Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Длительное культивирование Trichomonas vaginalis как медико-биологическая основа экспериментального изучения трихомониаза

На правах рукописи

Пляченко Дмитрий Анатольевич

ДЛИТЕЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Trichomonas vaginalis КАК МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ ТРИХОМОНИАЗА

14 00.46 ~ клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

доктор медицинских наук, член-корр. РАМН, профессор Глыбочко Петр Витальевич;

кандидат медицинских наук, доцент Софьин Василий Станиславович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Гладилин Геннадий Павлович;

доктор медицинских наук

профессор Пучиньян Даниил Миронович.

Ведущая организация: ФГУ Пензенский институт усовершенствования врачей.

Защита состоится «elf » Q$ 2007 г на заседании диссертационного совета К 208 094. 01 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012, Саратов, ул Большая Казачья, 112

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан _'О__ 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛ ЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Распространенной ошибкой является мнение о простейших как низкоорганизованных животных

Простейшие представляют собой особый уровень в эволюции эукариоти-ческих организмов, сочетающих организменную и клеточную природу Инвазии, вызываемые простейшими и гельминтами, в отличие от инфекций, имеют, несомненно, патогенетические, клинические и микро- экологические особенности. Это обстоятельство нельзя не учитывать при эпидемиологических и клинических наблюдениях за патологиями, обусловленными простейшими паразитами, особенно при диагностике данных заболеваний.

Одной из наиболее распространённых инвазий является мочеполовой три-хомониаз В мире трихомониазом ежегодно заболевает до 170 млн человек ( Межевигонова Е А с соавт, 2005).

Заболеваемость трихомониазом по Саратовской области остается стабильно высокой- от 298-340 на 100 тыс. населенияв 1994-1998 гг до 430-437 на 100 тыс населения в 2000 году

Общероссийский показатель составлял в 2000 г-317,бна100 тыс населения (СофьинВ С, 1999, УщС Р, Пронь Д А, 2001)

Хронический трихомониаз значительно чаще, чем прочие инфекции, передающиеся половым путем, вызывает тяжёлые патологии урогенитального тракта у мужчин - уретриты, простатиты, аденому предстательной железы (Глы-бочио П В. с соавт ,2001,0 Рейт, 1998)

Таким образом, трихомониаз - это серьезная медико-социальная проблема Наряду с вектором постоянного роста заболеваемости трихомониазом четко

прослеживается тенденция изменения клинической картины этого заболевания как у мужчин, так и у женщин, а также многочисленные артефакты лабораторной д иагностики (Михайлов А.В и соавт, 1999)

Преобладание вялотекущих, бессимптомных форм заболевания, сложных для диагностики, большинство авторов связываете нарушением естественного экологического равновесия микроорганизмов, которые поддерживают гомеос-таз внутренних органов и кожи человека, изменением биоценозов, снижением колонизационной резистентности слизистых, формированием сложных микробных ассоциаций, связанных в том числе и с коммерциализацией секса и нетрадиционными формами сексуальной жизни (Сабсай М.И и соавт, 1998; Михайлов А В, ГасановаХА, 1999, КираЕ Ф., 2000).

Морфология и физиология Trichomonas vaginalis, несмотря на небольшие размеры (7-10мк), довольно сложны Достаточно сказать, что геном уроге-нитальной трихомонады насчитывает 160 млн пар оснований ( у человека в 20 раз меньше). Весьма сложен и метаболизм трихомонад, являющихся гетеротрофными организмами с голозойным типом питания (Полянский Ю.И, 1968) Именно с этими таксономическими особенностями, скорее всего, связаны такие свойства трихомонад, как высокая изменчивость, полиморфность, мимикрия, весьма затрудняющие диагностику трихомониаза.

Биологические свойства трихомонады приобретают особое значение, если рассматривать влияние непосредственно на ее организм различных физических факторов, широко используемых ныне в физиотерапевтических методах лечения, и реабилитации больных трихомониазом.

Имеется достаточно большое количество исследований, посвящённых изучению влияния лазерного излучения, СВЧ- и КВЧ- излучений на организм человека н лабораторных животных, прокариотических микроорганизмов, но практически отсутствуют работы, которые преследовали бы цель изучить вли-

яние физических факторов непосредственно на клетки трихомонад в чистой культуре

Физиотерапевтические методы лечения, вероятно, изменяют морфологические и генетические свойства Trichomonas vaginalis, что может затруднить выявление её в организме больного руганными способами и методами ПЦР - диагностики Это, в свою очередь, влечет за собой постановку ложноотрицательных диагнозов при проверке эффективности лечения

Исходя из вышеизложенного, изучение влияния физических факторов (лазерного, СВЧ и КВЧ - излучений) на чистую многодневную культуру Trichomonas vaginalis представляет собой значительный научно-практический интерес

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение чистой культуры Trichomonas vaginalis на жидких средах различного состава в условиях как стационарного, так и проточного культивирования, и изучение влияния на неё лазерного, КВЧ- и СВЧ- излучений

Исходя из поставленной цели, решали следующие ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1 Модифицировать методы непрерывного культивирования Trichomonas vaginalis с целью получения чистой культуры

2 Изучить морфо-физиологические особенности Trichomonas vaginalis

в условиях непрерывного культивирования.

3 Исследовать влияние лазерного, КВЧ- и СВЧ- излучений различной интенсивности непосредственно на культуру Т vaginalis in vitro

НАУЧНАЯНОВШНА Разработаны модифицированные методы непрерывного, длительного культивирования Trichomonas vaginalis in vitro

Впервые изучены особенности морфофизиологии Trichomonas vaginalis в условиях непрерывного культивирования

Впервые проведены эксперименты по изучению воздействия низко- интенсивного лазерного СВЧ и КВЧ - излучений на культуру Trichomonas vaginalis ю vitro

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложенный модифицированный метод непрерывного культивирования Trichomonas vaginalis и изучение на его основе влияния лазерного СВЧ и КВЧ - излучений на организм простейшего является медико-биологической базой для разработки дальнейших методов лечения и диагностики трихомониаза.

На основании результатов изучения влияния широко используемых в лечении трихомониаза низкоинтенсивных лазерных СВЧ и КВЧ - излучений непосредственно на организм простейшего подготовлены научно-практические рекомендации по назначению физиотерапевтических мероприятий для лечения трихомониаза

Разработаны новые схемы алгоритма диагностики трихомониаза с применением как рутинных лабораторных методов, так и методов молекулярных исследований

ОСНОВНЬШ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1 Технология длительной культивации Trichomonas vaginalis существенно отличается от культивации прокариотических организмов

2, Чистая культура Trichomonas vaginalis может служить биологической моделью для дальнейшего изучения морфофизиологических особенностей этого простейшего и его патогенеза.

3 Воздействие на культуру трихомонады терапевтических доз лазерного, СВЧ- и КВЧ-излучений приводит к изменению фенотипа паразита и стимулирует его размножение, что необходимо учитывать при лечении больных

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были доложены и обсуждены на межрегиональной конференции дерматовенерологов ( Казань, 2005 г.); научно-практической конференции с международным участием «Частные вопросы дерматовенерологии» ( Саратов, 2006 г ); ассоциации врачей- лаборантов г.Саратова ( 2006 г.).

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ Разработанные методы лабораторной диагностики и используемые физиотерапевтические воздействия применяются в клинике кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава», Саратовском областном и городском кожно-венерологических диспансерах. Отдельные фрагменты работы внедрены в учебный процесс на кафедрах клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС, кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ

СТРУКТУРА И ОЕЬЕМДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав, включающих полученные результаты, обсуждение результатов, выводов, списка литературы, содержащего 144 источника, в том числе 110 отечественных и 34 иностранных Иллюстративный материал представлен 13 рисунками и 10 таблицами

МАТЕРИАЛ ЫИМЕТОДЫИСОЕДОВАНИЯ

Материал для исследований брали у пациентов клиники кожных и венерических болезней СГМУ и городского кожно-венерологического диспансера г Саратова с основным диагнозом - урогенитальный трихомониаз

Диагноз данным больным ставился на основании клинических данных и результатов микроскопии окрашенного мазка.

Техника взятия инокулята была стандартна и соответствовала регламентирующим инструкциям и приказам МЗ РФ Забор материала был произведён у 51 больного - 34 мужчин и 17 женщин в возрасте от 17 до 40 лет. Инокулят брали, как правило, до начала лечения или в самом его начале

Методы исследования Для стационарного длительного культивирования мы провели несколько серий опытов, в которых использовали среды различного состава и схемы пассажей.

В первой серии инокулят вводился в жидкую диагностическую среду "Уа^сии", произведенную в Финляндии Среда содержит белковый гидролизат, дрожжевой экстракт, мальтозу, цистеин, аскорбиновую кислоту, сыворотку крови овец, а также антибиотики для подавления сопутствующей патогенной микрофлоры. Культивирование проводилось в термостате при температуре 37оС. В этой серии посев был произведён материалом от 51 больного

Во второй серии опытов посев производился непосредственно в жидкую среду СДС-199. Данная среда очень широко применяется в микробиологических исследованиях. В данном случае использовался инокулят 10 больных, от которых материал уже засевали на среду "Уа§1сик".

В третьей серии инокулят первоначально засевался в среду "У^гаЛ". а на 3 - 7-й день культивирования, в случае положительной динамики роста, делали пересев на жидкую среду СДС -199 Использовали материал, взятый у 8 пациентов

Микроскопический анализ материала проводился ежедневно, начиная с третьего дня после посева, для чего изготавливались нативные препараты и препараты, окрашенные раствором метиленового синего

Анализ проводился на микроскопе Jenaval при увеличении 10x100 Микрофотографии сделаны с помощью цифровой камеры-окуляра для микроскопа Scopetek DCM35.

Подсчет клеток Tr. vaginalis осуществлялся в камере Горяева Чтобы препятствовать активному передвижению трихомонад, мы модифицировали технику подсчёта Затем производили расчет числа клеток на 1мл среды

Помимо стационарного культивирования как с пересевом, так и без пересева, мы провели серию опытов с проточным культивированием.

С этой целью использовалась установка каскадно-проточного культивирования с интерактивным управлением «Каскад» Прибор состоит из комплекса ферментёров, объемом 10 мл каждый, соединённый трубками и управляемый компьютером В связи с тем, что трихомонада является строгим анаэробом, нами внесены конструктивные изменения в установку, исключающие поступление кислорода в проток Кроме того, мы поместили в ферментёры субстраты и носители В качестве субстрата использовались культуры живых клеток, а носителями (покрытиями) - различные материалы - от традиционных - стекловолокна, керамики, желатина, - до современных- «Биокол» и «Фолидерм».

Такая модель ферментёров по типу турбидостата, имитирующего до известной степени мочеполовой тракт, дала возможность использовать её для длительного культивирования трихомонада на стандартных диагностических средах, а также провести ряд экспериментов по изучению воздействия на Trichomonas vaginalis лазерного, СВЧ- и КВЧ-излучений ю situ

Для выявления трихомонад в культивируемом материале, подвергнутом лазерному, КВЧ- и СВЧ- излучениям, использовалась параллельно ПЦР методика определения ДНК Тг Vaginalis.

Проточное культивирование проводилось в российско-японском биотехнологическом центре (г Москва) непосредственно при нашем участии ПЦР-

анализ осуществлялся в диагностическом центре «ДИ-центр» с любезного разрешения заведующего лабораторией Эдуарда Анатольевича Федотова, за что приносим ему глубокую благодарность

При проведении экспериментов по изучению влияния различного рода излучений на культуру Tr. vaginalis использовались широко применяемые физиотерапевтические аппараты: Явь -1, Луч -4, Узор-А-2К, «Атос»

Интенсивность, длина волны, а также экспозиция были те же самые, что и при физиотерапевтических процедурах при лечении больных урогенитальным трихомониазом

Облучение культур проводилось пятикратно на 2-е, 3-й, 4-е и 5-е и 7-е сутки культивации

Статистическая обработка материала Обработка полученных данных проводилась с помощью пакета программы Microsoft Excel ХР По каждой серии опытов указывались объёмы, средние арифметические значения и ошибки среднего, уровни значимости, проводился корреляционный анализ

РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЯ Инокуляционный материал 51 больного пациента, высеянный на диагностическую среду "Vagxcult", дал рост культуры в 35 случаях Придонный рост начинал наблюдаться через 48 часов, продолжался в среднем до 5-7-х суток, после чего прекращался, и культуры гибли на 12-20-е сутки культивации (рис. 1)

Несовпадение в 16 случаях клинических диагнозов, подтверждённых главным образом микроскопией окрашенного мазка с нашими результатами кулыу-ральных исследований, можно объяснить главным образом несовершенством микроскопического метода или «человеческим фактором»

Анализ как нативных, так и окрашенных препаратов трихомонад из культуры, проводили каждый день, было обнаружено, что большинство кле-

ток имело типичную грушевидную форму В нативном препарате трихомо-нады активно передвигались, у них были видны жгутики и ундулирующая мембрана. На окрашенных препаратах все трихомонады имели классическую грушевидную форму У них были видны четко окрашенные ядра и зернистая цитоплазма

Максимальное число клеток зарегистрировано на 5-е сутки культивирования Их количество увеличилось до 520 ООО в 1 мл. Затем их количество стало уменьшаться и на 7-е сутки достигло 151 ООО кл\мл. В течение всего времени культивирования трихомонады сохраняли типичную грушевидную форму и активную подвижность

Необходимо отметить наличие в культуральной среде значительного количества сопутствующей флоры и эпителиальных клеток, что существенно затрудняло идентификацию трихомонад При проведении пассажей в свежую среду количество этих элементов существенно уменьшалось

Посев инокупяционного материала на жидкую среду СДС -199 от 10 больных, чей материал уже использовался в первой серии, дал рост культуры в 7 случаях. При этом рост культуры не произошёл в том же случае, что и при посеве на среду " Vagicult" Это подтверждает высокие диагностические свойства данной среды, однако в отличие от первой серии рост культуры визуально заметен только через 72 часа, когда титр клеток достиг 750 ООО на 1 мл Рост культуры продолжался до 7 - 12- го дня На пике роста количество клеток составляло в среднем 1590000 на 1 мл среды. Фаза динамического равновесия длилась в среднем 5 дней, после чего титр клеток начинал уменьшаться, и культуры гибли в среднем на 30-35-й день культивации В отличие от посева на "Vagicult" посев на данную среду давал значительно меньше сопутствующей флоры и клеточных элементов, что позволяло лучше идентифицировать как типичные, так и атипичные формы трихомонад

Полученные в этой серии опытов данные послужили контролем к вариантам с облученными трихом он а дам и.

Результаты третьей серии опытов с пересевом материала со среды "на среду СДС-199 по динамике роста существенно не отличались от результатов второй серии, когда материал засевался непосредственно на среду СДС-199. Однако продолжительность фазы роста была несколько короче и составляла 5-7 дней, при этом количество клеток на 7-й день культивации достигало 2400000, что составляло статистически достоверную разницу с предыдущей серией (Р = 0,01). Жизнедеятельность культуры в этой серии поддерживалась без пересева до 30-35-го дня, как и в предыдущей серии. Количество сопутствующей микрофлоры и клеточных элементов было весьма незначительным.

Рис. 1. Данные кулъмуральногороста Tr.vagmalis на различных средах

Серия опытов с проточным культивированием показала, с одной стороны, высокую жизнестойкость трихомонады - культура существовала столько, сколько работал ферментёр По техническим и экономическим причинам сроки ферментации не превышали 3-4 недель Титр клеток при этом, начиная с третьего дня культивирования, составлял в среднем от 1000 ООО клеток до 5000000 в зависимости от вида субстрата и покрытия. Наиболее интенсивный рост типичных клеток происходил на живых клетках (фибробластах), «посаженных» на «Фолидерм». При этом методе культивации посторонняя флора практически отсутствовала.

ВЛИЯНИЕ ФИЗИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ДОЗ ЛАЗЕРНОГО, СВЧ- И КВЧ-ИЗЛУЧЕНИЙ НА TRICHOMONAS VAGINALIS

Проведенные нами опыты по длительному культивированию на стандартной диагностической среде показали возможность использования данного метода для проведения экспериментов по изучению воздействия на Тг vaginalis магнитно-лазерного, СВЧ- и КВЧ - излучений in vitro

Были проведены две основных серии опытов - облучение культур, выращенных на среде Vagicult инасредеСДС-199

При импульсном лазерном облучении (аппарат «Узор-А-2К») частота повторения импульсов составила 150 Гц, мощность импульса - 14 Вт, время облучения - 5 мин

Производилось пятикратное облучение со 2-го по 7-й день культивации. Количество трихомонад в 1 мл среды до облучения в среднем равнялось 5890 кл\мл (рис.2).

Это были грушевидной формы, активно подвижные клетки с хорошо различимыми жгутиками и мембраной

После первого облучения культуры импульсным лазерным излучением произошла интенсификация роста культуры по сравнению с контролем, особен-

но заметная на 3-й и 5-е сутки. После третьего сеанса была достигнута статистически значимая разница между опытной и контрольной сериями Однако в последующие дни количество трихомонад резко снизилось по сравнению с контролем.

Лазерное излучение привело к резкому снижению подвижности трихомонад После третьего облучения они еще сохраняли подвижность и только после четвертого полностью потеряли ее. Движение на одном месте возобновилось после пятого облучения одновременно с изменением формы клеток на округлую

Облученная культура трихомонад погибла на 1—15-й день культивирования после 5- кратного воздействия магнитно-лазерным излучением.

С первого по четвертое облучение форма клеток Tr.vaginalis оставалась типичной грушевидной, а после пятого облучения помимо типичных форм в нативных и окрашенных препаратах встречались крутые

При воздействии на культуру Vagicult КВЧ-облучением (аппарат «Явь-1») длина волны равнялась 7,1мм (частота42194± 10 МГц) Время воздействия-10 и 15 мин Эти параметры также соответствуют используемым при лечении больных урогенитальным трихомониазом

При КВЧ - облучении материала после первого и второго сеансов наблюдалось статистически значимое снижение титра клеток простейшего по сравнению с контрольной средой (рис 2) При этом форма клеток оставалась типичной, грушевидной. Однако после третьего облучения помимо типичных форм появляются округлые клетки А после пятого - большинство клеток Tr.vaginalis приобретают круглую форму Подвижность трихомонад при КВЧ - обработке прекращается после второго облучения

На 7-й день культивации после 4-го сеанса наблюдался интенсивный рост количества трихомонад, но к 15-му дню культивации культура гибнет

При СВЧ-облучении культуры трихом она д Уа§1сиИ (аппарат <Луч-4») использовался излучатель 2 диаметром 35 мм с керамическим диэлектриком. Мощность первого облучения составила 2 Вт, а последующих - 3 Вт. Время первого облучения -10 мин, а последующих -15 мин.

3000000-,

2500000- ' 2000000-К

)

Кп/ми 1500000- '

1 Сутки 2 сутки Зсутки 5сутки 7 сутки 10 сутки 15сутки

а Контроль ЯЛшр»*Эй воздействие РСВЧ. излучение 1К8Ч- излучений |

Рис. 2. Воздействие лазерного, СВЧ и КВЧ -излучений на культуру Tr■vag¡nalis в среде Vagicult

Облученные клетки в течение 7 суток культивирования и 5-кратного облучения сохраняют типичную грушевидную форму Количество клеток на 1мл среды после первого облучения увеличивается практически в два раза по сравнению с контролем (рис.2). Последующие два облучения также сопровождаются кратным увеличением числа клеток. Максимальное их количество наблюдается после третьего облучения 2 783 тыс клеток в 1 мл среды. Однако, несмотря на высокий темп размножения, подвижность клеток исчезает уже после первого облучения (наблюдается лишь движение жгутика) С 4-го облучения темп размножения клеток снижается На 15-20-й день культура погибала.

ПЦР - анализ контрольной культуры трихомонад (без облучения) и культур, обработанных лазерным и КВЧ и СВЧ- излучениями показал присутствие в этих вариантах ДНКТгл^шаЬз.

Результаты биологической эффективности воздействия лазерного, СВЧ и КВЧ - излучений на культуру Тг.у^шаЬэ, выращенную на среде СДС-199, представлены на рис. 3.

Полученные результаты имеют определённое сходство с предыдущей серией опытов на среде Ч^шик, но в тоже время весьма специфичны. Стимулирующее действие лазерного и СВЧ- излучений более выражено и наблюдается уже после 2-го и 3-го сеансов Продолжительность стимулирующего действия также была больше по сравнению с культурой, выращенной на среде Уа§юик Воздействие КВЧ-излучений также ингибировало рост трихомонад после первого сеанса, но уже после второго облучения наблюдался значительный пролифератив-ныйрост.

Изменение формы трихомонад и снижение подвижности также наблюдались в более поздние сроки культивации по сравнению со средой Уа§1сиЙ

■ Контроль ■Лазерное воздействие ПСВЧ- излучение ■ КВЧ- излучение'

Рис.3. Воздействие лазерного, СВЧ и КВЧ-излучений па культуру Тгл^таНз в среде СДС-199

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Все виды излучений, используемые в данной экспериментальной работе в терапевтических дозах, способствовали значительному увеличению числа клеток по сравнению с необлученными вариантами Это указывает на стимуляцию пролиферации Tr .vaginalis низкими дозами лазерного, КВЧ- и СВЧ- излучений.

Возможность стимуляции пролиферации подтверждается в ряде работ, в которых отмечается действие низкоинтенсивных излучений на важнейшие функции эукариотических клеток Установлено, что лазерное излучение на молекулярном уровне увеличивает синтез белков, образование молекул АТФ, усиливает метаболитические процессы, а на клеточном уровне повышает пролифера-тивную активность клеток Возможность стимуляции митотической активности клеток КВЧ - излучением показана на эукариотических клетках животных и клетках дрожжей. Есть указания, что СВЧ-излучение также может приводить к усилению митотической активности

Зарегистрированный нами аналогичный эффект данных излучений на Тг vaginalis ранее не наблюдался Отмеченная в наших опытах стимуляция размножения трихомонад физиотерапевтическими дозами, применяемыми для лечения трихомониаза, может иметь значение д ля разработки рекомендаций по его лечению, поэтому исследования в этом направлении необходимо продолжить Пока неясно, к чему может привести 10- кратное облучение культуры трихомонад (как при лечении), а не 5- кратное (как в наших экспериментах) Но для проведения таких опытов необходимо дальнейшее усовершенствование метода длительного культивирования трихомонад in vitro. Именно культуральный метод позволяет непосредственно воздействовать различными факторами на чистую культуру трихомонад, размножать ее в нужных количествах и проводить многосторонний анализ биологических свойств трихомонад

Проведенная нами оценка среды Уа^стЛ показала возможность многодневного выращивания на ней культуры трихомонад, хотя данная среда является диагностической и, вероятно, на длительное культивирование не рассчитана Срок культивирования на этой среде был ограничен 8-10-ю сутками, но это позволило проследить реакцию трихомонад на воздействие различных излучений непосредственно на организм простейшего.

Все виды излучений приводили к изменению формы клеток Они приобретали округлую, атипичную форму Вероятно, это результат модификационной изменчивости, индуцированной влиянием данных излучений на клетки в чистой культуре.

Ранее нами изучался эпигенетический механизм этой формы изменчивости простейших (Пляченко ДА с соавт., 2005)

Так как полиморфность трихомонад существенно затрудняет диагностику трихомониаза, то полученная информация представляет интерес в связи с пониманием возможности влияния на морфологические характеристики возбудителя физиотерапевтических методов с использованием данных видов излучений

Проведенные исследования показали, что все используемые виды облучений приводят к потере активной подвижности трихомонад Вероятно, это не является свидетельством снижения их жизнеспособности, поскольку клетки интенсивно размножаются Возможно, это связано с их реакцией на какой-то специфический фактор Таковыми могут быть повышение температуры культу-ральной среды вовремя процедуры облучения или изменение её рН,

В литературе, посвященной диагностике трихомониаза, нередко отмечается, что после антибактериальной терапии и физиотерапии при использовании ПЦР можно получить ложноотрицательные результаты Вероятно, это связано с нарушением специфических участков ДНК, к которым присоединяются прай-меры В наших экспериментах это наблюдение не подтвердилось ПЦР - тестиро-

вание культур после обработки всеми видами излучений показало наличие ДНК Tr.vaginalis как при физиотерапевтических дозах, так и при высоких дозах облучения, как в живых культурах, так и погибших Исходя из этого, можно предположить, что различные дозы лазерного, СВЧ и КВЧ-излучений не изменяют определенные специфические районы ДНК. Однако нельзя исключить, что положительный ПЦР анализ в наших опытах обусловлен высокой надежностью использованной тест-системы (АмшгаСенс Trichomonas vaginalis-250)

Зарегистрированная изменчивость показателей жизнеспособности (темпы размножения и подвижности) и формы клеток под влиянием излучений, вероятно, является изменением физиолого-биохимических процессов в клетке, связанных, по всей видимости, с вмешательством в регуляцию экспрессии генов Trichomonas vaginalis

ВЫВОДЫ

1 Предложен метод многодневного культивирования Tr. vaginalis in vitro для экспериментальных исследований изменчивости морфогенетических характеристик простейшего Отмечена перспективность метода для оценки жизнеспособности и морфологии трихомонад, а также для оценки степени и характера влияния внешних факторов на эти признаки

2. Физиотерапевтические (низкие) дозы лазерного, СВЧ-, КВЧ- излучений значительно увеличивают пролиферацию трихомонад, приводят к появлению клеток с атипичной округлой формой. Двигательная активность клеток снижается до полной ее потери.

3 Механизмы воздействия излучений могут быть связаны как непосредственно с самими излучениями, так и изменением свойств кулыуральной среды 4. ПЦР-анализ во всех облученных вариантах показал присутствие ДНКТг vaginalis Это свидетельствует об отсутствии мутагенного действия изученных

факторов Зависимости результатов ПЦР диагностики от вида и дозы облучения не обнаружено

5 Полученные данные требуют пересмотра регламента применения физиотерапевтических методов лечения трихомониаза, основанных на использовании низкоинтенсивных излучений различной природы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пляченко, ДА О возможных причинах артефактов при генодиагностике урогенитального трихомоноза/ ДА.Пляченко, В.С Софьин, В.Е Плыкин // Актуальные вопросы дерматовенерологии Материалы межрегиональной конференции дерматовенерологов, посвященной 1000-летию г, Казани. -Казань, 2005 - С. 143-144.

2 Пляченко, Д А. Непрерывное культивирование ТгусЬотопав уаргаКв на диагностических средах / Д. А Пляченко, Е К Серенко, В.В Калинин // Молодежь и наука, итоги и перспективы Материалы ассоциации студентов и молодых специалистов. - Саратов, 2005. - С.46-47.

3. Пляченко, Д. А Роль мочеполового трихомониаза в возникновении хронических воспалительных изменений предстательной железы / Д. А Пляченко, ЕАЛиниченко// Молодежь и наука- итоги и перспективы Материалы ассоциации студентов и молодых специалистов -Саратов, 2005 -С.113-114

4 Пляченко, ДА Эпигенетические модификации как возможная причина артефактов в ПЦР-диагностике трихомониаза /ДА Пляченко, В И.Калинин // Молодые ученые - здравоохранению региона Материалы 66-й науч -практ конф студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета,-Саратов, 2005-С 97-98.

5. Пляченко, Д А Изучение влияния СВЧ-, ЬСВЧ- и магнитно-лазерного излучения на Тг.уа§ша118 в условиях длительного культивирования / П В Глыбочко, Д А Пляченко, В.С Софьин И Частные вопросы дерматовенерологии Материа-

лы межрегиональной науч -практ конф смеждунар участием -Саратов, 2006 -С123-124

6 Пляченко, Д А Биологическое действие лазерного, СВЧ КВЧ- излучений на Trychomonas vaginalis в условиях длительного культивирования / Е.В.Капустина, Д А Пляченко, А В Лобанова // Материалы 71-й международной итоговой студенческой научно-практической конференции, посвященной 130-летию со дня рождения профессора В.Ф Войно-Ясенецкого и 65-летию КрасГМА. -Красноярск, 2007.- С 272-273.

7 Влияние лазерного, СВЧ- и КВЧ-излучений на Trychomonas vaginalis в условиях непрерывного культивирования/П.В.Глыбочко, Д.А Пляченко, В.С.Со-фьин, А.В Лобанова // Вестник Волгоградского медицинского университета — 2007 -№2 -С.24-27.

Многочисленные эпидемиологические исследования свидетельствуют, что урогенитальный трихомониаз, возбудителем1 которого является простейший одноклеточный паразит Trichomonas vaginalis - одно из самых распространенных заболеваний, передающихся половым путём.

Урогенитальный трихомониаз лидирует по частоте выявления среди ИППП у лиц, обратившихся за специализированной дерматовенерологической, акушерско-гинекологической и урологической помощью.

По данным» Всемирной организации здравоохранения в мире трихомониазом страдает примерно 170 млн. человек ( Donovan В, 2004 ).

Частота заражённых урогенитальной трихомонадой клинически здоровых женщин в развитых странах составляет 2-10% и в развивающихся 15-40%.

В США до последнего времени ежегодно выявлялось около 3 тыс. новых случаев заболеваний ( Копылов В.М. с соавт., 2006; Wolner-Hansen P.J at al., 1989).

В Российской Федерации заболеваемость трихомониазом также остаётся стабильно высокой.

В 1996 году на 100- тыс. населения зарегистрировано 339 случаев трихомониаза ( Адаскевич В.П., 1999; Копылов В.М. с соавт., 2006 ).

В 1999 году - 327, 3 на 100 тыс. населения ( Кубанова А.А., Тихонова Л.И., 2001 ).

В. 2005 -2006 году было выявлено 343 случая мочеполового трихомониаза, тогда как за этот же период было диагностировано 111 случаев сифилиса, 82 - гонореи, 95 - хламидиоза ( Ермоленко Д.К. с соавт., 2007).

Заболеваемость трихомониазом по Саратовской области колебалась от 298-340 на 100 тыс. населения в 1994-98 г.г. до 430-437 на 100 тыс. населения в 2000 году ( Утц С.Р., Пронь Д.А. 2001; Софьин B.C. с соавт. 2003; Калинин В.И., 2005 ).

Хронический трихомониаз, значительно чаще, чем прочие инфекции передающиеся половым путем, вызывает тяжёлые патологии урогенитального тракта у мужчин - уретриты, простатиты, аденому предстательной железы ( Глыбочко П.В., с соавт., 2001 г./ Скрипкин Ю.К. с соавт., 2001; D.Petrin, 1998г. Cindi van der Schee 1999 ).

Таким образом, трихомониаз - это серьезная медико-социальная проблема, так как представляет собой реальную угрозу репродуктивному здоровью населения вследствии развития различных осложнений. Наряду с вектором постоянного роста заболеваемости трихомониазом четко прослеживается тенденция изменения клинической картины этого заболевания, как у мужчин, так и у женщин, а так же многочисленные артефакты лабораторной диагностики ( Дмитриев Г.А., 2005; Кисина В.И. 2007; Fukuda М., Fukuda К., Ranoux С. 1996 ).

Морфология и физиология Trichomonas vaginalis, несмотря на небольшие размеры (7-10мк), довольно сложны ( Козлюк А.С. 2006; D.Petrin, 1998 ). Геном урогенитальной трихомонады насчитывает 160 млн. пар оснований, в то время как у человека он в 20 раз меньше ( Jane М. Carlton et al. 2007 ).

Весьма сложен и метаболизм трихомонад, являющихся гетеротрофными организмами с голозойным типом питания ( Полянский Ю.И., 1968; D.Petrin, 1998; Alvarez-Sanchez ME et al. 2000 ). Именно с этими таксономическими особенностями, скорее всего, связаны такие свойства трихомонад как высокая изменчивость, полиморфность, мимикрия, весьма затрудняющие диагностику трихомониаза, а также значительная цитотоксичность.

Биологические свойства трихомонады приобретают особое значение, если рассматривать влияние непосредственно на её организм различных физических факторов, широко используемых ныне в физиотерапевтических методах лечения, и реабилитации больных трихомониазом.

Имеется достаточно большое количество исследований, посвященных изучению влияния лазерного излучения, СВЧ- и КВЧ- излучений на организм человека и лабораторных животных, прокариотических микроорганизмов, но практически отсутствуют работы, которые преследовали бы цель изучить влияние физических факторов непосредственно на клетки трихомонад в чистой культуре ( Белишева Н.К., с соавт., 1984; Горбатова М.Э., с соавт., 1987; Шестерина М.А., соавт., 1987; Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., 1999; Глыбочко П.В., 2007 ).

Физиотерапевтические методы лечения, вероятно, изменяют морфологические и генетические свойства Trichomonas vaginalis, что может затруднить выявление её в организме больного рутинными способами и методами. ПЦР - диагностики. Это, в свою очередь, влечет за собой постановку ложноотрицательных диагнозов при проверке эффективности лечения.

Исходя из вышеизложенного, изучение влияния физических факторов (лазерного, СВЧ- и КВЧ - излучений) на чистую многодневную культуру Trichomonas vaginalis представляет собой значительный научно-практический интерес.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение чистой культуры Trichomonas vaginalis на жидких средах различного состава в условиях как стационарного, так и проточного культивирования, и изучение влияния на неё лазерного, КВЧ- и СВЧ-излучений.

Исходя из поставленной цели, решали следующие

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Модифицировать методы непрерывного культивирования Trichomonas vaginalis с целью получения чистой культуры.

2. Изучить морфо-физиологические особенности Trichomonas vaginalis в условиях непрерывного культивирования.

3. Исследовать влияние лазерного, КВЧ- и СВЧ- излучений различной интенсивности непосредственно на культуру Tr.vaginalis in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработаны модифицированные методы непрерывного, длительного культивирования Trichomonas vaginalis in vitro.

Впервые изучены особенности морфофизиологии Trichomonas vaginalis в условиях непрерывного культивирования.

Впервые проведены эксперименты по изучению воздействия низкоинтенсивного лазерного СВЧ - и КВЧ - излучений на культуру Trichomonas vaginalis in vitro.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложенный модифицированный метод непрерывного культивирования Trichomonas vaginalis и изучение на его основе влияния лазерного СВЧ -и КВЧ - излучений на организм простейшего является медико-биологической базой для разработки дальнейших методов лечения и диагностики трихомониаза.

На основании результатов изучения влияния широко используемых в лечении трихомониаза низкоинтенсивных лазерных СВЧ - и КВЧ излучений непосредственно на организм простейшего подготовлены научно-практические рекомендации по назначению физиотерапевтических мероприятий в комплексном лечении трихомониаза.

Разработаны новые схемы алгоритма диагностики трихомониаза^ с применением как рутинных лабораторных методов, так и методов молекулярных исследований.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Технология длительной культивации Trichomonas vaginalis существенно отличается от культивации прокариотических организмов.'

2. Чистая культура Trichomonas vaginalis может служить биологической моделью для дальнейшего изучения морфофизиологических особенностей этого простейшего и его патогенеза.

3.Воздействие на культуру трихомонады терапевтических доз лазерного, СВЧ- и КВЧ-излучений приводит к изменению фенотипа паразита и стимулирует его размножение, что необходимо учитывать при лечении больных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были доложены и обсуждены на межрегиональной конференции дерматовенерологов ( Казань, 2005 г. ); научно-практической конференции с международным участием «Частные вопросы дерматовенерологии» (Саратов, 2006 г. ); ассоциации врачей-лаборантов г. Саратова ( 2006 г.).

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

Разработанные методы лабораторной диагностики и используемые физиотерапевтические воздействия применяются в клинике кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава», Саратовском областном и городском кожно-венерологических диспансерах. Отдельные фрагменты работы внедрены в учебный процесс на кафедрах клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС, кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертационного исследования опубликовано 7 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 105 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав, включающих полученные результаты, обсуждение результатов, выводов, списка литературы, содержащего 164 источника (в том числе 110 отечественных и 54 иностранных). Иллюстративный материал представлен 13 рисунками и 10 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод многодневного культивирования Tr.vaginalis in vitro для экспериментальных исследований изменчивости морфогенетических характеристик простейшего паразита человека. Несомненна перспективность метода для оценки жизнеспособности и морфологии урогенитальной трихомонады, а также оценки степени и характера влияния внешних факторов на эти признаки.

2. Физиотерапевтические дозы лазерного, СВЧ-, КВЧ- излучений значительно увеличивают пролифирацию Tr.vaginalis , приводят к появлению клеток атипичной, круглой формой. Двигательная активность паразита при этом снижается до полной её потери.

3. Механизмы биологического эффекта воздействия излучений могут быть связаны как непосредственно с воздействием на клетку простейшего, так и изменением параметров культуральной среды.

4. Молекулярно-генетические исследования во всех сериях опытов по облучению ЭМИ показал присутствие ДНК Tr.vaginalis. Это свидетельствует об отсутствии мутагенного действия физиотерапевтических факторов. При этом зависимости результатов ПЦР диагностики от вида и дозы облучения не обнаружено.

5. Полученные результаты наших исследований требуют пересмотра регламента применения физиотерапевтических методов лечения трихомониаза, связанных с использованием низкоинтенсивных излучений различной природы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведённая экспериментальная работа, что культуральный метод диагностики на жидких средах, по-прежнему является незаменимым для диагностики трихомониаза, в связи со значительным полиморфизмом Tr.vaginalis.

2. ПЦР анализ рекомендуется использовать в качестве вспомогательного экспресс метода диагностики трихомониаза.

3. Диагностическая среда "Vagicult" может использоваться в экспериментальных работах по изучению Tr.vaginalis.

4. Непрерывное культивирование урогенитальной трихомонады в модифицированных ферментёрах может служить моделью для изучения патогенеза трихомониаза.

5. Нецелесообразно применение ЭМИ как терапевтического мероприятия в острый период трихомониаза.