Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия раково - тестикулярных генов у больных колоректальным раком

На пртахрукописи

ГОЛЫШКО ПАВЕЛ ВИКТОРОВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО - ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ

Специальность: 14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

-8 ИЮЛ 2015

005570420

МОСКВА-2015

005570420

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» (директор — академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Давыдов Михаил Иванович).

Научные руководители: доктор медицинских наук кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Голенков Анатолий Константинович — доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО Московского областного научно-исследовательского клинического института имени М.Ф. Владимирского.

Петерсон Сергей Борисович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой онкологии и лучевой терапии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Степанова Евгения Владиславовна Новиков Дмитрий Викторович

Ведущее научное учреждение:

Ведущее учреждение — МНИОИ им. П.А. Герцена — филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России.

Защита диссертации состоится « 2015 г. в/^часов на заседании

диссертационного Совета Д. 001.017.02. ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, Д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина».

Автореферат разослан f^S 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор L ^-Барсуков Юрий Андреевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Колоректальный рак включает рак ободочной и прямой кишки. Эта нозология устойчиво занимает 3-е место в структуре заболеваемости и смертности в мире. Прогноз заболевания и выживаемость больных напрямую связаны со стадией в момент установления диагноза. В 2012 г было 34 238 тыс. новых случаев рака ободочной кишки, прирост за 5 лет у мужчин - 11,3 %, женщин - 11 %. В 70 % случаев опухоль поражает сигмовидную и слепую кишку. По гистологическому типу рак ободочной кишки в 80 % представлен аденокарциномой разной степени дифференцировки. Рак прямой кишки составляет 20 — 25 % всех злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта, а по темпам прироста заболеваемости вышел на 1-е место в большинстве развитых стран. В России в 2012 г. выявлено 26 316 вновь заболевших, прирост за 5 лет у мужчин 10,6 %, а у женщин - 9,4 %. По гистологическому строению рак прямой кишки чаще всего является аденокарциномой.

Колоректальный рак — это иммуногенная опухоль. Опухолевые клетки экспрессируют большое количество опухоль-ассоциированных антигенов, против которых развивается клеточный и гуморальный иммунные ответы. Среди них особое место занимают раково-тестикулярные антигены (РТА), кодируемые уникальными генами, преимущественно экспрессироваными в человеческих терминальных клетках и которые отсутствуют в соматических тканях взрослого человека. РТА становятся ненормально экспрессированы в различных опухолевых тканях. Продукты раково-тестикулярных генов (РТГ) являются многообещающими антигенами для развития Т-клеточного и гуморального иммунного ответа. В литературе сообщается о более чем 150 генов, кодирующих РТА. Примерно 30 членов семейства этих генов локализованы в Х-хромосоме.

РТА экспрессированы при раке яичника, мочевого пузыря, синовиальной саркоме, легкого, меланоме и раке молочной железы. Частота

3

экспрессии СТА сильно варьирует среди различных типов опухолей. Меланома, рак яичника, множественная миелома и рак легкого имеют высокую частоту экспрессии РТА. Лейкозы, лимфомы почки, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы имеют низкую частоту экспрессии РТА. Результаты исследования корреляции между экспрессией РТА и клинико-патологическими характеристиками различаются при различных типах опухолей. Продемонстрирована связь экспрессии РТА с размером опухоли, стадией заболевания и плохим клиническим прогнозом. Однако, в литературе представлено мало сведений об экспрессии раково-тестикулярных генов и их антигенов при колоректальном раке.

Цель исследования

Изучение экспрессии мРНК раково-тестикулярных генов в образцах опухоли и периферической крови больных колоректальным раком.

Задачи исследования

1. Изучение экспрессии в образцах опухоли и периферической крови больных колоректальным раком матричной РНК 20 наименований раково-тестикулярных генов: мРНК шести наименований генов семейства MAGEA - MAGE-AÏ, MAGE-A2 MAGE-A3 MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6; восьми генов семейства GAGE (GAGE 1-8), мРНК трех генов семейства S SX (SSX1, SSX2, SSX4), мРНК генов XAGE, NY-ES01 и мРНК гена MAGE-C1.

2. Провести анализ частоты экспрессии мРНК РТА генов в зависимости от степени морфологической дифференцировки опухоли, стадии заболевания, размера опухоли.

3. Определить наличие мРНК СТА генов в крови до и после удаления опухоли.

Научная новизна

Впервые изучена экспрессия раково-тестикулярных генов в периферической крови больных колоректальным раком. Впервые проведено сравнение экспрессия мРНК 20 раково-тестикулярных генов в образцах опухоли больных колоректальным раком и периферической крови. Обнаружена гетерогенность экспрессии генов РТА в опухоли. Обнаружена зависимость частоты экспрессии генов РТА от размера опухоли, стадии заболевания и морфологической дифференцировкой опухоли. мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 более часто определяются при высокодифференцированной аденокарциноме, тогда как мРНК MAGE-A1-6 и SSX1,2,4 генов чаще выявляются в низкодифференцированных аденокарциномах.

Научно-практическая значимость

Экспрессия раково-тестикулярных генов при колоректальном раке может быть использована при разработке противоопухолевых вакцин. Выявление мРНК раково-тестикулярных генов можно использовать в качестве мониторинговых тестов. Так наличие в крови больного колоректальным раком мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 может быть потенциальным маркером более благоприятного течения заболевания. В то же время, мРНК MAGE-A1-6 и S SX 1,2,4 генов могут свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе.

Апробация диссертационной работы

Апробация диссертационной работы состоялось 13 марта 2015 года на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории рекомбинантных опухолевых антигенов, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории биомедицинских исследований,

5

лаборатории трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ имени H.H. Блохина».

Материалы диссертационной работы были представлены на научной конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2015.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 121 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», выводов и списка литературы. Указатель литературы состоит из 205 источников, из которых 38 отечественных и 167 иностранных. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

Диссертация выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей (заведующий — доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников) ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для определения частоты встречаемости мРНК MAGE-Al-6, MAGE-C1,

GAGE 1-8, SSX1,2,4, NY-ESO-1, и XAGE1 генов использовали 98 образцов

периферической крови и опухоли больных колоректальным раком. Средний

возраст пациентов составил 64±9 лет. Постановка диагноза проводилась на

основании клинического, морфологического, эндоскопического,

рентгенологического обследования и по результатам оперативного

вмешательства. Забор крови у больных колоректальным раком производили в

2 этапа: до операции и на 5-7 сутки после. Образцы опухоли объемом 1 мм3

были взяты во время операции. Контрольную группу составили 30 образцов

периферической крови, взятой у клинических здоровых людей - доноров

6

крови. Реакцию ПЦР обратной транскрипции определяли по стандартной методике. Последовательность использованных праймеров приведена в таблице 1. Синтез праймеров осуществляли в ООО НПФ "Литех" (Россия).

Таблица 1

Праймеры для выявления раково-тестнкулярных антигенов

Название Первичная структура (5'- 3')

1т-2Р1 5 '-АОАОСССССТОСГГСАОТТС-З'

№"2-3111 5' -ТСТвС АвС АвТС АОТСОО АТ-3'

№1-2Р2 5 '-ССТОСГгеАОТТСТЛССТСО-З •

№2-3112 5'-ОСАетСАСТСООАТАетСАО-3'

ОР1 5'-АТТёёЁССТАТеСёёСССеА-3'

РР1 5 '-СЁТА8ЛССААТёАТСТАТ8Т-3'

ОРЮ 5'-ТССААСАУА82АёСАеССТё-3' (У = Тили С)

вРР2 5'-А§САТСТеСАе8ТСААёёёС-3' (Э = в или С)

ОР112 5 '-gCAATCACAgYSgTTAAAAgA-3'

88X1-2Р1 5'-САОААОАТССААААООССТТ-3'

88X4-514 5'- TTCTГgggCATgATCTTCgg-3'

8ЭХ2-ЗР2 5'-АССССАТОАСТАААСТАООТ-3'

88X3-4112 5'-ТСТОАООАСОТТСААССТСА-3'

ХР1 5' -СТАСТёАёАС АСё§СёёАС А-3'

ХЯ1 5'-ГГё 1' ПСА8С^ТСТТСАТ-3'

ХР2 5' - АТАС AgCTgAgATCC С AgTg-3'

ХЛ2 5'- TTgTggTTgCTCTTCACCTg-3'

СТР1 5 '-CCTATCCAgTCTTCAAggTg-3

СТЮ 5'-САё§АСААСТСТёАё2АСТС-3'

СТР2 5'-AgTgCCAggAgTCAAggTTC-3'

СТЯ2 5 '-gCATATCCTTgTCCCCCATg-3

ММЯР1 5 '-CTgAAggAgAAgATCTgCC-3'

5'- CACACTCAgCTCCTCCCAgA-3'

Ма§е-Р 5'- AgAAgATCTgCCWgTgggTC-3' = А или Т

Ма§е-К2 5'- gTgCTTggCCCCTCCTCTTC-3'

Гнездовую ПЦР проводили в два раунда, с использованием разных наборов праймеров, специфичных для мРНК каждого из тестированных генов. В микроцентрифужную пробирку «Eppendorf» объёмом 0.5 мл вносили 2.5 мкл десятикратного (10х) буферного раствора для Taq-полимеразы, 2.0 мкл 8 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (НПФ «Литех», Россия), 2.5 мкл смеси прямых и обратных праймеров следующего состава: MMRP1 и MAGE-Rl; NY-R1 и NY-Fl; GP-Rl, P-F1 и G-Fl; CT7-R1 и CT7-F1; X-R1 и X-Fl; SSX4-5R1 и SSX1-2F1, 0.5 мкл раствора Taq-полимеразы в буфере для хранения (5 единиц активности в мкл), 15,5 мкл деионизованной воды и 2 мкл кДНК, полученной в результате проведения реакции обратной транскрипции. Реакционную смесь перемешивали, центрифугировали на вортекс-центрифуге «СМ 70 М-07 Sky Line» (ELMI, Латвия) и покрывали 1-2 каплями минерального масла (ICN Biomedicals, США). Затем проводили 35 циклов амплификации по следующей программе: 94°С - 30", 55°С - 30", 72°С - 30".

Второй раунд гнездовой ПЦР проводили раздельно для каждого из раково-тестикулярных генов. В реакционную смесь вносили 2,5 мкл десятикратного (10х) буферного раствора для Taq-полимеразы, 2,0 мкл 8 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (НПФ «Литех», Россия), 1 мкл смеси прямых и обратных праймеров, индивидуальных для каждого гена, 0,5 мкл раствора Taq-полимеразы, 17 мкл деионизованной воды и 2 мкл смеси, полученной при проведении первого раунда ПЦР. Перемешивали с помощью вортекса «REAX top» (Heidolph, Германия), центрифугировали и покрывали 1-2 каплями минерального масла. Затем проводили 30 циклов амплификации по следующей программе: 94°С - 30", 60°С - 30", 72°С - 30". Использовали амплификатор Терцик-2. Регистрацию результатов реакции проводили с помощью гель-электрофореза в 2 %-ной агарозе. ДНК визуализировали при длине волны 254 нм и документировали с использованием системы обработки изображений «ViTran» («Биоком», Москва).

Для подтверждения полученных результатов и оценки специфичности реакции определяли нуклеотидную последовательность полученных фрагментов кДНК. Полученную кДНК эллюировали из геля и использовали в реакции терминирования дидезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными флюоресцентными красителями. Результаты реакции регистрировали в автоматическом режиме с использованием секвенатора ABI Prism 3130.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Частота встречаемости мРНК раково-тестикулярных генов (РТГ) у больных колоректальным раком

Было изучено наличие в крови и образцах опухоли 98 больных колоректальным раком матричной РНК 20 наименований РТГ. Среди них было мРНК шести наименований генов семейства MAGEA - MAGE-A1, MAGE-A2 MAGE-A3 MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6 - определяемых одновременно с помощью метода, позволяющего выявлять общую для всех шести генов нуклеотидную последовательность мРНК; мРНК восьми генов семейства GAGE (GAGE 1-8), также одновременно определяемых по общей для всех нуклеотидной последовательности, мРНК трех генов семейства SSX (SSX1, SSX2, SSX4), мРНК генов XAGE1, NY-ESOl и MAGE-C1.

Суммарная частота обнаружения мРНК РТГ GAGE 1-8, NY-ESOl, SSX1, 2, 4, MAGEC1, XAGEla и b, MAGEA 1-6 в образцах опухолевых очагов составила 86 %. В периферической крови тех же пациентов до проведения операции суммарная частота обнаружения исследуемых мРНК составила 80%. После проведения операции количество положительных образцов периферической крови у тех же пациентов возросло до 90 % (Рис.1).

-—B-Serieslj-KpeBb-до операции;

^ Seriesl; —Опухолевый очаг; 86

Рис. 1. Суммарная частота выявления мРНК РТГ в опухоли и периферической крови больных колоректальным раком до и после операции.

В крови больных колоректальным раком после операции выявлялось большее число наименований мРНК РТГ, чем до операции. До операции в периферической крови больных колоректальным раком преимущественно выявлялась мРНК одного из исследуемых генов, и ни разу не было выявлено 6-7 мРНК PIT одновременно. В периферической крови пациентов после операции преимущественно детектировалось 2-4, а в некоторых образцах 6-7 видов мРНК РТГ. В образцах опухоли также чаще всего регистрировалось 24 мРНК РТГ, и несколько образцов показали одновременное наличие 6-7 мРНК.

РТГ чаще всего в образцах опухоли выявлялись мРНК SSX1,2,4 и MAGE-A1-6 генов. Реже всего выявлялись мРНК NY-ESOl, GAGE 1-8 и PAGE1 генов (Табл. 2).

Таблица 2

Встречаемость мРНК РТГ в опухоли и периферической крови больных

колоректальным раком

мРНК Периферическая кровь до операции (п=98) Образцы опухоли (п=98) Периферическая кровь после операции (п=98)

GAGE 1-9 18% (18) 29% (28) 31% (30)

MAGEA1-6 33% (32) 55% (54) 35% (34)

MAGE-C1 25% (24) 10% (10) 21% (20)

XAGE1 29% (28) 33% (32) 29% (28)

SSX1,2,4 22% (22) 59% (58) 35% (34)

NY-ESO-I 14% (14) 33% (32) 12% (12)

мРНК не обнаружена 20% (20) 14% (14) 10% (10)

1 мРНК 41% (40) 14% (14) 33% (32)

2-4 мРНК 39% (41) 61% (60) 50% (48)

6-7 мРНК 0 10% (10) 7% (6)

Вероятно, при операции происходит попадание небольшого количества опухолевых клеток в кровяное русло, и за счет этого идет рост количества разновидностей мРНК РТГ, циркулирующих в периферической крови больных колоректальным раком.

Частота встречаемо™ мРНК раково-тестикулярных генов на разных стадиях заболевания

На первой стадии заболевания суммарная частота выявления мРНК РТГ как в периферической крови, взятой до, так и после операции, а также в образцах опухолевых очагов составила 78 % (14 из 18 образцов положительны).

Начиная со второй стадии заболевания, суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в образцах опухоли была выше, чем в образцах опухоли первой стадии (Рис. 2). Таким образом, частота обнаружения мРНК в опухоли возрастает со стадией колоректального рака.

1 2 3 4 Стадии

Рис. 2. Суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов на разных стадиях колоректального рака.

В то же время образцы периферической крови, взятые после операции, были чаще положительны, чем образцы тех же пациентов, взятые до операции. На второй стадии количество позитивных образцов периферической крови больных колоректальным раком, взятых после операции было даже выше, чем количество положительных образцов опухоли. В периферической крови, взятой после операции, как правило, мРНК РТГ выявлялась не реже, чем в образцах опухоли тех же пациентов.

12

Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов при опухолях разной степени дифференцировки

Проведен анализ частоты обнаружения мРНК РТГ в образцах периферической крови больных колоректальным раком до и после операции и в образцах опухоли при разной степени дифференцировки опухоли (Рис.3).

В образцах периферической крови до операции и в опухоли количество положительных проб было минимальным у пациентов с высокодифференцированной опухолью. У пациентов с низкодифференцированной аденокарциномой мРНК ОАОЕ1-8, КУ-ЕБСН, 88X1, 2, 4, МАОЕС1, ХАОЕ1, МАОЕА1-6 генов выявлялась в 100 % образцов. У пациентов с умеренно дифференцированной аденокарциномой экспрессия мРНК носила промежуточный характер.

■ опухоль

Е кровьдо операции

в кровьпосле операции

высоко умеренно низко

Рис. 3. Суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов при различной степени дифференцировки опухоли.

В образцах периферической крови, полученных после операции от пациентов с высокодифференцированной аденокарциномой, мРНК GAGE1-8, NY-ESOl, SSX1, 2, 4, MAGEC1, XAGE1, MAGEA1-6 генов были выявлены во всех случаях. При умеренной дифференцировке опухоли мРНК РТГ выявлялись только в 84 % протестированных образцов, а при низкодиферренцированной опухоли - в 100 % случаев. Различия статистически не значимы.

При высокодифференцированной аденокарциноме в крови больных до операции чаще выявлялись мРНК MAGE-C1 и XAGE1 - в 43 % и 43% протестированных образцов. При умерено дифференцированной аденокарциноме мРНК MAGE-C1 и XAGE1 выявлялась реже (21 % и 23 % случаев), при низкодифференцированной - в 21 % и 23 % протестированных образцов периферической крови больных колоректальным раком, соответственно (Табл. 3).

Таблица 3

Частота экспрессии мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 в крови

в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки MAGE-C1 XAGE1

Высоко- дифференцированная 43 % (42/98) 43 % (42/98)

Умеренно-дифференцированная 21 % (20/98) 23 % (22/98)

Низко- дифференцированная 21 % (20/98) 23 % (22/98)

Р1,2= 0,0013 Р1,3=0,0013 Р2,3= 0,8593 Р 1,2=0,003 8 Р1,3= 0,0038 Р2,3=0,8641

Таблица 4

Частота экспрессии мРНК генов МАСЕ-А1-6, САСЕ1-8 н 88X1,2,4 в крови в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки МАСЕ-А1-6 САСЕ1-8 88X1,2,4

Высоко- дифференцированная 29 % (28/98) 14 % (14/98) 14 % (14/98)

Умеренно- дифференцированная 31 % (30/98) 13 % (13/98) 18% (18/98)

Низко- дифференцированная 50 % (49/98) 25 % (24/98) 75 % (74/98)

Р1,2= 0,8757 Р1,3=0,0034 Р2,3= 0,0088 Р1,2= 1,0000 Р1,3=0,1039 Р2,3= 0,0680 Р1,2= 0,5621 Р1,3=0,0000 Р2,3= 0,0000

Для мРНК генов МАСЕ-А1-6, ОАОЕ1-8 и 88X1,2,4 в крови обнаруживалась обратная тенденция (Табл. 4). В крови у пациентов с высокодифференцированной аденокарциномой мРНК МАОЕ-А1-6, ОАОЕ1-8 и 88X1,2,4 выявлялась в 29 %, 14 % и 14 % случаев соответственно, при умеренно дифференцированной карциноме — в31%, 13% и 18% случаев, соответственно (Табл. 4). Максимально часто мРНК этих генов выявлялись в периферической крови больных колоректальным раком при низкодифференцированных опухолях, обладающих всеми характеристиками злокачественной опухоли в максимальной степени. Матричная мРНК генов МАОЕ-А1-6, ОАСЕ1-8 и 88X1,2,4 выявлялась в крови этих больных в 50 %, 25 % и 75 % протестированных образцов.

Матричная РНК МУ-Е80-1 выявлялась только в периферической крови пациентов с умеренно дифференцированной аденокарциномой (18 %

случаев). В крови пациентов с высоко- и низкодифференцированной аденокарциномой mPHKNY-ESOI не обнаруживалась.

В образцах опухоли мРНК MAGE-A1-6 реже всего выявлялась при высокодифференцированной аденокарциноме (50 %) (Табл. 5). При умеренно дифференцированной карциноме она обнаруживалась в 55 % случаев, при низкодифференцированной - в 75 % случаев (Табл. 5). Для мРНК SSX1,2,4 генов была показана обратная тенденция. При высокодифференцированной опухоли мРНК SSX1,2,4 генов была обнаружена в 67% образцов опухолевых очагов. При умеренно и низкодифференцированной опухоли - в 61 % и 50 % случаев, соответственно. Матричная РНК GAGE 1-8 детектировалась только при умеренно и низкодифференцированной опухоли (34 % и 25 % случаев, соответственно). При высокодифференцированной опухоли она не была выявлена ни в одном случае (0%).

Таблица 5

Частота экспрессии мРНК генов MAGE-A1-6, GAGE1-8 и SSX1,2,4 в

опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки MAGE-A1-6 GAGE1-8 SSX1,2,4

Высоко- дифференцированная 50 % (49/98) 0 % (0/98) 67 % (66/98)

Умеренно дифференцированная 55 % (54/98) 34 % (33/98) 61 % (60/98)

Низко- дифференцированная 75 % (74/98) 25 % (24/98) 50 % (49/98)

Р1,2= 0,5672 Р 1,3= 0,0004 Р2,3= 0,0044 Р1,2= 0,0000 Р1,3=0,0000 Р2,3= 0,2083 Р 1,2= 0,4561 Р1,3=0,1068 Р2,3= 0,4691

Матричная РНК MAGE-C1 выявлялась в опухоли только при умеренно дифференцированный опухолях (13 % случаев), мРНК XAGE1 определялась при высоко- и умеренно дифференцированной аденокарциноме в 50 и 29% случаев, соответственно (Табл. 6). В образцах опухоли мРНК гена NY-ESOl выявлялась на всех стадиях дифференцировки: в 17% случаев при высокодифференцированной аденокарциноме, в 37% случаев при умеренно дифференцированной опухоли и в 25% случаев при низкой степени дифференцировки (Табл.6).

Таблица 6

Частота экспрессии мРНК генов MAGE-CI, XAGE1 и NY-ESO-1 в опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки MAGE-C1 XAGE1 NY-ESO-1

Высоко- дифференцированная 0 % (0/98) 50 % (49/98) 17% (17/98)

Умеренно-дифференцированная 13 % (13/98) 29 % (32/98) 37 % (36/98)

Низко- дифференцированная 0 % (0/98) 0 % (0/98) 25 % (24/98)

Р1,2= 0,0006 Р2,3= 0,0006 Р1,2= 0,0203 Р1,3= 0,0000 Р2,3= 0,0000 Р1,2= 0,0038 Р 1,3= 0,2920 Р2,3= 0,0882

После операции в периферической крови пациентов с высокодифференцированной аденокарциномой чаще всего (57 % случаев) обнаруживалась мРНК ХАОЕ1. При умеренно и низкодифференцированных опухолях она выявлена в 18 и 25 % образцов соответственно. Так же часто (в 50% случаев) в периферической крови после операции у больных с

17

высокодифференцированной аденокарциномой выявлялись мРНК MAGE-Al-6, GAGE1-8. Матричные РНК SSX1,2,4, NY-ES01 и MAGEC1 выявлялись реже (в 33, 17 и 33% случаев соответственно). После операции мРНК генов MAGE-A1-6 и NY-ES01 в периферической крови не выявлялись при низкодифференцированной аденокарциноме. При умеренной степени злокачественного перерождения частота выявления таких мРНК составила 37 и 18 % соответственно (Табл. 6).

Частота выявления мРНК GAGE 1-8, SSX1,2,4 и MAGEC1 в периферической крови пациентов с умеренно дифференцированной аденокарциномой после операции составила 26, 34, и 18%, соответственно. При низкодифференцированной - 50, 50 и 25%, соответственно.

При опухоли со степенью инвазии Т1 мРНК GAGE1-8, NY-ESOl, SSX1, 2, 4, MAGEC1, XAGE1, MAGEA1-6 не выявлялись ни в образцах периферической крови больных, ни в образцах опухоли (Табл.7, Рис. 4). При опухоли со степенью инвазии Т2 суммарная частота выявления мРНК раково-тестикулярных генов составила 89 % для образцов опухоли, 78 % и 78% для образцов периферической крови до и после операции. При опухоли со степенью инвазии ТЗ частота выявления была обнаружена в 78 % образцов опухолевых очагов, в 84 % образцов периферической крови до операции и в 94 % образцов после резекции опухоли. При опухоли со степенью инвазии Т4 суммарная частота выявления мРНК раково-тестикулярных генов составила 95 % в образцах опухолевых очагов, 76 % - в образцах периферической крови до лечения и 90 % после удаления опухоли.

Таблица 7

Частота встречаемости мРНК раково-тестикулярных генов САСЕ1-8, КУ-Е801, 88X1, 2, 4, МАСЕС1, ХАСЕ1, МАСЕА1-6 в зависимости от степени инвазии стенки кишки опухолью

Степень Частота Частота Частота

инвазии стенки встречаемости в встречаемости встречаемости

кишки опухоли (%) в крови до в крови после

опухолью операции(%) операции (%)

Т1 0 (0/98) 0 (0/98) 0 (0/98)

Т2 89 (87/98) 78 (76//98) 78 (76/98)

ТЗ 78 (76/98) 84 (82/98) 94 (92/98)

Т4 95 (93/98) 76 (74/98) 90 (88/98)

Р 1,2= 0,0000 Р1,2= 0,0000 Р 1,2= 0,0000

Р1,3=0,0000 Р1,3= 0,0000 Р1,3=0,0000

Р Р1,4= 0,0000 Р1,4= 0,0000 Р1,4= 0,0000

Р2,3= 0,0563 Р2,3= 0,3663 Р2,3= 0,0022

Р2,4= 0,1921 Р2,4= 0,8662 Р2,4= 0,783

Р3,4= 0,0009 Р3,4= 0,2148 Р3,4= 0,2336

Рис. 4. Встречаемость мРНК раково-тестикулярных генов в зависимости от степени инвазии стенки кишки опухолью (Слева на право: Т1, Т2, ТЗ, Т4)

Экспрессия мРНК раково-тестикулярных генов при различной локализации опухолей. В доступной литературе отсутствуют данные о частоте встречаемости мРНК раково-тестикулярных генов в крови или опухоли при различной локализации опухоли. В соответствии с полученными нами данными в образцах опухолевых очагов суммарная встречаемость мРНК РТГ составила 78 % при локализации опухоли в ободочной кишке и 85 % при локализации опухоли в ректосигмоидном соединении. В 100 процентах случаев мРНК РТГ выявлялись в образцах опухолевых очагов, локализованных в прямой кишке (Табл. 8, Рис. 5). Таким образом, частота экспрессии мРНК раково-тестикулярных антигенов при раке прямой кишки была выше, чем при других локализациях.

Таблица 8

Частота встречаемости раково-тестикулярных генов при различной локализации опухоли

Локализация Частота встречаемости (%)

Ободочная кишка 78

Ректосигмоидное соединение 85

Прямая кишка 89

В периферической крови, взятой у первичных пациентов до начала лечения, мРНК раково-тестикулярных генов выявлялись в 82%, 78% и 68% случаев при локализации в ободочной кишке, ректосигмоидном соединении и прямой кишке.

%

Ободочная ректосигмоидное Прямая соединение

Рис. 5. Суммарная встречаемость мРНК раково-тестикулярных генов при разной локализации опухоли.

¡8 опухоль

вкровьдо операции

Ш кровь после операции

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена гетерогенная экспрессия мРНК 20 раково-тестикулярных генов (РТГ) в образцах опухоли больных колоректальным раком.

2. мРНК раково-тестикулярных генов также определяется в периферической крови больных колоректальным раком. Частота экспрессии мРНК раково-тестикулярных генов в периферической крови увеличивается после оперативного удаления опухоли.

3. Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в опухоли и периферической крови возрастает со стадией заболевания.

4. Частота экспрессии мРНК раково-тестикулярных генов в опухоли и периферической крови зависит от дифференцировки опухоли: при высокодифференцированной опухоли экспрессия минимальная, а при низкодифференцированной - максимальная.

5. мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 в периферической крови более часто определяется при высокодифференцированной аденокарциноме, а мРНК MAGE-A1-6 и SSX1,2,4 генов чаще выявляются при низкодифференцированных аденокарциномах.

6. Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в опухоли и периферической крови возрастает с размером опухоли.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Голышко, П.В. Молекулярные мишени антиангиогенной терапии / П.В. Голышко // Российский биотерапевтический журнал. — 2014. —Т. 13, № 4. — С. 83-92.

2. Голышко, П.В. Раково-тестикулярные гены в крови и опухоли больных колоректальным раком / П.В. Голышко, Д.В. Новиков, C.B. Ананьев, К.А. Барышников, В.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. — 2015.-Т. 14, № 1.-С. 19-24.

3. Голышко, П.В. Липосомальная араноза не индуцирует аутофагию / Д.А. Афанасьева, М.А. Барышникова, Ю.А. Хоченкова, П.В. Голышко. Д.А. Хоченков, Е.В. Степанова, О.О. Рябая // Российский биотерапевтический 2015. — Т. 14, №1. — С. 15-18.

4. Голышко, П.В. Раково-тестикулярные гены у больных колоректальным раком / П.В. Голышко, B.C. Ананьев, К.А. Барышников, Д.В. Новиков, В.В.Новиков // Российский биотерапевтический журнал. — 2015. — Т.14, №1. - С.73.

5. Голышко, П.В. Иммуногенные раково-тестикулярные антигены и их гены при злокачественных новообразованиях / П.В. Голышко, C.B. Ананьев, К.А. Барышников, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал.-2015.-Т. 14, №2. С. 3-8.

Подписано в печать 14.04.15. Формат 60x84/16. Бумага офисная «Бу^оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 234. Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24