Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение дубровника белого (Teucrium polium L.) флоры Северного Кавказа

На правах рукописи

РУДАКОВА ЮЛИЯ ГЕОРГИЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДУБРОВНИКА БЕЛОГО (TEUCRIUM POLIUM L.) ФЛОРЫ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 9 ИЮЛ 2015

Пятигорск - 2015

005571110

005571110

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте -филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Попова Ольга Ивановна

Официальные Шилова Инесса Владимировна, доктор

оппоненты: фармацевтических наук, ФГБНУ «Научно-

исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга», старший научный сотрудник лаборатории фитофармакологии и специального питания

Зилфикаров Ифрат Назимович, доктор фармацевтических наук, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений», главный научный сотрудник отдела фитохимии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Сибирский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 30 сентября 2015 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России и на сайте Ьпр:/Ау\¥лу.ртес1р11агт.ги

Автореферат разослан <,(/¿1» ^¿¿Р/Сс^ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Заболевания мочевыводящих путей имеют широкое распространение в России, являются причиной обращения пациентов в лечебные учреждения и назначения антибактериальной терапии. В настоящее время существует много схем антибактериальной терапии, однако рост резистентных штаммов возбудителей требует поиска альтернативных методов лечения. Решение данной проблемы достаточно эффективно по результатам доказательной медицины при применении растительных лекарственных препаратов, которые в отличие от синтетических обладают лучшей переносимостью, что позволяет использовать их для симптоматического, профилактического и продолжительного лечения. Одним из эффективных методов поиска новых перспективных лекарственных растений является обращение к средствам народной медицины. Среди них внимание заслуживает дубровник белый (Теиспит роПит Ь.) сем. Ьапнасеае, представитель флоры Северного Кавказа. Народы Кавказа отвар дубровника белого используют при циститах, гипофункциях желудка, дизентерии. В народной медицине ряда стран Юго-Восточной Азии настойку, отвар и настой из надземных частей дубровника белого применяют в качестве мочегонного, антибактериального, противовоспалительного, спазмолитического и желчегонного средств.

Однако в нашей стране нет сведений об использовании в официальной медицине травы дубровника белого. Тем не менее, в литературе имеются противоречивые данные о качественном составе и количественном содержании биологически активных веществ дубровника белого, отсутствуют сведения о его сырьевых запасах на территории Северного Кавказа. Поэтому фармакогностическое изучение дубровника белого, как нового источника природных биологически активных веществ с целью разработки отечественных препаратов является актуальным и целесообразным.

Степень разработанности темы исследования

Дубровник белый имеет широкий спектр биологической активности, его водные и спиртовые извлечения применяют за рубежом (Болгария, Иран,

Армения, Туркмения, Япония). В литературе имеются сведения о наличии в дубровнике белом, произрастающем в странах Юго-Восточной Азии, эфирного масла, дитерпеноидов и флавоноидов, но сведения об их количественном содержании, динамике накопления отсутствуют. Иностранными учеными биологическая активность извлечений из растений рода Теиспит Ь. подтверждена многочисленными экспериментальными исследованиями, согласно которым они проявляют противовоспалительное, спазмолитическое, противоопухолевое и антибактериальное действие.

Цель и задачи исследования

Целью работы является фармакогностическое изучение дубровника белого, произрастающего в Ставропольском крае, и научное обоснование возможности использования его в качестве потенциального источника сырья для получения лекарственных средств, обладающих диуретическим и антимикробным видами действия. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. провести фитохимический анализ дубровника белого травы с целью выявления основных групп биологически активных веществ (БАВ);

2. определить морфолого-анатомические признаки и установить числовые показатели качества для проведения стандартизации сырья;

3. изучить динамику накопления основных групп БАВ по фазам вегетации в различных органах исследуемого растения;

4. определить сырьевые запасы дубровника белого в 3-х районах Ставропольского края;

5. провести фармакологический скрининг извлечений из травы дубровника белого;

6. разработать проект нормативного документа (ФСГТ «Дубровника белого трава») и инструкцию по сбору и сушке на данный вид сырья.

Научная новизна

• Изучен химический состав травы дубровника белого, произрастающего в Ставропольском крае;

• Установлены оптимальные условия количественного определения эфирного масла в траве дубровника белого и изучена динамика его накопления по фазам развития и органам растения;

• Методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии с использованием базы данных библиотеки Willey 275 идентифицировано 52 компонента эфирного масла с вероятностью совпадения не менее 95%, среди которых преобладают: транс-кадина-1,4-диен, транс-Р-фарнезен, т-кадинол, у-химахален, гермакрен D, ß-куркумен, цис-Р-фарнезен, (1Е,4г)-гермакрен В, кадален, у-элемен, т-мууролол, 5-кадинен, ди-эпи-а-кедрен-(1), бициклогермакрен, а-бизаболен, а-копаен, химахален эпоксид. Впервые в данном виде идентифицированы: транс-кадина-1,4-диен, у-химахален, ß-куркумен, кадален, ди-эпи-а-кедрен-(1), химахолен эпоксид, 1-эпи-кубенол, хелифолен, а-кедрен, транс-а-бергамотол, хамазулен, азулен;

• Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии идентифицировано 9 соединений фенольной природы: рутин, гиперозид, кверцетин, апигенин, лютеолин, кемпферол, феруловая, хлорогеновая и кофейная кислоты;

• Установлено количественное содержание суммы флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, иридоидов, органических кислот, тритерпеновых соединений и дубильных веществ в траве дубровника белого;

• Проведены исследования по стандартизации травы дубровника белого:

- предложена методика определения флавоноидов и идентификации сырья дубровника белого с использованием тонкослойной хроматографии, подобраны оптимальные условия хроматографирования (система растворителей и способ детекции пятен веществ) в присутствии стандартного образца лютеолина;

- разработана методика спектрофотометрического определения флавоноидов в сырье дубровника белого. Предложенная методика валидирована по показателям: линейность, прецизионность и правильность;

• Определены аминокислотный и минеральный состав травы дубровника белого;

• Выявлены и охарактеризованы внешние и микроскопические признаки, необходимые для идентификации сырья «Дубровника белого трава»;

• Установлено, что водное извлечение из травы дубровника белого практически не токсично, а спиртовое - малотоксично. Доказана их антимикробная и диуретическая активность. Доказано, что антимикробная активность эфирного масла дубровника белого травы сопоставима с антимикробной активностью 1% спиртового раствора «Сальвин»;

• Определены запасы сырья и рассчитан объём возможных ежегодных заготовок травы дубровника белого на территории 3-х районов Ставропольского края (Буденновского, Советского и Георгиевского).

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость. Теоретическая значимость исследования

заключается в расширении знаний о химическом составе БАВ травы дубровника

белого, произрастающего на территории Ставропольского края.

Показана возможность использования нового вида отечественного сырья -

«Дубровника белого трава» для получения лекарственного средства, обладающего

диуретической и антимикробной активностью.

Практическая значимость. С учетом основных требований,

предъявляемых к определению подлинности и доброкачественности

лекарственного растительного сырья, а также путей его использования,

разработаны и внедрены методики качественного и количественного определения

эфирного масла, флавоноидов и экстрактивных веществ в траве дубровника

белого. Рассчитан объём ежегодных заготовок и определены оптимальные сроки

заготовки сырья на территории 3-х районов Ставропольского края.

Разработаны проект ФСП «Дубровника белого трава» и «Инструкция по

сбору и сушке травы дубровника белого». Акты внедрения: «Методика

6

количественного определения суммы флавоноидов в траве дубровника белого» (акт внедрения от 09.06.2014 г.) на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО Северо - Осетинского государственного университета, «Морфолого - анатомическое изучение травы дубровника белого флоры Северного Кавказа» (акт внедрения от 27.08.2014 г.) на кафедре фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО Волгоградского государственного медицинского университета и «Методика количественного определения суммы дубильных веществ в траве дубровника белого», (акт внедрения от 28.05.2014 г.) на кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО Дальневосточного государственного медицинского университета Минздрава России.

Методология и методы исследования

Методология построена на изучении и обобщении литературных данных по теме исследования, оценке степени разработанности и актуальности темы. В работе использован современный подход к проведению фотохимического анализа и стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья. Идентификацию и количественное определение БАВ проводили с использованием различных физико-химических методов: тонкослойная (ТСХ) и бумажная (БХ) хроматография; газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГЖХ/МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ);

УФ-спектрофотометрического, атомно-эмиссионной спектроскопии;

титриметрических, ресурсно-биологических методов. Исследования острой токсичности и фармакологический скрининг построены на методологии классической фармакологии.

Положения, выносимые на защиту:

• результаты фотохимического изучения основных групп БАВ травы дубровника белого;

• результаты морфолого-анатомического исследования сырья «Дубровника белого трава»;

• методики анализа, показатели подлинности и нормы качества сырья «Дубровника белого трава», необходимые для разработки проекта нормативной документации;

• результаты ресурсоведческих исследований сырья дубровника белого в 3-х районах Ставропольского края;

• результаты предварительных фармакологических исследований эфирного масла, водного и спиртового извлечений из травы дубровника белого.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов определяется использованием различных современных физико-химических методов анализа, объемностью изученной информационной базы и обширностью исследования, математико-сгатистической обработкой полученных данных. Статистическая обработка результатов проводилась согласно требованиям ГФ XI, XII с использованием возможностей программы Microsoft Excel 7.0 и «Биостатистика». Все разработанные методики количественного определения основных БАВ валидированы. Объем проведенной работы подтверждается наличием и достоверностью первичных материалов, их экспертной оценкой, значительным количеством графического материала (таблицы, графики, рисунки).

Основные положения работы доложены на 68-ой и 69-ой научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, ПМФИ - филиал ВолгГМУ, 2013 г.; 2014 г.); III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2012); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2013); IV Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки (г. Владикавказ, 2013); IV Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2013); VI Международной студенческой электронной научной

конференции «Студенческий научный форум 2014» (г. Москва, 2014);

8

межрегиональном научно-инновационном конкурсе молодых ученых «У.М.Н.И.К.» (г. Ставрополь, 2014 г.); 72-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов ВолгГМУ с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», исследования автора отмечены I местом среди работ по секции «Исследования лекарственных растений» (г. Пятигорск, ПМФИ - филиал ВолгГМУ, 2014 г.). По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 9 в журналах из Перечня российских рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора

При непосредственном участии автора были определены цели и задачи работы. Автор самостоятельно выполнил экспериментальные исследования по фитохимическому анализу травы дубровника белого, разработке методик количественного определения основных групп БАВ, установлению диагностических признаков сырья и норм его качества. Автор участвовал в ресурсоведческих исследованиях по определению запасов сырья на конкретных зарослях в некоторых районах Ставропольского края, а также изучении фармакологической активности эфирного масла, водных и спиртовых извлечений из исследуемого сырья. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Объём н структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 166 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», 4 глав экспериментальной части, заключения, списка литературы, приложения. Список литературы включает 177 источников, из них 94 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы приведено современное состояние изученности представителей рода Теиспиш Ь.: ботаническая характеристика, распространение, химический состав и биологическая активность.

9

Объектом исследования является дубровник белый, собранный в различные фазы вегетации в период 2012-2014 гг. на территории 3-х районов Ставропольского края (Советском, Буденновском, Георгиевском).

Фитохимическое исследование травы дубровника белого Определение содержания эфирного масла в траве дубровника белого проводили методом перегонки с водяным паром в свежем и высушенном растительном сырье с последующим измерением его объема, используя приемник Гинзберга (2012-2014 г.). Количественное содержание эфирного масла в анализируемых образцах составило от 0,24 до 0,31% в свежем сырье (при влажности 70,3%), и от 0,22 до 0,28% в абсолютно сухом сырье.

Результаты изучения динамики накопления эфирного масла по фазам вегетации представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Динамика накопления эфирного масла в траве дубровника белого в зависимости от фазы вегетации растения в абсолютно сухом сырье, %

(п=3)

Основные фазы вегетации Год заготовки сырья Район заготовки сырья

Советский Буденновский Георгиевский

Бутонизация 2012 0,20±0,03 0,21±0,03 0,21±0,03

2013 0,21±0,04 0,21±0,05 0,23±0,04

2014 0,22±0,03 0,22±0,03 0,22±0,02

Цветение 2012 0,24±0,04 0,25±0,04 0,26±0,03

2013 0,24±0,03 0,24±0,03 0,25±0,04

2014 0,25±0,03 0,23±0,02 0,28±0,05

Плодоношение 2012 0,20±0,05 0,21±0,03 0,20±0,03

2013 0,20±0,03 0,22±0,02 0,20±0,02

2014 0,22±0,04 0,20±0,04 0,21±0,04

Полученные данные свидетельствуют, что наибольшее содержание эфирного масла накапливается в фазу цветения от 0,23 до 0,28% в образцах сырья, заготовленных в Георгиевском районе.

Компонентный состав эфирного масла определяли на хроматографе Agilent Technologies 7890 GC System (USA). Полученные результаты представлены в таблице 2.

ю

Таблица 2 - Компонентный состав эфирного масла из травы дубровника белого

(п=3)

Время удерж мин Компонент Содержание, % в эф1фном масле Время удерж мин Компонент Содержание, % в эфирном масле

13.01 Линалоол 0,09±0,05 28.64 Гермакрен В 0,59±0,04

20.99 Азулен* 0,18±0,14 28.74 Д и-эпи-а-кедрен-( 1) * 2,09±0,31

21.19 Бициклоэлемен 0,40±0,16 28.87 Эремофила-1(10),11-диен* 0,25±0,12

21.64 а-кубебен 0,17±0,04 29.01 Химахален эпоксид* 1,00±0,18

22.46 а-копаен 1,02±0,15 29.33 Алло-кедрол* 0,19±0,02

22.74 Р-бурбонен 0,63±0,05 29.44 Глобулол 0,29±0,03

22.92 7-эпи-сесквитуйен* 0,77±0,20 29.52 Не идентифицирован 0,84±0,13

22.98 р-элемен 0,78±0,19 29.64 Вульгарен А* 0,48±0,04

23.27 7-эпи-а-кедрен* 0,17±0,05 29.72 Кедрол * 0,44±0,07

23.39 Хелифолен* 0,45±0,04 30.15 1,10-ди-эпи-кубенол* 0,93±0,09

23.60 а-кедрен* 0,37±0,08 30.27 1-эпи-кубенол* 0,98±0,12

23.70 Цис-а-бергшотен* 0,34±0,03 30.56 т-кадинол 6,63±0,36

23.84 Кариофиллен 0,52±0,15 30.90 т-мууролол 2,82±0,41

24.14 Селина-4(15),5-диен* 0,15±0,04 30.98 8-кадинол . 0,42±0,05

24.33 у-элемен 3,57±0,35 31.35 Кадален* 3,67±0,32

24.67 Дис-Р-фарнезен 5,98±0,05 31.53 Кадина-4( 14), 10( 15)-диен-5р-ол* 0,76±0,14

25.24 Транс- Р-фарнезен 8,19±0,18 31.61 Эпи-а-базаболол* 0,34±0,07

25.26 а-акоренон* 0,20±0,11 31.68 7ранс-а-бергамотол* 0,69±0,05

25.35 Р-акоренон* 0,43±0,05 31.82 Акоренон* 0,30±0,06

25.83 у-химахален* 6,56±0,46 32.53 Кариофилла-3,8(13)-диен-5а-ол ацетат* 0,23±0,04

25.92 Гермакрен О 6,16±0,33 32.75 Не идентифицирован 0,21±0,08

26.28 Бициклогермакрен 1,99±0,32 32.84 Хам азулен* 0,25±0,05

26.63 а-бнзаболен 1,41±0,31 33.06 Минтсульфид* 0,12±0,04

26.77 Р-куркумен* 6,02±0,09 33.83 Не идентифицирован 0,17±0,05

27.10 6-кадинен 2,37±0,24 34.81 Нооткатон* 0,12±0,02

27.30 7ранс-у-бизаболен 0,52±0,05 35.75 Гексагидрофарнезил ацетон* 0,25±0,04

27.89 Транс-кадша-1,4-диен* 13,32±0,34 ИТОГО: 99,99

28.17 (1Е,4г)-гермакрен В 5,11±0,20 Идентифицировано 98,77

Примечание: * - соединения, впервые обнаруженные в траве дубровника белого, произрастающего на территории Ставропольского края.

Предварительную идентификацию фенольных соединений проводили методом БХ и ТСХ с использованием стандартных образцов в различных системах растворителей. По значениям и окраске пятен обнаружены: лютеолин, рутин, кверцетин, апигенин, гиперозид, танин, кофейная и феруловая кислоты.

Для подтверждения качественного состава и количественного определения фенольных соединений использовали метод ВЭЖХ (таблица 3).

Таблица 3 — Результаты анализа фенольных соединений травы дубровника белого методом ВЭЖХ (п=3)

Группа БАС Содержание в % от суммы фенольных соединений в извлечении* Идентифицированные соединения

Гидроксикоричные кислоты 0,09 Хлорогеновая кислота

3,40 Кофейная кислота

10,32 Феруловая кислота

Флавоноиды 2,36 Рутин

2,81 Гиперозид

18,55 Лютеолин

0,06 Кверцетин

10,59 Апигенин

0,22 Кемпферол

Примечание: *- Среднее значение трех определений (погрешность около 6,0%)

Таким образом, методом ВЭЖХ с помощью стандартных образцов в траве дубровника белого идентифицировано 9 соединений фенольной природы. Преобладающими являются лютеолин (18,5%), апигенин (10,6%) и феруловая кислота (10,3%).

Количественное определение флавоноидов в сырье проводили методом дифференциальной спектрофотометрии, основанным на определении оптической плотности полученных комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом. Расчет содержания суммы флавоноидов вели по доминирующему флавоноиду лютеолину с использованием его удельного показателя поглощения с алюминия хлоридом. Образующийся окрашенный комплекс имеет максимум свето-поглощения при длине волны 394 нм. Экспериментально установлено, что наиболее полное извлечение суммы флавоноидов достигается при использовании спирта этилового 70%, степени измельченности сырья 2 мм, соотношении сырья и экстрагента 1:30 при трехкратной экстракции в течение 30 минут. Содержание суммы флавоноидов в траве дубровника белого колеблется от 1,12% до 1,54%.

Разработанная методика была подвергнута валидационной оценке в соответствии с требованиями ОФС РФ «Валидация фармакопейных методов» по показателям: линейность, правильность и прецизионность. Методика имеет линейный характер, является правильной и прецизионной.

Для оптимизации сроков заготовки травы дубровника белого проведено изучение динамики накопления суммы флавоноидов по фазам вегетации в некоторых органах растения и сырье «Дубровника белого трава» по разработанной методике (таблица 4).

Таблица 4 - Динамика накопления суммы флавоноидов по фазам вегетации в некоторых органах растения и сырье «Дубровника белого трава» (п=6)

Основные фазы вегетации Соцветия Листья Трава

Начало вегетации - 0,85±0,02 -

Бутонизация 1,42±0,02* 1,17±0,02 1,19±0,03

Цветение 1,40±0,03 1,13±0,03 1,21±0,04

Плодоношение - 1,12±0,04 0,98±0,02

Примечание: *- Результат содержания суммы флавоноидов в бутонах

Экспериментальные данные свидетельствуют, что заготавливать траву дубровника белого необходимо в фазу цветения.

Количественное содержание гидроксикоричных кислот в пересчете на кофейную кислоту в сырье, определенное методом спектрофотометрии, составило 2,12% при относительной погрешности методики 2,2%.

Качественный состав иридоидов травы дубровника белого изучен методом ТСХ в различных системах растворителей. Проявляли хроматограммы реактивами Шталя и Бэкон-Эдельмана. На хроматограмме наблюдали зоны адсорбции с Rf = 0,44 и Rf = 0,88, что показало вероятность присутствия 2-х веществ иридоидной природы - гарпагида и гарпагида ацетата.

Количественное содержание иридоидов в сырье определяли спектрофотометрическим методом. Расчет проводили по удельному показателю поглощения гарпагида ацетата (Е^°м =56,03 при 512 нм). Содержание суммы иридоидов составило 0,51% при относительной погрешности методики ±2,7%.

Методом ТСХ в хлороформных извлечениях из сырья идентифицирована урсоловая кислота, зона адсорбции с Rf = 0,28±0,03 совпадает со значением Rf СО урсоловой кислоты в системе растворителей хлороформ-этилацетат (9:1). Методом спектрофотометрии установлено, что сумма агликонов в пересчете на урсоловую кислоту в траве дубровника белого составила 2,34±0,05%.

Идентификацию органических кислот в траве дубровника белого проводили методом БХ. Установлено наличие лимонной, винной и яблочной кислот.

Количественное определение содержания свободных органических кислот в траве дубровника белого проводили по методике ГФ XI «Плоды шиповника». Их содержание в водном извлечении из сырья дубровника белого составило в среднем в исследованных образцах 1,65±0,07%.

Для определения количественного содержания дубильных веществ в сырье дубровника белого использовали 3 метода: перманганатометрия, кулонометрия, спектрофотометрия (таблица 5).

Таблица 5 - Результаты определения дубильных в траве дубровника белого

№ Метод X Зг ДХ е%

1 Перманганатометрия 7,81 0,10 0,050 0,12 1,5

2 Кулонометрия 3,25 0,19 0,073 0,17 5,2

3 Спектрофотометрия 3,75 0,09 0,048 0,15 4,1

Эксперименты показали, что результаты количественного определения дубильных веществ методами кулонометрии и спектрофотометрии близки по значениям и дают более объективные данные по их содержанию в сырье.

Для определения аминокислотного состава травы дубровника белого использовали метод ВЭЖХ с применением аминокислотного анализатора марки «ААА-400» (Чехия). Установлено наличие 16 аминокислот, 7 из которых являются незаменимыми. Доминирующими аминокислотами являются аспарагиновая, глютаминовая и лейцин.

Определение элементного состава проводили на базе испытательной лаборатории ФГБУ ЦАС «Хабаровский» с помощью атомно-эмиссионного спектрометра с индуктивно связанной плазмой 1СРУ1з1а АХР1Ю. Установлено присутствие в траве дубровника белого 23 элементов, среди которых основными по содержанию являются кальций, калий, железо. Содержание токсичных элементов (Аэ, Сс1, РЬ) сравнивали с предельно допустимой концентрацией (ПДК)

для листьев чая китайского. Полученные значения не превышали ПДК для листьев чая китайского и соответствуют требованиям СанПин 2.3.2. 1078-01.

Фармакологический скрининг извлечений из травы дубровника белого Определение острой токсичности извлечений из травы дубровника белого проводили на белых мышах - самцах. Экспериментально установлено, что по классификации Н.С. Hodge и L.H. Sterner водное извлечение практически нетоксично, спиртовое - малотоксично.

Диуретическую активность извлечений изучали на здоровых животных - 64 белых крысах - самцах линии «Wistar» массой 220-240 г. Извлечения вводили животным за час до создания водной нагрузки. Интактная группа животных получала эквиобъемное количество воды (таблица 6).

Таблица 6 - Влияние извлечений из травы дубровника белого на диуретическую активность у крыс _(п=8)

Группы, доза Объем мочи за 3 часа, мл/200 г

Интактные 1,84±0,208

Водное извлечение, 100 мг/кг 1,59±0,207

Водное извлечение, 300 мг/кг 3,31±0,211* +80%

Водное извлечение, 500 мг/кг 3,43+0,234* +86%

Спиртовое извлечение, 100 мг/кг 2,09±0,338

Спиртовое извлечение, 300 мг/кг 3,28+0,258* +78%

Спиртовое извлечение, 500 мг/кг 3,67+0,295* +99%

Отвар ортосифона тычиночного (250 мг/кг в пересчёте на сухое сырье) 3,83+0,402* +108%

Примечание: * - достоверно ( Р < 0,05 ) по отношению к интактной группе животных; п — количество животных в группе

Исследования показали, что при однократном введении в желудок крысам извлечений в диапазоне доз 300 - 500 мг/кг они обладают мочегонным эффектом, сопоставимым с таковым отвара ортосифона тычиночного.

Изучена антимикробная активность эфирного масла и извлечений травы

дубровника белого на 11 тест-культурах, с использованием в качестве экстрагента

воды очищенной, 40% и 70% спирта этилового. Установлено, что спиртовые

извлечения обладают антимикробным действием в отношении Staphylococcus

aureus (209), Escherichia coli 675, Salmonella galenarum, Bacillus anthracoides - 1,

Proteus vulgaris. Выявлена антимикробная активность эфирного масла в

отношении Enterococcus faecalis, Streptococcus mutans и Staphylococcus aureus, что

15

подтверждает целесообразность применения травы дубровника белого как антимикробного средства.

Установление норм качества сырья «Дубровника белого трава» Установлены внешние и анатомо-диагностические признаки сырья. «Дубровника белого трава» представляет собой смесь цельных или частично измельченных листьев, цветков, кусочков стеблей толщиной до 3 мм, иногда бутонов и незрелых плодов. Стебли цилиндрические, войлочно-опушенные, седоватые или снежно-белые. Листья короткочерешковые, ланцетные, на верхушке тупые, по краю неглубоко городчато-зубчатые с резко выступающими жилками на нижней стороне. Сверху зеленые, снизу беловатые, опушенные. Соцветия густые, головчатые. Цветки почти сидячие, беловатые или желтоватые. Чашечка коротко-трубчато-колокольчатая, беловойлочная. Венчик снаружи войлочно-мохнатый. Ценобии - продолговатые или продолговато-яйцевидные. Поверхность глубоко-сетчатая от темно-коричневого до черного цвета. Запах сырья специфический. Вкус горьковато-вяжущий.

Микроскопические признаки: стенки клеток нижнего эпидермиса листа, в отличии от верхнего эпидермиса, сильноизвилистые, вдоль жилок прямостенные. Устьица диацитного типа, овальные, чечевицевидные расположены на верхней и нижней стороне листа. На нижней стороне листа устьица погруженые в эпидермис. Поверхность листа густо опушена простыми одноклеточными, многоклеточными, вильчато-разветвленными и головчатыми волосками. Головчатые волоски с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой. Эфирно-масличные железки на короткой ножке с 4-6 (реже 8) выделительными клетками, наиболее часто расположены на нижней стороне листа (рисунок 1, 2).

Клетки эпидермиса венчика цветка извилистостенные, покрыты бородавчатой кутикулой. На эпидермисе встречаются простые многочисленные одноклеточные, многоклеточные, головчатые и вильчато-разветвленные волоски. Волоски имеют гладкую и бородавчатую поверхность. Эфиромасличные железки радиальные, 8-клеточные. Пыльцевые зерна округло-трехгранные (рисунок 3, 4).

■ ' -

НИ® •*"%.* " сДм

Рисунок 1 - Фрагмент нижней эпидермы листовой пластинки дубровника белого (увеличение 16x10) 1- клетки эпидермиса; 2- устьица

Рисунок 2 - Фрагмент нижней эпидермы по краю листовой пластинки дубровника белого (увеличение 16x10) 1 - эфирно - масличные железки 2- простые многоклеточные вильчато-разветвленные волоски

2

Рисунок 4 - Фрагмент цветка дубровника белого (увеличение 16x10) 1 - простой волосок; 2 - пыльца; 3 - эфирно - масличная железка

На эпидермисе стебля видны волоски: головчатые, одноклеточные, многоклеточные и вильчато-разветвленные. Диагностическое значение имеют волоски вильчато-разветвленные.

На основании проведенных исследований по изучению основных групп БАВ, морфолого-анатомических исследований предложены показатели подлинности и нормы качества для сырья - «Дубровника белого трава», которые положены в основу разработанной нормативной документации (таблица 7).

17

Рисунок 3 - Фрагмент цветка дубровника белого (увеличение 16x10)

1 - эфирно-масличная железка;

2 - простой 2-х клеточный волосок;

3 - головчатый волосок; 4 - эпидермис

Таблица 7 - Показатели подлинности и нормы качества сырья «Дубровника белого трава»____

Основные показатели Методы Нормы

Подлинность: Внешние признаки: - цельное сырье - измельченное сырье ГФ XI, вып. 1, с. 256 Макроскопический (визуально, органолептически) Смесь цельных и частично измельченных стеблей, листьев, цветков и бутонов, не содержащая грубых частей

Микроскопия: -цельное сырье -измельченное сырье ГФ XI, вып. 1, с.277 Микроскопический Одноклеточные, многоклеточные, вильчато-разветвленные и головчатые волоски, эфиромасличные железки радиального типа, устьица диацигные

Качественные реакции Флавоноиды Химические реакции: 1. Цианидиновая проба. При добавлении к спиртовому извлечению 0,5г цинковой пыли, 5 капель кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревании на кипящей водяной бане (5 минут), должно наблюдаться красное окрашивание (через 5 минут) 2. С раствором алюминия хлорида. При добавлении к спиртовому извлечению 2 мл 5% раствора алюминия хлорида в 70% спирте этиловом, должно наблюдаться желтое окрашивание

1. Лютеолин ТСХ - анализ спиртового извлечения из сырья В системе растворителей: бутанол- кислота уксусная - вода (4:1:5) на хроматограмме должна обнаруживаться зона адсорбции, имеющая коричневый цвет в УФ-свете при >.=254 со значением (по лютеолину) = 0,56±0,04. Допустимо наличие дополнительных зон.

уф. спектрофотометрия УФ-спектр спиртового извлечения 70% должен иметь 2 максимума поглощения (Хшах): 282±5 нм; 334±5 нм;

Числовые показатели: 1. Цельное сырье - Дифференциальная спектрофотометрия по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом - ГФ XI, вып. 1, с.290 - ГФ XII, вып. 1 - ГФ XI, вып.1,с.295 - ГФ XI, вып.1,с.285 - ГФ XI, вып.2,с. 24 - ГФ XI, вып.2,с. 25 - ГФ XI, вып. 1,с. 276 - ГФ XI, вып. 1 ,с. 276 - ГФ XI, вып. 1,с. 276 - Не менее 1,1% - Не менее 0,2% - Не менее 24% - Не более 10% - Не более 5% -Не более 1% - Не более 5% - Не более 2% - Не более 1%

- сумма флавоноидов в пересчете на лютеолин - содержание эфирного масла - содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 70% спиртом этиловым - влажность - зола общая - зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной - содержание частиц, изменивших окраску и других частей, не соответствующих описанию - органические примеси - минеральные примеси

Ресурсоведческие исследования дубровника белого в условиях Ставропольского края

В основе работы лежало экспедиционное обследование 3-х районов Ставропольского края (Георгиевский, Советский, Буденновский). Экспедиции проводились в период с 2012 года по 2014 год включительно. Определение запасов проводили на конкретных зарослях. Урожайность определяли методом учетных площадок. Учетные площадки закладывали произвольно, 15-20 учетных площадок по 1 м2 при 5-ти кратной повторное™ на 1 га. Сбор сырья с учетных площадок проводили путем срезания верхних 20-25 см цветущей надземной части с последующим взвешиванием. Общая площадь зарослей травы дубровника белого в исследованных ценопопуляциях на территории 3-х обследованных районов составила около 15 га, эксплуатационный запас - 4225,7 кг свежего сырья, а рекомендуемый объем ежегодных заготовок - около 1500 кг. Таким образом, территория Ставропольского края является перспективной для заготовки травы дубровника белого. Фенологические наблюдения за развитием дубровника белого проводили в регионе Кавказских Минеральных Вод (КМВ) на стационарном участке. .

В результате фенологических наблюдений и изучения динамики накопления БАВ установлено, что заготовку травы дубровника белого целесообразно проводить в фазу цветения с конца июня до начала августа, а в случае более поздней вегетации - с начала июля до конца августа.

Заключение

В результате проведенных экспериментальных исследований расширены знания о химическом составе дубровника белого, произрастающего на Северном Кавказе, подтверждено наличие фармакологической активности.

На основании проведенных исследований сделаны следующие выводы: 1. Фотохимическими исследованиями надземной части дубровника белого, произрастающего на территории Ставропольского края, установлен комплекс биологически активных веществ: эфирное масло (до 0,28±0,04% - в соцветиях, 0,24±0,03% - в листьях, 0,26±0,04% - в траве); фенольные

19

соединения: флавоноиды (1,12%-1,54%), дубильные вещества - 3,02 - 3,86% (метод кулонометрии и спектрофотометрии), 7,70%-7,92% (метод перманганатометрии); гидроксикоричные кислоты (2,07%-2,19%), иридоиды (0,49%-0,53%); тритерпеновые сапонины (2,24%-2,37%%); органические кислоты (1,59%-1,73%); аминокислоты; хлорофилл; макро- и микроэлементы. В результате изучения эфирного масла травы дубровника белого подобраны оптимальные условия его количественного определения (время и условия перегонки); методом ГЖХ/МС установлен компонентный состав, преобладающими компонентами которого являются: транс-кадина-1,4-диен, транс-Р-фарнезен, т-кадинол, у-химахален, гермакрен О, Р-куркумен, цис-р-фарнезен, (1Е,4г)-гермакрен В, кадален, у-элемен, т-мууролол, 8-кадинен, ди-эпи-а-кедрен-(1), бициклогермакрен, а-бизаболен, а-копаен, химахален эпоксид. Впервые в данном виде идентифицированы: транс-кадина-1,4-диен, у-химахален, Р-куркумен, кадален, ди-эпи-а-кедрен-(1), химахолен эпоксид, 1-эпи-кубенол, хелифолен, а-кедрен, транс-а-бергамотол, хамазулен, азулен. Методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ вдентифицированы 9 веществ фенольной природы: лютеолин, рутин, гиперозид, кверцетин, апигенин, кемпферол, феруловая, хлорогеновая, кофейная кислоты и определено их количественное содержание. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы флавоноидов в траве дубровника белого в пересчете на лютеолин и проведена ее валидация.

2. Определены основные внешние признаки и морфоло-анатомические

характеристики нового вида сырья - травы дубровника белого (цельное,

измельченное, порошок). Выявлена и охарактеризована совокупность

микроскопических признаков необходимых для идентификации сырья -

«Дубровника белого трава». Установлены основные числовые показатели,

характеризующие качество сырья: содержание эфирного масла (не менее

0,2%), сумма флавоноидов в пересчете на лютеолин (не менее 1,1%),

содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 70% спиртом этиловым (не

менее 24%), влажность, зола общая, зола, нерастворимая в 10% растворе

20

кислоты ' хлористоводородной, содержание органической' примеси, минеральной примеси, содержание частиц изменивших окраску и других частей, не соответствующих описанию.

3. Для оптимизации сроков заготовки травы дубровника белого проведено изучение динамики накопления основных БАВ (эфирное масло и флавоноиды) по фазам вегетации. Установлено, что наибольшее содержание эфирного масла и флавоноидов наблюдается в фазу цветения, что и послужило основанием рекомендовать ее для заготовки сырья.

4. В результате проведенных ресурсоведческих исследований установлены типичные местообитания дубровника белого и ценопопуляции, пригодные для промысловых заготовок сырья. На территории 3-х районов Ставропольского края (Георгиевском, Советском и Буденновском) определены эксплуатационные запасы травы дубровника белого, рассчитан объём возможных ежегодных заготовок.

5. Результаты определения острой токсичности извлечений из травы дубровника белого позволили отнести их по классификации Н.С. Hodge и L.H. Sterner к практически нетоксичным веществам (водное извлечение) и к малотоксичным веществам (спиртовое извлечение). Экспериментально подтверждено их диуретическое и антимикробное действие.

6. Разработаны проекты нормативных документов - ФСП «Дубровника белого трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы дубровника белого». Полученные результаты могут служить предварительным

экспериментальным обоснованием перспективности использования данного вида сырья для разработки отечественных лечебно-профилактических средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рудакова, Ю.Г. Химический состав травы дубровника белого Teucrium polium L. [Электронный ресурс] / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 5.-Режим доступа: http://www.science-education.ru/lll-10725 (дата обращения: 10.11.2013).

2. Рудакова, Ю.Г. Изучение фенольных соединений травы дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова, С.П. Сенченко, О.И. Попова // Вопросы биол., мед. и фармац. химии.- 2014,- №3,- С.34-37.

3. Рудакова, Ю.Г. Биологическая активность Teucrium polium (Lamiaceae) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова//Раст. ресурсы,- 2014.-Вып.2.-С.307-315.

4. Рудакова, Ю.Г. Онтогенетическая структура ценопопуляций дубровника белого (Teucrium polium L.) в Ставропольском крае / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Вопросы биол., мед. и фармац. химии.- 2014.-№4.-С.62-63.

5. Рудакова, Ю.Г. Содержание дубильных веществ в траве Teucrium polium L. (Lamiaceae) и антиоксидантная активность ее извлечения / Ю.Г. Рудакова, А.Б. Дмитриев, О.И. Попова // Химия растительного сырья,- 2014.-№1,- С.203-207.

6. Рудакова, Ю.Г. Морфолога - анатомическое изучение травы дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Вопросы биол., мед. и фармац. химии.- 2014 -№ 6.-С.27-30.

7. Рудакова, Ю.Г. Элементный состав травы дубровника белого (Teucrium polium L.) [Электронный ресурс] / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №6,- Режим доступа: http://www.science-education.ru/120-16108 (дата обращения: 26.12.2014).

8. Рудакова, Ю.Г. Определение иридоидов в траве Teucrium polium (Lamiaceae) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Растит, ресурсы,- 2015.- Т.51, №1.- С.100-105.

9. Изучение биологической активности травы дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова, Е.О. Сергеева, JI.A. Саджая [и др.] // Вопросы биол., мед. и фармац. химии,-2015,- №1,- С. 9-13.

10. Рудакова, Ю.Г. Результаты хроматографического исследования некоторых фенольных соединений травы дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр -Пятигорск, 2013. - Вып. 68.-С.89-91.

П.Рудакова, Ю.Г. Определение дубильных веществ в траве дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: материалы Всеросс. науч.-практ. конф,- Владикавказ, 2013,- С. 170-175.

12. Рудакова, Ю.Г. Определение товароведческих показателей травы дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Наука и устойчивое развитие: материалы VII Всерос. конф. молодых ученых. - Нальчик, 2013. - С. 107-108.

13. Рудакова, Ю.Г. Количественное определение флавоноидов в траве Teucrium polium L. / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: материалы IV Междунар. науч.-практ. конференции. - Владикавказ, 2013.-С. 267-268.

14. Рудакова, Ю.Г. Определение экстрактивных веществ в траве дубровника белого (Teucrium polium L.) / Ю.Г. Рудакова // Санкт-Петербургские научные чтения - 2013: тез. докл. V Междунар. молодежный медицинский конгр,- СПб, 2013.-С.360.

15. Фармацевтические аспекты сохранения и укрепления здоровья населения на основе фитотерапии / И.В. Попов, Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.-2013.- Т.15.- №3(6).-С.1911-1913.

16. Эколого-фитохимическое исследование сырья растений семейства Lamiaceae / О.И. Попова, Ю.Г. Рудакова, И.В. Попов [и др.] // Человек и лекарство: тез. докл. XXI Рос. нац конгр -М., 2013.-С.311.

П.Рудакова, Ю.Г. Содержание хлорофилла по фазам вегетации в траве дубровника белого (Теиспит роНит Ь.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2014. - Вып. 69.-С.71-73.

18. Рудакова, Ю.Г. Современные подходы к выбору экстрагента для рационального использования травы дубровника белого (Теиспит роНит Ь.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Вестник ВолгГМУ: приложение (материалы V Всеросс. науч.-практ. семинара молодых ученых с междунар. участием «Геномные и протеомные технологии при создании лекарственных средств»).- Волгоград, 2014,- С.113-114.

19. Рудакова, Ю.Г. Распространение и запасы дубровника белого (Теиспит роНит Ь.) в Ставропольском крае / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова, А.И. Медвецкий // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: материалы IV Всеросс. науч.-прак. конф,-Сев.-Осет., 2014.-С.200-204.

20. Рудакова, Ю.Г. Разработка отечественного препарата на основе травы дубровника белого для лечения инфекций мочевыводящих путей / Ю.Г. Рудакова // Инновационные идеи молодежи Ставропольского края - развитию экономики России: сб. материалов Всеросс. науч.-прак. конф. Ставрополь, 2014.-С.68-70.

21. Рудакова, Ю.Г. Определение тритерпеновых соединений в траве дубровника белого (Теиспит роНит Ь.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Молодая фармация - потенциал будущего: материалы IV Всеросс. научн. конф. с междунар. участием,- СПб., 2014,- С.534-537.

22. Рудакова, Ю.Г. Аминокислотный состав травы дубровника белого (Теиспит роНит Ь.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Успехи современного естествознания.- 2014.- №8.-С. 160161.

23. Рудакова, Ю.Г. Определение органических кислот в траве дубровника белого (Теиспит роИит Ь.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Проблемы фармацевтической науки и практики: материалы IV Междунар. науч.-практ. конференции с междунар. участием. Сев.-Осет. гос. ун-т им. К.Л. Хетагурова - Владикавказ, 2014,- С. 76-79.

24. Рудакова, Ю.Г. Изучение антимикробного действия извлечений из травы Теиспит роНит ,Ь. (Ьапиасеае) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Папаяни, О.И. Попова // Фармация и фармакология.-2014.- №3(4).-С.41-43.

25. Рудакова, Ю.Г. Биология прорастания семян дубровника белого (Теиспит роНит Ь.) / Ю.Г. Рудакова, О.И. Попова // Молодые ученые и фармация XXI века: сб. науч. тр., второй науч.-прак. конф. с междунар. участием.-М., 2014.- С.34-36.

РУДАКОВА ЮЛИЯ ГЕОРГИЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДУБРОВНИКА БЕЛОГО (TEUCRIUM POLIUM L.) ФЛОРЫ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « 07 » июля 2015 г. Формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 293

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ

Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)