Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Действие реаферона на опиоидные механизмы алкогольной интоксикации крыс

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ЦЕНТР НАРКОЛОГИИ

На хтравах рукописи

УДК 615.917'262-613.81

..............ПЕТРИЧЕНКО Ольга Борисовна

ДЕЙСТВИЕ РЕАФЕРОНА НА 01ШОЩНБЕ МЕХАНИЗМ' АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ КРЫС.

14.00.45 - наркология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой'степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

/ **

Работа выполнена в Центре наркологии МЗ РСФСР

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Л.Ф.Панченко кандидат биологических наук А.М.Балашов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б.М.Коган доктор химических наук Н.В.Породенко

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательский институт психиатрии Минздрава РСФСР

Защита диссертации состоится ¿^^-¿¿¿А 1992 г.

в -/0"° чзсов на заседании специализированного совета Д.074.50.01 Центра наркологии по адресу: 121931, Москва, Малый Могильцевский пер., дом 3-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке центра.

Автореферат разослан п<30

оиЛ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

О.Ф.Львова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Решение проблем, связанных с злоупотреблением алкоголем, представляется одной из наиболее важных задач современной медицинской: науки. Широкая распространенность алкоголизма среди различных слоев населения, его неблагоприятные медико-социальные последствия предопределяют необходимость разработки эффективных методов и средств лечения данного заболевания. При этом особое внимание следует обратить на соединения, купирующие или предотвращающие развитие его основных симптомокомлексов: патологического влечения к алкоголю, толерантности к нему и алкогольного абстинентного синдрома. Вместе с тем, ясно, что создание адекватных способов терапии невозможно без всестороннего изучения механизмов развития алкоголизма (Г.В.Морозов, 1981).

Проведенные исследования показали, что этанол приводит к нарушению функционирования центральных медиаторных систем, в частности катехоламиновых, которые вовлечены в патогенез алкоголизма (И.Б.Анохина, Б.М.Коган 1975, 1985). G другой стороны можно считать установленным, что в регуляции нейромедоаторных процессов принимают участие эндогенные огогоидше пептиды, выполняющие нейромодуляторные функция (И.П.Анохина и др. 1981, 1984; Л.Ф.Панченко и др. 1981, 1982; , B.Tabakoii et al 1981). Боле.е того, изменения активности отгоидиих систем могут играть ключевую роль в процессах формирования зависимости от алкоголя и .толерантности к нему (Л.Ф.Панченко и др. 1982; Н.А.Беляев и др. 1984, Р.Ю.Юхананов и др. 1985; В.ТаЪакоП 1983). Поэтому одно из перспективных направлений разработки средств терапии алкоголизма связано с поиском соединений, обращающих нарушенное этанолом

состояние опиоидных систем: влияющих на синтез и деградацию пептидных лигандов, или модулируквдя активность специфических рецепторов. Наиболее интересными в этом отношении представляются исследования эндогенных веществ, например, иммунной природа, как возможных лекарственных препаратов с менее выраженными по сравнению с ксенобиотиками побочными эффектами.

Проблема взаимодействия нервной и иммунной систем привлекает в последнее время внимание исследователей как с фундаментальной, так и с практической точки зрения (Ы.Ва!пу ег а1 1983; Л.Е.Ног1еу ег а1 1935, 1986; 1!.Р1о1п1коИ ег а1 1987; Б.Сагг еЪ а1 1988; <1..Е.В1а1оск. 1988). Предполагают, что существование, связи между ними обусловлено, с одной стороны, свойством многих нейропептидов выступать в роли модуляторов специфических иммунных реакций, а с другой, способностью иммунокомпетантшх клеток воздействовать на активность медааторных систем, продуцируя нейрогормоны, лимфокины и монокины («7.Е.Мог1еу et а1 1987). К числу возможных модуляторов состояния опиоидных систем может быть отнесен «-интерферон (а-ИФН) - известный регулятор клеточного гомеостаза, обладающий антибелоксинтезирующей, противовирусной и антиклеточной, активностями.

Цель работы состояла в изучении влияния «-интерферона на опиоидергическиэ механизмы формирования зависимости от этанола и толерантности к нему.

Задачи исследования:

- установить характер влияния и выявить механизм действия рекомбинантного <х-интерферона на субпопулящш опиоидшх рецепторов головного мозга крыс;

- ' изучить изменения состояния описидных систем у' экспериментальных животных при острой алкогольной интоксикации на

фоне введения а-интерферона; """ ' " "• '* ■........

- исследовать возможность нормализации препаратом "Реаферон" нарушений, состояния опиоидных систем, вызванных хроническим потреблением этилового спирта;

оценить целесообразность применения реаферона для купирования проявлений зависимости крыс от этанола и толерантности к нему.

Научная новизна. Установлено, что а-ИФН способен эффективно подавлять проявления экспериментальной алкогольной зависимости, а также снижать толерантность к гипотэрмическому действию этанола. Нормализация реафероном физиологических проявлений хронической алкогольной интоксикации сопровождается восстановлением параметров, характеризующих функциональное состояние опиоидных систем: активности опиоидных рецепторов и содержания эндогенных лигандов. Введение «-интерферона на фоне острой алкогольной интоксикации эффективно, обращает как нарушения опиоидаой рецепции, так и изменения содержания пептидов (г?-эндорфина и мет-энкефэлина). Показано, что действие реаферона на состояние опиоидшх систем опосредовано его взаимодействием с опиоидныш рецепторами головного мозга. Обнаружена способность «-интерферона аллостерически регулировать опиоидные рецепторы.

Практическое значение. Экспериментально подтвервдено ' существование взаимосвязи нервной и иммунной систем, при этом регуляция центральных процессов может быть, опосредована «-интерферон-зависимыми ''механизмами. Получены доказательства возможности использования препаратов «-интерферона в наркологической практике для подавления алкогольной зависимости и снижения толерантности к этиловому спирту. На основании результатов исследования подана и принята к рассмотрению заявка

на авторское свидетельство "Реаферон как средство, подавляющее влечение к алкоголю".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: X Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы, Горький, 1987; конференций молодых ученых ВНЦ наркологии, Москва, 1988; X региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону, Рига, 1988; Ш республиканской конференции молодых ученых БССР "Медико-биологические аспекты повреждения и компенсации. Проблема алкоголизма и здоровый образ жизни", Гродно, 1989; 5-ой Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов", Москва, 1990; Учредительном конгрессе международного общества патофизиологов, Москва, 1993; Проблемной комиссии по вопросам наркологии Всесоюзного центра наркологии, Москва, 1991.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения , выводов и списка литературы. Работа изложена на /Î2 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 16 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель содержит наименований, в т.ч. S2 отечественных и иностранных авторов. ' ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на самцах белых лабораторных беспородных крыс с начальной массой 100-220 г. Острую алкогольную интоксикацию моделировали однократным вяутрибрюшшным введением 25% (объем / объем) раствора этанола в дозе 4,5 г/кг массы животного. Крыс забивали через 30 минут после инъекции. Реаферон

в дозе I04 МЕ/ животное вводили однократно за I час до забоя. Для создания модели хронической алкогольной интоксикации животным в течение 10 месяцев предоставляли I5S раствор этанола в качестве единственного источника жидкости.

Предпочтительное потребление животными алкоголя исследовали в условиях свободного выбора. Влияние реаферона оценивали при однократном внутрибрюшишом введении 2хЮ4 МЕ/ крысу или ежедневном введении I04 МЕ/крысу препарата в течение 10 дней. Чувствительность алкоголизированных крыс к этанолу определяли на основании изменения ректальной температуры в ответ на тестовую дозу этилового спирта - 2,5 г/кг.

Для' определения свызыванцих характеристик опиоидных рецепторов (ОР) использовали радаорецепторный анализ. Мембранную фракцию ОР выделяли по методу (R.Slmantov et al 1976) в модификации (А.М.Балашов и др. 1981).

Содержание р-эндорфша (БЭ) и мет-энкефалина (МЭ) в образцах определяли с помощью коммерческих наборов фирмы "INC Star" (США). Иссечение отделов головного мозга экспериментальных животных проводили по методу (R.J.Killer et al. 19Т8). Пептиды из ткани экстрагировали 1н. уксусной кислотой. Для получения плазмы кровь собирали в пробирки с ЭДТА (7,2 мг на 100 мкл раствора для 5 мл крови).

Определение катионов натрия в использованных растворах реафзрона проводили на плазменном. фотометре . IL-343 фирмы "Instrumentation Laboratory" (Австрия).

Белок определят! по методу (O.H.bowry et al.I95I) с использованием предварительной обработки суспензии белка дезоксихолатом натрия.

Математическую обработку результатов радиорецепторного

анализа осуществляли, используя методы (С.Д.Варфоломеев и др. 1985; В.Г.Дегтярь, Ю.В.Милосердов 1987). Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета статистических программ Б1а15гаГ, применяя г-критерий Стьюдента. ;

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние реаФерона на связывающие характеристики опиоидных

рецепторов.

Известно, что лейкоцитарный а-ИНФ оказывает влияние на опиоидные системы, причем механизм его взаимодействия с ОР зависит от концентрации иммунного гликопептида и типа связываадих участков (Т.Н.АляСьева и др. 1987). При изучении способности реаферона воздействовать на состояние ОР, оценивали изменение специфического связывания и &- лигандов: 3Н-ДДДЛ, 3Н-морфина, 3Н-дигидроморфина, 3Н-ДАГ0 и 3Н-налоксона - с ОР головного мозга крыс. Реаферой вытеснял из участков связывания агонисты опиоидных рецепторов. Исходя из экспериментально определенных значений величин Кд и ЕС50 для каждого лиганда, были рассчитаны соответствующие константы ингиОирования, которые составили: 3,25 - 0,35 МЕ х ю4/мл - ДЛЯ 3Н-морфина; 4,28 * 0,81 МЕ х 104/Ш1 - для 3Н-Дигадроморфина; 6,51 - 1,27 МЕ X 104/мл - для 3Н-ДАГ0; 8,50 - 2,60 МЕ X Ю3/Ш1 - ДЛЯ 3Н-ДАДЛ. Можно заметить, что способность реаферона уменьшать связывание с ОР <5-лиганда ДДДЛ -на порядок превосходит его влияние на взаимодействие м-селективных меток; это свидетельствует о предпочтительности действия препарата на 5-ОР.

Характер влияния реаферона на .рецепцию антагониста ОР -

налоксона оказался совершенно шшм (см. рис.1). В концентрациях вплоть до Ю5 МЕ/мл рекомбинантннй «-ИФН не сникал уровень рецепции метки; напротив, в присутствии более 5 х Ю3 МЕ/мл

С (реаферона)

Рис Л. Влияние реаферона на уровень специфического связывания 3Н-налоксона с опиоидными рецепторами головного мозга крыс. По оси абсцисс - логарифм концентрации реаферона. По оси ординат - специфическое связывание метки в %.

реаферон активировал специфическое связывание налоксона. Анализ насыщения ОР лигандом в присутствии рекомбинантного а-ИФН показал, что активация рецепции налоксона происходила за счет увеличения.сродства участков связывашя (уменьшения Кд), в то не время число мест связывания не изменялось. В связи с тем, что взаимодействие веществ в активном центре рецептора сопровождается вытеснением метки, регистрируемым в радиорецепторном анализе по снижению уровня ее рецепции, предположим существование особого

регулягорного участка на ОР-комплексе, отличного от активного центра. Связывание а-ИФН с этим участком,приводит к возрастанию сродства специфического взаимодзйствивия антагониста. Следовательно, влияние реаферона на рецепцию налоксона осуществляется по механизму аллостерической регуляции.

Фармакологический препарат "Реаферон" представляет собой рекомбинантный «-ИФН с антивирусной активностью I млн. ME в одной ампуле и содержит в качестве стабилизатора человеческий сывороточный альбумин. Дополнительным компонентом препарата являются также соли натрия, присутствующие в буфере, из которого а-ИФН- был лиофилизирован. Плазменной фотометрией выявлено содеркание натрия в одной ампуле, которое составило 200 мМ. В связи с этим, было необходимо рассмотреть влияние на рецепцию 3Н~ДАДЛ и 3Н-нало'ксона альбумина и ионов Na+.

Экспериментальной проверкой установили,, что .препарат, содержащий эквимолярное "Реаферону" количество человеческого сывороточного альбумина - 2 мг/мл - в заданном диапазоне концентраций не влиял на взаимодействие меток с ОР.

Катионы Иа+ , как известно, вызывают снижение связывания опиатшх агонистов, не изменяя при этом взаимодействия с ОР антагонистов в концентрациях, близких к физиологическим (С.В.Pert 1974; R.Slmantov et al. 1976; P.Puttfarcken et al. 1986). Поскольку использование различных количеств реаферона для оценки его действия на связывание лигавдов приводило к дополнительному внесению в среду ионов Na+ в концентрациях до 50 мМ, было необходимо оценить характер их влияния на уровень связывания опиатного антагониста. -Было обнаружено, что рецепция матки, неизменная вплоть до 3 Ш NaCl, увеличивалась с ростом концентрации Na+ и достигала максимального значения в присутствии

10 мМ NaCl. Зарегисгрировашое плато наблюдалось в довольно узком диапазоне концентраций от 10 до 25 мМ, затем уровень связывания налокссна снижался до контрольных значений. Определение параметров рецепции в присутствии НаС1 позволило объяснить колоколообразный характер влияния ионов Иа+ на уровень связывания метки: было обнаружено увеличение сродства связывающих участков к налоксону во всем исследованном диапазоне концентраций NaCl (до 100 мМ); при этом отмечаемая сначала тенденция уменьшения Вмакс (вплоть до 10 мМ NaCl) трансформировалась в достоверное снижение этой величины. Следовательно, полученные результаты соответствуют литературным данным о неизменном уровне рецепции налоксона в присутствии 100 мМ NaCl ( Pert et al. 1974).'

Таким образом, ионы Na+, как и реаферон, усиливают специфическое связывание 3Н-налоксона с опиоидными рецепторами, что возможно, благодаря юс взаимодействию с ~ собственным регулягорным центром. Однако, характер влияния катионов натрия на рецепцию налоксона отличается от эффекта реаферона, который, по-видимому, обусловлен связыванием- молекулы «-МФП с другим регуляторшм участком.

Влияние реаЗерона на состояние опиоидных-снстем при однократном

введении этанола.

. Обнаружив способность реаферона взаимодействовать с ОР в модельных " экспериментах In vitro, провели исследование его влияния на состояние ошюидных систем,~ лзмененнное однократным введением алкоголя ln vivo. С помощью анализа насыщения ОР 3Н-ДАГ0 установили, что этанол приводил • к снижению сродства специфических участков связывания метки при неизменном itx

количества (си. табл. I). В основе этого явления лежит, по-видимому, изменение конформационного состояния рецептора за счет влияния этилового спирта на текучесть мембран (Р.Ь.НоНюап ег а1 1984). Инъекции реаферона за полчаса до этанола приводили к восстановлению сродства р-ОР до контрольного значения. Введение рекомбинантного «-ИФН контрольным животным не изменяла параметры специфического взаимодействия метки.■

Таблица I.. Параметры связывания ОР коры, больших полушарий мозга крыс с 3Н-ДАГО после однокагного введения этанола и реаферона. . ' .

Группы животных Кд(нМ) Вшкс (фмоль/мг .белка)

Контроль 2,59 - 0,02 163,5 - 5,0

Контроль + реаферой 2,54 ~ 0,03 165,4 - 2,4

Этанол 5,71 - 0,10* 155,1 - 7,9

Этанол + реаферон 2,33 ¿0,13 132,9 ±4,8

Представлены результаты (М - т) 3х независимых экспериментов. Достоверность отличия мевду группами составляет:

*Р < 0,001 - по сравнению с контролем.

Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве лиганда - 3Н-ДАДЛ: наблюдаемое снижение сродства низкоаффинных участков связывания на фоне введения алкоголя, купировалось предварительной инъекцией реаферона.

Таким образом, м-ОР оказались более чувствительными к действию этилового спирта, что связано, по-видимому, с особеностями их липидного окружения (A.P.Smith et al 1983). Реафэрон способен предотвращать изменение параметров связывания рецепторов при однократном введении этанола. Вероятно, механизм,

с помощью которого а-щ нейтрализует действие алкоголя, связан со стабилизацией конформациошгого состояния активного центра p-рецептора с помощью аллостерической регуляции.

Способность реаферона влиять на параметры связывашга ОР в экспериментах ln vivo не позволяет полностью раскрыть вызываете им изменения состояния ОС. Необходимо провести исследование действия а-ЦФН на уровень эндогенных ошюидных лигандов. В работо определяли концентрации БЭ в гипофизе и плазме, а также МЭ - в стриатуме, надпочечниках и плазме.

В таблицах 2 и 3 суммированы результаты определения содержания БЭ и МЭ при раздельном и сочетанием введегаш реафвропа и этанола. Однократное введение алкоголя не влияло на

Таблица 2. Содержание /í-эндорфина в гипофизе и плазме крови крыс после однократного введения этанола и реаферона.

Концентрация БЭ (фмолъ/мг ткани или фмоль/мл)

Контроль Реаферон

Нейрогаюфиз:

«таз. раствор 13,66 - 1,11 16,30 i 1,29

Этанол 15,80 ± 1,67 15,02 ± 0,34 Дценогипофиз:

Физ. раствор 4,25 - 0,35 3,59 - 0,37

Этанол 2,83 ± 0,19** 3,76 - 0,25° Плазма:

Физ. раствор 32,3 - 11,0

Этанол 78,0 -.8,0* 62,7 ± 4,7

Представлены результаты (Ы - ш) 5 определений для каэдой группы животных. Достоверность отличия между группа!® составляет:

*Р < 0,05; **Р < 0,01 - по отношению к контрольной группе,

получавшей физ. раствор; °Р < 0,05 - по отношению к контрольной груше, получавшей этанол.

i i

концентрацию БЭ в нейрогипофизе, приводя к достоверному уменьшению его уровня в эденогипофизе; одновременно наблюдалось снижение содержания МЭ в стриатуме и надпочечниках крыс. При этом в плазме крови регистрировали увеличение концентраций исследуемых пептидов. Следовательно, однократное введение этанола активировало высвобождение БЭ и МЗ из центральной и периферической опиоидных систем, что было также показано другими исследователями (Ю.В.Буров и др. 1984, Н.А.Беляев и др. 1989, С.(51апои1аМ.з 1984).

Таблица 3. Содержание мет-энкефалика в стриатуме, надпочечниках и плазме крови крыс после однократного введения этанола и реаферона.

Концентрация МЭ (пг/мг ткани или пг/мл)

Контроль Реаферон

Стриатум:

Физ. раствор 551,0 + 63,1 442,1 + 45,9

Этанол 350,2 + 40,2* 310,3 + 63,1*

Надпочечники:

Физ. раствор • 21,8 + 2,6 -

Этанол 6,9 + 1,0** 19,9 ± 4,5°

Плазма:

Физ. раствор 121,-9 + 22,8

Этанол . 214,4 + .12,6* 141,2 + п,в00

Представлены .результаты (М - т) 5 определений для каждой группы животных. Достоверность отличия между группами составляет: *Р .< 0,05; **Р;<"0,01/- по отношению к контрольной группе,

\ получавшей физ. раствор; °Р < 0,05; 00Е < 0,01 - по отношению к контрольной группе,

получавшей этанол.

Внутрибркшинная инъекция' препарата а-ИФН восстанавливала контрольный уровень БЭ в аденогипофизе и МЭ в надпочечниках, но влияя на измененное алкоголем содержание МЭ в стриатуме. В плазме были зарегистрированы следующие изменения: достоверное снижение ■уровня МЭ и тенденция нормализации концентрации БЭ.

Вероятно, объяснение полученных результатов заключается в существовании особенности действия реаферона на эндорфшювую и энкефалиновую систеш, при этом влияние с*-КФН на содержание эндогенных опиоидных пептидов мояет бить опосредовано описидашми рецепторами. Учитывая установленную в экспериментах In vitro специфику взаимодействия реаферона с разными типами ОР, можно предполагать существование аналогичной специфичности его активности in vivo. Эти особенности могут приводить к существенным отличиям действия а-ИФН на различные опиоидые систеш, и, в конечном итоге, обусловливать выявленную разницу в реакций пептидов.

Влияние реаферона на состояние опиоидных систем при хроническом

введении этанола.

Определение параметров опиоидной рецепции в мозге хронически алкоголизировашшх крыс показало, что характеристики взаимодействия 3Н-ДАДЛ с высокоспецифичкыми к нему местами связывания остались неизменными, в то время как равновесная константа диссоциации низкоаффинных участков достоверно увеличивалась как в состоянии интоксикации, так и после отмены этилового спирта (см. таблицу 4).

Хроническое введение реаферона алкоголизированным крысам, находящимся в состоянии интоксикации, не восстановило измененный

этанолом параметр низко афршшх участков связывания 3Н-ДАДЛ. В то зкэ время, а-МФН нормализовывал сродство низкоаффинных мест связывания лиганда через 24 часа после отмены этанола. В связи с

Таблица 4. Основные параметры связывания Н-ДАДЯ с опиоидныш рецепторами мозга хронически алкоголизированных крыс: влияние реаферона.

Группа животных.

Высокоаффинные участки Низкоаффинные участки

кд (нМ)

Бмаке (фмоль/мг)

кд (нЫ)

t>

макс (фноль/мг )

Контроль:

- реаферон + реаферон Хроническая

алкоголизация: интоксикация:

- реаферон + реаферон

отмена:

- реаферон + реаферон

0,93 ± 0,29 73,3 - 16,9 15,2 ± 1,2 204 - 22 0,63 - 0,05 92,2 - ИД 12,2 - 0,7 288 - 14

0,91 0,80

0,07 0,08

0,61 ± 0,09 0,74 - 0,02'

88.7

69.8

80,4 95,8

5,9 12,2

12,9 14,0

25,8 ± 1,3* 25,2 ± 2,5*°

34,3

± 3,5*

14,2 Î I,5+

287 337

293 291

27 45

42 IG

Представлены результаты (И ш) 3х независимых экспериментов. Достоверность отличия групп составляет :

*Р < 0,01 - по отношению к груше -контроль - реаферон; °Р < 0,01 - по отношении к груше контроль + реаферон;

Р < 0,01 - к соответствующей группе - реаферон.•

тем, что - при хронической алкогольной интоксикации в мембранах в ответ на "разжижение" этанолом происходит компенсаторное накопление холестерина и насыпанных жирных кислот (G.Y.Sun, A.Y.Sun 1985), которое приводит к изменению их жидаостности при отмене этилового спирта, предположили, что для проявления

действия реаферона на конформационное состояние рецептора необходима отличная от контрольной текучесть цитоплазматической мембраны.

МЕ х 104/мл

связывания 3Н-ДАДЛ.

1 - контрольные животные;

2 хронически а легализированные в состоянии интоксикации;

3 - хронически алкоголизированные в состоянии отмены.

Затем сравнивали способность реаферона вытеснять 3Н-ДАДЯ из вы с о ко гффшпшх связывающих участков мозга контрольных крыс и животных, забитых в состоянии интоксикации и отмены этанола. Были рассчитаны константы ингибирования рекомбинантным «-ИФН специфического связывания лиганда с ¿-опиоидными рецепторами. Как видно на рис. 2, обнаружено возрастание К^ у атаоголизированных животных, которое достоверно отличалось от контрольной группы лишь у крыс, забитых через 24 часа после отмены этанола. Так как состояние высокоаф$инннх мест связывания 3Н~ДАДЛ не изменялось

после длительного действия алкоголя (табл. 4), наиболее вероятное объяснение полученных результатов заключается в существовании влияния этилового спирта на "реаферон"- связывающие участки, отличные от активного центра опиоидных ¿-рецепторов.

Достоверное уменьшение сродства р-ОР было зарегистрировано через 24 часа после отмены этанола при их насыщении и 3Н-налоксоном. Введение реаферона приводило .к восстановлению измененного параметра до контрольных значений. При этом способность а-ИФН активировать связывание налоксона сохранялась независимо от препарата используемых мембран (контрольных или опытных).

Кроме того, было показано, что хроническое потребление этанола сопровождается снижением .содержания БЭ в аденогипофизе и МЭ в стриатуме и надпочечниках крыс. Инъекции реаферона в течение недели нормализовали измененный уровень БЭ в аденогипофизе, при этом содержание МЭ в надпочечниках, также восстанавливалось, а в стриатуме еще более уменьшалось. Наблюдаемые различия в действии а-ИФН на содержание ЭОП у хронически алкоголизированных животных согласуются с результатами по влиянию однократного введения этилового спирта и реаферона.

Итак, в результате исследований, проведенных на модели-хронической алкогольной интоксикации, было установлено, что, рекомбинантный 'а-ИФН нормализует состояние ОР головного мозга крыс через 24 часа после отмены этанола, а также выявлено своеобразие ответа _на .введение препарата у центральных и периферических опиоидных систем.

Влияние реаФерона на зависимость алкоголизированных крыс от этанола и чувствительность к неыу.

'Хронически алкоголизированных крыс тестировали на чувствительность к этанолу, фиксируя в течение 4 часов изменение ректальной температуры в ответ на введение 2,5 г/кг этилового спирта внутрибрюшинно - (рис. 3). Предварительно животных лишали на сутки доступа к алкоголю. Оказалось, что алкоголизированные крысы отвечают на введение тестовой дозы этанола значительно меньшим падением температуры тела по сравнению с контрольными животными, что говорит о развившейся у mix толерантности к гипотермичоскому эффекту этилового спирта. Инъекции реаферона за полчаса до алкоголя достоверно увеличивали их чувствительность к этанолу. Вовлеченность ОС в процессы терморегуляции предполагает возможное участие опиоидергических механизмов в реализации эффекта а-ИФН, о чем свидетельствуют также результаты исследований, в которых обнаружена способность «-ИФН предотвращать развитие толерантности к гипотермическому эффекту морфина (N.Dafny 1985).

В качестве экспериментального критерия зависимости от этанола использовали тест на ' предпочтительное потребление животными этилового спирта в условиях свободного выбора. При этом отобрали крыс устойчиво потребляющих алкоголь, разделив их на две группы: с индексом предпочтения 0,2-0,4 ("малопьющие") и более 0,75 ("многопьющие"). Влияние реаферона на свободное потребление алкоголя оценивали в течение 10 дней на фоне ежедневных внутрибрюшшпшх инъекций препарата в дозе 104№/крысу жиеотным обеих групп. Показано, что реаферон эффективно уменьшал потребление этанола хронически алкоголизированными крысами: "многопьющими" - с 7,38 - 0,60 до 4,37 - 0,98 г/кг; "малопьющими"

- с 4,21 - 0,51 ДО 2,7 - 0,34 г/кг, снижая при ' этом индекс предпочтения первой группы животных. Более того, однократное введение препарата в дозе 2хЮ4 МЕ "малопьющим" крысам также

время (час)

Рис.3. Гшгатермический эффект этанола: влияние реаферона на

контрольных и хронически алкоголизированных крыс. По оси абсцисс- время после введения этанола в дозе 2,5 г/кг. По оси ординат- изменение ректальной температуры. • I - контрольные животные; 2 - хронически алкоголизированные животные; 3 - хронически алкоголизированные крысы + реаферон.

приводило к икгибированяю потребления этанола, сохранявшемуся в течение всего периода наблюдения (до 1,89 - 0,89 г/кг). В связи с тем, что опиоидные системы играют важную роль в контроле за потреблением алкоголя, предположили, что наблюдаемые изменения обусловлены влиянием реаферона на их состояние.

Таким образом, выявлено нормализующее . влияние реаферона на проявления зависимости алкоголизировашшх крыс от этанола и

чувствительности к нему. При этом нормализация поведенческих реакций сопрововдается коррекцией состояния ОС, измененного введением этилового спирта. Исследования взаимодействия реаферона с OP In vitro указывают, что фармакологический эффект препарата может быть обусловлен аллостерической регуляцией специфических опиоидных рецепторов.

ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантный «-интерферон взаимодействует In vitro с опиоидными рецепторами головного мозга крыс, ингибируя или активируя специфическое связывание лпгандов. Влияние препйрата на рецепторы определяется типом и состоянием связывают;« участков и может осуществляться по механизму аллостерической регуляции.

2. Этанол, вводимый крысам как однократно, так и хронически, вызывает снижение сродства м-рецепторов в тканях головного мозга, не изменяя их содерзкания. Инъекции реаферона предотвращают нарушения параметров рецепции при острой алкогольной интоксикации и приводят к их нормализации после отмены этанола у хронически алкоголизированных крыс. Препарат не влияет на связывающие характеристики опиоидных рецепторов контрольных и хронически интоксицированшх животных.

3. Реаферон восстанавливает измененные^ однократным или хроническим введением алкоголя уровни /з-эндорфина в аденогипофизе и мет-энкефалина в наддачечниках крыс, при этом наблюдается нормализация концентрации пептидов в плазме кров;;. В то же время, препарат не . обращает вызванного этанолом снижения' содержания мот-энкефалина в стриатуме животных.

4. Сформировавшаяся у хронически алкоголизированных крыс

толерантность к гшготермичэскому действию этанола "частично обращается однократным введением реаферона.

5. Рекомбинантный «-интерферон подавляет алкогольную мотивацию у хронически алкоголизировашых крыс, вызывая снижение потребления этанола е условиях свободного выбора за счет уменьшения как суточной дозы этилового спирта, так и величины индекса предпочтения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балашов A.M., Алябьева Т.Н., Петриченко О.Б. Взаимодействие "реаферона" с ошатными рецепторами дельта-типа в головном мозге хронически алкоголизировапных крыс.// Тез. X Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы.- Горький, 1987,- С. 171.

2. Балашов A.M., Петриченко О.Б., Алябьева Т.Н., Пан'уенко Л.Ф. Опиатная рецепция налоксона в головном мозге крыс: "влияние ионов натрия.// Биохимия.- Г988.- Т. 53.- В. 9.- С. I527-I53I.

3. Панчснко Л.Ф., Алябьева Т.Н., Петриченко О.Б., Бумялис В.В., Балашов A.M. Специфическое связывание и- и г-лигандов опиатшми рецептора?,ш головного мозга крыс в присутствии реаферона.// Бюлл. эксп. биол. мед.- 1988,- Т. 106, В. 9.- С. 307-309.

4. Панченко Л.Ф., Алябьева Т.Н., Петриченко 0., Балашов A.M. Опиоидная рецепция у„ kpuc после введения этанола и реаферона.// Тез. X регион, симп. соц. стран по интерферону.- Рига, 1988.- С. 95-96.

5. Петриченко О.Б. Активация рецепции налоксона препаратами альфа-интерферона.// Тез. докл. межрайон, конф. молод, специал.

"Актуальные проблемы фармакологии, фармации и фармакотерапии".-М., 1988.- С. 52-54.

6. Панченко Л.Ф., Теребилина Н.Н., Малиновская В.В., Манахова Л.С., Петриченко О.Б., Балашов A.M. Альфа-интерферон модифицирует вызванные этанолом изменения содержания опиоидных пептидов в стриатумэ и гипофизе крыс.// Вопр. мед. химии,- 1990.Т. 36., В. 3.- С. 71-73.

7. Петриченко О.Б., Балашов A.M., Панченко Л.Ф. Аллостерическая регуляция опиоидных рецепторов.// Тез. 5-ой Всесоюз. конф. "Физиология и биохимия медпаторных процессов".-М., 1990.- С. 225.

8. Balashov A.M., Alyabyeva Т.Н., Petrlclienko О.В., Panchenko L.P. Central mechanisms of Interieron antladdietlve effects.// In: Ггос. Const. Congr. Intern. Soc. Pathophyslol.-Kuoplo (Finland), 1991.- P. 24.