Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние хорионического гонадотропина на антигеннезависимую дифференцировку Т-лимфоцитов и функциональную активность нейтрофилов человека

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УрО РАН

ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА АНТИГЕННЕЗАВИСИМУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ Т-ЛИМФОЦИТОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор С.В.Ширшев

Пермь - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список основных сокращений............................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................. 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ГОРМОНЫ РЕПРОДУКЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННЫХ ПРОЦЕССОВ.................................................................................. 10

1.1. Характеристика иммунной системы в период беременности.......... 10

1.2. Гормоны и белки беременности как регуляторы иммунных реакций..................................................................................................... 15

1.3. Роль хорионического гонадотропина в регуляции иммунитета....... 19

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................... 30

Глава 3. РОЛЬ ХГ В АНТИГЕННЕЗАВИСИМрЙ ДИФФЕРЕНЦИ-РОВКЕ Т- ЛИМФОЦИТОВ И ИХ АКТИВАЦИИ ДНА РАЗНЫХ СТАДИЯХ СОЗРЕВАНИЯ........................................................................ 40

3.1. ХГ как регулятор дифференцировки и пролиферации тимоцитов... 41

3.2. Влияние ХГ на пролиферативную активность МПК..................... 50

3.3. ХГ-зависимая модуляция уровня сАМФ в Т-лимфоцитах перифе-

рической крови............................................................................... 51

Глава 4. ХГ КАК РЕГУЛЯТОР ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ.......................................................... 58

4.1. Влияние ХГ на основные функции нейтрофилов......................... 58

4.2. Влияние женских половых стероидов на чувствительность нейт-

рофилов к действию ХГ..................................................... 73

4.3. Роль циклооксигеназы нейтрофилов в реализации гормональных

эффектов........................................................................ 86

4.4. ХГ-зависимая регуляция пролиферативной активности МПК

в присутствии аутологичных нейтрофилов. Роль циклооксигеназы..... 90

4.5. Влияние ХГ на уровень цАМФ в нейтрофилах человека................ 91

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................... 98

ВЫВОДЫ............................................................................ 106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................... 107

Список основных сокращений

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

АОК - антителообразующие клетки

АФП - альфа-фетопротеин

АЦ - аденилатциклаза

АЭТ - аминоэтилизотиурониум бромид

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг гормон

ДН-тимоциты - дубль-негативные тимоциты (СБ4 СБ8 )

ДП-тимоциты - дубль-позитивные тимоциты (СБ4+СБ8+)

ЕК - естественные киллеры

ИФЗ - инозитол 1,4,5-трифосфат

ИФНу - интерферон гамма

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ЛГ/ХГ-Р - рецептор для лютеинизирующего гормона и хорионического хонадотропина

ЛЗХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция

МкАТ - моноклональные антитела

МПК - мононуклеары периферической крови

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

НСТ- нитросиний тетразолий

ПГЕ2, ШТ2а - простагландины Е2 и 2а

ПИБФ - прогестерон-индуцируемый блокирующий фактор

ПКА - протеинкиназа А

ПКС - протеинкиназа С

ПЛ - пролактин

ППС - полная питательная среда

РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

CKJI - смешанная культура лимфоцитов

Txl, Тх2 - Т-хелперы 1 и 2 классов

ФГА - фитогемагглютинин

ФИФ2 - фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат

ФЛС - фосфолипаза С

ФНО - фактор некроза опухолей

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХГ - хорионический гонадотропин

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

ЭБ - эритроциты барана

АР-1 - транскрипционный фактор

CD (clusters of differentiation) - мембранные маркеры лейкоцитов Con А - конканавалин А G - ГТФ-связывающий белок FITC - флуоресцеинизотиоцианат

HLA - антигены главного комплекса гистосовместимости NFAT - транскрипционный фактор РЕ - фикоэритрин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Иммунная система матери в период гестации испытывает значительное влияние со стороны репродуктивных гормонов, в том числе основного гормона беременности хорионического гонадотропина (ХГ). Известно, что наряду с регуляцией стероидогенеза плаценты и плода, гормон активно участвует в контроле иммунных процессов [29,31,125,150,203,351]. На сегодняшний день некоторые эффекты ХГ изучены достаточно полно и не вызывают сомнений, однако создание более четкого представления о роли гормона в перестройке иммунной системы при беременности требует дальнейших исследований в данной области. В первую очередь это относится к тимическому этапу дифференцировки Т-лимфоцитов, который связан с формированием основных Т-клеточных субпопуляций и определяет в конечном счете как клеточноопосредованный, так и гуморальный иммунитет. Известно, что лютеинизирующий гормон, структурный аналог ХГ, спонтанно секретируется тимоцитами [278,282], а сам ХГ выявляется в фетальном тимусе в концентрациях, указывающих на его аккумуляцию и/или секрецию в этом органе [159]. Необходимость изучения дифференцировочной активности ХГ диктуется также и тем, что до сих пор анализ влияния репродуктивных гормонов на тимус ограничивался оценкой его массы, клеточности или секреторной активности и не затрагивал собственно дифференцировки Т-клеток. Исследование роли ХГ в этом процессе важно для понимания механизмов, контролирующих иммунный ответ при беременности и становление иммунной системы в эмбриогенезе.

Система неспецифической защиты организма и, в частности, нейтрофилы как ее основные эффекторы также практически не изучены в плане регуляции их ХГ, хотя имеющиеся в литературе данные указывают на активное участие гормона в контроле функциональной активности данных клеток. ХГ является сильным хемоаттрактантом для нейтрофилов [268] и ответственен, по крайней мере частично, за лейкоцитарную инфильтрацию тканей репродуктивного тракта [66,244,327,339], в том числе и

фетоплацентарной единицы. Учитывая активное участие нейтрофилов в отторжении тканевых трансплантатов [243], можно говорить об исключительной важности изучения роли ХГ в регуляции функций этих клеток, а оценка иммуномодулирующей активности гормона на фоне женских половых стероидов позволила бы более объективно судить об эффектах ХГ на уровне организма.

Поскольку известно, что функции Т-лимфоцитов и, в частности, их пролиферативная активность эффективно регулируются нейтрофилами [257], а некоторые эффекты ХГ реализуются только в присутствии акцессорных клеток [32], анализ влияния гормона на Т-клеточное звено был бы существенно дополненен исследованием роли аутологичных нейтрофилов в реализации гормональных эффектов.

Целью работы являлось изучение роли ХГ в Т-клеточном онтогенезе и регуляции функциональной активности лейкоцитов периферической крови. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. Оценить регуляторную активность ХГ в отношении Т-лимфоцитов человека на разных стадиях созревания.

2. Изучить влияние ХГ на функциональную активность нейтрофилов человека и модуляцию гормональных эффектов женскими половыми стероидами.

3. Исследовать роль аутологичных нейтрофилов в ХГ-зависимой регуляции функций Т-лимфоцитов периферической крови.

4. Изучить некоторые внутриклеточные механизмы реализации гормонального сигнала в Т-лимфоцитах и нейтрофилах человека.

Научная новизна работы. Впервые продемонстрировано участие ХГ в контроле процессов дифференцировки и пролиферации тимоцитов. Показано, что влияние гормона на Т-клеточное звено иммунитета может реализоваться в том числе и на этапе тимической дифференцировки. Выявлена зависимость эффектов ХГ на Т-лимфоциты от дозы гормона, стадии дифференцировки клеток и их активации.

Новыми являются данные о регуляции гормоном функциональной активности нейтрофилов, которая может быть одним из механизмов снижения антимикробной резистентности при беременности. Выявлена зависимость иммуномодулирующего действия ХГ от пола человека, фазы менструального цикла и активности женских половых стероидных гормонов. Показано участие продуктов циклооксигеназы нейтрофилов в реализации эффектов ХГ как в самих нейтрофилах, так и в Т-лимфоцитах периферической крови и возможность их опосредования внутриклеточным цАМФ.

Теоретическая и практическая значимость. В теоретическом плане работа позволяет создать более четкое представление о контроле иммунной системы репродуктивными гормонами, раскрывая новые механизмы иммуномодулирующей активности ХГ, женских половых стероидных гормонов и их сочетаний, характерных для физиологически протекающей беременности.

Полученные результаты должны учитываться при беременности и различных патологических состояниях, сопровождаемых эктопическим синтезом гормона в организме, а также в случае терапии препаратами на основе ХГ и женских половых стероидов.

Положения, выносимые на защиту:

1. ХГ стимулирует фенотипическое и функциональное созревание СБ4+СБ8+ -клеток, но не оказывает дифференцировочного влияния на раннюю субпопуляцию С04=СБ8=- тимоцитов. Гормон индуцирует продукцию С04СЮ8=- клетками аутокринных ростовых факторов и угнетает пролиферативный ответ на ФГА С04+СЮ8+ -тимоцитов и Т-лимфоцитов периферической крови. В последних эффекты гормона сопровождаются повышением уровня цАМФ.

2. Физиологические дозы ХГ угнетают основные функции активированных нейтрофилов: экспрессию адгезионных молекул, фагоцитоз, продукцию активных метаболитов кислорода и азота, а также модулируют

уровень цАМФ в этих клетках. Эффекты гормона зависят от пола человека, фазы менструального цикла и регулируются женскими половыми стероидными гормонами.

3. Антипролиферативное действие ХГ на периферические Т-лимфоциты существенно усиливается в присутствии аутологичных нейтрофилов и зависит от активности циклооксигеназы в этих клетках.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Результаты работы представлены на Международных конференциях "Проблемы загрязнения окружающей среды-98" (Москва, Россия, 1998) и "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, Россия, 1998); 6-м Международном экспертном форуме по иммунотерапии и генной терапии (Флоренция, Италия, 1998), III Международном конгрессе по патофизиологии (Лахти, Финляндия, 1998).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 20 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 353 источника.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1

ГОРМОНЫ РЕПРОДУКЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННЫХ

ПРОЦЕССОВ

1.1. Характеристика иммунной системы в период беременности

Вследствие экспрессии клетками плода отцовских антигенов благополучное течение беременности требует эффективных регуляторных механизмов для предупреждения возможных антифетальных иммунных реакций. Анализ литературных данных показывает перестройку различных звеньев иммунной системы в этот период, не обязательно связанную с иммуносупрессией.

Физиологическая беременность сопровождается временной инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы [274] и клеточности [99,253,273,274,292], главным образом за счет атрофии коркового слоя [99] и истощения популяции кортикальных тимоцитов [253,292]. Одновременно отмечается гипертрофия медуллярного слоя тимуса [99]. Пролиферативная активность тимоцитов in vitro угнетается плацентарными (трофобластными и децидуальными) клетками [283] и их супернатантами [213]. Снижение клеточности органа и пролиферации тимоцитов показано для второй половины беременности, причем выраженность процессов последовательно нарастает, тогда как на раннем этапе отмечается обратный эффект, который, возможно, является ответом тимуса на оплодотворение и имплантацию [99].

Селезенка и регионарные лимфоузлы при беременности по одним данным не изменяются [292], по другим - увеличиваются в размерах [55,218]. Сведения по численному составу иммунокомпетентных клеток периферической крови в этот период также противоречивы: общее количество лимфоцитов не изменяется [170,264,292] или снижается [22,23,337,338] при относительном уменьшении доли Т-клеток [22]. В популяции Т-лимфоцитов соотношение CD4+/CD8+ -клеток остается прежним [170,323,337], однако

имеются данные о снижении доли цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ (СБ8+86Р1+)) и повышении количества Т-супрессоров (СБ8+86Р1~) [214]. Кроме того, в период гестации в периферической крови снижено число клеток, несущих рецептор для ИЛ-2, который рассматривается как активационный маркер лимфоцитов [170,214]. Поскольку ЦТЛ являются важнейшими эффекторами реакций отторжения тканевых трансплантатов [243], снижение доли этих клеток и уровня их активации, очевидно, имеет значение для благополучного развития плода.

Беременность сопровождается изменением активности Т-клеточного звена иммунитета: реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) значительно снижена в этот период [292], а пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на митогены и аллоантигены угнетается аутологичной сывороткой [214,279] и супернатантами децидуальной ткани [213]. Последняя, кроме того, существенно снижает генерацию ЦТЛ [213]. Поскольку удаление сыворотки отменяет супрессивный эффект [72,214,262], полагают [214], что в период гестации Т-лимфоциты периферической крови сохраняют функциональную активность, а угнетение Т-клеточных реакций на уровне организма связано с действием сывороточных факторов. Кроме того, при беременности материнские Т-лимфоциты приобретают временное состояние специфической толерантности к отцовским НЬА-антигенам: в отличие от сингенной беременности, мыши, несущие полуаллогенный плод, имеют сниженное число Т-клеток, реактивных к данным антигенам и не отторгают опухолевые трансплантаты, экспрессирующие отцовские НЬА, тогда как после родов фенотип и реактивность клеток восстанавливаются [310].

Важнейшей особенностью функционирования Т-клеточного звена при беременности является изменение в соотношении двух основных субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов - Т-хелперов 1 и 2 класса (Тх1 и Тх2), различающихся набором секретируемых цитокинов и стимулирущих соответственно клеточноопосредованные и гуморальные иммунные реакции

[179]. Антигензависимая дифференцировка Т-лимфоцитов в период беременности приводит к преимущественному развитию Т-хелперов 2 класса [179,341], причем переключение иммунного ответа способна индуцировать даже оплодотворенная яйцеклетка [171]. Снижение уровня Тх1-цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-12, ИФНу), по-видимому, предупреждает отторжение плода, связанное с активацией главным образом клеточноопосредованных реакций, тогда как повышение продукции Тх2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13), оказывающих трофическое действие на фетоплацентарную единицу и, более того, секретируемых самой плацентой [26], имеет важное значение для роста и развития плода. С этой точки зрения, неудивительно, что спонтанные аборты ассоциированы с повышенным уровнем Тх1-цитокинов [254,267,307].

Вышеописанные изменения в развитии Т-хелперных субпопуляций, по-видимому, объясняют тот факт, что, в отличие от клеточноопосредованных реакций, гуморальное звено иммунной системы в период гестации остается функционально полноценным, о чем косвенно свидетельствует продукция анти-НЬА-антител, более интенсивная у многорожавших женщин [123]. Общее содержание иммуноглобулинов класса М, А, О в крови беременной женщины, несмотря на высокий титр анти-НЬА-антител, остается на уровне здоровых доноров [20,23]. Как и большинство иммунных реакций, гуморальный ответ организма зависит от срока гестации. Как правило, он повышен в начале беременности, а впоследствии не изменяется или незначительно снижен [124,172,296]. Полагают [11], что стимуляция гуморального ответа в ранние сроки беременности является одним из механизмов, компенсирующих угнетение клеточноопосредованных иммунных реакций, и направлена на повышение резистентности к инфекционным агентам. Необходимо упомянуть и о том, что иммунизация беременных мышей фетальными лимфоцитами, но не клетками взрослых животных, вызывает у них преимущественное образование иммуноглобулинов в! изотипа [94], не способных связывать комплемент, что позволило авторам сделать

вывод о направленном переключении изотипа антител во время беременности. Поскольку иммуноглобулины подкласса Gi способны проникать через плаценту и акцептироваться клетками плода, было высказано предположение о том, что антитела данного изотипа выступают в качестве молекулярной защиты плодных антигенных детерминант от материнских эффекторных клеток [64,65], и, более того, являются специфическими индукторами роста и дифференцировки плодных клеток и тканей [11]. Возможно, этим объясняе