Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Экспериментальное обоснование применения дермального эквивалента в лечении ран

На правах рукописи

ПРОТАСОВ Михаил Викторович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ДЕРМАЛЬНОГО ЭКВИВАЛЕНТА В ЛЕЧЕНИИ РАН

14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□ОЗ175572

Санкт-Петербург 2007

003175572

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель доктор медицинских наук Галибин Олег Всеволодович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Васильев Сергей Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор Майстренко Николай Анатольевич

Ведущее учреждение ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Медицинская академия Постдипломного Образования»

Защита диссертации состоится «_»_2007 года в

«_» часов на заседании диссертационного совета Д 208.090 05 при

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (197089, Санкт-Петербург, улица Льва Толстого 6/8) в зале заседаний Ученого Совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «_»_2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Марина Олеговна Мясникова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема лечения длительно незаживающих ран остается значимой в хирургии и в настоящее время (Шумаков В И и др, 2002, Расулов M Ф , и др., 2003; Schultz G.S., et al., 2004). В течение последних 10 лет для улучшения результатов лечения длительно незаживающих ран применяют биотехнологические методы восстановления кожного покрова (Sabolinski M L, et al ,1996; Falanga V , Sabolinski M , 1999, Muhart M, et al., 1999, Шумаков В И и др , 2002; Расулов M Ф , и др, 2003, Marston W A et al, 2005), в частности, трансплантацию дермалыгого эквивалента (ДЭ) Дермальный эквивалент, состоит из культуры дермальных фибробластов, заключенных в гель из коллагена I типа В качестве одного из новых методов мониторинга течения раневого процесса может быть использована оценка динамики активности матриксных металлопротеиназ (ММП) - ферментов, ответственных за ремоделирование внеклеточного матрикса (ВКМ), в течение раневого процесса (Wysocki А В , et al, 1993; Bullen Е С ,et al, 1995, Tarlton J F , et al, 1997; Wysocki А В., et al, 1999, Agren M.S., 1999, Marastschijski U, et al, 2002, Воронкина И В , 2003).

В изученной нами отечественной и зарубежной литературе не найдено работ, посвященных применению оценки протеолитической активности раневого отделяемого для прогнозирования результатов лечения длительно незаживающих ран.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является оптимизация лечения ран с использованием новых биотехнологических методов — трансплантации дермального эквивалента (ДЭ) в сочетании с расщепленным кожным лоскутом (РКЛ).

Задачи исследования:

1) Изучить результаты трансплантации дермального эквивалента (ДЭ) и его сочетания с расщепленным кожным лоскутом (РКЛ) на моделях длительно незаживающих ран

2) Сопоставить активности матриксных металлопротеиназ (ММП) и данные морфологического анализа состояния раны на моделях длительно незаживающих ран, в том числе после пересадки дермального эквивалента (ДЭ) и расщепленного кожного лоскута (РКЛ).

3) Сопоставить активности ММП и данные морфологического анализа состояния раны в I фазу раневого процесса в норме и при воздействии биологически активных веществ

Научная новизна

1) Выработаны подходы к оптимизации сроков трансплантации дермального эквивалента (ДЭ) в эксперименте.

2) Впервые использована оценка активности ММП для мониторинга и прогнозирования течения раневого процесса, в том числе при трансплантации дермального эквивалента (ДЭ) и расщепленного кожного лоскута (PKJI).

3) Разработаны модели ран у крыс, позволяющие изучать динамику протеолитической активности раневого отделяемого параллельно с гистологической оценкой тканей раны

4) Впервые изучено влияние белковых фракций жидкости регенерирующей морской звезды на течение раневого процесса в первые трое суток у млекопитающих in vivo.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1) Трансплантация ДЭ сокращает срок заживления ран в эксперименте

2) Трансплантация ДЭ после пересадки РКП улучшает результаты последней

3) Активность ММП-2 и ММП-9 раневого отделяемого является прогностическим показателем при пересадке ДЭ и РКП

4) Активность ММП-2 и ММП-9 взаимосвязана с морфологическим строением тканей раны на протяжении I фазы раневого процесса, как в норме, так и при воздействии на рану биологически активных веществ (белковых фракций жидкости регенерирующей морской звезды)

5) Активность ММП-2 и ММП-9 позволяет судить о процессах в длительно незаживающих ранах в эксперименте

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Результаты, полученные в представленной экспериментальной работе, имеют значение для дальнейшей разработки клинических подходов к оптимизации лечения ран с использованием биотехнологических методов На основании положений, изложенных в данной работе, могут быть разработаны клинические рекомендации по сочетанной трансплантации ДЭ и PKJI, клинико-лабораторные методы (оценка активности ММП-2 и ММП-9) мониторинга и прогнозирования лечения ран.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Автором работы лично поставлены все серии экспериментов на лабораторных животных и выполнена статистическая обработка полученных результатов. Морфологические исследования выполнены при консультативной поддержке сотрудников отдела патоморфологии Научно - исследовательского центра СПбГМУ им. акад И П Павлова

(Санкт-Петербург, ул Льва Толстого 6/8) Изучение активности ММП осуществлялось совместно с сотрудниками отдела клеточных культур Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург, пр Тихорецкй 4).

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры общей хирургии СПбГМУ им акад И П. Павлова (Санкт-Петербург, ул Льва Толстого 6/8), в научно-методические разработки отделов экспериментальной медицины и патоморфологии Научно-исследовательского центра СПбГМУ им акад. И П Павлова (Санкт-Петербург, ул Льва Толстого 6/8) № гос. регистрации темы 01 200.212876.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы и основные положения диссертации изложены на- III Международной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Санкт-Петербургский научный форум - 2003», Седьмой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 18 апреля, 2004), на Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 25 - 27 октября 2004); на IX Российском национальном конгрессе «Человек и здоровье» (Санкт-Петербург, 22 - 26 ноября, 2004), на VI научно-практической конференции с международным участием «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 1 - 3 декабря 2004), на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18 - 22 апреля 2005), на Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 7 -9 декабря 2005), на международной конференции «Актуальные проблемы термической травмы» (Санкт-Петербург, 20 - 22 июня 2006), на 16-й ежегодной конференции «Innovation in tissue repair from the lab to the patient» (Италия, Пиза, 13 - 16 сентября 2006); на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006)

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Текст диссертации включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение результатов эксперимента, обсуждение результатов, заключение, выводы и список цитируемой литературы Работа изложена на 158 страницах, иллюстрирована 51 рисунком и 16 таблицами, список литературы содержит 208 наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Количественное распределение животных по экспериментальным группам. Исследование проводилось на 120 белых беспородных крысах-самцах массой тела 200-250г

I. Для изучения динамики протеолитической активности раневого отделяемого в первую фазу течения раневого процесса использовалась модель раны с имплантацией ПХВ- камеры (всего 60 крыс) в каждой из ниже перечисленных групп срок наблюдения составлял 1,2 и 3 суток.

11 контрольная группа (введение в полость раны 0,9% раствора NaCl) (15 крыс);

12 1-я опытная группа (введение в полость раны белков целомической жидкости I группы -15 крыс),

13 2-я опытная группа (введение в полость раны белков целомической жидкости II группы - 15 крыс),

I.4 3-я опытная группа (введение в полость раны белков целомической жидкости III группы -15 крыс)

II. Изучение динамики протеолитической активности раневого отделяемого на модели неэпителизируемой раны (всего 40 крыс) срок наблюдения в каждой из групп составил 24 суток'

II. 1 контрольная группа (моделирование неэпителизируемой раны - 10 крыс),

112 1-я опытная группа (моделирование неэпителизируемой раны и трансплантация РКЛ на 9-е сутки -10 крыс);

113 2-я опытная группа (моделирование неэпителизируемой раны, трансплантация РКЛ на 9-е сутки и ДЭ на 12 сутки от создания модели -10 крыс),

II.4 3-я опытная группа (моделирование неэпителизируемой раны, трансплантация ДЭ на 6-е сутки и РКЛ на 9-е сутки - 10 крыс)

III. Изучение динамики протеолитической активности раневого отделяемого на модели раны с краевой эпителизацией (20 крыс) (срок наблюдения составил 15 суток)-

III 1. контрольная группа (моделирование раны - 10 крыс);

III 2 опытная группа (моделирование раны и трансплантация ДЭ на 6-е

сутки - 10 крыс)

1. Методики, использованные для изучения первой фазы раневого процесса

2.1. Моделирование раны с имплантацией ПХВ-камеры. В

асептических условиях, под наркозом, выполняли разрез длинной 2 см по паравертебральной линии в проекции костовертебрального угла В дне

раны выкраивали мышечный лоскут 2x0,7x0,5см В рану помещали ПХВ-камеру, представляющую фенестрированную трубку 2,0x0,5 см, кожу ушивали наглухо В контрольной группе в сформированную полость вводилось 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ШС1, в опытных - 0,5 мл раствора фракций целомической жидкости регенерирующей морской звезды Для гистологического исследования тканей раны на 1-е, 2-е и 3-е сутки после моделирования раны животных выводили из опыта Из материала дна и краев раны готовили гистологические препараты с окраской гематоксилин - эозином Раневое отделяемое аспирировали шприцом из полости ПХВ-камеры.

2.2. Получение белковых фракций целомической жидкости регенирирующей морской звезды. Получение белковых фракций целомической жидкости регенирирующей морской звезды осуществлялось в отделе клеточных культур института Цитологии РАН (зав отделом проф Пинаев Г П) Целомическую жидкости регенирирующей морской звезды центрифугировали для отделения целомоцитов и концентрировали, после чего проводили гель-фильтрацию Выделенные белки целомической жидкости морской звезды использовались в качестве биологически-активных веществ, влияющих на раневой процесс.

2.3. Оценка протеолитической активности раневого отделяемого. Обнаружение протеаз осуществлялась посредством зимографии проб раневого отделяемого Присутствие металлопротеиназ, расщепляющих желатин, определяли по наличию неокрашенных полос на геле Для количественного анализа содержания ММП-2 и ММП-9 гели сканировали, изображения обрабатывали с помощью программ (ЗиапиБсап

2.4. Морфологические исследования. На первом этапе морфологических исследований использовался описательный метод При этом оценивались изменения гистологических препаратов, характерные для тканей окружающих ПХВ-камеру На втором этапе применялись методы количественной морфологической оценки

3. Методики, использованные для изучения раневого процесса на модели неэпителизируемой раны

3.1. Моделирование неэпителизируемой раны. Крысам контрольной группы в асептических условиях под наркозом по паравертебральной линии в проекции костовертебрального угла формировали дефект кожи, подкожной клетчатки, поверхностной и собственной фасции круглой формы диаметром 13 мм Края кожи выворачивались и подшивались к верхнему краю силиконового кольца.

Поверх раны укладывали марлевый шарик и фиксировали перекрестным завязыванием свободных концов лигатур, фиксирующих силиконовое кольцо.

3.2. Пересадка расщепленного кожного лоскута (РКЛ). В первой, второй и третьей опытных группах на 9-е сутки от момента формирования раны производили пересадку РКЛ диаметром 2 мм и толщиной 0,3 мм, что соответствует уровню сосочкового слоя кожи. РКЛ фиксировали в центре раны двумя узловыми швами. Размеры РКЛ были меньше раневой поверхности

3.3. Получение и пересадка дермального эквивалента (ДЭ). Приготовление ДЭ осуществлялось в отделе клеточных культур института Цитологии РАН (зав. отделом проф. Пинаев Г.П). Культивирование фибробластов осуществлялось в питательной среде ОМЕМ с добавлением 10% фетальной сыворотки коров в течение 2-3 суток Во второй и третьей опытной группах трансплантация РКЛ дополнялась трансплантацией ДЭ на 12-е и 6-е сутки эксперимента соответственно ДЭ переносили на поверхность раны и расправляли по всей ее площади При переносе ДЭ укладывали на рану так, чтобы поверхность его, соприкасавшаяся с дном чашки Петри, прилежала к дну раны.

3.4. Сбор раневого отделяемого и выведение животных из опыта. Во всех группах перевязки осуществляли каждые трое суток (на 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 сутки эксперимента). Срок наблюдения составлял 24 суток в каждой группе Сбор раневого отделяемого с целью последующего его анализа на активность ММП осуществляли при каждой перевязке, перед трансплантацией РКЛ, ДЭ и выведении животных из опыта На 24-е сутки от момента моделирования раны животных всех групп выводили из опыта летальными дозами С02 Материал из дна раны фиксировали в 10% растворе формалина для последующего морфологического изучения.

4. Моделирование раны для изучения краевой эпителизации

В контрольной группе в асептических условиях, под эфирным наркозом, в проекции костовертебрального угла формировали дефект кожи и подкожной клетчатки круглой формы диаметром 20 мм Края раны подшивали к кольцу из полихлорвинила, таким образом, чтобы край кожи плотно прилегал к подлежащим тканям. Подшивание к краю раны кольца из ПХВ предотвращало контракцию краев раны, в результате чего заживление ее происходило только за счет пролиферации эпителия краев раны. В опытной группе на шестые сутки эксперимента выполняли трансплантацию ДЭ Раз в трое суток в обеих группах под наркозом

осуществлялись перевязки. При каждой перевязке, а также перед трансплантацией ДЭ, производился сбор раневого отделяемого для оценки активности ММП После выведения крыс из опыта на 15-е сутки от начала эксперимента, моделированную рану иссекали на всей площади, фиксировали в 10% растворе формалина, после чего измеряли площадь кожного дефекта

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение раневого процесса на модели раны с имплантацией ПХВ-камеры.

Анализ морфологических данных показал, что изменения в тканях раны у животных всех групп в течение первых двух суток соответствуют первой фазе раневого процесса, о чем свидетельствует преобладание воспалительных изменений, а к третьим суткам начинается переход во вторую фазу, что подтверждается формированием к этому сроку элементов грануляционной ткани Гистологические характеристики тканей раны на всех сроках наблюдения согласуются с данными литературы по морфологическим характеристикам раневого процесса у крыс Нами впервые описано влияние белковых фракций целомической жидкости морской звезды на течение раневого процесса у млекопитающих Показано, что три основные белковые фракции целомической жидкости регенерирующей морской звезды по разному изменяют течение раневого процесса На это указывают результаты описательного и количественного морфологического анализа тканей раны

Полученные результаты позволили нам использовать белки целомической жидкости морской звезды в качестве примера биологически-активных веществ разнонаправлено изменяющих течение раневого процесса

При изучений взаимосвязи активности ММП и гистологического состава тканей раны нами использовался корреляционный анализ Коэффициент корреляции (г) рассчитывался между средней активностью ММП-2 и ММП-9 и средним количеством гистологических элементов тканей раны в одном поле зрения для каждой группы Корреляционная связь считалась сильной при 0,70<г<0,90 (положительная связь) или -0,90< г <-0,70 (отрицательная связь), очень сильной, то есть близкой к функциональной - при г > 0,90 (положительная связь) или г < -0,90 (отрицательная связь) Значения коэффициента корреляции между активностью ММП и числом гистологических элементов тканей раны представлены в табл 1

Таблица 1

Коэффициенты корреляции между активностью ММП и числом гистологических элементов тканей раны_

Группа ММП Количество нейтрофилов Количество фибробластов Количество капилляров

Значение коэффициента корреляции

Контрольная группа ММП-2 -0,89 0,10 0,52

ММП-9 0,80 -0,85 0,54

Первая опытная группа ММП-2 0,59 -0,20 -0,86

ММП-9 0,94 -1,00 -0,73

Вторая опытная группа ММП-2 0,65 -0,59 -0,88

ММП-9 0,95 -0,53 -0,84

Третья опытная группа ММП-2 0,84 -0,96 -0,99

ММП-9 0,94 -0,37 -0,72

Из литературных источников известно, что основными продуцентами ММП-2 являются клетки мезенхимы в процессе их миграции (Wysocki А В et al., 1993, Pilcher В К. et al, 1997; Werb Z, 1997; Agren M S , 1999, Woessner F.J., Nagase H„ 2001)

Динамика активности ММП-2 значительно различается в контрольной и опытной группах В контрольной группе активность ММП-2 последовательно статистически значимо нарастала с первых по третьи сутки, что совпадает с данными других исследований Во всех опытных группах активность ММП-2 была наибольшей в первые сутки, а последующее снижение ее активности к третьим суткам было достоверным во второй и третьей опытных группах. Подобный вариант изменений активности ММП-2 в течение первых трех суток течения раневого процесса ранее не описан При этом в контрольной группе активность ММП-2 была статистически достоверно меньше, чем во всех опытных группах на протяжении первых и вторых суток, а к третьим не отличалась от активности в опытных группах

В эксперименте на животных введение белков целомической жидкости морской звезды изменяло миграционные свойства клеток мезенхимы, чем, вероятно, и обусловлены изменения в динамике активности ММП-2. В контрольной группе повышение активности ММП - 2 соответствует усилению миграции клеток из окружающих тканей к месту повреждения, что подтверждается нарастанием количества фибробластов и фибробластоподобных клеток и положительной корреляционной связью между этими показателями и активностью

ММП -2 В то же время в опытных группах выявлены отрицательные корреляционные связи между активностью ММП-2 и количеством капилляров, фибробластов и фибробластоподобных клеток в тканях раны. Такое несоответствие между результатами в контрольной и опытных группах может быть объяснено следующим образом В контрольной группе происходят нормальные процессы пролиферации и миграции фибробластов и ангиогенеза, что сопровождается относительно низкой активностью ММП-2 В опытных же группах под действием введенных белков к первым суткам количество фибробластов и фибробластоподобных клеток достигает уровня статистически значимо большего, чем в контроле на всех сроках наблюдения. Такое количество фибробластов и фибробластоподобных клеток может быть обусловлено лишь резким усилением процессов миграции в течение первых суток После накопления в тканях раны большого количества клеток мезенхимного ряда миграция их в рану прекращается, однако количество продолжает нарастать за счет пролиферации Замедление процессов миграции сопровождается снижением активности ММП-2 со вторых по третьи сутки В то же время процесс формирования капилляров отстает от активности в контрольной группе вплоть до третьих суток вследствие повышенной желатиназной активности, которая препятствует формированию структуры ВКМ Ангиогенезу также препятствует сохраняющаяся избыточная миграционная активность клеток. Таким образом, активность ММП-2 без стимуляции миграции и пролиферации положительно коррелирует с количеством фибробластов и фибробластоподобных клеток и капилляров, в то время как избыточная активность ММП-2, вследствие стимуляции процессов миграции клеток какими-либо факторами, имеет отрицательную корреляционную связь с количеством фибробластов и фибробластоподобных клеток и капилляров

ММП-9 присуща нейтрофилам, которые секретируют ее в процессе деструкции поврежденных тканей (ВсЬайёг С I, Ыаппеу Ь В., 1996) По данным корреляционного анализа, между интенсивностью нейтрофильной инфильтрации тканей и активностью ММП-9 во всех группах, на всех сроках наблюдения имеется сильная или очень сильная (близкая к функциональной) положительная связь Наличие же отрицательных корреляционных связей различной выраженности между активностью ММП-9 и количеством капилляров и фибробластов и фибробластоподобных клеток, на наш взгляд, обусловлено антагонизмом между процессами острого воспаления и репаративного гистогенеза (Кузин МИ, Костточенок БМ, под ред, 1990) Таким образом, мы полагаем, что активность ММП - 9 является значимым маркером

выраженности воспалительных явлений на протяжении всей первой и в начале второй фазы раневого процесса

2. Результаты, полученные на модели неэпителизируемой раны и их обсуждение

Для изучения результатов совместной пересадки РКП и ДЭ, а также изучения активности ММП при их применении нами выбрана модель неэпителизируемой раны (Горелик Ю.В , 1996) Гистологическая картина тканей раны к 3 суткам соответствовала времени перехода первой фазы раневого процесса во вторую, на что указывает появление в ране элементов незрелой грануляционной ткани Более поздние сроки, на которых осуществлялось изучение гистологических изменений тканей раны (6,9,24-е сутки), соответствуют второй фазе раневого процесса (Серов В В , Шехтер А Б 1981, Кузин М И , Костюченок Б М, под ред, 1990) Зрелая грануляционная ткань, имеющая полнослойную структуру, формировалась к 9-м суткам. На более позднем сроке (24-е сутки) строение грануляционной ткани дна раны характеризовалось преобладанием фиброзного слоя Это придает ей сходство с патоморфологической картиной длительно незаживающих ран и трофических язв у человека (Кузин М И , Костюченок Б М , под ред, 1990, Васютков В Я, Проценко Н В , 1993)

Пересадка РКЛ осуществлялась во всех опытных группах на зрелую грануляционную ткань на 9-е сутки после начала эксперимента Выбранные нами малые размеры пересаженного РКЛ (диаметр 2 мм) создавали неблагоприятные условия для его приживления, что воспроизводило клиническую ситуацию, когда размеры пересаживаемого РКЛ меньше размеров раны, или когда после пересадки РКЛ произошел его частичный лизис Перечисленные выше причины и обусловливали наблюдавшиеся у животных опытных групп случаи лизиса пересаженного РКЛ

В первой опытной группе, где выполнялась пересадка только РКЛ на 9-е сутки, лизис его наблюдался в 4 из 10 случаев Во второй и третьей опытных группах пересадка РКЛ сочеталась с пересадкой ДЭ Во второй опытной группе, где пересадка ДЭ на 12-е сутки следовала за пересадкой РКЛ на 9-е сутки, случаев лизиса последнего не наблюдалось Это свидетельствует о способности ДЭ, пересаженного после выполнения аутокожной пластики, улучшать ее результаты В то же время в третьей опытной группе, где пересадка ДЭ на 6-е сутки предшествовала пересадке РКЛ на 9-е сутки, лизис последнего наблюдался чаще, чем в первой опытной группе (в 6 из 10 случаев)

В литературе можно наИти данные о динамике ММП в раневом отделяемом в процессе заживления ран разного происхождения (Воронкина И.В. и др., 2003; 2004). Но в настоящее время отсутствуют сведения о влиянии пересадки РКЛ на активность ММП в раневом отделяемом, поэтому в настоящей работе впервые прослежена активность ММП после пересадки РКЛ.

Нами выявлено достоверное прогностическое значение активности ММП раневого отделяемого для результатов пересадки РКЛ, ранее не описанное в литературе (рис.1).

Рис. 1. Активность ММП-2 раневого отделяемого с девятых суток после моделирования раны у крыс опытных групп.

При изучении активности ММП-2 в опытных группах выявлено, что при ее активности в диапазоне 186,7±91,2 на момент пересадки РКЛ и в диапазоне через трое суток после его пересадки 174,7±72,6 случаев лизиса не наблюдалось. При повышенных значениях активности ММП-2 -399,2±25,5 в момент пересадки РКЛ и через трое суток после пересадки (337,3±34,б) - наблюдается его лизис. Также лизис РКЛ наблюдался и при более низких значениях ММП-2, чем у части крыс, у которых РЮ1 прижился. У этой части животных активность ММП-2 в раневом отделяемом составляла 50,8±25,1 на момент пересадки РКЛ и 54,8^24,1 через трое суток. Промежуточные значения активности ММП-2 соответствовали случаям, когда пересаженный РКЛ приживался, но его размеры к концу эксперимента (24-е сутки) были меньше исходного. Сведения о роли ММП-2 в процессах приживления РКЛ отсутствуют, но можно предположить, что эта протеаза, как и другие ММП, необходимы для перестройки ВКМ в зоне интеграции пересаженного РКЛ и дна раны. При этом избыточная активность ММП-2 не позволяет прижиться пересаженному РКЛ и способствует его лизису, в то время как низкие значения активности могут свидетельствовать о недостаточной миграции клеток, что препятствует связи пересаженного РКЛ с тканями дна раны.

Активность ММП-9 непосредственно перед пересадкой РКЛ и после нее также имеет прогностическое значение для его приживления

групп.

Как показывают результаты изучения активности ММП-9, во всех опытных группах у крыс с прижившимся РКЛ ее активность была статистически значимо выше, чем у крыс, у которых наблюдался лизис пересаженного РКЛ. Так, на 9-е сутки эксперимента непосредственно перед пересадкой РКЛ активность ММП-9 у крыс, у которых он прижился, составляла 750,931±290,663, на 12-е сутки эксперимента -786,449±302,483, а у крыс, у которых РКЛ лизировался, на 9-е сутки -542,289±374,120, на 12-е сутки - 585,043±259,362, различие статистически достоверно (р=0,021 и р=0,000004 соответственно) Это различие сохранялось до конца срока наблюдения (24-е сутки эксперимента) Промежуточные значения активности ММП-9 соответствовали случаям, когда пересаженный РКЛ приживался, но его размеры к концу эксперимента были меньше исходного

ММП-9 продуцируется нейтрофилами и кератиноцитами в процессе их миграции (БсЬаГГег СI, Ыаппеу Ь В , 1996) Ранее нами была показана близкая к функциональной корреляционная связь между активностью ММП-9 и количеством нейтрофилов в тканях раны. Более высокая активность ММП-9 на 9-е сутки у крыс с прижившимся РКЛ свидетельствует об активной санации дна раны нейтрофилами до его пересадки После пересадки РКЛ более высокая активность ММП-9 может быть обусловлена гибелью и резорбцией нейтрофилами небольшой части РКЛ, вследствие гого, что он до приживления к грануляционной ткани лишен кровоснабжения, а также появлением в ране кератиноцитов, продуцирующих ММП-9 в процессе миграции Дальнейшая повышенная активность ММП-9 у крыс с прижившимся РКЛ, может быть обусловлена

процессами перестройки тканей РКЛ и дна раны в месте их интеграции, так как в этом процессе принимают участие нейтрофилы, а также продукцией ММП-9 кератиноцитами пересаженного РКЛ в процессе их миграции

3. Результаты полученные на моделировании раны для изучения краевой эпителизации и их обсуждение

В изученной нами литературе не найдено модели раны у крыс, пригодной для избирательного изучения процессов краевой эпителизации Разработанная нами модель позволяет изучать процессы, происходящие в кожном крае раны, а также процессы, связанные с формированием и эволюцией грануляционной ткани на протяжении второй фазы раневого процесса.

В опытной группе к девятым суткам после моделирования раны увеличивалось количество серозного отделяемого. На 12 — 15-е сутки в опытной группе рана была более поверхностной, чем в контрольной группе Край раны в опытной группе к 12-м суткам становился пологим, что указывает на активную краевую эпителизацию, в то время как в контрольной группе у части крыс край кожи оставался подрытым И в контрольной, и в опытной группах наблюдалось статистически значимое уменьшение площади раны (р=0,0005 и р<0,000001 соответственно) от исходной (314,18мм2) При этом площадь раны в опытной группе была статистически значимо меньше (р=0,0001), чем в контрольной (рис 3)

1

250 200 150 ЮО 50 О

Плоиушь раны в опытной Пло1додь раны и контрольной группе группе

Рис 3 Площадь раны у крыс контрольной и опытной группы на 15-е сутки после моделирования раны

При световой микроскопии препаратов ран на 15-е сутки как в контрольной, так и в опытной группах грануляционная ткань дна раны

имела сходную структуру, характерную для указанного срока наблюдения (Серов В.В., Шехтер А Б , 1981) Отличием контрольной группы от опытной явилось большая выраженность фибринозно-лейкоцитарного слоя и различия в строении кожного края раны. В контрольной группе пласт эпидермиса, переходящий на раневую

поверхность, был меньшей протяженности, чем в опытной группе Перечисленные особенности ран у крыс опытной группы свидетельствуют об ускорении процессов образования грануляционной ткани и эпителизации после пересадки ДЭ.

В контрольной группе активность ММП-2 значимо не изменяется на протяжении всего срока наблюдения Активность ММП - 9 в контрольной группе статистически достоверно снижается к концу срока наблюдения, что обусловлено снижением количества нейтрофилов в тканях раны в процессе ее заживления. В опытной группе активность ММП-2 достоверно повышается после пересадки ДЭ к 9-м суткам и затем постепенно снижается. Это обусловлено активизацией процессов миграции клеток под действием продуцируемых фибробластами ДЭ цитокинов и факторов роста, а кроме того коллаген I типа и продукты его деградации также выступают в роли хемоатграктантов (РовйеЦпуайе А Е е1 а1, 1978, СеровВВ, Шехтер А Б, 1981, МапэЬпс^е.!. й а1, 1998, КасНсе М е1 а1, 1996, ЭаЬоЬшк! МЬ й а1,1996, Ра1аг^а V , БаЬоЬшк! М , 1999; МашЬпс^е е( а1„ 1999, МиКаП М е1а1 1999, СаЛН1 ег а1, 2002)

Активность ММП-9 в опытной группе до пересадки ДЭ также статистически достоверно не отличалась от контрольной группы, а после нее достоверно увеличивалась Повышение активности ММП-9 в опытной группе на третьи сутки после пересадки ДЭ обусловлено частичной резорбцией пересаженного ДЭ На более поздних сроках после пересадки ДЭ основным продуцентом ММП-9 были, вероятно, мигрирующие кератиноциты, а не нейтрофилы. Это подтверждается меньшей выраженностью нейтрофильной инфильтрации в поверхностных слоях ткани раны и значительно большей протяженностью новообразовавшегося эпидермиса

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте трансплантация дермального эквивалента ускоряет заживление раны посредством краевой эпителизации.

2 Трансплантация дермального эквивалента после пересадки расщепленного кожного лоскута улучшает результаты последней в эксперименте

3 Активность ММП-2 и ММП-9 раневого отделяемого значимо коррелирует с данными морфологического анализа тканей раны в I фазу раневого процесса и позволяет оценить процессы, происходящие в ране при воздействии на нее биологически активных веществ в эксперименте.

4 Активность ММП-2 и ММП-9 раневого отделяемого позволяет оценивать процессы, протекающие во II фазу раневого процесса на

экспериментальных моделях длительно не заживающих ран и является прогностическим критерием эффективности трансплантации дермального эквивалента и расщепленного кожного лоскута в эксперименте. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные позволяют рекомендовать использование ДЭ для клинических испытаний и внедрения в клиническую практику

2. Оценка активности ММП-2 и ММП-9 может быть рекомендована как метод лабораторного мониторинга течения раневого процесса в эксперименте и при дальнейшей разработке внедрена в клиническую практику

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1.Галибин О В., Воронкина ИВ, Прокопчук СН, Протасов М.В, Соловьева M А, Пинаев Г П Комплексная оценка течения раневого процесса на модели глубокой раны у крыс с имплантацией полихлорвиниловой камеры // Цитология — 2004 - Т 46, №12 - С 10731079.

2 Воронкина И В, Протасов M В., Галибин О В., Пинаев Г.П., Прокопчук С H, Соловьева M А Изучение влияния белковых фракций целомической жидкости регенерирующей морской звезды Asterias rubensHa зажвление ткани на модели глубокой раны у крыс // Цитология -2004 - Т 46, №10 - С. 904

3 Воронкина И В , Протасов M В , Соловьева M А , Смагина Л В , Юдинцева H M, Галибин О.В, Пинаев Г П Изучение активности матриксных металлопротеиназ (ММП) после пересадки дермального эквивалента на модели незаживающей раны у крыс // Цитология - 2006 -Т 48, №9 - С 750-751

4 Галибин О В , Протасов M В., Чиховская Ю В , Беляева И Г , Питкин M Р Исследование процессов роста костной и кожной тканей в пористом имплантате, предназначенном для крепления наружного протеза после ампутации конечности // Цитология 2007 - Т. 49, №4 - С 281-283

5 Протасов M В , Соловьева M А Модель глубокой раны с имплантацией полихлорвиниловой камеры для комплексной оценки течения раневого процесса // «Человек и его здоровье», тезисы докладов Седьмой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей - Издательство СП6ГЭТУ«ЛЭТИ»,- Санкт-Петербург -2004 - С 236-237

6 Galibin О V., Protasov M V, Chihovskaya J.V , Belyaeva I.G, Pitkin M Skm and bone integrated prosthetic technology III. An exposed implantation of a porous titanium mto the skin // Congress materials IX Russion national

congress "People and Halth" St Petersburg, Russia, November 22-26, 2004 -P. 210.

7 Протасов M В , Воронкина И В , Галибин О.В , Соловьева М А Изучение влияния белковых фракций целомической жидкостирегенерирующей морской звезды Asterias Rubens на течение раневого процесса на модели раны с имплантацией полихлорвиниловой камеры у крыс // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (18-22 апреля 2005 г., Москва). - Москва, 2005 - С 698

8 Протасов М В , Соловьева М А, Ковальчук Т С Изучение влияния белковых фракций целомической жидкости регенерирующей морской звезды Asterias Rubens на заживление ткани на модели глубокой раны у крыс // Вестник молодых ученых, приложение к серии «Науки о жизни, физиология и медицина» Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей - 14 -16 апреля 2005 г. - Санкт-Петербург. - 2005 - С. 95.

9. Галибин О В , Протасов М В , Соловьева М.А. Экспериментальное изучение влияния трансплантации дермального эквивалента на результаты пересадки расщепленного аутодермального лоскута. // В сб. научн работ. Современная многопрофильная клиническая больница. 135 лет со дня основания больницы Святого Георгия (1870 - 2005) - СПб , 2005 - С. 1617

10. Галибин О В , Протасов М В , Чиховская Ю В , Беляева И.Г, Питкин М Имплантация пористого титана в костную ткань- экспериментальное исследование // В сб. научн работ Современная многопрофильная клиническая больница. 135 лет со дня основания больницы Святого Георгия (1870 - 2005) - СПб , 2005 - С 18

11 Pitkin М , Raykhtsaum G , Galibin О V, Protasov М V , Chihovskaya J V , Belyaeva IG Skin and bone integrated prosthetic pylon A pilot animal study // Journal of Rehabilitation Research & Development (JRRD) - 2006 - Vol 43, № 4. - P 573-580

12 Protasov M V , Voronkina I.V, Solovieva M A, Smagina L V, Yudintseva N M, Galibin О V, Pinaev G P Method of wound healing rate evaluation during different treatment courses on chronic wound model on rats // Wound Rep Reg -2007 - Vol 15.-PA75

л

Лицензия ИД № 00597 от 15 12 99 подписано в печать 16 10 07 Уел печ л 1,25 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз Заказ 748/07 197022, Санкт-Петербург, ул Л Толстого 6-8 Издательство СПбГМУ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

До настоящего времени проблема лечения длительно незаживающих ран полностью не решена (Васютков В. Я., Проценко Н. В. 1993; Расулов М.Ф., и др., 2003; Шумаков В.И. и др., 2002; Schultz G.S., et al., 2004;). Одним из перспективных подходов к улучшению результатов лечения длительно незаживающих ран является использование биотехнологических методов восстановления кожного покрова (Sabolinski ML, et al., 1996; Falanga- V, Sabolinski M.,1 1999; Muhart M, et al., 1999; Шумаков В.И. и др., 2002; Расулов М.Ф., и др., 2003; Mirastschijski U. et al., 2004; Marston W.A. et al., 2005), в частности трансплантация дермального эквивалента (ДЭ). Дермальный эквивалент представляет собой культуру взрослых дермальных аллогенных фибробластов, заключенных в гель из коллагена I типа животного происхождения, по своей структуре моделирующий дерму.

Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению биотехнологических методов-лечения ран, нами не найдено исследований, посвященных сочетанию клеточной и тканевой трансплантации и пересадки расщепленного кожного лоскута (PKЛ).

Для широкого внедрения биотехнологических методов восстановления кожного покрова в клиническую практику требуется использование новых методик мониторинга раневого процесса при различных воздействиях на рану (Jones JE, Nelson ЕА., 2000). Основным лабораторным методом, предлагаемым для мониторинга состояния раны, является морфологический' (мазки-отпечатки и т.п.) (Кузин М.И., Костюченок Б.М., под ред., 1990), в то время как использование заместительной клеточной терапии требует более подробного изучения взаимоотношений клеточных элементов и внеклеточного матрикса на уровне тканевых ферментов и сигнальных молекул. Одним из новых методов мониторинга течения раневого процесса может быть оценка динамики активности матриксных металлопротеиназ

ММП) — ферментов, ответственных за ремоделирование внеклеточного матрикса, в течение раневого процесса (Wysocki А.В., et al., 1993; Bullen E.C.,et al., 1995; Tarlton J.F., et al., 1997; Wysocki A.B., et al., 1999; Agren M.S., 1999; Marastschijski U., et al., 2002; Воронкина И.В., 2003).

В изученной нами отечественной и зарубежной литературе не найдено работ, посвященных применению оценки протеолитической активности раневого отделяемого для прогнозирования результатов лечения длительно незаживающих ран.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является оптимизация лечения ран с использованием новых биотехнологических методов - трансплантации дермального эквивалента в сочетании с расщепленным кожным лоскутом.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1) Изучить результаты трансплантации дермального эквивалента и его сочетания с расщепленным кожным лоскутом на моделях длительно незаживающих ран.

2) Сопоставить активности матриксных металлопротеиназ (ММП) и данные морфологического анализа состояния раны на моделях длительно незаживающих ран, в том числе после пересадки дермального эквивалента и расщепленного кожного лоскута.

3) Сопоставить активности ММП и данные морфологического анализа состояния раны в I фазу раневого процесса в норме и при воздействии биологически активных веществ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1) Выработаны подходы к оптимизации сроков трансплантации дермального эквивалента в эксперименте.

2) Впервые использована оценка активности ММП для мониторинга и прогнозирования течения раневого процесса, в том числе при трансплантации дермального эквивалента и расщепленного кожного лоскута.

3) Разработаны модели ран у крыс, позволяющие изучать динамику протеолитической активности раневого отделяемого параллельно с гистологической оценкой тканей раны.

4) Впервые изучено влияние белковых фракций целомической жидкости регенерирующей морской звезды на течение раневого процесса в первые трое суток у млекопитающих in vivo.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1) Трансплантация дермального эквивалента сокращает срок заживления ран в эксперименте.

2) Трансплантация дермального эквивалента после пересадки расщепленного кожного лоскута улучшает результаты последней.

3) Активность ММП-2 и ММП-9 раневого отделяемого является прогностическим показателем при пересадке дермального эквивалента и расщепленного кожного лоскута.

4) Активность ММП-2 и ММП-9 взаимосвязана с морфологическим строением тканей раны на протяжении I фазы раневого процесса, как в норме, так и при воздействии на рану биологически активных веществ (белковых фракций целомической жидкости регенерирующей морской звезды).

5) Активность ММП-2 и ММП-9 позволяет судить о процессах в длительно незаживающих ранах в эксперименте.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Результаты, представленные в данной экспериментальной работе, имеют значимую1 практическую ценность для дальнейшей разработки клинических подходов к оптимизации лечения ран с использованием биотехнологических методов. На основании положений, изложенных в данной работе, могут быть разработаны клинические рекомендации по сочетанной трансплантации дермального эквивалента и расщепленного кожного лоскута, клинико-лабораторные методы (оценка активности ММП-2 и ММП-9) мониторинга и прогнозирования лечения ран в первую и вторую фазы раневого процесса.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры общей хирургии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова; в научно-методические разработки отделов экспериментальной медицины и патоморфологии научно-исследовательского центра СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова № гос. регистрации темы 01.200.212876.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы и основные положения диссертации изложены на: III Международной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Санкт-Петербургский научный форум — 2003»; Седьмой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 18 апреля, 2004); на Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 25 - 27 октября 2004); на IX Российском национальном конгрессе «Человек и здоровье» (Санкт-Петербург, 22 — 26 ноября, 2004); на VI научно-практической конференции с международным участием «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 1—3 декабря 2004); на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18 — 22 апреля 2005); на Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 7-9 декабря 2005); на международной конференции «Актуальные проблемы термической травмы» (Санкт-Петербург, 20 - 22 июня 2006); на 16-й ежегодной конференции «Innovation in tissue repair: from the lab to the patient» (Италия, Пиза, 13 — 16 сентября 2006); на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006).

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте трансплантация дермального эквивалента ускоряет заживление раны посредством краевой эпителизации.

2. Трансплантация дермального эквивалента после пересадки расщепленного кожного лоскута улучшает результаты последней в эксперименте.

3. Активность ММП-2 и ММП-9 раневого отделяемого значимо коррелирует с данными морфологического анализа тканей раны в I фазу раневого процесса и позволяет оценить процессы, происходящие в ране при воздействии на нее биологически активных веществ в эксперименте.

4. Активность ММП-2 и ММП-9 раневого отделяемого позволяет оценивать процессы, протекающие во II фазу раневого процесса на экспериментальных моделях длительно не заживающих ран и является прогностическим критерием эффективности трансплантации дермального эквивалента и расщепленного кожного лоскута в эксперименте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные позволяют рекомендовать использование дермального эквивалента для клинических испытаний и внедрения в клиническую практику.

2. Оценка активности ММП-2 и ММП-9 может быть рекомендована как метод лабораторного мониторинга течения раневого процесса в эксперименте и при дальнейшей разработке внедрена в клиническую практику.