБТС обладает растительное средство «Аркосител» (1С50=8,12 мкг/мл), причем самым активным компонентом является экстракт A. montana (1С50=9,55мкг/мл). Максимальная радикал связывающая активность против радикала ДФПГ характерна для экстракта A. montana (1С5о=6,72 мкг/мл), а наименьшая - для экстракта A. lappa (1С50= 17,31 мкг/мл). Наиболее эффективным протектором Р-каротина от перекисной деструкции является «Аркосител» (1С50=17,91 мкг/мл) с большим вкладом экстракта A. montana (1С5о=16,91 мкг/мл).

Исследование антиоксидантной активности индивидуальных экстрактов показало, что для смесей, содержащих A. montana и О. stamineus, наблюдается наибольшая выраженность действия; данные компоненты являются определяющими в проявлении антиоксидантной активности исследуемого средства. Применение численных методов к результатам, полученным с использованием модели перекисной деструкции Р-каротина, показало, что активность сбора не является аддитивной из таковой отдельных экстрактов, а превышает ее на 15-20%. Данное явление свидетельствует о наличии потенцирующего влияния совместного присутствия индивидуальных компонентов. Так, NO-связывающая активность возрастает в ряду A. lappa (1С5о>10,0 мг/мл) < S. baicalensis < С. palustre < О. stamineus < сбор «Аркосител» (1С50=1,87 мг/мл) < A.montana (1С50=1,84 мг/мл) < галловая кислота (1С50 =0,19 мг/мл). Особо следует отметить железосвязываю-щую активность. Связывание ионов Fe2+ возрастает в ряду галловая кислота (1С50>5) < A. lappa (1С50 >4,00 мг/мл) < S. baicalensis < С. palustre < «Аркосител» (1С50=2,98 мг/мл) < О. stamineus < A.montana (1С5о=2,32 мг/мл).

Исследование фармакотерапевтической эффективности «Аркоситела» при ишемии/реперфузии почек белых крыс

В условиях моделирования такой патологии как ишемия почек, важнейшими показателями функциональной способности почек являются диурез, СКФ и уровень протеинурии. Изменения их полностью отражают степень поражения почечной ткани (Кутырина и соавт., 2009; Смирнов и со-авт., 2008) (рис. 1, 2, 3).

Рис. 1. Влияние «Аркоситела» и канефрона на диурез при ише-мии/реперфузии почек белых крыс

В результате И/Р почек крыс наблюдалось резкое снижение диуреза, уменьшение скорости клубочковой фильтрации, увеличение протеинурии у контрольной группы животных в 2 раза по сравнению с контролем. На фоне приема фитоэкстракта «Аркосител» и канефрона показатели диуреза увеличились на 47% и 35% соответственно по сравнению со значениями диуреза у контрольных животных (рис. 1).

Введение «Аркоситела» приводило к повышению скорости клубочковой фильтрации на 36% по сравнению с таковым контрольной группы (рис.2). Уровень протеинурии под влиянием исследуемого средства заметно приближался к интактным значениям содержания белка в моче (рис. 3). Действие препарата сравнения было сопоставимо с таковым «Аркоситела».

Рис. 2. Влияние «Аркоситела» и канефрона на скорость клубочковой фильтрации при ишемии/реперфузии почек белых крыс

Рис. 3. Влияние «Аркоситела» и канефрона на уровень протеинурии при ишемии/реперфузии почек белых крыс

При исследовании влияния «Аркоситела» на состояние ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной защиты организма при И/Р почек установлено, что данное средство снижает содержание МДА, повышает активность каталазы и ВГ в гомогенате почек. Так, на фоне И/Р снижалась активность каталазы на 25%, а уровень МДА возрос в 2 раза по сравнению с интактом. После курса введения крысам «Аркоситела» в дозе 200 мг/кг активность каталазы увеличилась на 22% относительно данных контрольной группы (табл. 6).

Таблица 6 - Влияние «Аркоситела» и канефрона на перекисное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы у белых крыс при ишемии/реперфузии почек

Показатели Группы животных

Интактная п=8 Контрольная (И/Р+Н20) п=8 Опытная 1 (И/Р+«Аркоси-тел») п=9 Опытная 2 (И/Р+канефрон) п=8

МДА в гомогенате, нмоль/г ткани 2,25±0,08 4,52±0,21 2,54±0,09* 2,71±0,11*

Каталаза в гомогенате, МЕ 22,12±0,98 16,57±0,82 20,21±1,01* 19,50±0,92*

Каталаза в сыворотке крс ви, МЕ 17,62±0,91 12,31±1,02 16,01±0,78* 15,05±0,67*

Восстановленный глутатион в гомогенате почек, нмоль/мг белка 1,82+0,03 1,05±0,003 1,45±0,05* 1,40±0,06*

Введение канефрона в дозе 30 мг/кг сопровождалось повышением активности каталазы на 18% по сравнению с контролем.

Курсовое введение «Аркоситела» животным опытной группы подавляло активность процессов ПОЛ со снижением МДА в гомогенате почек на 44%. Введение канефрона также уменьшало содержание МДА, снизив его на 40% по сравнению с контрольным значением.

В результате ишемического повреждения почек количество ВГ сократилось на 42% (табл. 6). Курсовое введение животным «Аркоситела» приводило к увеличению уровня ВГ на 38%, а канефрона - на 33% по сравнению с таковым в гомогенате почек контрольной группы животных.

Влияние «Аркоситела» на энергетическое состояние почек при ишемии /реперфузии почек крыс Учитывая тот факт, что «Аркосител» обладает выраженными мембра-ностабилизирующим, антиоксидантным, противовоспалительным свойствами было изучено его возможное влияние на окислительное фосфорили-рование при ишемии/реперфузии почек белых крыс, которая ведет к снижению продукции АТФ (КатакпзИпа е1 а1., 2012). Энергетическое состояние почек крыс при И/Р на фоне приема «Аркоситела» и препарата сравнения - канефрона оценивали по показателям АТФ, содержанию пировино-градной кислоты, молочной кислоты и активности пируваткиназы в гомогенате почек (табл. 7).

Таблица 7 - Влияние «Аркоситела» и канефрона на показатели энергетического состояния почек белых крыс при ишемии/реперфузии

Показатели Группы животных

Интактная п=10 Контрольная (Н20), п=10 Опытная 1 (И/Р+ «Аркосител»), п=9 Опытная 2 (И/Р+ кане-фрон), п=9

АТФ, мкмоль/г 1,31 ±0,043 0,68±0,03 0,92±0,03* 0,89±0,04*

Пируват, мкмоль/г 0,169±0,008 0,128±0,004 0,175±0,007* 0,177±0,00б*

Лактат, мкмоль/г 1,73±0,09 3,15±0,14 1,92±0,08* 2,12±0,08*

Активность ПК, мкмоль/мин/мг белка 2,23±0,10 2,81±0,12 2,43±0,09* 2,52±0,09*

Примечание: ПК - пируваткиназа.

Ишемическое повреждение почек вызывало угнетение энергопродукции. Это выразилось в снижении уровня АТФ на 48% по сравнению с уровнем АТФ в интактной группе. На фоне введения «Аркоситела» количество АТФ в ишемизированных клетках было на 35% больше по сравнению с таковым в контрольной группе. Такой же положительный эффект наблюдался при профилактическом введении канефрона — увеличение содержания АТФ на 31% по сравнению с контрольным значением. Известно, что отношение лактат : пируват в норме не превышает 10:1 (Торшин, 2001) и указывает на баланс между анаэробным и аэробным дыханием. Сдвиг этого отношения в сторону лактата свидетельствует о переходе клеток на анаэробный гликолиз, что характерно для гипоксических, ишемических состояний. Действительно, как показали наши данные (табл. 7), при И/Р почек содержание лактата в контрольной группе возросло на 82%, а уровень пирувата снизился на 24% по сравнению с интактными значениями. Соотношение лактат : пируват сдвинулось в сторону молочной кислоты до 15:1, а курсовое введение «Аркоситела» и канефрона снизило это соотношение в ишемизированных органах до 12:1 и 11:1 соответственно. Кроме того, И/Р почек сопровождалась повышением активности пируваткиназы на 26%. При введении «Аркоситела» активность фермента снизилась на 14% по сравнению с контрольным значением. Введение канефрона снизило данный показатель на 10%.

Влияние «Аркоситела» на дыхание митохондрий при ишемии/реперфузии

почек крыс

Поскольку примерно 90% продукции АТФ приходится на окислительное фосфорилирование в митохондриях (Chen et al., 2005), а при И/Р, как нами было установлено, значительно снижается концентрация внеклеточного АТФ, изучено возможное влияние «Аркоситела» на дыхательную функцию митохондрий.

Результаты измерения потребления кислорода митохондриями почек у контрольных животных с И/Р и у крыс с И/Р, получавших предварительно «Аркосител» в дозе 200 мг/кг в течение 5 суток, представлены в таблице 8.

Как следует из полученных данных, скорость дыхания митохондрий в состоянии окислительного фосфорилирования (V3) при окислении сукци-ната на фоне курсового введения «Аркоситела» повышалась на 42%, тогда как при введении канефрона скорость дыхания в состоянии 3 (V3) повышалась на 32% по сравнению с контролем.

Индекс сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О) снижался на 42%. На фоне введения исследуемого средства «Аркосител» происходило повышение коэффициента сопряженности АДФ/О на 55%. Коэффициент стимуляции дыхания (Cfl=V3:V4n) в контроле уменьшался на

27% по сравнению с интактом, а после курсового введения исследуемого средства и препарата сравнения коэффициент стимуляции дыхания повысился на 24 и 30% соответственно (табл. 8).

Таблица 8 - Влияние «Аркоситела» и канефрона на интенсивность митохондриального дыхания (сукцинат) в почках белых крыс при ише-

мии/реперфузии

Параметры дыхания митохондрий, п=8 Группы животных

Интактная группа п=8 Контрольная группа (И/Р+Н20) п=8 Опытная 1 (И/Р+ «Аркосител») п=8 Опытная 2 (И/Р+канефрон) п=8

V3 12,05±0,33 7,14±0,22 10,12±0,57* 9,42±0,15*

V4o 3,14±0,21 2,42±0,26 3,71±0,17* 2,71 ±0,11

V4„ 3,11±0,17 2,53±0,13 2,89±0,13* 2,57±0,10

СД 3,87±0,26 2,82±0,14 3,50±0,11* 3,66±0,14*

АДФ/О 1,66±0,10 0,97±0,07 1,50±0,11* 1,19±0,17

Примечание: У3 - скорость дыхания митохондрий в состоянии окислительного фосфорилирования; У4о - скорость потребления кислорода после цикла фосфори-лирования добавленного АДФ; У4п - скорость потребления кислорода до цикла фосфорилирования добавленного АДФ; СД — коэффициент стимуляции дыхания (СД=УЗ:У4п); АДФ/О - коэффициент сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О); размерности единиц скорости дыхания (У4п, У3, У4о) - наномоль 02/мин/мг белка.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что курсовое введение комплексного фитосредства «Аркосител» усиливает интенсивность дыхания митохондрий по сравнению с контролем.

Патоморфологическое исследование почек крыс с ишеми-ей/реперфузией вьивило интерстициальные геморрагии, дилатации канальцев и гломерулярную дегенерацию с атрофией. У крыс, получавших «Аркосител», реже наблюдали геморрагии, а также незначительные дистрофические изменения гломерул, вакуольную дистрофию эпителия незначительно дилатированных канальцев. Гломерул с признаками атрофии отмечали реже. Патоморфологические исследования показали, что курсовое введение «Аркоситела» в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг ограничивает развитие повреждения ткани почки при И/Р.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате экспериментальных исследований были определены следующие фармакологические свойства «Аркоситела»: мочегонное, гипоазо-темическое, противовоспалительное, иммуномодулирующее, мембрано-стабилизирующее, антиоксидантное и антирадикальное. Установлена фар-макотерапевтическая эффективность исследуемого средства при ише-мии/реперфузии почек у животных, выражающаяся в увеличении диуреза, салуреза, скорости клубочковой фильтрации и снижении уровня протеину-рии. Данный факт подтверждается морфологическими исследованиями. Известно, что одним из механизмов развития ишемических повреждений почек является индукция процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул в мембранах клеток (Белая и соавт., 2005; Зенков и со-авт., 2001). Это подтверждается увеличением концентрации продуктов ПОЛ в гомогенате почек. Одновременно наблюдалось угнетение антиок-сидантной защиты, обусловленное снижением активности фермента ката-лазы и угнетением глутатионопосредованной системы. Под влиянием «Аркоситела» наблюдали улучшение показателей функционального состояния почек, снижение содержания продуктов ПОЛ и повышение активности эндогенной антиоксидантной системы.

Учитывая, что в основе патологических процессов в клетках лежит нарушение энергетического статуса клеток с дисфункцией митохондрий (Di Mauro et al., 2012; Лукьянова, 2011; Кошелев, 2009), показано, что введение комплексного фитосредства «Аркосител» усиливает интенсивность дыхания митохондрий по сравнению с контролем при ишемии/реперфузии почек крыс. Данный факт объясняется, главным образом, усилением полиэкстрактом фосфорилирующей системы: FiF0ATPa3bi и/или АТФ/АДФ транслокатора и, только, частично - повышением активности комплексов дыхательной цепи митохондрий. К тому же было показано, что «Аркосител» сдвигает соотношение лактат : пируват в пользу последнего, а именно, с 15:1 до 12:1, что косвенным образом также указывает на восстановление окислительного фосфорилирования.

В целом, «Аркосител» по спектру фармакологической активности и выраженности фармакотерапевтической эффективности при ишемических повреждениях почек не уступает, а по ряду показателей превосходит препарат сравнения канефрон. Испытуемое средство является не токсичным веществом, не вызывает нежелательных побочных реакций при его длительном введении лабораторным животным в экспериментально-терапевтических дозах.

Проведенные исследования позволяют утверждать, что важными механизмами нефропротекторного действия «Аркоситела» являются его способности ингибировать процессы свободнорадикального окисления

биомакромолекул и повышать активность эндогенной антиоксидантной системы, а также стимулировать процессы энергетического обмена и дыхания митохондрий клеток.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что «Аркосител» проявляет противовоспалительную, антиоксидантную, мембраностабилизирующую, иммуномодулирующую активность, а также повышает диуретическую, концентрационную, салуре-тическую и фильтрационную функции почек.

2. «Аркосител» обладает выраженной фармакотерапевтической эффективностью при ишемии/реперфузии почек крыс: нормализует диурез, снижает протеинурию, оказывает гипоазотемическое действие, а также повышает активность ферментов антиоксидантной защиты.

3. Показано, что «Аркосител» обладает энергопротекторным действием и нормализует процессы окислительного фосфорилирования при ишемии/реперфузии почек крыс, активизируя дыхание митохондрий.

4. В основе нефропротекторного действия «Аркоситела» лежат его способности ингибировать процессы перекисного окисления липидов, стабилизировать мембранные структуры клеток почек, повышать активность антиоксидантной защиты, что приводит к купированию нефротического синдрома и способствует нормализации почечной функции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать «Аркосител» для клинических исследований с целью использования его в составе комплексной фармакотерапии ишемических повреждений почек.

2. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе при изучении курсов фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинских ВУЗов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние новых лекарственных средств на течение экспериментальных нефропатий / А.Г. Мондодоев, C.B. Лемза, Ю.Э. Макушкина, A.A. Гуржапова, И.Б. Багинова / Мат-лы III Всерос. научно-практ. конф. с международным участием «Развитие традиционной медицины в России». -Улан-Удэ, 2010. - С. 312-318.

2. Николаев М.П. Противовоспалительные свойства сухого экстракта из корней и корневищ сабельника болотного / М.П. Николаев, А.Г. Мондодоев, C.B. Лемза, Т.А. Ажунова, Ю.Э. Макушкина, С.Д. Бардымова //

Вестник Бурятского государственного университета. - 2010. - № 12. - С. 8488.

3. Mechanisms of nephroprotective effect of plant remedies in experimental nephropathies / A. G. Mondodoev, S.V. Lemsa, Yu.E. Makushkina, A.A. Gurz-hapova, I.B. Baginova // Abstracts of International scientific conference "Current situation and future trends of drug research and development from natural sources, Ulaanbaatar, 2010. - P. 69-71.

4. Макушкина Ю.Э. Антиоксидантная активность растительного средства «Аркосител» / Ю.Э. Макушкина, Д.Н. Олейников, С.В. Лемза // Мат-лы II Межд. научной конф. «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии». В 3 томах,- Т. 3. - Улан-Удэ, 2011. - С. 78.

5. Лемза С.В. Влияние растительных средств на активность ферментов антиоксидантной защиты in vitro / С.В. Лемза, Т.А. Ажунова, А.А. Торопо-ва, Ю.Э. Макушкина, А.А. Гуржапова // Мат-лы II Межд. научной конф. «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии». В 3 томах. -Т. 3. - Улан-Удэ, 2011. - С. 75-76.

6. Макушкина Ю.Э. Иммуномодулирующая активность растительного средства «Аркосител» / Ю.Э. Макушкина, В.Б. Хобракова // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. - 2012. - № 2. - Ч. 1. - С. 128-130.

7. Макушкина Ю.Э. Антиоксидантная активность растительного средства «Аркосител» / Ю.Э. Макушкина, Д.Н. Олейников // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. - 2012. - № 6. - С. 167-168.

Подписано в печать 15.03.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,3 печ. л. Тираж 100. Заказ №14.

Отпечатано в типографии Изд-ва Федерального государственного бюджетного учреждения науки БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.