Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Дифференциальные потенции стромальных фибробластов кроветворных ... органов и их роль в формировании гемопоэтического, ...ологического микроокружения

РГ8 М 1 5 MAR 1393

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕЩЭДИШКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ - ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИШНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ЧАЙЛАХЙЯ РУБЕН КАРЮШЧ

да -Jb/Wl ПОТЕНЦИИ СТОГЛАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

КРОЕЕТ. БОРНЫХ , ' "АНОВ И ИХ РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ГЕМОПОЭТИЧ""' » ЛОГИЧЕСКОГО ШКРО ОКРУЖЕНИЯ

~ аллеРгология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени . почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук,

профессор А.Я.Фриденштейн

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик АЕН РФ,

профессор А.А.Ярилин

доктор медицинских наук, академик АЕН РФ,

профессор Б.Б.Перпган

доктор медицинских наук Н.А.Торубарова

Ведущая организация: Российский Государственный медицинский университет

Зашита состоится 1993 г.

в ^^часов на заседании Специалмированного совета *

Д.001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН (123093, Москва, ул. Гамалеи, 13)

С диссертацией (ложно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

.„ж /е

Автореферат разослан __1993 г.

Учешй секретарь Специализированного совотс доктор медицинских на^к Е.И.КОПТЕЛОВА

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Изучение кроветворного и линфоидного «сроокружения является одной из актуальных проблем современной длунологии. Кроветворение и лимфопоээ, т.о. размножение и дкффв-знцировка геьюпоэткческих и пмиуно компетентных клеток, происхо-ît только в определенных органах, ко территории которых действу? строиальное шкроокружение, обеспечивающее условия для созра-зния кроветворных и лтафоидных клеток.

Исследования гемопоэтического а иммунологического шкроокру-зкия, интенсивно проводите в последило года, выявили новые йе-знизш взаимодействия строгальных и кроветворных клеток, указы-зюлле на то, что через строгальное микроокруяение могут быть ¡уществленк направленные воздействия на иммунитёт и кроЕСТВоро-îe /ФриденлтеЗн А.Я. и др., I968-IS92; Чертков И.Л., Фрэденш-5йн А.Я., 1370,1977; Старостин В.И., Мичурина Т.В.,-1977; Чорт-)В И.Л., Гуревич O.k., 1984; Curri J. et al. , 1957; Bernstsia 3, 370; Trentin J. , IS70; Wolf N. , 1973-1979; Bentley S. . IS32, 534; Dexter T. ■ , I976-I99I; Whitlock et al. , IS84, IS87).

Основу микроокруг.ення составлявт глпогае категории клеток: тдотелиалыше, ретикулярные, фибробласты и макрофагальнне оле-знты. Важным компонентом структурной организация строгального псроокружокия явюхотся вкеглеточннЯ мэтрпкс, синтезируем, ï, : поено м, стромальшии клеткаш, через которой они опосредуют зое действие на кроветворша гл'зтки-предаеотЕенники /iiingueli, ax-dy , 1939; Dorshkind et al. , I9S0/. Он представлен различиы-i типами кодлагега, фибропсктином, протеоглпканамп, пышная го-зран-сульфат, хонд|иит:1К-суль$зт и глюкурокоьую кислоту. Уста->влено, что один из классов протеогликаков, а именно гепзрак- . гльфат, монет селективно ежзнвагь гемошзтическяе факторы рос-з и предъявлять их гемопоэтпческим клегкглнпредаестЕвняикам.По-ззано, что фибронок-тиковыа компонент кзтрпкеа :.шет регулировать )зревание эритровдных клеток, а гемонвктин участвует в спэцифи-гском СЕЯЗывгнии гранулоцктаргак предшественников / Zuckerman , icha , 1983; Patel, Lodish , 1986; Gordon nt al. , 1987,1988;. oulonbel et al.', K88; Boberts et al. , 1988; Ruoaiathi ,1389; 'orok-Storb , Ï923; Anklesaria at al. , 1932/.

Приведегахо данные свидетельствуют об активном учг«~тии строчного ыакроокрузэякя и продуцируешь им факторов в рзхующип змопогза. Лэдэйгсл ркудяцяя, основанная на ^ункционироглгош

многих факторов стромалького микроокружения, обеспечивает в органах кроветворения и иммунитета интенсивно протекающие процессы пролиферации я дифференцировал, с быстрым сдвигом в составе клеточных популяций в момент повышенного запроса. Действие их направлено на ксммитированные клетки-предыественники и распространяется на все территории кроветворной ткани Altus, Bernstein ',1971;

•Harigaja, Handa ,1985; Song et al. ,1985; Rennick et ai. ,1987/.

Эпягеномнкз факторы, воздействующие на стволовые кроветвор-. ные клетки (СКК) в юмент выбора ими направления дифференцировкк, носят локальный, короткодистантный характер и связаны с жизнедеятельностью гемопоэтической стромы кроветворных органов или всей системы, объединяемой понятием кроветворного микроокрузкения.

Дискримектный иммунологический анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга и кроветворной ткани радиохимер показал,что клетки, переносящие микроокружение, имеют происхождение, гистоге-нетячески. отличное от стволовых кроветворных клеток / Фридекштейн А.Я. и др.,1968-1971; Куралесова А.И.,1971/.

-Это явилось обоснованием поиска клеток, переносящих микроокружение, не среди кроветворных, и лимфоидных клеток, а среда стро-калышх элементов органов гемо- и лж1фопоэза. Необходимость данной работы определялась отсутствием сведений о клеточном состава и функциональных возмозностях отдельных категорий клеток, объединенных понятием "стрэмалькое мккроокружение". Получение этих данных обеспечило бы выявление клеток, ответственных за перенос и организацию специфического микроокружения в органах гемопоэза и иммунитета, их идентификацию, анализ нх пролиферативкых и диффе-ренцировочных потенций, что способствовало бы ремекито одной из актуальных проблем иммунологии и созданию концепции кроветворного и лимфоидного ыикройкрукенпя.

Долг» и задачи исследования. Цель настоящего исследования состоит з определении, какие именно клетки в кроветворных н лимфо-идных органах способны обеспечить создание специфического тро-окруяекяя и выяснить, годдеряивзются ли во взрослом организме строыэль'ные клеточняо .танки, разработать методы* их кулътивпрова-кия и ргтраноплактащы э. организм, обеспечивающие образование ко бух кроветворных к лиьфоздных органов.

В соответствий с этлы решались следующие задачи: J. РэзтипЛпч'ат» wft4*o,i.; vтльтилмтювяH'iff г:тро>гJ.rr^vvx клеток крорч-?:<орчсй I' ТК5НК, ответственных за организации с по-

цкфпческого микроокружения.. ' , Выяснить иролиферативные потенции стромальных колониеобразую-щих клеток костного мозга и селезенки к возможность получения в культурах диплоидных штаммов этих клеток. Определить кинетику роста и условия, влияющие на увеличение численности клеток в таких штаммах.

, Изучить, происходит ли при развитии штаммов стромальных фибро-бластов в культура нарастание численности клеток, переносящих кроветворное и лк.-дфоидное минроокруяение. Разрабо тать метод обратной трансплантации в организм штзммое стромальных фибробластов кроветворных и лимфеидных органов, ' который обеспечивал бы их приживление и формирование новых органов кроветворения и иммунитета.

Исследовать структуру 1фоветворных и ликвидных органов, которые формируются при трансплантации штаммов стромальных фибро-бластов, в том числе характер дифференцирован в этих органах кроветвор1шх и лимфоидных клеток.

Путем анализа мошклональшх штаммов, полученных из.индивидуальных клеток, образующих колоши фиброоластов (КОКф), определить, существует ли внутриорганная мозаичность КОКф по диффе-ренцировочным потогсдош и способности создавать юткроокруЕопие для разшх направлений дифференцировки кроветворных и лимфоидных меток.

Новизна получениях результатов. Результаты, полученные в дан-й работе, явились определявшими в развитии нового направления следований - изучения шкроокругения в органах гемо- и лимфопо-а. Работа'выполнена на впервые выявленной категория стромальных етох-предаественникоз, ответственных за организацию мпкроокру-1шя в этих органах.

Разработана модель избирательного кло!шровзнля в мокослойкых ль турах стромальных клегок-предазственников, позволяющая кзу-ть их численность, свойства, пхелиферзтивше и дафференцировоч-о потенции.

Епергые установлено, что поток® строгальных клеток-предге-ьеккиков, вырастающие в таких культурах, могут бить рззмкокены виде диплоидных ктаммов стромальных фпбгсбластсв, и что обрат-я транешгантация этих итоммов обеспечивает ¡форгллроваг-е новых га но б кроветворегая 'л имг'ут'.тета.

Иго веденный кзриологичеекий анализ стромалышх и кроветгор-

них клеток в гетеротспных трансплантатах костного мозга показал, что строкальные фибробласты представляют сздастоятельную линию клеток, гистогенетически независимую от стволовых кроветворных клеток.

Впервые показано, что строыаяыше клетки костного мозга, обладающие остеогеккыми свойствами, имеют высокий пролиферативкый потенциал, а их остеогеннае потенции нг теряются в процессе культивирования. Пройдя а культурах более 30 удвоений, они сохраняют способность к построению ретикулярной; костной и хряцевой тканей, причем масса костной ткани, которую они могут построить, в десятки т^сяч раз превышает ее содернакие в костномозговых органах.

Получены ш но кло на льны е по строме костномозговые органы и изучена дкфферепцирозка кроветворных клеток в таких органах. На основании клональкогэ анализа среди стромэльных клеток-предшественников костного газга впервые выявлена категория бипотенцкаль-пых клеток, потомки которых могут формировать как костнуз, так и хрящевую ткань. Зги данные впервые доказывают, что костная и хрящевая ткани в организме имеют общего предшественника, и что стро-малыше клеткз-предшестьенники костного мозга являются претендентами ка роль стеолоьых клеток сгромальной ткани.

Впервые доказана возможность получения в культурах штакмов стромальных клеток ли.\фоздных органов и способность их при обрат-'ной трансплантации в организм формировать строму лимроидкых органов. Заселяющие вновь образованные лимфоадные органы Е-лим$оцкты при активировании антигеном проходят.весь путь дифференцкровки вплоть до антителообразуэдих клеток.

Изучена реакция строгальной ткани на процесс регенерации костного мозга. Показано, что регенерация кроветворного микроокру-кения при механической травме костного мозга сопровождается не только перестройкой стрэмы в погрэндеикой области, по даеет уес-то системный ответ.етромалъкой ткааи органов г с.'.я- и лимфопоаза-

Ид^но-1гдзк'пгч?Слйп значимость гзботы. Используя разработанный г/етод ко послойного культивирования клеток органов кроветворения и иммунитета, впервые удалось вийБ>:ть новую категорию строгальных клсгтог.-пре/дсстЕенкиков, ответственных за организзага и поддержание кровэтгярного и лимфоидного (.мкросг.руг.енкя, установить хдокальнуа природу образуемых ими колоний фибрсблзсгов, и доказать, пто строча «•""""тшьа гкстсгеавтетес-

ки независим от суголлънх клс-ток. Полутени даиас-

ие штаммы стромальных фибробластов, сохраняющие после длитель-о культивирования свои дифференцировочные,потенции. Показано, не только диплоидные штаммы, образованные десятками КОКф, но втомки одной стромальной клетки-предшественника способны пере-ить специфическое микроокружение и формировать новые кроветво-е органы, моноклональные по строме. Впервые установлено, что тная и хрящевая ткани происходят во взрослом организме от обо предшественника. Результаты исследования позволяют считать, в популяции стромальных клеток-предшественников присутствует егория клеток, которые по своим пролиферативным и дкфференци-очным потенциям являются претендентами на роль стволовых кле-стромэльной ткани и обеспечивают при обратной трансплантации рганизк образование костной и хрящевой, а также ретикулярной ни, пригодной для заселения кроветворными и иммуно ко мпете нтны-клетками. Стромальнке клеточные линии подцерживаются во взрос-организме, что дозволяет моделировать в эксперименте генез эпоэтического и иммунологического ми кро о хру же гая и анэлизиро-ь его клеточные и молекулярные, механизм. Это открывает, путь к усственному созданию у взрослых млекопитающих кроветворных и ^юйдкых органов заданного состава. .

Шсокий пролиферативный потенциал и выраяепные остеогенные енпии костномозговых стромальных фибробластов,. которые сохра-тся при длительном культивировании, позволили совместно с ¡КТО разработать и внедрить в практику здравоохранения "Способ зния дефектов костей" (авторское свидетельство й 1400616 от 3.88 г.), который предусматривает зутотранспланташто в область гного дефекта выращенных и размноженных в культурах остеоген-стромалышх клеток костного мозга. Метод п* лучил широкое ири-ние, был представлен на ВДНХ СССР и удостоен серебряной г.: еда ли зтановление от 25.09.88 № 959-Н). Разработанный метод культи-звания стромальных клеток-предшественников кроветворных и лим-цных органов широко используется как в экспериментальной рабо-так и в практическом здравоохранении (в Гематологическом на-зм центре РАМН, Центральном институте травматологии и ортопе-им.ПриороЕа РАМН, Ереванском НИИ травматологии и ортопедии РА, Институте медицинской радиологии МЗ РФ, Киевском институте эпедии 1.13 РУ, а также в ряде зарубежных стран - США, Англия, аиль и др.).

Материалы диссертации включены в отечественные к зарубежные

монографии ("Руководство пр гематологии" под ред. А.И.Воробьева, М., 1987 г,; "Гистология" А.Хэм, Д.Кормах, М.,"Мир",1983 г.; Фри-денштейк А.Я., Ладынина К.С. "Индукция костной ткани и остеоген-ные клетки-предаественкики", М.,"Медицина",1973 г.; И.ЛЛертков, А.Я.Фридекштёйн "Клеточные основы кроветворения", М.,"Медицина", 1977 г.; А.Я.Фридекштейн, Е.А.Лурия "Клеточные основы кроветвор-. ного кикроокрукеняя", И.,"Медицина",,IS80 г.), а также в курс лекций го иммуноморфологии в МГУ им.М.В.Ломоносова и ЦИУВ г.Москва.

АттробЗц'ля диссертации, ддсеергаЦия ацрйбкроьаиз иа конференции отдела иммунологии НИИЭ1! им.Н.Ф.Гамалеи РАМН II толя 1990 г.

. ■ •. Основные положения диссертационной работы доложены и обсувдены на международных, всесоюзных съездах, конференциях и симпозиумах, заседаниях.научных обществ, перечень которых приведен в конце автореферата.

Публикэцга. Основные полозения диссертации опубликованы в 42 научных работах.

Структура и объем диссертации. Работа написана по традиционному алану к включает следующие разделы: "Введение", "Обзор лите-ратурк"(3 главы), "Материалы и методы", "Собственные исследования"^ глав), "Обсуждение", "Вывода" и "Список литературы (446 источников). Работа иллюстрирована 37 рисунками и 25 таблицами. Общий объем диссертации 263 страницы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе были использованы кролики калифорнийской породы, морские свинки линии Huston , беспородные морские свинки, мыши линии СЕА, крысы линии Wistar и August «. Эксплантационннй материал. Под общим немгЗуталовым наркозом у кроликов удаляли селезенку или часть ее, резецировали фрагменты крыла тазовой кости и теменной кости или отсасывали костный мозг из бедренной кости. Во всех остальных случаях материал получали от животных, умерщвленных эфиром. .

Костный мозг выскабливали из предварительно расщепленных плоских костей, а содержимое селезенки выдавливали из капсулы в питательную среду.

При механическом способе приготовления суспензий фрагменты • костного мозга и селезенки пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл. При энзиматическом способе -

)слз измельчения ножницами фрагменты тканей двукратно обрабаты-5ли трипсином. ,

Готовые суспензии клеток фильтровали через 4-слойный капро-«вый фильтр, после отмывки ресуспецдировали в свежей среде и по-¡читывали количество живых клеток в камере Горяева. ■сплантация клеток. Для определения эффективности колониеобразо-|ния (ЭКОф) и получения моноклоналышх штаммов одинаковое коли-ство клеток исследуемой суспензии помещали в 3 матраса с пло-дью дна 25 см**. Костный мозг эксшгантировали по 2-4x10^ клеток/ , а селезенку - по 2-5х104 клеток/см2. Через 2 часа среду слили, матрасы промывали, заливали свеяей средой и добавляли по . ' клеток костного мозга, облученного 60 Гр, в качестве фидера.

Для получения поликлоиальных штаммов использовали матрасы с эщадью дна 80 или 1ЭЗ см^ и в 2-4 раза более высокую зкспланта-знную плотность клеток.

В качестве культуральных сред использовали at. -MEM. RPKT-Чбед, ! F-I2 НАМ ( Signa или Flow) с добавлением 20 % эмбриональной юротки коров (ШИЭМ им.й.ФЛ'амэлеи РАМН), а также пешщиллина :трептомицина по 100 ед/мл.

(счет колоний. 12-14-дневные культуры фиксировали этанолом или малином и окрашивали азур-эозином по Ромзновскому-Гимза. Число осиих дискретных колоний, содержащих 50 и более фибробласт^, считывали под бинокулярной лупой.

сщзование фибробластов. Поликлокальные штаммы получали, пасси-: все колонии фиброблестов из 2-кедельккх культу (первичных) с ощыо 0,1-0,25 % раствора трипсина. Необходимое количество кле-переносили в новые матрасы. Do достижении плотного монослоя робластов повторные пассажи проводили тем жп способом.

Коноклоналыше штаммы получали, снимая яелатиповими губками явидуалькиз колонии округлинлихся клеток с поверхности мзтра-; обработанных трипсином в течение 1-3 мигу т. Клетки из каж-губки. вымывали з отдельную лунку, где культивировали в прк-:-твии облученных фидерных клеток до образования плотного моко-

-Далее клетки пассировали без добавления фидера на большую цадь.

ипл,оптация клеточт.'х взвесей. Взвеси сваяеЕццеленных костномо-вых меток или. выращенных строыальных фабробластов »/сдали в тоновые или желатиновые губки, в инактнвированнкй губчатый ко-1й мзтрикс, в плазменный сгусток, в костный чехол или диффу-

зионные камеры из миллипоровых фильтров НА (0,45 мк) объемом 0,015 см3- тип А или объемом 0,15 сы3- тип 0. Диффузионные камеры имплантировали животным внутрибрюшинно, все остальные аутотрансплантаты помещали под почечную капсулу. Через 30-90 дней трансплантаты фиксировали и подвергали гистологической обработке, а также определяли вес костной и хрящевой ткани. •

Наркологический анализ. 3 работе использовали метод Ford-et al. /1958/, модифицированный для исследования стромальных фибробластов. Идентификации X и У-хромосом были подвергнуты кроветворные клетки и стромальные фибробласты индивидуальных колоний и моноклональных штаммов, полученных из смешанных культур костного мозга самцов и самок кроликов, а также из гетеротопных костномозговых трансплантатов линейных морских свинок.

Определение числа ентителообрззуших клеток (А0Ю. Число АОК з селезенке, трансплантатах селезенки и лимфоидных органах, образованных выращенными в культурах строыальныки фибробластами селезенки, определяли по методу Jerne, Nordin /1563/.

Метод кмретажз. Опустошение медуллярной полости большеберцовых, бедренных и плечевых костей морских свинок проводили по методу Knospe et ai. /1973/ иод общим наркозом.

Статистическая обработка •результатов. Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стыодента. Разница считалась достоверной, если уровень значимости не превышал 5 % (Р 0,05).

3. СОВЗТЕЕНШЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОЩУЩЕНИЕ

3.1. СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕ'ГКИ-ГОЬЗДКВСТВЕННИКИ КРОВЕТВОРНЫХ И ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ

3.1.I. Кслониеобразующие свойства стромальных клеток-предшественников

. Методы клонирования клеток-предшественников кроветворной ткани, разработанные в последнее время, позволили выявить различные категории этих клеток, определить их концентрацию в костном мозге, изучить свойства, установить гистогенетическута принадлегность /Bredley ,1369; ?ike, Kobinsoa ,1970; Metealf, Moore ,1971; Metealf ,1977; и др./. I

Разработанный нами метод избирательного клонирования позволил выявить в мопослойных культурах клеток кроветворных и лимфокднюс органоЕ и охарактеризовать новую категорию клеток-предаественников,

9.

именно стромальнке клетки-предшесгвеннкки.

Формирование колоний стромалышх фибробластов было изучено в льтурах клеток костного мезга, селезенки, тимуса, лимфатических лов крыс, морских езинок к кроликов. Культуры клеток, экспланти-ваиких с оптимальной^плотностыо 104-10° клеток/см2 для костного зга и селезенки и Ю°-Ю6 клеток/см2 для культур тимуса и лимфа-ческих узлов, фиксировали в течение 14 дней ежедневно, начиная следующее дня после эксплантации.

Культуры в своем рззвитии проходят последовательные фазы мор-логических изменений. В первые часы и дни в культурах присутству-клетки с неизмененной морфологией и переживающие формы зрелых эточкых элементов, в следующей фазе развития в культуре начинает растать количество макрофагов. Последние, как правило, полностью гесняются бистро прелиферирующими фиоробластоподобными клетками, зало формирования колоний относится к 3-4-му дню, когда в культу-к наблюдазтея скопления фибробластов, состоящие из 4-8 клеток.По-з этого срока за счет активной пролиферации фибробластов происхо-р рост уже сформировавшихся колоний. На Я-12-й день образуются цимые невооруженным глазом дискретные колонии, состоящие из фиб-5ластоподобных клеток, число которых к 12-14 дню достигает несть ких тысяч клеток. Подобная картина характерна для культур кост-?о мозга и селезенки.

В культурах тимуса и лимфатических узлов у всох исследованных job животных почти отсутствует стадия образования макрофагов. На ie дегенерирующих лимфоцитов видны лишь единичные крупные фиброзе то подобнее метки, которые при последующем развитии культур разуют колонки.

В зависимости от экспланткруемого материала - костного мозга, 1езешш, тимуса, или лимфатических узлов - мы наблюдал!! разную зуктуру вырастающих колоний. В культурах костного мозга и тимуса i состоят из Ектянутых, плотно упакованных фибробластов, тогда с в культурах селезенки и лимфатических узлов фибрсбластьг более ¡пластаны, а образованные ими колонии более рыхлые. По своей эуктурной орга1газаш;и, морфологии, упаковке клеток и размерам юник различаются не только в культурах разных органов, но к Гтри отдельно взятой культуры, например, клеток костного мозга, гыпянство колоний состоит из типичных фибробластов. Однако гаечаются колонии, образованные фибробластаки, имеющими ромбо-XTiym ил-/ неправильную форму и организованными в колониях в виде зрепицы". В колониях фибробласты, как правило, располагаются в

ю.

несколько слоев, особенно плотных в центре колоний. Размеры колоний в пределах одной культуры могут колебаться от 0,2 до 1,0 см в диаметре, что свидетельствует об их разнокачественкости, хотя бы но пролиферативным потенциям. Колонии в культурах селезенки или костного мозга.разных лабораторных животных и человека морфологически неотличимы.

Цитологических признаков и энзимных маркеров, отличающих стро-ыальные клетки-предшественники гемопоэтических и лимфокдных органов у различных видов экспериментальных киеотшх, цитохимическими исследованиями обнаружить не удалось.

3.1.2. Клона ль ная природа колоний фкбрсбластрв, выращзншх в культурах

Установление.клональной природы колоний сдергало бы возможным определение численности и изучение пролиферативных и дифференаиро-вочкых потенций отдельных стромальккх предшественников. Поэтому необходимо было выяснить, являются ли колонии клеточными кленами, ~л соответственно все клетки, входящие в состаз колонии, потомка!,® одной колониеобразуюцей клетки.

Ранее были получены косвенные данные о том, что колониеобразу-зицая величина является постоянной, и что колонии образуются независимо друг от друга.

Хромосомный анализ в смешанных культурах селезенки от самцов и самок морских свинок показал, что колонии действительно являются клеточными клонами, т.е. производным сдной колониеобразущой клетки. Маркерами служили половые хромосомы XX или ХУ, по которым определял! принадлежность делящихся фибробластов либо самцу, либо самке. Были проанализированы 10 колоний, в каждой из которых было проидентифкцировако 3-5 мзтафазных пластинок. Оказалось, что каждая колония содержала клетки либо только сакцэ, либо тслькс самки. Это явилось первым прямым доказательством того, что каждая колония является клеточным клоком, т.е. образуется в результате размножения одной колокиеобразуащей клетки.

Эти данные были подтверждены при хромосомном анализе делящихся клеток 15 колотой в смешанных культурах мюток костного мозга от самцов к самок кроликов С табл. I). Колонии, которые содержали бы делящиеся клетки как самца, так и самки ял в смешанных культурах клеток с эле зе иск морских свинок, ни в лианных культурах клеток костного мозга кроликов не были об^груаенн.

Помяко анализа г/зтгфазных дл&етигаж в колониях иэрва«шгх

ультур проведен хромосомный анализ делящихся клеток 10 монокло-алышх штаммоЕ, полученных путем пассировз!шя индивидуальных коло-ий, выделенных из смешашшх культур костного мозга кроликов. В аддоц штамме было протипировано от 4 до 6 метафэзных пластинок.Де-яциеся клетки в 4 штаммах принадлежали самцу, а в 6 штаммах -эмке (табл. 2).

Таблица I

Хромосомный анализ фибробластсв в колониях смешанных культур клеток костного мозга кроликов

колонии I „ ! л 1 3 1 4 ■5 6 7 {8 <3 I у 10 |п| 12 13 15

:сло ис-

гедован-

IX мета- Ь 3«. 4 6 8 7 4 5 и) 7 7 4 6 8 8

13НЫХ

гастинок

самец 0 .3 4 0 Я 7 0 ■5 0 7 0 0 К 0 8

самка Ь' 0 0 5 С 0 "4 а та С 7 ? 0 3 0

Таблица 2

Хромосомный анализ фибробластов моеоклокэлышх штаммов из смешашшх культур костного мозга кроликов

штамма I ! ? ! 1 * 1 3 1 4 1 ^; 6 ! ?! в | 9 ТО

ело ис-

:едовэн-

х мета- 4 6 4 5 0 6 5 4 5 6

зных

астинок •

самеп 0 6 0 0 5 В 0 л 0 0

самка 5 0 г 5 0 С г) 0 0 £

Таким образом, данные, полученные при тшшровакки делящихся еток в колониях и моноклоналышх штаммах фибробластов костного зга и селезенки в смешанных культурах от самцов к самок, еввде-льствуют, что каждая колония является клеточным клоном, т.е. проходят от отдельной клетки-предшественника.

Установление клокальной природа колоютй позволяет исследовать еержакие клопогонных клеток-предаествекняков в различных клетсч-к популяциях и изненеш;е их численности при некоторые возде*!ст-тх на организм (облучение, иммунизация, кровопускаки-. и т.д.).

В то пре.'/л изучение пролиферативных и дчффорзгаировочных генгшй клдпвидуольшх клоков приблизит нас к поиимагсяо структур-

ной организации стромы кроветворных и лимфоидных органов и определит возможные пути воздействия на'ее формирование.

3.1.3. Концентрация клеток кроветворной и лим^оидной тканей, образующих колонии фибробластов (КОКф) в ыонослойннх культурах

Дискретный рост колоний фибробластов в монослойных культурах клеток кроветворных и лимфоидных органов (при оптимальной эксплан-тационной плотности порядка Ю4-Ю^ клеток/см2 площади культураль-ного флакона) обусловлен низкой концентрацией ..олониеобразующих клеток в этих органах.

Отмшение числа выросших колоний к количеству эксплэнтироиан-ных клеток характеризует эффективность колониеобразования (ЭКОф). По эффективности колониеобразования можно определить, сколько КОКф содержится в исследуемой суспензии и, зная, какую часть органа использовали для ее приготовления, .определить, сколько клоногенных клеток содержится в целом органе.

Для проведения исследований по определении содержания клоногенннх стромальннх клеток в органах гемо- и лимфопоэза была необходима система с устойчивой эффективностью клонирования, обеспечивающая линейную зависимость числа выросших колоний от числа експлапти-ровэнных клеток. Такая модель, созданная в лаборатории иммуноморфо-логии, основана на добавлении к эксплантированным клеткам облученных БО Гр фидерных клеток (Лацикйк Н.В. и др., 1986). При эксплантации взвесей кроветворных к лимфоидных клеток в присутствии облученного фидера показано, что в органах гемо- и лимфопоэза взрослых яивотннх кощентрация стромальных колониеобразующих клеток различ-. на: в костном мозге • . " ЗКОф составляет примерно 1,0-5,0 на Т.О"4, в селезенке -1,0 на КГ5, в тимусе и лимфоузлах - 1,0 на Ю-'.

Концентрация строгальных клеток-предшественников кроветворных к лимфоидных органов изменяется в течение низ ни животного. Это продемонстрировали данные экспериментов, в которых были использованы 7-, 35- и 70-днев1Ш£, а также годовалые крысы. Определение концентрации КОКф у 7- и 35-дневных крыс показало, что в эти сроет как в костном мозге, так и в селезенке их численность сохранялась на одинаковом уровне. К 70 дна число КОКф, по сравнению с их концентрацией у 35-дцеБких хкес-тных, уменьшилось в костном мозге на 30 %, а в селезенке - почти в 2 раза. КЬнцентрация КОКф в костном мозге годовалых крыс была з 2 раза меньше, чем у 7-днгьных. Возрастаю изменения кощонграцик коло.-шеобрагушйх кллхок ъ селезенке оказа-

ись более значительны: в течение первого года кизил их концентра-ия снизилась в 4 раза. .В целом, можно заключить, что концентрация ОКф выше и в кроветворной и ли мфо ид пой ткани в первые недели зкизни ивогных, но уже к концу Г-го года падает в несколько раз.

При сравнительном изучении концентрации КОКф а костном мозга ясских и трубчатых костей кроликов и морских свинок видно, что нет азлзчий как меяду одноименными костями, так и мезду бедренными и азовыми костями каадого из этих видов животных.

Полученные данные свидетельствуют, что в отдельных органах ро ват воре кия и иммунитета концентрация КОКф значительно отличается, аа изменяется в течете жизни аивотного, з также, как показано по-1нее, при различных воздействиях на организм.

3,1.4. Происхоздение клеток, образующих колонии фибробластов в «оноелейных культурах кроветворных и лимфоидных органов

Целью проведенных исследований явилось установление. гистогене-гческой принадлежности стромалышх клеток,- образующих колонии фиб-»бластов з монослойных культурах, путем кариологического анализа ;оватворных и стромалышх клеток из гетеротопных трансплантатов icTHoro мозга и костного мозга бедренных костей реципиентов, со-фзкацих эти трансплантаты. Работа выполнена на юрских свинках лиги Huston . Под капсулу почки самцов трансплантировали костный >зг из бедренных костей самок. Через 1-2 месяца трансплантаты-»едстазлялн собой хорошо сформированные костномозговые органы, по-1ытые костным чехлом я содержащие в среднем I, C-1, 5x10 кроветвор-'х клеток на трансплантат. Тяпированиа кроветворных клеток проводи через I и 3 месяца после подсадки костного мозга. Принадлея-стх. клеток устанавливали по половим - XX или УЗ - хромасомзм. сть клеточных суспензий экеллантировали в монослойнке культуры я получения штаммов стромальных фибробластов и последующего типи-вания клеток.

Данный кариологического анализа кетафазных пластинок кревет-рных клеток (табл. 3) показали, что все делящиеся клетки в бед-нном костном мозге реципиентов и в геторотопных трансплантатах, торые эти реципиенты имели под капсулой почки, содер^ти У-хромо-

т.э, принадлежали реципиенту. Стромальныв фибробльсты. БЫра-шшз из костномозговых клеток бедренных костей реципиентов, со-, раалн 7-хрсмосому, наличие которой свидетельствовало об их при-

надлекности к клеткам реципиента. Анализ 55 метафазних пластинок стромалышх фибробластов, выращенных из костномозговых клеток гете' ротопных трансплантатов, продемонстрировал их принадлежность донору, так /как все они содержали две X -хромосомы.

Результаты настоящего исследования показали, что стромальные клетки-предшественники и их потомки, формирующие колонии фибробластов в культурах, не образуются из СКК и имеют отличную от кровет- . верных клеток гистогенетическую принадлежность.-Стропильные клетки-предшественники реципиэкта не репопулируют гетеротопшй костномозговой орган, образованный донорскими стромальными клеткам, несмотря на то, что в трансплантат активно врастают сосуды из окружающей ткани и наблюдается значительный приток в эту область реципиентскю кроветворных клеток.

/ Таблица 3

Результаты наркологического анализа кроветворных и стромалькых клеток из гетеротопных трансплантатов и костного мозга бедренных костей реципиентов

Источник клеток Мета&азы с 2У-хромоссмами Метафазы о XX-хромосоками

Костный мозг из бедренных 76 * 0

костей реципиентов

Фиброблэсты пассаишх куль- 37 ■ 0

тур клеток бедренного кост-

ного мозга реципиентов •

Костный мозг из гетеротопных 78 0

трансплантатов

Фиброблэсты пассажных куль- 0 55

тур кдаток костного мозга из

гетеротопных трансплантатов

Примечание: а - количество исследованных мзтефззнкх пластинок .от А реципиентов

Полученные результаты свидетельствуют о том, что стромалыше клетки-предаестЕйЕпнка имеют независимое от стволовых кроветворных клеток гкстогекзткчесное происхождение.

Клетки, ооразующие колонии фибробластов (КОКф) к монослсйнкх

культурах, впервые были выявлены нами в костном мозге морских свинок /Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С.,1969/. В последующем они были выделены у мышей, крыс, хомяков, кроликов, собак и человека /Кузьмен-ко Г.Н. и др.,1971; Панасюк А.Ф. и др.,1971; Горбунова И.А.,1580; McNeil et al. ,1974; Castro-Kalaspine at al. ,1980/. Данные О КЛО-нальной природе колоний, полученные в аллогенной системе смешанных культур, были подтверждены Лаци;гак Н.В. и др./1987/ в сингенной системе (на мышах, несущих аутосомные маркеры). Использование модели культивирования стромальных предшественников в присутствии фидерных клеток /Лациник Н.В. и др.,1990; Priedenatein et al.,1992/, которые стабилизируют и повышают эффективность колониеобразования", стимулируя практически все прикрепившиеся фибробласты к пролиферации, позволило с наибольшей информативностью проводить исследования по определена концентрации КОКф в органах гемо- и лимфопоэза. При знзиматической обработке фрагментов костного мозга и селезенки за счет высвобождения дополнительной фракции клеток-предшественников, эффективность колониеобразования повышается в 10 раз /Лациник Н.В. И др.,1931; Ploemacher et al. ,1583/..

Гистогенетическая независимость КОКф от стволовых кроветворных клеток была подтверждена также методом иммунофлзооресценции /Иванов-Смоленский А.А. и др.,1978/ на той же модели гетеротопных трансплантатов, а также в костном мозге радиохимер. Аналогичный вывод был сделан в работе на тех же моделях с использованием цитолитического действия Т киллеров /Ладикик Н.В.,1984/, а также в цитотоксической реакции с антилпнейной сывороткой и комплементом.

Противоположный результат был получен на сингенных радиохиме-ргх в работе Ploenacher et al. /1983/, однако позднее автор (уст&э сообщение) отказался от него в саззд с ошибкой з идентификации типов'делящихся клеток.

Во всех рассмотренных работах били титрованы фибробласты, находившиеся в составе колоний, вырастающих в монослойных культурах костного мозга. Отдельную группу составляют исследования, выполненные на адгезивной фракции культур по Dexter костного мозга людей, подвергнутых химиотерапии и трансплантации кроветворной ткани допоров, отличавшихся либо по половым хромосомам, либо по глюкозо-6-Ьосфатдег/дрогенззе / b'ialkou et al. ,1982; Keating ot аЗ. , 1282/. -}дипаковое (донорское) происхождение, по данным этих ai .ров, кроветворных и стромалышх меток позволило ум поставить вопрос об эбщем предшественнике во взрослом организме. Однако, используемы.;

вид культур представляет собой множественную систему клеточных типов, что несомненно затрудняет идентификацию и определение принадлежности стромальных фибробластов. Креме того, массивная химиотерапия таких больных также могла повлиять на прижиЕЛяемость трансплантируемых клеток в костном мозге.

Таким образом, гистогенетическую независимость КОКф от стволовых кроветворных клеток подтвердили практически все многочисленные исследования, где были использованы как хромосомные, так и антигенные маркеры.

Критическим mqmshtom в работах такого рода является правильная идентификация типа анализируемых клеток. Как показано с помощью ен-тиколлагеювых сывороток /Лациник Н.В. и др.,1987/, клетки в составе, колоний продуцируют коллаген I и Ш типов и являются фибробласта-ми.

Концентрация КОКф в костном мозге, селезенке, тимусе и лимфатических узлах у различных лабораторных животных не отличалась, то есть не являлась видоспецифичной. Сходные с выявленными нами возрастные изменения концентрации стромальных предшественников в костном мозге и селезенке были отмечены Лациник Н.В. и др./1974/ на морских свинках, показавших, что концентрация КОКф с возрастом уменьшается. В то ке время Сидоренко A.B. и др./1976/ получили данные противоположного характера. У мышей концентрация КОКф с возрастом увеличивалась и была самой высокой у старых животных. Р1оеша~ eher et al. /1983/, также изучавшие возрастную дакашку численности КОКф у мышей, выявили в ней сложные разнонаправленные изменения с наибольшей стабилизацией в возрасте 5-6 месяцев. Однако, несмотря не некоторые колебания ЗКОф, все они укладываются в диапазоне 2-4-х кратных изменений, к концентрация КОК^ у взрослых животных составляет з костном мозге I КОКф на 10^-10* кроветворных клеток, а в селезенке - I КОКф на Ю4-Ю= клеток.

3.2. ДИФФЕР£ИЦИ?0Ш1НЫЕ ПОТЕНЦИИ ДИПЛОИДНЫХ ШТАШОВ СТРОМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КР0ЕКТБ0РНЫХ ОРГАНОВ

3.2.1. Получение в пролиферзгивкые свойства штаммов

Стрсмальиые клатки-предаественкот кровэтворках к лимфоидных органов ка JtO-14-ft день культивирования формируют t монослойнкх культурах колонии фибробластов. Зти клетки .тегг.о снимаются со стекла или пластик? после ибраооткч их грипсином и могут быть лодзер-

гнуты многократному пассированию с образованием значительной клеточной массы» Время формирования монослоя пассируемыми клетками зависит от плотности их посадки на единицу площади культурального флакона.

При культивировании клеток кроветворных или лиюфоидных органов человека, кролика, морской свинки или крысн вырастающие к 12-14 дню в первичных культурах колонии фибробластов почти свободна от макрофагов. Единичные макрофаги или их небольшие скопления, которых Есег-да больше в культурах селезенки, располагаются между колониями и практически не перекосятся при пассировании. Уяе в 1-м пассаже формирующийся мокослой фибробластов практически однороден. Это подтверждают и данные поставленной на части культур реакции розеткообразо-вания.с эритроцитами барана, тонированными Ig 5 /Лациник Н.В. а др., 1980/. Примесь розеткообразующих клеток (макрофагов) в ! пассаже бала менее I а в последующих пассатах - менее С,001 %.

Описанные в предыдущей главе гистохимические характеристики костномозговых, селезеночных и тимических штамков не зависели от сроков культивирования и были свойственны как для клеток первого, гак и для клеток Х-Ш пассажей.

Изучение пролиферативных сзойстз строкаль!шх кяеток-лредшест-венников л их потомков было проведено на 7 костномозговых штаммах. Зная, какую часть от общего числа выростах фибробластов сост-авлягг кресеваемыо метки, мы определяли общую клеточность штампа и динамику увеличения численности фибробластов в ходе последовательных гассаяей. Три костномозговых штамма были получены от одного нивот-.эго эксплантацией разного количества костномозговых меток - 10°, :0°, 10 . ЗКОф перзкчных культур составляло 15x10 , а эксплэнтиро--•анные взвеси соответственно содержали разное количество КОКф - 150, 500, 15000. Уже на I пассаже количество вчроеппх фибробластов премило число оксплактирозаших КОКф (табл. 4).

Из таблицы следует, чем меньшим числом КОКф были инициированы таммы, тем больше прирост числа фибробластов наблюдался при разви-ии штаммов. В штадае $ 3, начатом от 150 КОКф, такое превышение на пассзхе составляло 173 тысячи раз и было в 20 раз больше, чек капог.ичный показатель для штамма й I (в семь тнеяч раз). Это езна-ае-г, что кзвдая из эксплантправакных КОКф к этому моменту дала по-эмстео в количества 7 т-ыея* фнброблсстоя a mtskmg Js I и 173 тысячи збробластов в штампе & 3. Хотя общая клеточность вшз в атаииэ Г? 1, эрзстанке числа фибробластов относительно исходных КОКф шло быст-эе в штамме й 3. Эта теадетая-'сохранялась и при последующих nsc-asax. гфвекшенно этого показателя в штамма й 3 на УП лзссаде было

Таблица 4

Динамика клеточной численности штаммов костномозговых фибробластов

№ штамма Число запланированных клеток Число КОКф П А С С А 2

костного мозга 1-й 3-й 5-й 7-й 8-й ТО-й

I Ю7 15000 и^з 17.4 НО 773 2800. 13000 Ж76 £¿6,6

2 ю6 1500 ? 7 ь 10.9 тХ 56.7 377Н ?660 1и66,6 '

3 ю5 150 1x2 5^2 ити 26.0 17373 268 ' н/д 4000

Г/Бй.В 26666,7

с

Примечание: над чертой - количество фибробластов в пассакзх х 10 ; под чертой - прирост фибробластов относительно исходных КОКф х 10^.

почти в 10 раз больше, чем в штамме И, и вдвое больше, чем в ' штамме $ 2. Пролиферативныз потенции КОКф, которые характеризуются числом их клеточных удвоений в процессе развития штаммов, представлены на рис. I» На УП пассане превышение для этих штаммов составляло от I до 5 млн. раз, а в штамме й I на УШ пассаже - около 700 шн. раз. Отсюда следует, что среднее число клеточных удшений потомков КОКф после УП пассажа достигало 20-22, а после 2УШ пассажа -30.

Изучение динамики нарастания численности фибробластов в культурах продемонстрировало высокий пролифзративный потенциал стро-мальных клеток-предшественников, позволяющий за 2-3 месяца получить, значительную клеточную массу, в миллион раз превышающую число исходных КОКф.

Рис. I. Численность клеток в последовательных пассажах штаммов костномозговых фибробластсв

э оси абсцисс - номер пассажа; по оси ордьяат числа клеток, гаммы начаты от 37 (Л, 175 (2), 300 (3). и 3000 ( 4) КОКф эксплан-зцией.ЗхЮ4 (I), 1x10 (2), ГхЮ6(3) и 1х107(4) костномозговых поток.

3.2.2. Остеогенные свойства стромалышх клеток-предшестзэнников костномозговых штаммов

Как ранее нами было показано, обратная трансплантация в оргаг 1зм штаммов костномозговых фибробластов в диффузионных камерах риводит к образованию в них костной ткани /Чайлахян Р.К., Лалыки-з К., 1969/. Это свидетельствует о том, что>по крайней мере>часть хетск, образующая колонии фибробластов, является остаогенными тетками-предшественниками, и что .остеогенные клетки сохраняются з ,'льтурах. Однако оставалось неясным, какая часть колониеобразую-IX клеток-предшественников, выделенных из костного мозга, обладает ;теогеннкми свойствами л увеличивается ли в процессе культлвярова-!я количество остсогешшх клеток-предшественников. Для того, чтобы >лучкть ответ па первуга часть вопроса, а именно, какая часть коло-шобрззуощих клеток, выделенных из костного мозга, является остео-шной, фибробласты 1 пассажа ЗЭ штзммоз, полученных от 15 кролк->в, трансплантировали в иволокових губках под капсулу почек. Ис-

следуемые культуры происходили от разного количества исходно эксп-лактированных клеток и разного количества содержащихся в них' КОКф (табл. 5).

Таблица 5

Культуры I пассажа костномозговых фибробластов, трансплантированные гетерстолно

Число штампов Количество первично зксплантироЕЭК-ных костномозговых клеток х |С5 Количество первично эксплантирован-ных КОКф ~ х Ю3 Количество клеток, снятых с I пассажа х 10е *

8 ю 4,2 £ 0,5 5,8 + 1,0

5 5 2,1 + 0,36 4,2 + 0,78

И ** 3 0,97 £ 0,23 3,7 + 0,67

8 I 0,50 + 0,13 3,3 + 0,67

0,3 0,19 + 0,05 1,3 £ 0,18

5 од 0,07 £ 0,01 Г,21 £ 0,34

' 4" ' 0,05 0,028 £ 0,06 0,81 £ 0,24

Примечание: ж - клетки, снятые из каждой культуры, трансплантировали в одной губка под почечную капсулу. Во всех трансплантатах было получено образование костной ткани.

Все фибробласты, вырастающие в составе колоний каждой из 33 культур на 12-14 день снимали трипсином и переносили з отдельный флакон, то есть производили первый пассаж. Когда они образовывали юно слой клеток, весь клеточный урожай снимали, помещали в ивэло новую губку массой 1-2 мг и трансплантировали аутологично под почечную капсулу кроликов. Фиксацию проводили через 74-114 суток. Во всех 39 трансплантатах была сформирована кссунэя ткань характерной нюрфологии т- с замурованными, в основное вещество остеоцитами и хорошо выраженным остеобластическим слоем. В отдельных случаях вместе с костью происходило формирование очагов кроветворения между костными балками.

Приведенные данные свидетельствуют о тем, что образование кости происходило и при трансплантаций фибробластов 4-у. штаммов, каждый' из которых бал инициирован ккнмнаяъным числом - 28 - КОКф, содержавшихся в 0,05х106 костномозговых -глетах. Поскольку все вира-

венные фибробласты кавдого из штаммов помещали в одну губку, можно сделать вывод, что, по крайней мере, одна из 23 первоначально эксп-яантировэнкых КОКф являлась сстеогеннэй клеткой-предшественником.

Ответ на вторую часть вопроса - происходит ли размножение ос-геогенных клеток в процессе культивирования, был получен при изучении дифферещировочшх потенций 4-х штаммов'костномозговых фибропластов П-ХУШ пассажей. Штаммы были начаты эксплантацией 1,0хЮ5 !3 штамма) и З.ОхЮ'1 (I штамм) клеток костного мозга, получешшх от зазных кроликов. Эффективность колониеобразования в культурах, ис-юльзованных для инициации этих штаммов, составляла от 12,ЗхМ"4 до ;7,5хЮ-4. Остеогенные потенции фибробластов разных пассаявй тести-га вали трансплантацией определенной части клеточного 'урожая в диф-¡узионные камеры. Для этого использовали камеры типов А и 0. Трансплантация 10^-10® фибробластов е камеры типа А приводила к образованно костной ткани (табл. 6), а трансплантация 10^-2x10® фиброблас-ов в камеры типа 0 - к образованию костной и хрящевой ткани. На 5-70 сутки, когда производилась фиксация материала, костная и хря-;евая ткани в камерах имели типичную морфологию и гистохимические войства. Клетки и основное вещество кости проявляли высокую актив-ость щелочной фосфатазы, а в основном веществе содержалось большое оличсство фосфата кальция. Реакции на щелочную фосфатазу и на не-астворимкй кальций в хрящевой ткани были отрицательными.

Образование костной ткани означало, что введенные в камеру летки содержат как минимум одну остоогенную единицу. Помещая в кз-еры определенную часть клеточного урохая, мы могли определить ккл-ий предел численности остеогешшх единиц во всем штамме. Так, тзмм й I, который был на^зт эксплантацией 10° костномозговых кле-ок, содержал 173 КОКф. На УП пассате число выросших фибробластов оставляло 1,3 млрд. Из этого числа Т.О4 фибробластов были помещены диффузионную камеру А и образовали в ней кость. Это значит, что амерэ содержала как минимум одну остеогенную единицу, а общее чи-ло остеогенных единщ в штамме составляет не мзнео 135 тысяч. Это 783 раз больше начального числа КОКф, от которых произошел штамм, болы-а, чем число эксшшнтированных кроветворных клеток.

Аналогичные данные были получены и для штамма К 2 на IX пасса-е и для штамма й Д на Ш1 пассаже. Это значит, что количество ос-еогеыих единиц, определяемых даяе по их шкшему преде. „, начиная УП пассажа, в сотни тысяч превышало число КОКф, от которых были ачзты штаммы. Более того, количество остеогеншх единиц в штаммах нло больше, чем численность всех костномозговых меток, которые

эксплантировались при инициации штаммов.

Таблица 6

Скелетогенные потенции культивированных костномозговых фиброоластов

Квнйры-тат А

э* там-tuüa Число ' экелдаипх-роъажшх KOCIHO-.WQSfCSUt клеток; хЮ* Чгсло аксплаь тированных KOKÍ М пассажа KO.TJ-чгстзо еялтых OlíjpG-Сластсо, X Ю1 число кастах, траиспл актированных-л камере, ХЮ' отношение чдела глхср ■с когтьзо к общему -. холкестау кгиер иоличе.тао остссгензых •прирост остесгекных екшлц . отаосатйпьно' вехэшшх КОКф

' i 1.0 173 II ' 2.8 0.1 1.0 ' щ 1Д 230 ' 1.62

* . VII IX 1353 .5154 ' 0.1 10.0. 1д 2/2 г 13.6-10«. ' 788.4 '

1.0 ' .173 VI IX 200" 1920' ' • 3.0 0:1 .2/2 2/2 ■ 663.7 .19.2.10'. 3.55 1110

з- 4.0 • 175 ¿X -1600 ' . 1.0 . - 3.0 3/5 .3/3. 16-10» .31.4

4 0.3 •' 37 • 1.1 VI ' -XV1H .4.0 135 . .24854 0:1 . 2.0 ' 6,0 . .2/3 2/2' Щ • 400 675 4.1-10*' Ю.'З •1S.2 1120

Полученные результаты показали, что штаммы сохраняют сбои ос-теогонныо свойства вплоть до ОТ пассажа. При этом з процессе культивирования происходит интенсивное размножение сстеогенннх клеток, которое обеспечивает значительное превышение кх числа над числом ."первично экептантированных КОКф.

. Огромные остеогенные • потенции, заключенные в этих ктатках, обнаруживаются при сравнительном изучении той массы кости, которую они.способны наработать. Строыальныэ фибробласты IX пассажа штамма Je 3, трансплантированные б диффузионную камеру типа А, в количестве 10^ клеток на камеру, образовали в ней кость, сухой вес которой был равен 2 мг. Клетки, образовавшие эти 2 мг кости, составляв: 0-00007 численности всех клеток штамма. При пересчете на весь шташ, со есть если рассадить все 1,6 млрд клеток IX пассажа в диффузионные камеры по 10° клеток в каздуа, общий вес образованной имя кости составил бы 30 г. Штамм этот был получен з результате эксплантации 1/1000 доли клзч'ох, содерксйцихсл" в модулярной полости тазовой костя кролика Следовате-'ако, „костесбразовательный потенциал потомков ico-

стномозговых КОКф одной такой кости достаточен для формирования не менее 30 кг костной ткани.

Сухой вес кости и хряща, образованных в камере типа 0 Ю^фиб-робластов IX пчссажа штата № I, которые составляли 0,00002 численности всего штамма, был равен 6 мг. При аналогичном пересчете на весь штамм это составляет 300 г кости и хряща, а потенциал всех клеток тазовой костч равен 300 кг кости и хряща.

Проведенные эксперименты продемонстрировали, что как минимум каждая 23-я колониеобразующая клетка, выделенная из костного мозга, обладает остеогеняым потенциалом. Остеогенные клетки-предшественники успешно пролиферируют в культуре, не утрачивая при этом своих свойств, и, как оказалось, при обратной трансплантации способны образовывать значительную массу костной ткани. Число остеогенных единиц, выявляемое с помощью диффузионных камер, ка Х-ХУШ пассаже в . сотни тысяч раз превосходит число первично эксплантированных КОКф.

3.2.3. Перекос специфического микроокружения штаммами стромальных фибробластов костного мозга

Выраженные остеогенные потенции стромалышх клеток-предшественников и их потомков, образующих штаммы костномозговых фибробластов, позволили предположить, что именно эти клетки могут оказаться ответственными за перенос специфического микроскруяения и организацию на месте их гетеротопной трансплантация новых кроветворных органов.

Для проверки этой гипотезы были проведены исследования по гетеротопной трансплантации костного мозга кроликов, состоящие из следующих этапов: I) трансплантация фрагментов костного мозга из бедренных'и'тазовых костей; 2) трансплантация суспензии костномозговых клеток; 3) трансплантация выращенных в культурах штаммов костномозговых стромальшх фибробластов.

Полученные результаты продемонстрировали способность костного мозга кроликов образовывать кроветворные органы при ом гетеротопной трансплантации как в виде фрагментов, так и в виде взвесей костномозговых клеток, помещенных под точечную капсулу в ивэлоновых или желатиновых губках, пли в плазменном сгустке. Это позволило использовать дзннуа систему для определения способности г-ромэльных клеток-предаествежапсов и их потомков, образующих штаммы костномозговых фиброблзстов, в аналогичных условиях переносить специфическое микроокружение и формировать новые кроветворные органы.

Трансплантацию штаммов стромэльных фибробластов 1-У пассажей проводили несколькими способами (табл. 7). Всего от 32 штаммов было подсажено 75 трансплантатов, содержащих Ю5-2хЮ7 клеток. Лучшим среди использованных пористых каркасов оказался инактивированный костный губчатый матрикс. Ивалоновая губка менее приспособлена для переноса и организации гемопоэтического микроокружения. Процент положительных результатов, полученных в трансплантатах этого типа, был вдвое ниже (30,7 %), чем при трансплантации в костном матриксе (60 %). Нам не удалось установить зависимость образования костномозгового органа от числа фибробластов на.единицу объема трансплантата.

Гетеротопные трансплантаты стромалышх фибробластов, тафе как и трансплантаты костного мозга, проходят ряд последовательных стадий развития. Через 15-20 дней в трансплантате образуется костная ткань. В течение последующего месяца'происходит ремоделирование кости, образование синусоидов и формирование костномозговой полости. Заполнение ее кроветворными клетками происходит к конпу второго или началу третьего месяца. Кроветворная ткань развивается лишь около тех участков кости, которые покрыты слоем активных остеоблас-. тов. Более старые костные балки, окруженные вытянутыми фибробласто-подобнымя метками, и участки компактной кости не связаны с очагами кроветворения.

Костномозговые органы, образованные при гетеротопной трансплантации штаммоз, различаются между собой (что имело место и при трансплантации взвеси кроветворных клеток) по величине, костной массе, объему костномозговых полостей и количеству населяющих их кроветворных клеток. Большинство их было хорошо организовано, с развитой сетью синусоидов и активно кроветворяпим костным мозгом.

Данные, полученное в результате проведенных исследований, позволяют сделать основной вывод, что именно стромальные клетки-предшественники костного мозга являются ответственными за'перекос специфического микроокружения, необходимого для формирования новых кроветворных органов.

Таблица 7

Перенос специфического мякроокружения при гетеротопной трансплантации штамдав костномозговых фибробластов

й Вид

з/п трансплантатов

Число трансплантированных фибробластов

х Ю6

Отношение числа Про—

трансплантатов, цент

сформировавших поло-

костномозговой житель

орган, к обще- ных

му числу тран- резуль

сплантатов тэтоз

[. Сгусток осааделных фибро-. бластов б кольце !. Сгусток осажденных фибро-. бластов боз кольца

Суспензия фибробластов в . желатиновой губке в кольце 0,75-15 Суспензия фибробластов в

1-20

3 - 10

2/5 1/4 3/7

40 25

42,8

желатиновой губке без

. кольца_ 2 - 10 0/8 0

. Суспензия фибробластов в 2/4

. плазменном сгустке з кольце 5 - 7,5 50

. Суспензия фибробластов в .

. ивалоновой губке без кольца 0,1- -10 12/39 30,7

. Суспензия фибробластов в

. ивалонозой губка в кольцо 0,7- -15 1/3 33,3

. Суспензия фибробластов в

иязктивированном губчатом

костном метрйксе 8 - 10 3/5 60

3.2.4. Анализ клеточных дифференцировок штаммов стромальных фибробластов, полученных из костного мозга различной локализации

Йами было показано, что концентрация КОКф в костном мозге азличной локализации (теменная, бедренная и тазовая кости) одина-ова. Однако, дкфференцировсчные потенции КОКф, содержащихся в ос-овшлс и накладных костях скелета, оставались неизвест; .-ми. Как-адные кости, к которым, в частности, относятся теменные кости че-епа, в отличие от основных костей скелета, в филогенезе не прохо-

дят хрящевую стадии развития. Такая особенность могла привести к различиям в пролиферативкых и дифферент ровочных потенциях содержащихся в них КОКф.

Э"?и предположения и определили предмет исследований, а именно: сравнительное изучение пролиферативннх свойств КОКф, выделенных из костного мозга накладных и основных костей скелета, ери формировании и развитии штаммов и их диффереицирозочных потенций при трансплантации'в диффузионные камеры.

Пролиферативные. свойства КОКф костного мозга теменных, бедренных и тазовых костей кроликов были изучены на 9 штаммах стромальны фибробластов, выделенных от разных ккеотных. Для получения штаммов из каждого органа эксплантировали равное количество костномозговых клеток с добавлзнием клеток фидера.

Результаты экспериментов показали, что пролиферативные свойства КОКф накладных и основных костей, различающихся по своему филогенетическому развитию, сходны. Число клеточных удвоений, которое проходят КОКф в. культурах обоих типов, не отличаются ни при формировании первичных культур, что должно было отразиться на величине образуемых ими колоний, ни при формировании штаммов.

Дифференцировочные потенции КОКф из костного мозга различной локализации проверяли, трансплантируя штаммы стромальных клеток-предшественников Ш-У пассажей в диффузионные камеры двух типов, Использование камер типа 0 позволило выяснить, влияет ли отсутствие хрящевой стадии в филогенезе накладных костей на способность строгальных клеток-предшественников, содержащихся в их костномозговой полости, образовывать хрящевую ткань, подобно стромзльным предшественникам из костного мозга основных костей, а трансплантация в камеры типа А - установить, обладают ли КОКф остеогенными потенциями и не утрачивают ли их з процессе культивирования.

Способность костного мозга теменных костсй образовывать полноценный костномозговой орган была изучена путем гетеротопной еуто-трансплантацки его фрагментов под капсулу почки кролика. Ни в одном аз трансплантатов нз обнаружено каких-либо особенностей по сравнению с подобным органом, образованным при трансплантации костного мозга тазовых костей.

Штакмы, полученные из костнор мозга накладных костей и помещенные в квморч типа А, образовали только костную или костную и хрящевую ткйкь в б из 10 камер, а в камерах типа 0 подобный результат бнд достигнут в 7 из 12 камер. Структура кх не отличалась от костной и хрящевой ткани, образованной тгаммами, полученными из

потомков КОКф костного мозга тазовых костей. Реакции Косса и ка щелочную фосфатазу в обоих случаях были положительными в костной ткани и отрицательными в хрящевой. Процент положительных результатов, то есть образование кости или кости и хряща, в камерах обоих типов у штаммов ссромальнюс фибробластов из теменных и тазовых костей был почти одинаковый. Для камер типа А он составлял 60 % и 75 %, а для камер типа 0 - 53 % и 63 % соответственно.

Факт образования в камерах типа А наряду с костной еще и хрящевой ткани, по-видимому, связан с тем, что при монтгко камеры ее створки не всегда плотно прилегают к друг к другу, увеличивая объем кзмеры и образуя как бы камеру типа 0 меньшего объема.

Заключая, можно сказать, что колокиеобрззугощие клетки, содержащиеся в разных костях, оказались практически не отличимы по про-лифёрзтивным потенциям и одинаковы в своих дифференцировочных возможностях при трансплантации в диффузионные камеры и способности переносить полноценное кроветворное кикрсокрукение, Несмотря на отсутствие стадии хондрогенэза в филогенезе накладных костей, КОКф, содержащиеся в них, способны образовывать хрящевую ткань.

Высокие лролпферзтивкые потенции штаммов стромэльннх фибробластов были продемонстрированы многими исследователями. По данным Мискзровой к др./1970 / они активно лролиферировали, сохраняя пло-идкость и не снижая темпа клеточных удвоений до 20-22 пассата. ш-гзпо еЪ аХ. /1981/ показали, что не все штаммы костномозговых фибробластов обладают остеогьнккш потенциями. Одни штаммы при обратной трансплантации формировали зд;яаввуп ткань, а друтие обладали способностью резорбирсвать костный матрикс. В серии работ, выполненных иод руководством и.о«га , были изучены сотесгенные потенции костного мозга и штаммов стрсмальных фибробластов при трансплантации в диффузионные камеры. Были подтверкдеш наши результаты, а также показано, .что костная и хрящевая ткань в камерах располагается всегда определенным образом - костная ткань вблизи шляипоровых £лдьтров, а хрящевая-располагается з центре каморы. По мере формирования зтих тканей происходит переключение синтезов коллагена Ш типа на I и П, характерные для костной и хрящевой тканей. Авторы тредподэгают, что клетки, расположенные ка границе кость-хрящ, способны синтезировать обо типа коллагена, либо переключаться с • ¡интеэа одного типа па другой /азяЬ'оп et а1. »1330; вг& еь аХ., '£86; К&ГЙОП е-Ь гЛ. , 1937/.

Как показали каши исследования, именно стромальные клетки-предшественники постного мозга и их потомки, формирующие штаммы костномозговых фибробластов, являются ответственными за перенос кроветворного микрсокружения и формирование новых костномозговых органов. Эти данные не удалось подтвердить Anderson /1981/. Однако успех сопутствовал Patt, Maloney /1982, I98S/, которые пересаживали штаммы костномозговых фибробластов, полученные из "красного" и "желтого" костного мозга. Вновь образованные костномозговые органы воспроизводили особенности каждого из них. Из пассированных первичных культур мышиного костного мозга были получены несколько линий строматьнцх клеток / zipori et al. ,1984, 1986/, одна из которых 14 P-I, имеющая характеристики и фибробластов и адияоцстов, способна формировать при обратной трансплантации костномозговое микроокружеше. Еще одна из полученных линий обладала оотеогенныш потенциями, но не переносила шкроокружениа.

Стромальные клетки-предшественники, выделенные из различных костномозговых органов - бедренных, тазовых и теменных костей, не . отличаются по своим пролиферативным и дафференцировочным потенциям. Накладные кости черепа (теменные) в своем филогенезе не проходят хрящезой стадии развития и,как показали многочисленные.исследования /Полежаев Л.,1982; Саргсян А.,1990; sirola »i960/ в организме практически нз регенерируют. В наших исследованиях удалось установить, что населяющие их КОКф не лишены способности образовывать хрящ, и переносят полное костномозговое микроокружение.

3.3, ДШЕГЕЩИРОВОЧПКЕ ПОТЕРЛИ СТРОМАЛЪНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ОРГАНОВ ЛИШГОЭЗА

3.3.1'. Лимфоидные органы, образующиеся, при трансплантации

диплоидных штаммов стромальных фибробластов селезенки

Методические подходы получения штаммов стромалышх фиброблас-тоз селезенки не отличается от используемых при работе с культурами костного мозга. Колсшм стромальнкх фибробластов, вырастающие в культурах клеток селезек'.к, также легко снимаются с поверхности культурэльных флаконов после обработки трипсином к поддаются многократному пассированию.

Пролиферативнке свойства стромальных кяетпк-лрздаественииков селезенки били изучены на 3-х штаммах, полученных от разных животных. Для получения штаммов в каждый культуралышй флакон эксплан-тировали по Ю5 клеточной взвеси, приготовленной путем трпнсикиза-

ЦИЕ мелких фрагментов селезенки. Уже в результате I пассажа превышение числа выросших фибробластов над исходным числом КОКф в разных• культурах составляло от 3 до 7 тысяч раз, К ЛЗ пассажу численность фибробластов в штаммах составляла 9-11хЮ12 клеток. Изучение динамики нарастания численности флбробластоз в культурах продемонстрировало их высокий пролиферативкый потенциал, позволяющий за 2-4 месяца получить значительную клеточную массу, в миллионы раз превышающую число исходных КОКф.

Ранее нами было показано, что штаммы стромальных йнбгоблгстов костного мозга и селезенки при их обратной трансплантации в организм в диффузионных камерах формировали в них ткань, характерную для стромы соответствующего органа: костную - при трансплантации фибробластов из культур костного мозга и ретикулярную - в случае трансплантации фибробластов из культур селезенки.

Трансплантация штаммов стромальных фибробластов костного мозга приводила к образованию костномозговых органов. Кокке было предположить, что при обратной трансплантации б организм стромальных фибробластов из культур селезенки под капсулой почки может быть образован новый лимЬоидный орган.

В экспериментах были использованы 20 кроликов, у которых была резецирована 1/3 селезенки. Суспензии клеток селезенки готовили 2 способам!!: при помощи механической обработки и -путем трипсикизации измельчетпшх фрагментов селезеночной ткани. Для обратной трансплантации использовали штаммы У-УН пассажа. Снятые с флаконов фиброб-ласты переносили под капсулу почки в виде сгустка клеток, а так.«? з пористых каркасах - желатиновой и ивалоновой губках и в инективи-рованном губчатом костном матриксе. Подготовленные трансплантаты помещали под капсулу почки как в пластиковом кольце, так и без него [аналогично трансплантации костномозговых штаммов).

Из 20 штаммов, использованных для трансплантации, 13 был., инициированы трипсикизированными клетками селезенки, а 7 штаммоз -клетками, полученными путем ее механической обработки. Выращенные штаммы возвращали под капсулу почки з виде двух аутотрансплактатов на разных полюсах почки. Каждый трансплантат содержал 2-15х105 фибробластов. Как видно из таблицы 8, в этих количественных пределах число клеток б трансплантате не является определяющим для переноса лимЬоидного микроокруженпя. В тс. 1:3 время, выявилось зависимость числа вновь образованных лимфоидных органов от типа трансплантируемого штамма. Сравнение результатов по первым 4 видам теэноплянта-тов показало, что штаммы, полученные из тр2пскшзпрозз!!Ных взнесей,

Таблица .8

Трансплантация штаммов фибробластов селезенки

! i i

№■ ! n/'nj

i j

j i

тин штамма

Вид

трансплантате

! тркпсинизиро ванный ¡нетрипсинизированный ¡число ¡отношение чис-¡число !отношение~чйс-¡трансл.'ла трансплан- !трансп!лэ трансшган-!лакти-!татов, сформй-!лэнтк-!татов, сформи-!рован-!ровавшкх лим- ¡рован-! по ваших лим-!«¡ix ¡фоидный орган !шх ¡фоидный орган 'клеток!к общему числу ¡клеток!к общему числу | х jq6 [трансплантатов| . ^(.трансплантатов

1. Сгусток осажденных 3-8 фибробластов в кольце

2. Сгусток осажденных 5-7 фибробластов без

• кольца

3. Суспензия фиброблас- 2-5 тов в желатиновой губ. ке в кольце

4. Суспензия фиброблас- 3-5 тов в желатиновой губке бзз кольца

5. Суспензия фиброблас- 7 - Э тов в ивалоновой

губке

6. Суспензия фиброблас- '5-15 тов в инактивирован-

пом губчатом костном «

мэтриксе

2/3 1/2

1/2

1/3

0/5

С/9

5-12 7-10

3-7

5-8

6 - го'

1/3 Г/3

1/4

0/2

0/4

осуществляют перекос микроокружения в 50 % случаев, а к? нетрипси-низирсванных - лишь в 25 % случаев. Самым неподходящим каркасом для оргагазадии переносимыми клеткам-/ новых лимфоидных органов оказалась нгллоновая губка: ни. в одном из 9 трансплантатов, в том числе в 5-ти - с клетками трипскнквированных штаммов, положительный результат кз был достигнут. Почтя все губки были заполнены геюхо вас-ктляризированной, плотной соединительной тканью. Стромальные фибрс-бласта в желатиновых губках, трансплантированные непосредственно пг.'Д капсулу почки или помещенные туда же внутри пластикового кольца, образовывали небольшие но объему лш/фэидкые органы.

Возвращенные в виде сгустка выращенные фибробласты формировали новые лимфоидные органы почти в 50 % случаев. Эти органы были не-т сколько больше по размеру и состояли.из лимфоцитов, упакованных в ■ структуры типа ликфоидшх фолликулов.

Наиболее высокий процент (66,6 %) переноса лимфоидного микро-жружс-шя был отмечен при трансплантации в губчатом костном матрик-:е. Расположенные в его порах небольшие лимфоидкьге органы, тазфкз как I при трансплантации б желатиновых губках или в гиде сгустка клеток, ю имел:! специализированных структур в виде красной ц белой пульпы г состояли из сети нежных вытянутых ретикулярных клеток с большим .ветлым ядром и скоплений лимфоцитов между ними, образующих структу-1Ы типа лимфоидных фолликулов.

Образование лимфоидных органов на месте гетеротопной трансплан-ации штаммов стромальных клеток-предшественников вторичных лимфо-дных органов свидетельствует, что.именно эти клетки являются от-етственными за перекос специфического лимфоидного микроокруяенгя образование лимфоидных органов.

3.3.2. Сравнительная оценка иммунного ответа в селезенке, гетеротопном трансплантате селезенки и лимфоидном органе, образующемся при трансплантации стромаль-ных фибрсблзстов селезенки

.Лимфокдныа органы, образующиеся на месте трансплантации штам-зв стромальных фибробластоз селезенки, не имеют специализированных сруктур типа красной и белой пульпы и представлены ее лимфоидшш змпокентом типа лимфоидных фолликулов. Морфологич&скоэ строение гих органов не позволяет судить об их функциональных возможностях. >этому необходимо было определить, насколько переносимое стромаль-илн клетками яимфоидное микрсокружение является полноценным для тоеряания в нем нормального лимфопоэза и диффорекцироЕкя антите-юбразуюших клеток в ответ на антигенную стимуляцию.

Иммунный ответ кз эритроциты барана (ЗБ) изучали з нормальных ;лсзенках кролика, регенерирующих селезенках, з гетеротогаых тран-[лантзтах селезенки и зо вновь образованных лныфсидных органах, ¡генерирующими мы назвали селезенки, представляющие собой регене-т нормальной селезенкй кролика, 1/3 которой была ранее рэзециро-на.для трансплантации под капсулу точки или эксплантации в куль-ру. Такич образом, каждый трансплантат амел как бы свой аутоло-

гичный контроль.

Иммунизацию кроликов о трансплантатами селезенки проводили через 30-40 дней, когда в трансплантатах восстанавливалась структура селезеночной ткани, а кроликов с трансплантатами штаммов стромальных фибробластов селезенки - через 60-90 дней после трансплантации (времени, необходимого для образования лимфоидшх органов). Кроликов иммунизировали, вводя внутривенно по Зх109 ЭБ. Иммунный ответ определяли на 7-8 день после иммунизации, подсчитывая количество АОК по методу Ерне. Число АОК пересчитывали на 106 лимфоядных клеток. Работа была проведена совместно с научным сотрудником лаборатории клеточного иммунитета, к.б.н. О.Ю.Сосковской.

Уровень спонтанных АОК на 10^ клеток селезенки составлял 0,030,1. В селезенках нормальных иммунизированных кроликов среднее.число АОК на Ю6 селезеночных клеток составило 228,4 + 51,8 (табл. 9), число АОК в трансплантатах селезенки - 104,9 + 16,1. Это значение оказалось в 2 раза ниже, чем среднее число АОК у контрольных животных и в регенерирующих селезенках (которое было равно 245,2 + 35,9).

Таблица 9 . Количество антителообразующих клеток (АОК) в нормальных селезенках и трансплантатах

■ I i Исследуемы! орган ! ! Среднее число АОК в отдельных опытах на 10°клеток ¡Среднее значение числен-\ьости АОК в исследуемом ¡органе на Ю6 1 + и

Нормальные селезенки 163, 132, 33Ï 225, £ 51,8

Трансплантаты селезенки 136, 82, 97 104,9 + 16,1

Pr-енерирующие селезенки 310, 240, 185 245,2 £ 35,9

Трансплантаты селезеночных сгромалышх фибро-бластоз 27, 45, 52, 30 37,9 £ 5,8

Регенерирующие селезенки 270, 252 , 262, 321 . 303,1 £ 24,3.

В лимфоидных органах, образованных на месте трансплантации птаммов стромальных фибробластов селезенки, численность АОК .была почти з 3 раза ниже, чем в трансплантатах селезенки, и в 6 раз ниже, icм в селезенках нормальных кроликов. Срзднее значение АОК на 10® гамфоидных клеток в этой группе было равно 37,9 + 5,8. Число АОК во зноеь образованных органах в сотни раз превышало их фоновый уровень.

Полученные результаты свидетельствуют, что пересаженные строгальные флбробласты селезенки переносят специфическое микросхруже-ше. Клетки, заселяющие новый лимфоиднкй орган, в частности, В-клст-си, способны в этих условиях проходить весь путь своьго гистогенеза вплоть до антителообразующих клеток.

Динамика развития штаммов стромальных фибробластов селезенки га отличается от развития костномозговых штаммов»-При морфологически изучении лимфоидные органы, образовавшиеся при трансплантации ¡ыращенкнх in vitro стромальных фибробластов, представляли собой |бразование в виде лимфоидных фолликулов, без.распределения на бе-ую и красную пульпу. По данным Куралесовой А.И. /1973/ восстановите структуры в гетеротопком трансплантате селезенки происходит к .енпу первого месяца. В таких трансплантатах восстановление эритрз-:оэза предшествует актктелогенезу, что связывается с по с ледова те ль-остью восстановления соответствующего микроокружения /Цырлова.И.Г. др.,1980; Старостин З.И., Цырлова К.Г.,1984; Wolf N. ,1982/. На 4 и 20 дни число АОК в подобных трансплантатах, по сравнению с ко-тролем, составляло соответственно 2 % и ,4 Оно возрастало до 2 % к 23 дню, а затем вновь снижалось к 60 дню до -28 % /Нырлова И, 979/.

В лимфоидных органах, полученных при трансплантации стромаль-нх фиОробластов селезенки, число АОК на 10 клеток составляло т3,7# о сравнению с контролем и 36,1 % от числа АОК, выявляемых в гете-отопном трансплантате сзлеаенки кролика, и в сотни раз превышало исло спонтанных АОК, что поззоляет характеризовать функциональное остояние органа как удовлетворительное. Полученные данные стаде-эл1>стзуют, что популяционная структура стромальных предаественни-ов вторичных лимфоидных органов по способности воссоздавать при братной трансплантэции'вса компоненты стромального микроскуркенля ущественпо отличается от стромз.цьнкх предшественников костного мо-га, Трансплантация костномозговых фибробластов, даже потомков одой КОКф (5 % от крупных клоноз), приводит к формированию нового

органа гемопозза, практически не отличимого от интактного ни го кроветворной ткани, ни по строкальюму компоненту (.по костной и ретикулярной ткани). В случае же трансплантации селезеночных фиброб-ластов - потомков многих десяткой предшественников, воспроизводятся не все структуры, хотя и достаточные для репопуляции различных категорий клеток, участвующих в ответе нз Т-зазисимый АГ, их пролиферации и дифференцировки АОК. Остается открытым вопрос смозаичнссти КОКф по потенциям к переносу лимфоидного микроокружения и о механизмах реализации регулирующей функции стромы на разных этапах формирования иммунного ответа.

3.4. ПРО.'ШФЕРАТИШЫЕ И ДИФФЕРЕЩИРОВОЧШЕ ПОТЕНЦИИ . ИНЦИЕВДУАЛЬШХ КЛОНОВ СТРОШЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТЕЕНШКОВ КОСТНОГО МОЗГА

3.4.1. Получением динамика роста клональных штаммов

Для получения клональных штаммов.87 колоний-клонов из первичных культур костного мозга были подвергнуты индивидуальному пассированию. Для пассирования в 12-15-дневных культурах отбирали саше крупные колонии диаметром 8-10 мы, когда каждая колониеобразуэдая клетка в процессе формирования колоний прошла 12-15 клеточных удвоений. Колонии такого размера составляли 10 % от всех колоний в культурах. Из 87 колоний, подвергнутых пассированию, 48 колоний были спассированы на 12-луночше пластины, а 39 колоний - на 24-лу-ночные. При нормальном развитии штаммов именно разница площади дна лунок (то есть клеточкой плотности) определяла количество фиброб-ластов, вырастающих после первого пассажа. Сре^1 культур 1-го типа часть штаммов (из 81 % колоний) формировала монослой, проходя за 5-7'дней еще 2-3 клеточных удвоения, а остальные штаммы (из 19 % колоний) развивались быстрее, проходя за это время 3-4 удвоения. В большинстве культур 2-го типа (негодно с большой клеточной плотностью) фибробласты проходили нз более одного удвоения, хотя среди них тоже были более "быстрые" штаммы. Второй пассаж проводили в лункк с большей площадью'дна (соответственно в 6 и 12-луночкке пластины) . С этого момента культуры обоих типов имели одинаков динамику численности фибробластов с отставанием на один пассеж у штаммов от первоначально более плотных культур.

Темпы роста клональных штаммов позволяли в результате 2-3 пассажей получать достаточное количество клеток для изучения даффорон-

цироЕочнь-х потенций отдельных клонов путем аутологичной трансплантации штаммов под капсулу почки кролика или путем трансплантации.в -диффузионные камеры, имплантированные внутрибрашинко.

Пролкферативные потенции потомкоз индивидуальных КОКф на более высоких пассажах исследованы на 6 клональных штаммах, культивирование которых (с клеточной плотностью при пассировании 0,5-1,5x1 (Р фибробластов па см2) было продолжено до X пассажа и заняло по времени от 2 до 3 месяцев. Начиная с 4 пассажа, для последующего роста использовали только небольшую часть клеток данного пассажа. По результатам роста определяли численность клеток для всего ште?'.ма.Оказалось, что индивидуальные КОКф и их потомки обладают огромным про-лкферативным потенциалом. К X пзссажу численность фибробластов в отдельных штаммах составляла 1,2-7,2х109 клеток. В процессе своего развития они осуществляли до 31-34 клеточных удвоений.

3.4.2. Перенос костномозгового микроокружения отдельным! клонами стромальных клеток

Экспериментальные данные, приведенные в предыдущей главе, доказали, что гетеротопная трансплантация штаммов костномозгового происхождения, образованных несколькими десятками стромальных предшественников, приводила к образованию на месте трансплантации нового кроветворного органа. Возникает вопрос, способны ли перекосить костномозговое микроокружеиие отдельные клоны стромальных клеток или для этого требуется кооперация нескольких разных клоногенних стромальных предшественников? И если отдельные клоны окажутся способными к переносу кикроокружзния, будет ли оно полным, тс есть пригодным сразу для всех трех ростаов кроветворения, или разные ® игокы смогут обеспечивать формирование гяжроокружения лишь для отдельных ростков?

Для решения этих вопросов был рэзрзботан метод культивирования строгальных клетск-предшествэншков на коллагеновоы геле. В 2-3-. недельных культурах отдельные клоны фибробластов вырезали вместе с гелем и трансплантировали под капсулу почки сингенных мышей или в мышцу живота аутологичннх морских свинок. В последнем случае колонии на геле помещали в облученные костные чехлы. Таким способом были исследованы 52 клонз-фибробластов. В мшшных культурах- лизметр их составлял 0,3-0,5 см, а в культурах морских свинок - 0,8-1,0 см.

В контрольных опытах под капсулу почки и в костные чехлы имплантировали чистый коллагеновый гель. Фиксация материала проводили

на 50-30 день. В случае имплантации геля под почечную капсулу отмечалось незначительное утолщение капсулы. Полости облученных костных цилиндров бы.ти заполнены соединительной тканью.

Результаты трансплантации колоши костномозговых фибробластов показали, что только в 20 % случаев наблюдалось развитие костной или костной а кроветворной ткани. В остальных 80 % случаев результаты нв отличались от контрольных (тзбл. 10). Наибольший интерес представляли костные очаги с костномозговой полостью, заполненной костным мозгом (5 %), Внутри костных цилиндров такие очаги имели округлую форму л капсулу, построенную из костной ткани с остеоцита-ми и хорошо развитым сстеобластическим слоем. Костномозговая полость содержала ретикулярную ткань с кроветворными клетками.

Таблица 10

Перенос костномозгового микроокрукенпя отдельными клонами стромальшх клеток

Виды трансплантатов Общее Костко-число мозго-трансп- вой лантатов орган Костная ткань Ретикулярная ткань

клоны ко с Т но МО 3 ГО ЕЫХ фибробластов мыши и морской свинки на коллагеновом геле 52 '3 8 41

моноклональкыо атаммы кост номозго вдх фибро-бластов кролика в ивалоково/. губке 21 3 7 II

Под капсулой почхя трансплантат представлял собой типичный костномозговой орган. Строка костномозговой полости имела хорошо развитую систему синусов и содержала типичные жировыэ клетки. Кроветворная ткань (около 4хЮ5клетох на трансплантат)'состояла из миеле-идкнх, эрктроидных и мегакариоцитарньх элементов, соотношение которых не отличалось от такою го в обычном костном мозге. На месте трансплантации части колоний под капсулой почки была обнаружена костная ткань без следоь кроветворения (15 %). Часть из зтих очагов состояла, из компактной кости с оотеоцитэми и неполным остообласти-ческпм слори; и других случаях образовавшаяся костная ткань в момент фиксации была уже мертвой, то есть не содержала остеоцитов и но была покрыта остеоблзстическим слоем»

Обратной трансплантации такие были подвергнуты клетки Ш пассажа 21 моноклональгаго штамкэ костномозговых фибробластов кролика,, помещенные в ивалоновые губки. Материалы фиксировали через 2-3 месяца. В контрольной серии все.губки (первоначально только смоченные зрэдой) были заполнены ретикулярной тканью. В 14 % случаев пересаженные моноклональные штаммы образовывали костномозговой орган, состоящий из костной ткани и костномозговой полости, заполненной кроветворными клетками. В 33 % случаев трансплантированные штаммы фор-гировали компактную кость разной величины с замурованными в ней ос-?еоцитами и развитым остеобласткческим слоем. Остальные губки были ¡зполнены ретикулярной тканью.

Более еысокий процент клонов, выявленных в-последней серки экс-:ериментов, способных к остеогенезу и переносу микроокруаения, мо-:ет свидетельствовать о том, что условия для трансплантации на по-истых каркасах оказались лучше, чем в костных чехлах и на коллаге-обой полло.тае, и что клеточные клоны, будучи размноженными, делают то легче. На исключено, что использование более совершенных мето-эв может изменить эти соотношения.

■ Основной вывод из проведенных исследований заключается в том, го отдельные клоны стромальных костномозговых клеток способны грсить кость и одновременно переносить кроветворное микроокрулэние разу для трех (эритроидного, миелоидного и мегакариоцитарного) зстков гемопоэза.

3.4.3. Дифферепцировочные потенции клональных штаммов в диффузиошшх камерах

Ранее было показано, что трансплантация поликлоналышх штампов сгномоаговых фибробластов в диффузионные камеры, то есть в систе-, 'закрытые для проникновения клеток извне, приводила к образова-ю в них костной, либо костной и хрящевой тканей (выбор направле-я дкфференцировки клзток зависел от объема камеры)..К каким ти-и клеточных дифференцировок способны потомки отдельных клоноген-х стромальных предшественников, помещенные в закрытую систему $фузкошшх камер? Пслипотентда или детерминированы отдельные клок определенным типам днфференцировки? Необходимо .та кооператив-з взаимодействие нескольких кленов для проявления диЗфзрр.кп:1ро~ нагу потенций или тип дифферекцироБкк является закреплена прайсом отдельных клокок? И если оки'обладают такими гаяеютяга». --о саких соотношениях находятся предшественники, способшз строить

костную, ретикулярную или хрящевую ткань!

Фиброблас.ты крупных колоний в культурах костного мозга кроликов проходили в составе штамма 2-3 пассажа, после чего клетки снимали трипсином с пластика ж помещали в диффузионные камеры. 29 кле нальных штаммов, помещенных в диффузионные камеры, были имплантирс ваны внутрибрюшинно гомологичным животным (13 - в камерах типа А; 12 штаммов в камерах типа 0; клетки 4 штаммов - з камерах обоих ти пов). Фиксацию камер проводили на 30-60 сутки.

Проведенные исследования показали, что из 29 костномозговых моноклональных штаммов 13 формируют костную ткань. Только ретикулярную ткань содержали 9 камер, но вместе с костной и хрящевой тканью она присутствовала ещо в 13 камерах, что составляло всего 75,8 $ всех штаммов, В камерах типа 0, где была возможна дифферен-цировка как костной, так и хрящевой ткани, исследовано 16 штаммов. В 4 камерах (25 %) была образована как костная, так и хрящевая ткань. Причем во всех случаях, когда была обнаружена хрящевая ткан в камерах присутствовала обязательно и остеогенная ткань. Топография тканей в камере (от фильтра к центру - кость, ретикулярная ткань, хрящ) оставалась такой же, как при трансплантации поликло-нальных штаммов. Структуры костной и хрящевой тканей не имели особенностей по сравнению с аналогичными структурами в камерах с поли-клональными штаммами костномозговых фибробластов. В случае отсутствия кости и хряща в камерах формировалась ткань, состоящая из фиб-робластов (10 камер), либо камеры кэ содержали живых меток (10 камер).

Объединение двух методических подходов (получения моноклональ-них штаммов костномозговых стромзлышх фябробластов с трансплантацией их в диффузионные камеры) позволило определить, что на менее половины стромзлышх клеток-предшествешглков, образующих крупные колонии в первичных культурах костного мозга, обладают остеогешш-ки потенциями. Формирование кости и хряща в диффузионной камере, куда были помещены потомки одной клетки-предшественника, явилось доказательством существования во взрослом организме среди клеток костного мозга общего предшественника для этих двух типов тканей.

Клональный анализ выявил, что крупные колонии, составлявшие 10 % всех колоний, обладают большчм преллфергтйв'шм потенциалом. Фпбробласты в составе штаммов проходят несколько десятков клеточных удвоений и образуют значительную клеточную массу. Изучение дифференцировочных потенций в открытой системе - трансплантация

под капсулу почки - обнаружила способность отдельных клонов (около Ю %) переносить специфическое микроокружение сразу для всех трех, ростков кроветворения. Помещенные в .диффузионные камеры потомки отдельных стромальных предшественников дифференцировались в трех направлениях, образуя костную, хрящевую и соединительную ткань, причем 25 % из них проделывали это одновременно.

Данные о развитии моноклональных штаммов стромальных клеток-предшественникоз в мировой литературе отсутствуют. В наших исследованиях отдельные предшественники проходпля в составе штамма 31-33 клеточных удвоений, а их потомство составляло 0,9-2,0х109 клеток. Анализ дифференцировочных потенций отдельных костномозговых стромальных предшественников, проведенный путем трансплантации моноклональных штаммов в диффузионные камеры, зыявкл, что половика из них язляются остеогенными. Крупные колонии, среди которых проведен анализ, составляли 10 % от общего числа колоний. Следовательно, число остзогенных КОКф составляет не менее 5 % от их общей популяции. Поскольку среда малых колоний тестирование не проводилось, а среди ккх также могут быть остеогенные предшественники той или иной степени детерминированности, процентное содержание остеогеяннх предшественников может бытк выше. Среди выявленных остеогешшх предшественников присутствуют клетки, которые способны формировать одно-, временно костную и хрящевую ткань, то есть впервые установлено, что для этих двух типов тканей в организме есть общая клетка-предшественник. Они составляют 25 % среди тестируемых клонов, а их численность среди, общзй популяция клеток-предшественников составляет но менее 2,5

Клональный анализ КОКф костного мозга in vitro был проведен к.Owen /1987/, которая установила, что при воздействии на первичные культуры эпидерыалышй ростозой фактор увеличивал средний ряз-нер колоний, уменьшая клональнуя экспрессию щелочной фосфатазы, а добавление гидрокортизона активировало in vitro остеогенную направленность их дифферешкровки, Зти исследования подтверждают возможность проведения клокадьного анализа стромальных предлественни-ков vitro ,

' Гетерогенная трансплантация отдельных клонов костномозговых . фибробластов выявила новые аспекты структурной организации популяции стромзлы-шх предшественников. Среди них былч выявлены предшественники, способные переносить специфическое кикрсокруяение сразу

для всех ростков кроветворения. Их •численность среди исследованных крупных клоков на разных моделях составляла 5-15 %, то есть 0,51,5 % от общего числа выявляемых клеток-предшественников. Наряду с клонами, переносящими полное костномозговое микроокружение, присутствуют предшественники, детерминированные лишь к остеогентш потенциям. Их численность от общего числа предшественников составляла

т ^ _п сг

Л,^—О /От

Из перечисленных выше данных следует, что популяция стромаль-ных клеток-прздшестненкиков по своим дифференцировочным потенциям является гетерогенной. Среди них имеется категория клеток, претендующих на роль стволовых стромальшх клеток, поскольку, обладая высокими пролиферативными потенциями, способны дифференцироваться во всех трех направлениях, свойственных строыальной ткани костного мозга, образуя при этом костную, хрящевую и ретикулярную ткань. Для дальнейшего изучения популяционной структуры этой категории клеток необходимо иметь маркеры для выявления соответствующих дифференци-ровочных белков. Соответствующие исследования в настоящее время проводятся М.Оиеа /1990-1592/.

3.5. РЕАКЦИЯ КЛОКОГЕНШХ СТРОМАЛЬШХ ПРЕЖЕСТВЕННЖОБ НА ПРОЦЕССЫ РЕГЕНЕРАЦИИ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАШ

3.5.1. Системный ответ стромы кроветворных органов после локального ккретаяа костного мозга

Кюретая, или механическое Опустошение костномозговой полости, является удобной моделью доя изучения регенерации. стромалышх и кроветворных элементов и для определения роли стромы в процессе гемошоза. Для оценки кооть-косткомозговых взаимоотношений после проведенного вмешательства важно сопоставить изменение численности кроветворных элементов и стромальных клеток-предшественников в последовательных фазах регенерационного процесса.

В каждом опыте для оценки изменений численности стромальных клеток-предшественников определяли число вымытых из костномозговой полости больиеберцовой кости (ЕЕК) ядерных меток, концентрацию КОКф и количество КОКф ео всей БЕС,. Эксплантацию клеток из БЕК нормальных, животных проводили параллельно с каждым одытом по эксплантации клеток кгаретиро ваннах животных (Рис. 2).

При юоретаке костного мозга удаляется около половины клеток, образующих колонии фибробластов - КОКф (1300), В течение первых

грех суток, начиная с момента "О", достоверных изменений количества КОКф в третированной кости не происходит. Число КОКф к 7-12 суткам (2400 - 2600) возрастает и достигает соответствующей величины у контрольных животных (2200). К 20-м суткам содержание КОКф в третированной БЕК продолжает увеличиваться (5400) и в 2,5 раза превышает зх уровень у нормальных животных.

В результате цитохимического исследования установлено, что костномозговые клетки, взятке на 4-е и 6-е сутки после кюретажа, образуют в культурах колонии фибробластоз, 86 % и 73 % которых, соответственно, состоят из клеток, дающих положительную реакцию на щеточную фосфатазу по Гомори, тогда как клетки нормального костного гозга морских свинок образуют колонии фибробластов, даюших отрицательную реакцию по Гомори. Это может свидетельствовать об усилении ¡стеогенных потенций у костномозговых стрсмальных клеток-предшест-занников после нанесения механической травмы медуллярной полости, [инзмика изменения численности КОКф коррелирует с начинающимся с третьих суток процессом усиленного остеогенеза. Вполне вероятно, ¡то большая часть КОКф участвует в образовании кости и вновь формующейся ретикулярной стромы.

При этом общая клеточность костного мозга кюре тированной голе-м достоверно уменьшается с момента "О" (20 % от нормальней воличи-ы) в течение первых 3-х суток, что может быть связано с неблаго-раятннм кикроокружеитем, создаваемым разрастающейся ретикулярной каньв и формированием очагов остеоидной ткани, а также с поврежде-лем сосудистой системы при кюретаке. К 20-м суткам происходи? за-етнзе увеличение клеточности костного мозга, которая липь на 30 % иже нормы.

Начиная с 6 часов и по 20-е сутки включительно наблюдается до-товерное возрз-станио как концентрации, так и количества КОКф 4100 - 5500) з коктрлзторальней ЕВК, последнео превитает содержа-20 КОЖ з нормальном костном мозге в 2-2,5 раза. Число крозетвор-ых клеток по сраггсшта с контролем в контрлатеральной БЕК досто-орно не изменяется во все исследованные сроки.

При ш:о~ест;з2:п:с:,) юорстажо (3-5 костей: ББК, 2 бедра, 2 плече-•;е ::ости) тгкл.о прогоходнт увеличение концентрации " количесп'з ОКй в ииггряатвральгей ЕЕл. Причем концегстрепкя КОКф почти в 3 раз провес? их уровень ЯГ- трпг.-.'в одгой кости, и в а рзз - парольную величину. Содсрггаг.иэ ХСК} в контрлггзрзльной Г Г" нрч оюм з 2 тэт но срзз?нсяотз с ::?;рпт:зг:?' одной косп:: м п 6 раз

2(|х>0

Зсуг. 7с. ¿2с. 20с.

Рис. ?.. Изменение численности КОлф в кюретированной и контрлатеральной ББК.

е - контрлетеральная ББК;А-юоретированная ББК

.Л!

+

1 ♦♦

А

*

й ,

{«о») 2(1031)

Зч. 6ч. (>ч. Ич. Зсут. 7с. 12с. 20с.

Рис.3. Измене икс численности КСКф в селезенке в различные сроки после киретажа. По оси абсцисс - время послс кюретажа По оси ординат числа ИШф

контроль

Оч

по сравнению с контролем.

3.5.2. Реакция стромы вторичных лиг.йоидных органов на процессы регенерации костного мозгз

Представляло интерес выяснить, реагирует ли популяция КОТ'ф змфоядных органов, в частности, КОКф в селезенке, на механическую эавму костного мозга. Показано, что содернание КОКф в селезенке в зчение первых суток после кюретака ЕЕК, также как л общая глеточ->сть органа, не превышает контрольной величины. В дальнейшем отме-¡ется увеличение числешюсти КОКф, которое к 20-м суткам в 3 раза >евысает число КОКф в контрольной группа животных (Рис. 3). Эти ¡менения происходят на 'фоне увеличения общей клеточности селезенки i 50-60 %.

Таким образом, под влиянием механической травмы костномозговой |Дости происходят существенные изменения з ретикулярной строме не лько з оперированной кости и в отдаленных частях скелета, но и в лезете. Следует подчеркнуть, что в отличие от костного мозга, ;е увеличение численности КОКф наблюдается через сутки, з селезек-подобный ответ проявляется в более поздние сроки после операции, чипая с 7-х суток и достигая максимальных значений к 20-м суткам.

Представленные данные свидетельствуют о том, что при нанесении ханической травмы костномозговой полости имеет место системный вет стромальной ткани кроветворных и ликфоидных органов.

3.6. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ даГШЩНЫХ ШГАЖОВ ССТЕ0Г2НШХ СТРОГАЛЬНЫХ 1СЛЕТ0К костного ь:озга ЧЕЛОВЕКА КАК НОЕЬЙ ЕЮТЕХН0Л0ШЧ1СКИЙ МЕТОД ЛЕЧЗШЯ ДЕФ5КТ03 КОСТЕЙ

3 успоьиях клиники довольно часто встречаются случаи, когда рошэ регенерирующие з нормз трубчатые ковти "порс-стзют рзгечгзриро-ть, что зачастую приводит к возникновению ложных суставов к от- • тствиэ долхпого лечебного эффекта. Стимуляция регенерации костной а ни является едкой из актуальных проблем современной трзвматоло-а и ортопедии. Ведется поиск новых методов, которые позволили бы щелочить реализация регензрзаяонннх потенций хсстп. Разработан-\ нами метод позволяет выявить в костном мозге и рззннокить in tío иоийолее рзнпко сстссгошздо клетки-предаеслмпквки, среди горыг присутствуют стеоловыэ оотеогепныо клатки, способные при

обратной трансплантации в организм образовывать костную ткань на месте пересадки.

После предварительных экспериментов с травматологами были со- • гласовзны возможности использования выращенных in vitro костномозговых стромальных фибробластов для лечения костных дефектов в клинике. На Ученом медицинском совете КЗ СССР было сделано сообщение и получено разрешение на апробацию в клинике ЕрШИТО нового биотехнологического метода восстановления костных дефектов и проведение первой в практике отечественного здравоохранения обратной трансплантации в организм клеток, выращенных in vitro .

Учитывая, что одной из сложных и важных проблем современной травматологии и ортопедии является лечение несросшихся переломов, ложных суставов и больших костных дефектов, были отобраны больные с подобной костной пзтолсгией для лечения методом трансплантации в область костного дефекта выражениях in vitro остеогенкнх костномозговых фибробластов.

Методика операпии состояла из 2-х этапов:

1. Забор костного мозга у больного и культивирование остеоген-ных клеток-предшественников.

2. Аутотрансплантация выращенных клеток в очаг повреждения.,

Забор костного мозга производили под местным обезболиванием

путем трепанации подвздошной кости. Трепанат помещали в питательную срзду с гепарином. Обработку трепаната и культивирование проводили по обычной методике. Общее число пассажей зависело от числа клеток, которое было необходимо для проведения второго этапа операции, то есть зависело от объема заполняемого костного дефекта и технических подходов оперативного вмешательства. •

Техника еутотрансплентаыии зависела от перелома, положения отломков, степени васкуляризацаи их концов и других обстоятельств. Трансплантацию клеток производили в аллогенном губчатом костном ма-триксе, приготовленном по технологии, разработанной в ЕрШИТО /Осе-пяк К.А., Козлова В.И.,1981/. В I см3 матрккса помещали 1-2x1О7 вы-ращонгшх костномозговых фибробластов.

Начальные признаки консолидации различны е зависимости от вида и локализации рассматриваемой патологии, величины дефекта между отломками, тяжести и длительности воспалительного процесса в костях. Явяэшя остеогеяеза, отмечаемые рентгенологически, выявляются в сроки от 2 до 6 недель, а полное сращение - через 4-5 месяцев.

Результаты лечения у данной группы больных прослежены в течение 7 лет. Каких-либо осложнений, сзазэнкых с применяемой метода-

кой, нами не наблюдалось.

Лечение методом аутотрансплантации остеогенных клеток, выращенных in vitro , выгодно отличается от существующих методов заметным ускорением сроков сращения и замещения, а самое главное -высокой эффективностью. Он позволяет сократить сроки реабилитации, включая медицинскую, социальную и трудовую.

На разработанный метод получено авторское свидетельство. И 1400616 от 8 февраля 1988 г. я серебряная медаль ВДНХ СССР.

На основании приведенных данных можно сказать, что впервые в практику травматологии и ортопедии внедрен новый биотехнологический метод лечения костных дефектов, основанный на обратной трансплантации в организм аутологичных остеогенных клеток костного мозга, выращенных in vitro . На первом этапе он был использован для лечения больных с несросшимися переломами, ложными суставами и большими дефектами костей. Принцип разработанного нами нового.биотехнологичес-кЬго метода замещения костных дефектов является универсальным и диапазон его использования может быть значительно расширен не только в травматологических, но и в стоматологических, челюстно-лицевых и нейрохирургических клиниках.

- ВЫВОДЫ

1. Выявлена категория клеток-предшественников, ответственных за организации кроветворного и лимфоидного микроокружения. Трансплантация клеток только этой категории обеспечивает формирование но-еых органов кроветворения и иммунитета.

2. Разработана модель культивирования стромальных клеток-предшественников кроветворных и лимфоидных органов, позволяющая изучать их численность, свойства, пролиферативние и дифферонцировочные потенции.

3. Стромалыше метки-предшественники, выявляемые в монослсй-кнх культурах кроветворной и лимфоидной ткани, представляют самостоятельную линию клеток, гпстогенетически независимую от стволовых кроветворных клеток,

4. Стромальные клетки-предшественники обладают высоким проли-ферэтквнум потенциалом. При пассировании in vitro их потомки проходят более 30 удвоений.

5. .В составе штаммов костномозговых фибробластов наряду с приростом численности клеток увеличивается количество' остеогенных предшественников. Когда потомки КОКф проходят 20-25 удвоений, число' остеогенных единиц превышает не только число КОКф исходных для данного штамма, но и число всех костномозговых клеток, аксплантирован-ннх при инициации штамма.

6. Показано, что трансплантация клеток одной категории, а именно стромальных селезеночных фибробластов, обеспечивает формирование лимфоидных органов, на территории которых, б ответ на введение Т-ззвисимых АГ, происходит дифференцировка В-клеток до антзтелопроду-цирующих клеток.

. 7. 4-1 Ь% костномозговых стромальных клетокт-предшествекников способны давать начало клонам фибробластов, каждый ез которых при обратной трансплантация в организм переносит полноценное кроветворное микроокружение, обеспечивающее одновременное развитие всех трех ростков гемолоэза.

8. Установлено, что в костном шзге имеется общий предшественник для костной и хрящевой тканей, потомки которого в виде монокло-нального штамма, трансплантированного в диффузионные камеры, способны к остео- м ховдрог-енезу.

S. Показано, что стромальнне клетки-предшественники костного мозга из основных (тазовых и бедренных) и накладных (теменных) костей обладают хондро- и остеогенными потенциями, хотя в фило- и онтогенезе костей первого типа реализуются оба вида дафференцировоч-Kbix потенций, а во втором случае стадия хоздрогенеза отсутствует.

10. Регенерация кроветворного мккроокрукения при мехаиической травма (иоретзже) костного мозга сопровождается резкой перестройкой строкалькой ткани не только в поврежденной области, но и в отдаленных областях кроветзорных и лимфопдных органов, то есть имеет место системный ответ органов гемо- и лимфопоаза.

11. Разработан и внедрен в практику здоавоохраi;еiшя нозый биотехнологический- способ лечения дефектов костей (авторское свидетельство J5 1400616), основанный на трансплантации а область дефектов выращенных in vitro остеогенных костномозговых фибробластов.

12. В состав популяции стромальных клеток-предшественников костного мозга входят категория клеток, которые по своим пролифе-ративным к дифференцированным потенциям являются претендентами на роль стволовых клеток строыальной ткани, способных при обратной

трансплантации в организм обеспечить образование костной, хрящевой "и ретикулярной тканей.

Материалы диссертации доложены на:

1. Всесоюзном симпозиуме по вопросам консервирования, культивирования и титрования костного мозга. Москва, 1971.

2. Всесоюзных конференциях по радиационной иммунологии и микробиологии. Москва, 1972, 1977.

3. Ка УШ Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов. Ташкент, 1974.

4. Всесоюзной конференции по общей и прикладной иммунологии. Москва, 1974.

.5. I Всесоюзном съезде гистологов и трансфузиологов. Москва, 1979. .

6. IX Международном симпозиуме по сравнительному изучению лейкозов и родственных заболеваний. Сухуми, 1979.

7. Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии". Москва, 1981.

8. Международном симпозиуме "Стромальная и Т-клеточная регуляция кроветворных стволовых клеток". Москва, 1984.

9. Всесоюзной конференции "Вопросы иммунологии и молекулярной ' биологии". Нальчик, 1981.

10. Всесоюзном симпозиуме "Стволовые клетки и опухолевый рост", (иез, 1985.

11. Всесоюзном симпозиума "Кроветворные клетки-предшественники з механизмах повреждения и консолидации системы крови при действии га организм экстремальных факторов". Челябинск, 1986.

12. Всесоюзной конференции по проблемам физико-химической био-гагии и биотехнологии. Ереван, 1986.

13. Всесоюзном обществе иммунологов. Москва ,• 1986, 1589.

14. Всесоюзном обществе анатомов, гистологов, эмбриологов. 987, 1990.

15. Рабочем совещении Научного соеотэ АН СССР в рамках програм-ы "Проблемы биологии развития" в секции "Стволовая кроветворная летка". Москва, 1990. .

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной тка-, ки морских свинок.- Цитология,- 1970.- т.ЗШ.- Jé 9./соавторы: Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С./.

2. Кроветворная ткань в органных мопослойных культурах вне организма.- Вестник АШ СССР.- 1970.- Si 7./соавторы: Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., Лациник К.В., Прусевич Т.О./. '

.3, The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen celle. - Cell Tissue Kinetics.-1970,- v.3, a 4./соавторы: Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С./.

4. Остеогенная активность фибробластов из монослойных культур костного мозга и селезенки при их обратной гетеротопной трансплантации.- Материалы Всесоюзного симпозиума по вопросам консервирования, культивирозашя и типирования костного мозга.- Москва,- 1971. /соавтор Лалыкина К.С./.

5. Изучение фибробластоподобных клеток в монослойных культурах кроветворной ткани морских свинок,- Материалы общеакадемической конференции молодых ученых.- Москва.- 1971.

6. Обратная трансплантация клеток костного мозга, выращенных in vitro t Вопросы радиационной иммунологии и микробиологии. Тезисы.- Москва.- 1972,/соавторы: Лалыкина К.С., Герасимов Ю.В./.

7. Стромалыша клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфсидной ткани,- Проблемы гематологии и переливания крови.- 1973,- й 10./соавторы: Фриденштейн А.Я., Лациник Н.В,, Панасюк А.Ф., Кейлис-Борок И.В./.

8. ФкЬробЛиСТЫ, формирующие строга кроветворных и ллифоидных органов.- Тезисы УШ Всесоюзного съезда анатомов, гистологов и эмбриологов.- Ташкент.- Ï974./соавторы: Лациник Н.В., Герасимов Ю.В., Епихина С.Ю., Кейлис-Борок И.В./. . •

9. Stromal cells responsible for transferring the aicroenvi-ronTent_of the hemopoietic tissue.- Transplantation.- 19?4.-v."17.-¡t 4./соавторы: Фриденштейн Л.Я., Лациник Н.В., Панасюк А.Ф., Кейлис-Борок И.В./.

10. Трансплантация стромальных клеток, ответственных за создание специфического микроокружения.- Материалы Всесоюзной конференции по общей л прикладной иммунологии.- Москва.- 1574./соавтор:

Герасимов Ю.В./.

11. Изменение численности стромальных клеток-предиествашшков

после кюре тала,- Клетки-предшественники кроветворной ткани.. С б. трудов.- Москва.- 1977./соавторы: Герасимов Ю.В.ц Сысоева Л.П./.

12. Сравнительное изучение числа стромальных клеток-предшественников в плоских и трубчатых костях кролика,- Радиационная микробиология и иммунология. Сб. научных трудоз.- Москва.- 1Э77./соавтор: Герасимов И.В./.

1?. Изменение содержашщ стромальшх клеток-предшественников у крыс различного возраста. - Радиационная микробиология и иммунология, Сб.научных трудов.- Ыоскза.- 1977./соавтор: Герасимов Ю.З./.

14. Влияние кюретзла костномозговой полости на костномозговые стромальные клетки-предшественники.- Бюлл.зкспер.биол.мед,- 1978,-№ 9./соавтор: Герасимов Ю.В./.

15. Происхожденио стромальных механоцитсв костного мозга по данным их типирования по изоантлгенам и хромосомным маркерам,- Онтогенез.- 1978.- т.9, & З./соавторы: Иванов-Смоленский А., Герасимов Ю.В., Горская Ю.Ф., Куралесова А.И., Лациник Н.З., Фрвденштейц. А.Я./.

15. Перенос костно-мозгового микроокружения клонами с громадных механоцктов,- Еюлл.экспер.бисл.мбд.- 1978.- № 12./соавторы: Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я./

17. Origin of bone narrow stroaal aiechanocytes in radiochimeras and heterotopic transplants.- Kxperinental Hematology.-1978.-?? 6.

18. Стромальные механоциты - клетки, ответственные за перекос микреокружения.- Актуалыше вопросы пересадки органов и тканзЗ.Труды института.- 1978.- Москва.- т.ХШ.- Серия - хирургия.- Выпуск 23. /соавтор: Герасимов КЗ.В./. '

19. Имплантация аутологичнкх фпбробластоз на миллипоровых фильтрах в роговину кролика,- Еостннк офтальмологии.- 197Э.- А 4./соавторы: Краснов M.f.i., Зваютро1>а Г.Г., Малзева Л.В., Герасимов В.В./

20. Укрепление роговицы зутотраксгсгантзтгми как основа керото-¡грстбзировзькг. -- Реко.тструотввная офтальмохирургия. Сб.трудов.-[979.- .Мссчва./соазтсры: Краснов М.М., Ззангирова Г.Г., Малаева Л., Герасимов Ю.В./.

21. Морфологический а нагл з рьгзкергдаа костного мозга морской ;в-анъ-.и после г-'юрета.ча.-'Архив анатомии, гистологии я экмрис-логип.-[979,- & д./ соавторы: Герасимов В.В., Сксоозсг Л.П./.

22. Перенос кроветворного микроокру^е;ия цэдьвен популяцией и отдельным ¡слонами стромзлъних мехапсиитов, вырг.шенными in vitro Гезис.ы I Всссокзн. съезда гематологов и траисфузиологоз.- 1979.»

/соавторы: Герасимов Ю.В., Горская Ю.Ф., Грошева А.Г./.

'23. Костеобразовзнке в роговице кроликов при аутоимплантации костного мозга,- Всесоюзная конференция "Биологическая характеристика лабораторных животных и экстраполяция на человека экспериментальных данных.- 1930.- Москва./соавторы: Краснов М.М.,-Звангирова Г.Е., Шалаева Л.В.Г Герасимов Ю.В./.

24. Bone marrow stromal mechanocytes: Cloning in vitro and tha • transfer oi hemopoietic mioroenviroment. Advances in comparative

and Leukemia research.- Proc. IX intern, syap. on comparative research on leukemia and related discuss.- Сухуми.- 2979c- Москва.-I9B0.-/соавторы: Фридештейн А.Я., Лациник Н.В., Горская Ю.Ф., Герасимов Ю.В., Кузнецов С.А., ЛурияЕ.А., Грошева А .Г./.

25. Клетки, создающие кроветворное и лкмфоидное микроокружение: свойства, влияние внешних факторов и-регуляция антителообразевания в культурах.- Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии".- 1931.-..Москва.-4.1./соавторы: Генки-на E.H., Герасимов Ю.В., Горская Ю.Ф., Григулевич Е.И., Кузнецов

С.А., Кулагина H.H., Куралесова А.И., ЛурияЕ.А., Сидоренко A.B./.

26. Некоторые факторы, влияющие на клетки, создающие микроок-руяешю в костном мозге и селезенке. - Тезисы конференции "Вопросы иммунологии и молекулярной биологии".- 1981.- Нальчик./соавтор: Герасимов Ю.В./. - .'

27. Клетки-переносчики кроветворного микроокружения.- Итог*: нэуки и техники, серия "Иппология".- 1983.- Москва.-т,12./соав- ■ торн: Фркдештейн А.Я., Лацшшк Н.В., Куралесова А.И., Горская К?«Ф., Сидорова С.КЗ., Герасимовой.В./.,

28. Морфологические и цитологические особенности сТибробластов в мзнослойшх культурах.- Лабораторное дело.- 198а." 4./соавторы: Морозова В.Т., Егорова Т.И., Г.'.одестовз Е.З,, Герасимов Ю.В./.

29. Содержание в костном мозге остеогенных клеток-прэдшестзен-1шков и их размножение в культурах.- Евлл.экспср.биол.мед.- 1984.-т.ЯОТ.- й II./соавторы: Герасимов Ю.В., Фридештс-йп А.Я./.

30. Стволовые стромалььне клетки костного мозга,- Сб.наз'чных трудов "Стволовые клетки к опухолевый рост",- 1985.- Киев./ссавто-рп Герасимов Ю.В., Фриденетейи А.Я./.

31. Пролиферативныз к диффырекцкровочныв потенции скелетогея-ных костномозговых колониеобразующЕх клеток.- Цитология,- 1986.т. Х2УШ, й 3.-/соавторы:ФркденЩ'ГеЁн A.ft., Герасимов Ю.В./.

32. Остеогешше v хондрогенныо потенции стромальных клеток-

предшественников костного мозга.- Материалы симпозиума "Кроветворные клетки-предшественники в' механизмах повреждения и компенсации' системы крови при действии на оргазнзм экстремальных факторов". Тезисы докладов.-1986.-Челябинск./соавторы: Герасимов Ю.В., Фриден-штейи А.Я./.

33. Дифференцировочные потенции клональных штамгов костномозговых фибробластов.- Волл.экспер.биол.мед.- 1986.- № 7./соавторы: Герасимов Ю.В., Фридснштейн А.Я./.

34. Аутотра не плантация культуры костномозговых фибробластов при дефектах костей у человека.- Конференция по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов.- 1986,- Ере-ван./соавторы: Осепян И.А., Козлова В.В., Айвозян В.П., Горибян Э./.

' ' 35. Замещение дефекта черепа половозрелых кроликов костномозго-зыми клетками и стромалышш фибробласташ, имплантируемы!,® на синтетической основе,- Четвертая зональная межвузовская конференция по регенерации органов и тканей животных и ее стимуляция. Тезисы док-юдоз.-.1986.- Ереван./соавторы: Саргсян А.А., Козлова В.В./.

36. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation md transplantation in diffusion chambers.- Cell tissue kinetics.-'.987,- Is 20./соавторы: Фриденктейн А.Я., Герасимов К).В./.

37. Биосинтез фибробластега мембраноспецифических белкоз, рас-гознающих простые гаптекы и сходных по идиотину с антителами к томнее гантену,- Иммунология.- 1987,- № 2,/соазторы: Бартова Л.М., Ку-гагинз Н.М., Мзргулис Г,У., Тарханова И.А., Кульберг А,Я./'.

38. Лечение несроспшхся переломов, ложных суставов п'дефектов данных костей трансплантацией аутологичных костномозговых соиброб-:астов, шпрегнировашых в губчатый костный матрикс.- Ортопедия, . ■равизтология и протезирование.- 1387.- й 9,/соавторы: Осепян И.А., 'арпбян Э.С., Айвазян B.lT./.

39. Стволовые клетки костной -ткани,- П Всероссийский съезд нзтомов, гистолохиз. Тезисы докладов,- 1988,- Москва,/соавторы: ридепщ-тейн А.Я., Герасимов Ю.Б./.

40. Аутйтронст7ля:-ггг:ция костномозговых фибробластов з травка-ологки и ортопед;-,'!':.- Вестник хирургии.- IS88.- & 5./соавторы: сеглнИ.А., Гарибнн Э.С., Айвазян В,П./.

41. Способ лечения.дефектов костей,- Авторское свидетельство 14006Tb.- 1938./сог props: Осепян И.Л1., Фркдекитойн А.Я., Айвэзян

.П., Гар'.'бян З.С., Козлова З.В., Саргсян А,Л,, Герасимов Ю.В./.

42. lLTiLiOT>n;a кзрегенерирувдих дефектов костей черепа ¿¡.-план-

тацией костномозговых фибробластов в сочетании с.губчатым костным матриксом в эксперименте,- Журнал зкспер. клинич.мед. АН Арм ССР,-1989,- т.ШХ,- й 2./соавторы: Осепян И.А., Тевосянц A.B., Саргсян A.A., Геворкян H.H./.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ

АГ - антиген

БЕК - большеберцовзя кость .

АОК - антителообразушие клетки

•ИЛ - интерлейкин

КФН - интерферон

КОКф - клетки, образующие колонии фибробластов

СКК - стволовая кроветворная клетка

ССК - стволовая с громадная метка

Т® - фактор некроза опухоли

ЭБ - эритроциты барана

ЭКОф - эффективность образования колоний фибробластов