Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Дифференцировка цитотоксических Т-лимфоцитов и их функциональная активность при гипертензивных расстройствах во время беременности

На правах рукописи

ЛАЗАРЕВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРИ ГИПЕРТЕНЗИВ-НЫХ РАССТРОЙСТВАХ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ц НОЯ 2013

Москва-2013 005540210

005540210

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Сотникова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунологии с группой по диагностике СПИД ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

им Д.О. Отта» СЗО РАМН. Сельков Сергей Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор

кафедры иммунологии

ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова

Минздрава России. Стенина Марина Александровна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

Защита состоится к/<£п рАи^/^ЪО_]У- в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05 при ГБОУ ВПО РНИМ Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМ Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Гипертензивные расстройства - одна из актуальных проблем в современном акушерстве, так как являются распространенной патологией при беременности и занимают ведущее место в структуре материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [Чингаева Г.Н., 2013; Ману-хин И.Б., 2012; Макаров И.О. с соавт., 2011;Clivaz Mariotti L. et al., 2007]. В последнее время все большее количество исследований свидетельствует о роли иммунных нарушений в патогенезе гипертензивных расстройств во время беременности [Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Посисеева J1. В. с соавт., 2008; Панова И.А., 2007; Laresgoiti-Servitje Е. et al., 2010; Saito S. et al., 2007]. Большинство исследователей сходятся во мнении, что иммунная система женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности находится в активированном состоянии [Сотникова Н.Ю., 2005; Посисеева Л.В. с соавт., 2008; Панова И.А., 2007; Xia Y. et al., 2007; Laresgoiti-Servitje E. et al., 2010]. Так, при данной акушерской патологии усиливаются реакции адаптивного иммунитета с участием различных популяций ЦТЛ на системном и локальном уровне [Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Посисеева JI. В. с соавт., 2008.; Paeschke S. et al., 2005; Darmochwal-Kolarz D. et al., 2007]. В последние годы было показано, что уровень функциональной активности цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки [Сотникова Н.Ю., 2010; van Leeuwen R. et al., 2006]. При этом различают 4 пула цитотоксических Т-лимфоцитов: наивные клетки, центральные, претерминально-дифференцированные и терминально-дифференцированные клетки памяти, характеризующихся различной экспрессией молекул CD45RA и CD62L [Tomiyama Н. et al., 2002; Geginat G. et al., 2003; Sallusto F. et al., 2004]. Переход клеток на новую стадию дифференцировки определяет путь рециркуляции клеток через лимфоидную ткань, изменяет продукцию

цитокинов и цитолитических молекул [Maldonado А., 2003; Blander J.M. et al., 2003; Beckhove P. et al., 2004; van Leeuwen R, 2006]. В литературе практически отсутствуют данные о характере дифференцировки цитоток-сических Т-лимфоцитов при гипертензивных расстройствах во время беременности. Известно, что на дифференцировку клеток памяти способны оказывать влияние IL-2, IL-7, IL-15, TNFa и глюкокортикоиды [Талаев В.Ю. с соавт. 2005; Лядова И.В., 2008; Geginat J. et al., 2003]. Рядом авторов было показано, что при гестозе в периферической крови матери возрастает сывороточное содержание IL-2 [Dimitrakova Е. et al., 2007; Brewster J.A. et al., 2008] и уровень ЦТЛ, экспрессирующих рецепторы к IL-2 [Панова И.А., 2006]. В литературе дискутируется вопрос о возможности изменения характера иммунного ответа при гестозе в результате стимуляции материнских лимфоцитов микрочастицами синцитиотрофобласта попавшими в кровоток матери [Germain S. et al., 2007]. Отмечалось стимулирующее влияние частиц синцитиотрофобласта на продукцию провос-палительных цитокинов периферическими лимфоцитами при преэклам-псии [Germain S. et al., 2007]. Но данные об особенности влияния IL-2 и микрочастиц синцитиотрофобласта на дифференцировку цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов при неосложненной и осложненной, гипертензивны-ми расстройствами беременности отсутствуют.

Изучение процессов дифференцировки ЦТЛ с формированием различных пулов клеток памяти и их функциональной активности на системном и локальном уровнях, а также факторов, влияющих на данный процесс, позволяет уточнить механизмы, определяющие развитие гипертензивных расстройств во время беременности.

Цель исследования: установить особенности дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов и ее регуляции у женщин с гипертензив-ными расстройствами во время беременности для уточнения иммунных механизмов развития гипертензивных расстройств во время беременно-

сти.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности дифференцировки клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови и децидуальной оболочки плаценты при гипертензивных расстройствах во время беременности.

2. Оценить внутриклеточную продукцию эффекторных молекул GranzymeB, Perforin, IFNy и TNFa CD45RA+ и CD45RA- клетками в популяции цитототоксических Т-лимфоцитов при гипертензивных расстройствах во время беременности.

3. Выявить в эксперименте in vitro влияние IL-2 и микрочастиц ворсин аутологичного хориона на дифференцировку клеток памяти и параметры их апоптоза в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов при неослож-ненной и осложненной гипертензивными расстройствами беременности.

4. Выявить в эксперименте in vitro влияние IL-2 и микрочастиц ворсин аутологичного хориона на внутриклеточную продукцию эффекторных молекул GranzymeB, Perforin, IFNy и TNFa цитототоксическими Т-лимфоцитами при неосложненной и осложненной гипертензивными расстройствами беременности.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что развитие гипертензивных расстройств во время беременности сочетается с изменением характера дифференцировки клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, заключающимся в накоплении в периферической крови терминально-дифференцированных клеток памяти, в децидуальной оболочке - претер-минально-дифференцированных клеток памяти.

Впервые выявлено, что при гестационных гипертензивных расстройствах в популяции CD8+ лимфоцитов повышается содержание клеток, продуцирующих провоспалительные цитокины и цитолитические

молекулы, в периферической крови в пуле CD45RA+ лимфоцитов, в де-цидуальной оболочке плаценты - в пуле CD45RA- лимфоцитов.

В эксперименте in vitro впервые показано, что независимо от наличия гипертензивных расстройств у беременных IL-2 стимулирует рост уровня наивных клеток и снижение количества терминально-дифференцированных клеток памяти, и только при неосложненной беременности IL-2 повышает уровень центральных и снижает содержание претерминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических цитотоксических Т-лимфоцитов.

Впервые установлено, что стимуляция микрочастицами ворсин хориона периферических CD8+ лимфоцитов женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности индуцирует повышение пула наивных клеток и снижение содержания терминально-дифференцированных клеток памяти, при неосложненной беременности к снижению уровня наивных, центральных, претерминально-дифференцированных и повышению пула терминально-дифференцированных клеток памяти.

Впервые выявлено, что под влиянием IL-2 при беременности независимо от наличия гипертензивных расстройств, стимулируется ранний апоптоз периферических цитотоксических Т-лимфоцитов, только при гипертензивных расстройствах подавляются конечные этапы апоптоза.

Показано, что стимуляция микрочастицами ворсин хориона плаценты лимфоцитов при гипертензивных расстройствах во время беременности подавляет переход клеток на конечные этапы апоптоза, при неосложненной беременности - ранние этапы апоптоза в популяции периферических CD8+ лимфоцитов.

Впервые определено, что стимуляция IL-2 периферических CD8+ лимфоцитов при неосложненной беременности индуцирует повышение количества CD45RA+IFNy+ клеток и снижение CD45RA+Perf+, CD45RA+GrB+ и CD45RA-GrB+ клеток.

В эксперименте in vitro показано, что под влиянием микрочастиц ворсин хориона аутологичной плаценты в группе женщин с гипертензив-ными расстройствами во время беременности происходит усиление внутриклеточной продукции TNFa в популяции периферических CD45RA-CD8+ лимфоцитов, при неосложненной беременности - подавление внутриклеточной продукции Perforin периферическими CD8+CD45RA+ лимфоцитами.

Практическая значимость работы

Впервые установлены нормативные показатели содержания наивных, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов в периферической крови и в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочке зрелой плаценты.

Положения, выносимые на защиту

Гипертензивные расстройства во время беременности сочетаются с изменением дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов: на уровне периферической крови отмечается увеличение пула терминально-дифференцированных клеток памяти, на уровне децидуальной оболочке плаценты - накопление центральных и претерминально-дифференцированных лифоцитов при уменьшении количества терминально-дифференцированных клеток памяти. При этом происходит накопление в периферической крови CD45RA позитивных CD8+ лимфоцитов, продуцирующих GranzymeB, Perforin и TNFa, и снижение количества CD45RA- цитотоксических Т-лимфоцитов, продуцирующих Perforin и IFNy; в децидуальной оболочке плаценты - угнетение уровня CD45RA+ цитотоксических Т-лимфоцитов, синтезирующих GranzymeB, IFNy и TNFa, на фоне увеличения пула CD45RA- цитотоксических Т-лимфоцитов, продуцирующих GranzymeB, IFNy и TNFa.

IL-2 стимулирует рост уровня наивных лимфоцитов и уменьшает

количество терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических цитотоксических Т-лимфоцитов женщин с гипертен-зивными расстройствами во время беременности, а также стимулирует вступление периферических ЦТЛ в ранние этапы апоптоза.

Микрочастицы ворсин хориона индуцируют повышение пула наивных клеток и снижение содержания терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD8+ лимфоцитов у женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности, подавляют переход CD8+ лимфоцитов на конечные этапы апоптоза и усиливают продукцию TNFa периферическими CD45RA-CD8+ лимфоцитами.

Внедрение результатов в практику

Нормативные показатели содержания наивных, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-

дифференцированных клеток памяти в популяции С08+лимфоцитов в периферической крови и в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочке зрелой плаценты используются в работе врачей аллергологов-иммунологов КДП ФГБУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н.Городкова» Минздрава России и в учебном процессе на кафедре патофизиологии, клинической патофизиологии и иммунологии ГБОУ ВПО «ИвГМА» Минздрава России.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова" Минздрава России, Иваново 2009г., 2010г., 2011г.; VIII конференции иммунологов Урала, Сыктывкар 2010г.; IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции», Пермь 2011г.; конференции «Клиническая иммунология и иммуногенетика -междисциплинарные проблемы», Ташкент 2010г.; IX Российской конференции иммунологов Урала, посвященной 90летию Л.Я. Эберта, Челя-

бинск 2011г.; XIV Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург 2011г.; VIII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, V Съезде иммунологов России, Москва 2011г.; Объединенном иммунологическом форуме, VI Съезде иммунологов России, VI конференции по иммунологии репродукции, Нижний Новгород 2013 г.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 10 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора: Диссертационная работа представляет собой самостоятельный труд автора. Автором самостоятельно выполнялись иммунологические исследования. Была проведена систематизация полученных результатов, их статистическая обработка, описание полученных результатов.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 2 главы собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 211 источников. Работа иллюстрирована 24 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И. Малышкина). Исследования проводились в акушерской клинике, лаборатории клинической иммунологии (зав. лаб. д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова).

Всего было обследовано 72 беременных женщин с гипертензив-

ными расстройствами в 3 триместре гестации (согласно МКБ 10 34 женщины с гестационной артериальной гипертензией с незначительной про-теинурией и 38 женщин с умеренной и тяжелой преэклампсией) и 59 беременных женщины с неосложненным течением беременности в 3 триместре гестации. Исследования в 3 триместре проводились в 32-40 недель гестации.

Материалом для исследования служили периферическая венозная кровь из локтевой вены и плацента.

Иммунологические методы исследования:

Мононуклеарные клетки из плацентарных тканей выделяли без-ферментативным, механическим методом. Фракцию лимфоцитов из периферической крови и лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки плаценты выделяли методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078).

Для определения in vitro влияния IL-2 (Biosource, USA) и микрочастиц ворсин хориона обогащенную популяцию периферических CD8-позитивных лимфоцитов выделяли методом магнитной сепарации и культивировали в течении 4 суток в среде RPMI-1640, содержащей IL-2 (10 нг/мл) или микрочастицы ворсин аутологичного хориона (20-50 мг) при 37°С в 5% С02. В качестве контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в аналогичных условиях без стимулирования.

Микрочастицы ворсин хориона для in vitro стимуляции ЦТЛ получали механическим способом с помощью гомогенизатора, пропуская через 2 фильтра разного диаметра (50 мкм и 200 мкм). Полученный гомогенат, который оставался на фильтре меньшего диаметра, лизировали. Взвесь ультрацентрифугировали 3 мин при 12000 об/мин, надосадочную жидкость отбирали и добавляли 500 мкл среды RPMI-1640.

Исследование популяционного состава CD8+ лимфоцитов производили многоцветным методом проточной цитометрии на приборе

FACScan (Becton Dickinson, США). В CD8+ лимфоцитарном гейте определяли относительное содержание: наивных клеток (Тп, CD45RA+CD62L+); центральных (Tcm, CD45RA-CD62L+), претерми-нально-дифференцированных (Tem, CD45RA-CD62L-), терминально-дифференцированных (Temra, CD45RA+CD62L-) клеток памяти. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Параллельно оценивали уровень внутриклеточной продукции GranzymeB, Perforin, TNFa, IFNy в популяции CD8+CD45RA+ и CD8+CD45RA- лимфоцитов, используя процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invinrogen, Camarillo, CA, USA) для пермеабилизации клеточной мембраны. Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток Annexin V (CALTAG Laboratories, США) и пропидиумом иодидом (PI) (CALTAG Laboratories, США).

В работе использовали моноклональные антитела анти-С08 РС5, CD45RA РЕ, CD62L FITC, TNFa РЕ (Beckman Coulter, France); IFNy РЕ, Perf РЕ (eBioscience, USA); GrB PE (Invitrogen, USA). В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "Cell Quest Pro".

Общее количество проведенных исследований составило 2383.

Статистическая обработка данных проводилась с оценкой нормальности распределения и расчетом среднего арифметического, ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта "Microsoft Office 2003" и программы "Statistica 6.0". Достоверность различий показателей в группах определялась по t-критерию Стьюдента и по непараметрическим критериям: U-критерий Манна-Уитни для оценки различий между двумя независимыми выборками и Т-

критерий Вилкоксона для сравнения двух зависимых выборок. Расчет нормативных показателей содержания Tn, Тст, Теш, Тетга клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов в периферической крови и в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочке зрелой плаценты проводился на основе доверительного интервала 95%.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенные нами исследования различных пулов ЦТЛ на системном и локальном уровне позволили изучить все этапы процесса диф-ференцировки с образованием клеток памяти в периферической крови и децидуальной оболочке плаценты женщин с неосложненным течением беременности и гестационными гипертензивными расстройствами. Было установлено, что в периферической крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами в популяции ЦТЛ отмечалось преобладание доли Тетга клеток памяти (31,20±2,05 - гипертензивные расстройства во время беременности, 25,90+1,35 - неосложненная беременность, р<0,05) на фоне снижения уровня Теш лимфоцитов по сравнению с данными женщин с неосложненным течением беременности (18,30+1,24% - гипертензивные расстройства во время беременности, 24,77+1,40% - неосложненная беременность, р<0,001), при этом уровень наивных клеток (CD8+CD45RA+CD62L+) не изменялся (р>0,05). При исследовании внутриклеточной продукции цитокинов и цитолитических молекул периферическими CD8+ лимфоцитами при гипертензивных расстройствах во время беременности было выявлено повышение содержание клеток с фенотипом CD45RA+, продуцирующих Granzime В (24,52±2,59% - гипертензивные расстройства во время беременности, 12,69±1,03% - неосложненная беременность, р<0,001), Perforin (22,58+2,64% - гипертензивные расстройства во время беременности, 13,55+1,46% - неосложненная беременность, р<0,01) и TNFa (20,94+2,03% - гипертензивные расстройства во время беременности, 13,65+1,36% - неосложненная беременность, р<0,02) и

уменьшалось содержание CD45RA- цитотоксических Т-лимфоцитов, синтезирующих GranzymeB (20,94+2,03% - гипертензивные расстройства во время беременности, 13,65+1,36% - неосложненная беременность, р<0,02), Perforin (4,79+0,65% - гипертензивные расстройства во время беременности, 9,28+1,00% - неосложненная беременность, р<0,001) и IFNy (4,72+0,70% - гипертензивные расстройства во время беременности, 8,31+1,18% - неосложненная беременность, р<0,02). Молекула CD45RA экспрессируется на поверхности как Тп клеток, так и Temra клеток памяти [Maldonado А., 2003]. Как известно, не контактировавшие ранее с антигеном, наивные CD45RA+ клетки не обладают способностью к выполнению эффекторной функции [Ярилин А.А., 2010]. А наиболее высокоэффектор-ными клетками памяти способными к продукции большого количества цитокинов и цитолитических молекул являются терминально-дифференцированные клетки памяти [Maldonado А., 2003]. На основании этого мы расценили увеличение при гестационной гипертензии фракции периферических CD8+CD45RA+ лимфоцитов, продуцирующих GranzimeB, Perforin и TNFa, как усиление функциональной активности Тетга. Это хорошо согласуется с нашими данными о повышении общего пула терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции ЦТЛ. Это может обуславливать непосредственное участие данной популяции лимфоцитов, обладающей высокой цитотоксической активностью, в развитии синдрома полиорганной недостаточности у беременных женщин с гипертензивными расстройствами.

Наши исследования показали, что дифференцировка ЦТЛ при ги-пертензивных расстройствах во время беременности на локальном уровне в отличие от системного уровня характеризовалась увеличением в деци-дуальной оболочке зрелой плаценты доли Теш (13,64+1,33% - гипертензивные расстройства во время беременности, 6,00+0,89% - неосложненная беременность, р<0,001) и Tern CD8+ лимфоцитов с фенотипом

С04511А- (49,98+1,93% — гипертензивные расстройства во время беременности, 37,28+3,04% - неосложненная беременность, р<0,001) на фоне снижения уровня Тетга (29,29+1,84% - гипертензивные расстройства во время беременности, 41,24+2,16% - неосложненная беременность, р<0,001). При этом происходило накопление в плаценте С045ЯА- ЦТЛ, продуцирующих вгалгутеВ (22,34+1,92% - гипертензивные расстройства во время беременности, 9,93+1,70% - неосложненная беременность, р<0,001), 1ПЧу (12,10+1,92% - гипертензивные расстройства во время беременности, 6,48+1,34% - неосложненная беременность, р<0,05) и ТИБа (12,84+2,26% - гипертензивные расстройства во время беременности, 5,89+0,83% - неосложненная беременность, р<0,01) на фоне уменьшения содержания С045ИА+ ЦТЛ, синтезирующих ОгапгутеВ (11,77+1,14% -гипертензивные расстройства во время беременности, 28,10+3,39% - неосложненная беременность, р<0,001), ИТЧу (5,67+0,98% - гипертензивные расстройства во время беременности, 18,06+2,07% - неосложненная беременность, р<0,001) и ТМ-а (8,38+1,02% - гипертензивные расстройства во время беременности, 15,57+1,84% - неосложненная беременность, р<0,01). Следовательно, в децидуальной оболочке плаценты при гестаци-онной гипертензии происходит усиление эффекторной функции Тст и Теш клеток памяти, так как обе эти фракции клеток имеют фенотип С045ЯА-.

Известно, что изменение дифференцировки и активации ЦТЛ происходит под влиянием различных цитокинов, обладающих регулирующими и иммуномодулирующими свойствами, в частности, 1Ь-15 [Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Яа^ира^у Я., 2013]. По данным рядом авторов уровень продукции 1Ь-15 при гестационных гипертензивных расстройствах в периферической крови повышался [БИаппа Б. е1 а1., 2011; Е1-ВагасНе Б.М. е1 а1., 2009; Явупа-УШаБшИ Е. е1 а1., 2013], а в плаценте -снижался по сравнению с таковым при неосложненной беременности

[Agarwal R., 2001; Tranquilli A.L., 2008]. Выявленное нами повышение уровня высоко дифференцированных эффекторных клеток памяти в популяции ЦТЛ (Temra) в периферической крови и снижение - в дециду-альной оболочке плаценты у беременных с гипертензивными расстройствами могло быть обусловлено высоким содержанием IL-15 на системном уровне и низким - на локальном уровне соответственно при данной патологии.

Таким образом, можно предположить, что иммунный ответ у женщин с гипертензивными расстройствами при беременности мог определяться на системном уровне развитием дифференцировки ЦТЛ до терминального этапа при стимуляции высоким уровнем IL-15, в то время как, на локальном уровне при отсутствии такого сигнала происходит образование центральных и претерминально-дифференцированных клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов.

Известно, что плацентарный барьер не является абсолютной преградой для разделения материнского и плодового кровотока. По данным литературы преэклампсия характеризуется массированным поступлением в кровоток матери АГ плодового происхождения [Sargent I.L. et al., 2003; Goswami D. et al., 2006; Redman C.W. et al., 2012; Germain S.J. et al., 2007].

Нарушение проницаемости плацентарного барьера при гестаци-онной гипертензии и повышение уровня плодовых АГ в крови матери могут способствовать чрезмерной стимуляции материнской иммунной системы с развитием реакций адаптивного иммунитета с участием различных популяций ЦТЛ на системном уровне [Сотникова Н.Ю.с соавтю, 2005; Посисеева Л.В.с соавт., 2008; Сельков С.А., 2010].

С целью изучения возможного влияния антигенов плодового происхождения на формирование клеток памяти при беременности нами было проведено исследование особенностей дифференцировки периферических ЦТЛ под воздействием стимуляции микрочастицами ворсин хориона

аутологичной плаценты.

Результаты наших исследований показали, что при неосложнен-ной беременности под воздействием микрочастиц ворсин хориона увеличивалась доля Тешга (р<0,001) на фоне снижения доли Тп, Теш и Теш клеток в популяции ЦТЛ (р<0,01, р<0,05 и р<0,05 соответственно). В нашем эксперименте в группе женщин с неосложненной беременностью мы моделировали ситуацию, при которой материнские лимфоциты подвергаются массированной стимуляции антигенами плода, которая имеет место при развитии гипертензивных расстройств. Полученные результаты свидетельствуют о том, что длительная стимуляция плодовыми АГ приводила к накоплению большого количества высокоактивных Temra клеток памяти, способных активироваться и осуществлять эффекторную функцию непосредственно при контакте с АГ без длительного процесса его презентации. По-видимому, это явление отмечалось нами непосредственно в крови женщин с гестационной гипертензией.

Пул Temra ЦТЛ представляют наиболее длительно живущие клетки памяти, способные к циркуляции в кровотоке в течение всей жизни человека [Gupta G. et al., 2005; Maldonado A. et al., 2003; van Leeuwen R. et al., 2006]. Такое состояние определяется устойчивостью этих клеток к апоптозу [Gupta G. et al., 2005]. По нашим данным в периферической крови беременных женщин под влиянием микрочастиц ворсин хориона снижался уровень AnnexinV+PI- ЦТЛ. Возможно, эта ситуация определялась накоплением пула Temra клеток в максимальной степени устойчивых к апоптоз-индуцирующим факторам при стимуляции плодовыми АГ.

В группе женщин с гипертензивными расстройствами при беременности стимуляция CD8+ лимфоцитов микрочастицами ворсин хориона вызывала увеличение доли Тп на фоне уменьшения содержания Temra клеток памяти. Это могло определяться тем, что ЦТЛ у таких женщин были максимально простимулированы in vivo, а дополнительная АГ на-

грузка в отсутствии костимулирующих сигналов, например IL-2, не вызывала пролиферации соответствующих клонов Тешга клеток памяти.

При исследовании параметров раннего и позднего апоптоза периферических CD8+ лимфоцитов у беременных с гипертензивными нарушениями под влиянием микрочастиц ворсин хориона мы выявили уменьшение уровня клеток, находящихся на необратимых этапах апоптоза (р<0,001), которое, вероятно, было относительным, в результате увеличения доли наивных клеток.

Оценивая внутриклеточную продукцию цитолитических молекул ЦТЛ при стимуляции микрочастицами ворсин хориона у женщин с неос-ложненным течением беременности, нами было выявлено снижение уровня Perforin-продуцирующих клеток в популяции CD8+CD45RA+ лимфоцитов (р<0,05), что не совсем согласуется с установленным нами повышением уровня CD8+ Temra. Однако, Н. Takata и М. Takiguchi (2006) в своем исследовании в пуле высокоэффекторных клеток памяти ЦТЛ выделили две популяции с высоким и низким уровнем экспрессии Perforin (CD8+CD45RA+Perfhl и CD8+CD45RA+Perf)ow) [Takata Н., Takiguchi М.,2006]. По их мнению, ЦТЛ способны осуществлять свою цитотоксиче-скую функцию независимо от уровня экспрессии Perforin [Takata Н., Takiguchi М.,2006]. Вероятно, выявленное нами снижение уровня Perforin-продуцирующих клеток в популяции CD8+CD45RA+ лимфоцитов под влиянием антигенов плодового происхождения при беременности могло определяться увеличением популяции CD8+ лимфоцитов с низкой экспрессией Perforin в данной популяции. Возможно, увеличение циркуляции в материнском кровотоке плодовых АГ, наблюдаемое при гипер-тензивных расстройствах у беременных определяет сенсибилизацию материнской иммунной системы фетальными АГ. Это может приводить к развитию реакций адаптивного иммунного ответа с участием ЦТЛ и способствовать формированию полиорганной недостаточности.

При исследовании беременных с гипертензивными расстройствами мы не выявили изменений со стороны внутриклеточной продукции цитолитических молекул периферическими СБ8+ лимфоцитами под воздействием микрочастиц ворсин хориона (р>0,05 во всех случаях). По-видимому, этот феномен неотвечаемости на стимуляцию аутологичными микрочастицами ворсин хориона мог быть связан с тем, что циркулирующий пул ЦТЛ у этих женщин подвергался выраженной стимуляции достаточно долгое время во время беременности, и дополнительный стимул не оказывал влияния.

При неосложненном течении беременности микрочастицы хориона не влияли на продукцию 1Шу и Т№а периферическими С08+ лимфоцитами (р>0,05 во всех случаях). Вероятно, стимуляция ЦТЛ АГ плода является достаточным сигналом для дифференцировки клеток памяти, но не влияет на цитокин-продуцирующую функцию ЦТЛ.

Анализ продукции цитокинов СБ8+ лимфоцитами в ответ на стимуляцию микрочастицами ворсин хориона при гипертензивных расстройствах во время беременности выявил достоверное повышение уровня СВ8-КЮ45КА-ТЫРа+ клеток (р<0,01), при этом уровень клеток памяти с фенотипом С08+С045ЯА- (Теш и Теш) не изменялся (р>0,05 в обоих случаях). Возможно, в тех случаях, когда ЦТЛ уже прошли все этапы дифференцировки, и сформировались клетки памяти, как у женщин с гестационными гипертензивными нарушениями, ответ их на стимуляцию плодовыми АГ выражался не столько в изменении характера дифференцировки, сколько в изменении уровня продукции таБа.

По данным литературы гипертензивные расстройства при беременности сопровождаются повышением сывороточного уровня ТЫБа [Архангельский С.М., 2008 г.; Косу^ У., 2004; В, 2009]. Выявленное нами, увеличение содержания С08+С04511А-ПЧРа+ лимфоцитов у беременных женщин с гипертензивными расстройствами при стимуляции

микрочастиц ворсин хориона сочетается с данными этих авторов, установивших закономерность нарастания уровня TNFa в венозной крови женщин с гестозом.

Таким образом, как показали исследования в группе с неослож-ненным течением беременности, стимуляция антигенами плодового происхождения CD8+ лимфоцитов матери усиливала процесс дифференци-ровки до терминальных этапов формирования клеток памяти, способных к быстрому реагированию на повторное поступление антигена развитием цитотоксических реакции. Однако дополнительная АГ стимуляция высо-кодифференцированных клеток при гестационной гипертензии не вызывала подобных изменений.

Главным аутокринным фактором пролиферации Т-клеток является IL-2 [Ковальчук J1.B. с соавт., 2001; Ярилин A.A., 2010], содержание которого повышается в периферической крови беременных с гипертен-зивными расстройствами [Sharma D., 2011]. Можно предположить, что IL-2 может влиять на развитие дифференцировки CD8+ лимфоцитов при данной акушерской патологии. При оценке возможного влияния IL-2 на данный процесс было установлено, что в обеих исследуемых группах под влиянием IL-2 происходило увеличение доли Тп клеток (р<0,01 - неос-ложненная беременность, р<0,05 - гипертензивные расстройства во время беременности) и снижение уровня Temra клеток памяти (р<0,05 в обоих случаях). Только при неосложненной беременности IL-2 повышал уровень Теш клеток (р<0,02) и снижал содержание Теш клеток памяти (р<0,01). Известно, что IL-2 является основным ростовым фактором Т-лимфоцитов [Ярилин A.A., 2010]. В нашем исследовании IL-2 в основном определял пролиферацию наивных CD8+ лимфоцитов.

Снижение под действием IL-2 доли претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти при неосложненной беременности сочеталось с уменьшением количе-

ства GranzymeB-позитивных лимфоцитов в популяциях CD45RA+ и CD45RA- ЦТЛ (р<0,05 и р<0,02 соответственно) и уменьшением продукции Perforin в популяции CD45RA+ лимфоцитов (р<0,05). Это хорошо согласуется с данными о том, что именно Теш и Temra лимфоциты являются наиболее дифференцированными клетками памяти и обладают высокой цитотоксической активностью, определяемыми продукцией Perforin и GranzymeB [Пащенков Н.Е. с соавт., 2010; Maldonado A. et al., 2003].

Исследуя влияние IL-2 на цитокин-продуцирующую способность CD45RA- и CD45RA+ ЦТЛ, мы установили, что в группе с неосложнен-ной беременностью IL-2 вызывал рост IFNy+ клеток в популяции CD8+CD45RA+ лимфоцитов (р<0,05), но при этом не отмечалось роста пула CD8+CD45RA+CD62L- Temra. Следует отметить, что в нашем исследовании мы определяли процентное соотношение пулов наивных клеток и клеток памяти во всей популяции ЦТЛ и не рассматривали изменений в содержании короткоживущих эффекторных клеток. Это несоответствие может быть объяснено тем, что наряду с наивными клетками и клетками памяти в периферической крови циркулирует небольшой пул короткоживущих эффекторных клеток, имеющих фенотип CD45RA+/-[Decrion A.Z., 2007]. По данным литературы IL-2 стимулирует развитие короткоживущих эффекторных ЦТЛ и, в меньшей степени, влияет на дифференцировку Т-клеток памяти [Pipkin М.Е. et al., 2010; Joshi N.S. et al, 2007; Castro I. et al, 2011]. Можно предположить, что IL-2 стимулировал продукцию IFNy данным пулом CD8+ лимфоцитов, но не влиял на цитокин-продуцирующую функцию клеток памяти. Вероятно, в ходе эксперимента, стимулируя периферические ЦТЛ у женщин с неосложненной беременностью IL-2, мы моделировали ситуацию, имеющуюся in vivo при гипертензивных расстройствах во время беременности, так как, по данным некоторых авторов, уровень IL-2 повышен в периферической крови при данной патологии [Sharma D. et al, 2011]. Усиление продукции IFNy

под действием IL-2, вызывая активацию короткоживущих эффекторных ЦТЛ, может быть одним из механизмов развития цитотоксических реакций в III триместре гестации при развитии ПЭ. Это предположение подтверждают результаты наших собственных исследований и работы других авторов, в которых было показано усиление цитотоксического иммунного ответа при ПЭ [Посисеева Л.В. с соавт., 2008; Панова И.А., 2007; Xia Y. et al, 2007; Laresgoiti-Servitje E. et al, 2010].

Под действием IL-2 во внутриклеточной продукции цитокинов и цитолитических молекул CD8+ лимфоцитами в венозной крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами изменений не было (р>0,05 во всех случаях). Можно предположить, что уровень продукции GranzimeB, Perforin, TNFa и IFNy ЦТЛ достигал максимального значения при развитии гипертензивных нарушений во время беременности, и дополнительная стимуляция интерлейкином-2 не оказывала стимулирующего влияния. Таким образом, результаты наших исследований показали, что при гестационных гипертензивных расстройствах, IL-2 вызывал усиление клеточной пролиферации периферических ЦТЛ, увеличивая число наивных клеток, и не влиял на эффекторную функцию ЦТЛ.

Исследуя показатели апоптоза периферических ЦТЛ в III триместре гестации при стимуляции IL-2, мы выявили, что усиливались ранние/обратимые этапы апоптоза ЦТЛ в обеих группах женщин с неослож-ненным течением беременности и гестационными гипертензивными нарушениями (р<0,05 в обоих случаях). Только в группе беременных женщин с гипертензивными расстройствами отмечалось снижение под действием цитокина количества клеток, находящихся на поздних/необратимых стадиях апоптоза (р<0,05). По-видимому, отмеченное нами накопление в периферической крови всех исследуемых женщин пула CD8+AnnexinV+PI- лимфоцитов под влиянием IL-2 при отсутствии их последующего усиленного перехода в завершающую стадию апоптоза

может быть одним из факторов нарушения естественной элиминации активированных клонов лимфоцитов. Вероятно, 1Ь-2 независимо от наличия или отсутствия патологии при беременности приводит к накоплению активированных клонов клеток и способствует пролонгированию цитоток-сического иммунного ответа.

Можно предположить, что 1Ь-2 действует как фактор гомеостати-ческой пролиферации ЦТЛ, при беременности, осложнившейся гестаци-онной гипертензией. При этом независимо от наличия или отсутствия ги-пертензивных расстройств во время беременности 1Ь-2 приводит к усилению клеточной пролиферации СБ8+ лимфоцитов, увеличивая число наивных клеток, а также способствует пролонгированию цитотоксического иммунного ответа.

Суммируя полученные нами данные, можно предположить следующий механизм участия ЦТЛ в развитии гипертензивных расстройств при беременности. Длительная стимуляция антигенами плода способствует развитию дифференцировки ЦТЛ до терминального этапа диффе-ренцировки. При этом 1Ь-2, как ростовой фактор Т-лимфоцитов, приводит к усилению клеточной пролиферации СБ8+ лимфоцитов, увеличивая число наивных клеток, а также способствует пролонгированию цитотоксического иммунного ответа с накоплением активированных клонов ЦТЛ, что обуславливает развитием клинических проявлений гестационных гипертензивных расстройств.

Выводы:

1. Во время беременности с гипертензивными расстройствами особенностью дифференцировки периферических СБ8+ лимфоцитов является снижение уровня претерминально-дифференцированных и повышение содержания терминально-дифференцированных клеток памяти; дециду-альных СБ8+ лимфоцитов - снижение уровня наивных лимфоцитов и терминально-дифференцированных клеток памяти при одновременном

повышении уровня центральных и претерминально-дифференцированных клеток памяти.

2. Развитие гипертензивных расстройств во время беременности сочетается с повышением в периферической крови уровня TNFa+, GrB+, Perf+ клеток в популяции CD8+CD45RA+ лимфоцитов и снижением количества IFNy+, GrB+, Perf+ клеток в популяции CD8+CD45RA- лимфоцитов; в децидуальной оболочке плаценты - снижение уровня TNFa+, IFNy+, GrB+ клеток в популяции CD8+CD45RA+ лимфоцитов, при одновременном их повышении во фракции CD8+CD45RA- лимфоцитов по сравнению с таковым при неосложненной беременности.

3. IL-2 и микрочастицы ворсин хориона в эксперименте in vitro при гес-тационных гипертензивных расстройствах повышают уровень наивных клеток и снижают количество терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических ЦТЛ. При неосложненной беременности IL-2 стимулирует рост наивных и центральных клеток памяти, но снижает уровень эффекторных клеток памяти, тогда как микрочастицы ворсин хориона снижают уровень наивных, центральных и претерми-нально-дифференцированных и повышают уровень терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD8+ лимфоцитов.

4. При гипертензивных расстройствах во время беременности в эксперименте in vitro как IL-2, так и микрочастиц ворсин хориона тормозят переход периферических CD8+ лимфоцитов на необратимые этапы апоптоза. При неосложненной и осложненной гипертензивными расстройствами беременности IL-2 увеличивает, а микрочастицы ворсин хориона снижают количество клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза в популяции периферических CD8+ лимфоцитов.

5. В эксперименте in vitro IL-2 у женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности не влияет на внутриклеточную продукцию

GranzymeB, Perforin, IFNy и TNFa периферическими CD8+ лимфоцитами. У женщин с неосложненной беременностью IL-2 вызывает рост уровня CD45RA+IFNy+ клеток и уменьшение количества CD45RA+GrB+, CD45RA-GrB+ и CD45RA+Perf+ клеток в популяции CD8+ лимфоцитов. Микрочастицы ворсин хориона при гипертензивных расстройствах во время беременности индуцируют повышение уровня CD45RA-TNFa+ клеток, при неосложненной беременности - снижение уровня CD45RA+Perf+ клеток в популяции периферических CD8+ лимфоцитов. Практические рекомендации: Дополнительно к стандарту иммунологического обследования беременной женщины рекомендуется проводить оценку параметров диффе-ренцировки цитотоксических Т-лимфоцитов для диагностики гипертензивных расстройств.

Врачам аллергологам-иммунологам рекомендуется использовать нормативные значения содержания наивных, центральных, претерми-нально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических цитотоксических Т-лимфоцитов в 3 триместре гестации в комплексной оценке состояния иммунной системы беременной женщины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лазарева, Ю.Ю. Изменение характера дифференцировки периферических лимфоцитов при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова, И.А. Панова // Вестник Военно-Медицинской академии. - 2009. - №1(25). - С.501-502.

2. Лазарева, Ю.Ю. Характеристика дифференцировки и функциональной активности цитотоксических т-лимфоцитов при гестозе / Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова, Ю.Ю. Лазарева и др. // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - №4-5. - С.421.

3. Лазарева, Ю.Ю. Особенности формирования претерминально- и терминально-дифференцированных клеток памяти при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова, И.А. Панова // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. - №2. - С.244.

24

4. Лазарева, Ю.Ю. Особенности дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов при гестозе // материалы 89-й ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2009». - Иваново. - 2009. - С. 182.

5. Лазарева, Ю.Ю. Особенности дифференцировки периферических т-лимфоцитов при неосложненной беременности, гестозе и синдроме задержки роста плода / Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова, Ю.Ю. Лазарева и др. // Jurnali nazariy va klinik tibbiyot (Журнал теоретической и клинической медицины, Узбекистан). - 2010. - №5. - С.92-95.

6. Лазарева, Ю.Ю., Сотникова Н.Ю. Дифференцировка цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности и при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Н.Ю. Сотникова // Ж.Проблемы репродукции. -2010. - спец. выпуск - С.87-88.

7. Лазарева, Ю.Ю. Характер дифференцировки периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Д.Д. Гасанова // Ж. «Вестник Уральской медицинск ой академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии». - 2010. - №2/1(29) - С. 162-163.

8. Лазарева, Ю.Ю. Дифференцировка Т-клеток памяти при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Д.Д. Гасанова // «Российский Иммунологический журнал». - 2010. - Т.4(13). - №4. - С.405.

9. Лазарева Ю.Ю. Особенности дифференцировки Т-лимфоцитов при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Д.Д. Гасанова, Н.Ю. Сотникова, И.А. Панова // сборник научных трудов «Репродуктивное Здоровье Нового Поколения». - 2010. - С.225-228.

10. Лазарева, Ю.Ю. Внутриклеточная продукция цитокинов цитотокси-ческими Т-лимфоцитами и Т-хелперами при гестозе / A.B. Кудряшова, Н.Ю. Сотникова, Ю.Ю. Лазарева и др. // Ж. Актуальш питания пед1атрп, акушерства та гшекологи. - 2011. - №1. - С.196-198.

П.Лазарева, Ю.Ю. Влияние in vitro IL-2 и микроворсин хориона на дифференцировку клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов / Ю.Ю. Лазарева, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова // Медицинская иммунология. - 2011. - Т.13. - №4-5. - С.428.

12. Лазарева Ю.Ю. Особенности внутриклеточной продукции цитокинов цитотоксическими Т-лимфоцитами при гестозе // Ж. «Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии». - 2011. - №2/1(35). - С.42-43.

13. Лазарева, Ю.Ю. CD8+ лимфоциты на различных этапах дифференцировки при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова, И.А. Панова // Бюллетень ФЦСКЭ им В.А. Алмазова. - 2011. -Прил.4. - С.66.

14. Лазарева, Ю.Ю. Особенности проявления функциональной активно-

ста и дифференцировка клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов при гестационной артериальной гипертензии и преэк-лампсии / Ю.Ю. Лазарева, Н.Ю. Сотникова, A.B. Кудряшова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2012. - №4(41). - С.131-132.

15. Лазарева Ю.Ю. Влияние in vitro IL-2 и микроворсин хориона на функциональную активность периферических ЦТЛ при неосложнен-ной беременности и при гестозе // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т.7(16). - №2-3. - С.278.

16. Лазарева, Ю.Ю. Параметры апоптоза периферических CD8+ лимфоцитов при гестозе / Ю.Ю. Лазарева, И.А. Панова // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т.7(16). - №2-3. - С. 278.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

CD - кластер дифференцировки лимфоидных клеток

GrB - Granzyme В

IFNy - интерферон у

IL-2 - интерлейкин 2

Perf — Perforin

Tn - наивные клетки

TNFa - фактор некроза опухоли a

Tcm - ценральные клетки памяти

Теш - претерминально-дифференцированные клетки памяти Тешга - терминально-дифференцированные клетки памяти