Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Биологически активные пептиды костного мозга и их роль в регуляции грануломоноцитопоэза

На правах рукописи

МИХАЛЬЦОВ Александр Николаевич

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ КОСТНОГО МОЗГА И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ГРАНУЛОМОНОЦИТОПОЭЗА

(экспериментальное исследование)

14.00.29 — гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Военно-медицинской академии.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Змушко Е. И.

Н а у ч н ы и к о н с у л ь т а и т: доктор медицинских наук профессор Дмитриев В. И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Рыжков С. В., доктор медицинских иаук профессор Мазуров В. И.

Ведущая организация — Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад. И. П. Павлова.

I Л шпарит- и

Защита состоится 1997 н // ^ часов на за-

седании специализированного совета Д 084.19.01 Российского НИИ гематологии и трансфузиологнн (193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

В. С. Быков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Кроветворная ткань является динамической, постоянно обновляющейся системой. В связи с этим, вопросы кинетики гемопоэза и его регуляции являются ключевыми для понимания патогенеза заболеваний системы крови, их диагностики и лечения.

В настоящее время кинетические аспекты грануломоноцитопоэ-за освещены достаточно полно. Показано, что развитие всех кроветворных клеток происходит в результате пролиферации и диффе-ренцировки единой полипотентной стволовой клетки. Установлены клетки-предшественники как в целом для грануломоноцитопоэза, так и его составляющих: нейтрофило-, эозинофило-, базофило- и моноцитопоэза (Дерюгина Е.И. и соавт., 1990; Чертков И.Л. и со-авт., 1990; Воробьев А.И. и соавт., 1995; Manchar V. et al., 1994; Shivdasani R.A., Orkin S.H., 1996).

Вместе с тем, вопросы регуляции грануломоноцитопоэза требуют дальнейшего уточнения. По современным представлениям, на роль регуляторов кроветворения претендуют различные вещества: колониестимулирующие факторы, факторы строгального микроокружения, гормоны тимуса, кейлоны и антикейлоны и др. (Абдулкадыров K.M. и соавт., 1989; Бала А. Ю., 1991; Базарный В. В., Ястребов А.П., 1993; Witte 0., 1990; Steward W.. 1993; Nobuo 0. et al., 1996). Однако, вопрос о их роли и месте в поддержании процесса кроветворения остается открытым. Так, лекарственные препараты, созданные на основе этих факторов, не позволяют в полной мере быстро и эффективно добиться восстановления нарушенных структур кроветворения (Leonard J.P. et al., 1994; Du X.X., Williams

D.A., 1994; Aria А. T., 1994; Haan G. et al., 1996): - "

В то же время, число заболеваний, сопровождающихся угнетением кроветворения, и, в первую очередь, грануломоноцитопоэза из года в год неуклонно возрастает, что связано с воздействием вредных факторов окружающей среды, распространением и повышением интенсивности лучевой энергии, с ростом количества лекарственных препаратов, угнетающих гемопоэз, интенсивной полихимиотерапией и т.п. (Pisciotta А.V., 1993; Gruner U. et al., 1994). Нарушения кроветворения наблюдаются и при ВИЧ-инфицировании. Применяемые современные противовирусные средства обладают сильным миелотоксическим действием, а использование колониестимули--рующих факторов хотя и позволяет добиться временного восстановления гемопоэтической функции, в тоже время сопряжено с активацией внутриклеточных репликационных процессов ВИЧ (Белозеров

E. С. и соавт., 1995; Змушко Е. И., 1996, 1997; Рахманова А. Г.

199?; Lisignoli G.et al., 1993). Bcc это выставляет на первый план поиск и разработку новых лекарственных препаратов, обладающих выраженным гемостимулирующиы действием и лишенных побочного эффекта.

В настоящее время сформировано и развивается одно из новых перспективных направлений медицинской науки: изучение закономерностей пептидной регуляции в норме и в условиях патологии (Ерошенко Т.М. и др., 1991; Гомазков 0. А., 1993; Norman P.S., 1993). Значительный интерес представляют лекарственные препараты, полученные на основе индивидуальных пептидов, выделенных из органов и тканей. Данной группе веществ присуща высокая биологическая и лечебная активность. Поскольку пептидные препараты преимущественно являются низкомолекулярными веществами, то при введении в организм они не вызывают аллергических, митогенных и других побочных реакций (Чазов Е. И. 1986; Замятин A.A. 1990).

В связи с этим, актуальным представляется поиск биологически активных пептидов, регулирующих грануломоноцитопоэз. Изучение взаимосвязи структуры и функции данных медиаторов, обеспечивающих реализацию различных звеньев гемопоэза и иммуногенеза. создаст реальную основу для расшифровки глубинных механизмов поддержания иммуногематологического гомеостаза организма. Выделение отдельных медиаторов в чистом виде и создание на их основе новых лекарственных средств позволит использовать их в качестве эффективных препаратов для направленной терапии как гематологических заболеваний, так и иммунодефицитных состояний.

Цель исследования : Изучить в эксперименте гемо- и иммуностимулирующие свойства биологически активных пептидов, выделенных из полипептидного препарата костного мозга.

Задачи исследования :

1. Разработать адекватную схему для проведения скрининговых исследований биологической активности отдельных фракций, а так же индивидуальных пептидов, выделенных из полипептидного препарата костного мозга.

2. Провести сравнительную оценку биологической активности выделенных отдельных пептидов костного мозга.

3. Изучить гемостимулирующую и иммуностимулирующую активность индивидуальных пептидов костного мозга в эксперименте на модели миелотоксического агранулоцитоза

4. Исследовать влияние полученных препаратов костного мозга на Функциональную активность лейкоцитов периферической крови к ми-елокариоцитов у больных ВИЧ-инфекцией.

Научная новизна: 1. Впервые осуществлено выделение из костного мозга ряда биологически активных пептидов, установлена их аминокислотная последовательность: Уа1-С1у-С1у-С1и-А1а-Ьеи (\ДЗСЕ-АЬ), Ме1,-1еи-Тге-А1а-С1и-С1и-Ьуз~А1а (МЬТАЕЕКА) и Тге-А1а-С1и-й1и~Ьуз (ТАЕЕК), проведена сравнительная оценка действия. Выделенные пептиды являются фрагментами В-цепк гемоглобина и принимают участие в регуляции кроветворения. Среди выделенных пептидов максимальной биологической активностью обладает пентапептид ТАЕЕК.

2. Влияние пентапептида ТАЕЕК на процессы регенерации грануло-моноцитопоэза в условиях глубокой миелодепрессии при однократном введении препарата проявляется в короткие сроки (6 суток) и вызывает стойкое восстановление нормального функционирования кроветворной ткани.

3. На модели вторичного иммунодефицита, сопряженного с миело-депрессией показана возможность применения пептида ТАЕЕК в острую фазу стрессорной реакции: происходит практически полное восстановление иммунологической реактивности организма.

4. Использование пентапептида костного мозга в культуре миело-кариоцитов и лейкоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных способствует восстановлению функциональной активности клеток-предшественников грануломоноцитопоэза, а также лимфоидных и гранулоцитарных клеток.

Практическая значимость : Получен пентапептид ТАЕЕК, обладающий гемо- и иммуностимулирующими свойствами как основа для создания лекарственных препаратов, направленных на восстановление нарушенных структур и функций кроветворной ткани, а также сопряженных с этим нарушений в системе иммунитета.

Реализация и апробация работы Диссертационное исследование выполнено в соответствии с проблемным планом научных работ Военно-Медицинской академии (тематика N ГР 1600484).

Полученные теоретические и практические результаты внедрены в научную деятельность научно-исследовательской лаборатории СПИД и инфекционных заболеваний в ВС РФ, кафедры гематологии и

клинической иммунологии, кафедры инфекционных заболеваний Военно-медицинской Академии, а также научно-исследовательского института Военной медицины.

В ходе работы было подано 37 рационализаторских предложений, 3 изобретения (патент СССР N 1822564, патент РФ N 1441928, патент США N 93902884).

Основные материалы исследований и положения диссертации были доложены на : 2 Всероссийском съезде гематологов и транс-фузиологов (Челябинск, 1986); Всесоюзной научной конференции "Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гоме-остаза" (Ленинград, 1987); Всесоюзной научной конференции "Биохимия медицине" (Ленинград, 1988); Всесоюзной конференции "Реактивность и регенерация тканей" (Ленинград, 1990); 21 Европейском пептидном симпозиуме (Барселона, 1990); 12 Американском пептидном симпозиуме (Бостон, 1991); Симпозиуме "Пептидные биорегуляторы - цитомедины" (С.-Петербург, 1992); III Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (С.-Петербург, 1995); Научной конференции "Инфектология, достижения и перспективы" (С.-Петербург, 1996); IV Международной конференции " СПИД, рак и родственные проблемы", (С.-Петербург. 1996); V Международной конференции " СПИД, рак и родственные проблемы", (С. -Петербург, 1997).

Публикации: По теме диссертации опубликована 21 печатная работа в научных журналах и сборниках.

Положения, выносимые на защиту. 1. Клетки костного мозга продуцируют низкомолекулярные пептиды, одни из которых (полипептидная фракция А) обладают активностью, свойственной факторам тимуса и регулируют лимфопоэз. и другие (VGGEAL, MLTAEEKA и ТА-ЕЕК). - принимающие участие в становлении грануломоноцитопоэза.

2. Пептиды, регулирующие гемопоэз, являются фрагментами р-цепи гемоглобина и наиболее активный из них представлен пентапепти-дом ТАЕЕК.

3. Применение пенталептида ТАЕЕК в условиях выраженной гемодепрессии, вызванной введением животным массивных доз 5-фторураци-ла, позволяет в короткие сроки добиться восстановления нормального функционирования кроветворения.

4. Использование пенталептида ТАЕЕК в качестве иммуностимулятора в острую фазу развития миелотоксической гемодепрессии спо-

собствует практически полному восстановлению всех звеньев иммунной системы, а также полноценному иммунному ответу на антигенное воздействие.

5. Применение пептида ТАЕЕК в культуре клеток ВИЧ-инфицированных восстанавливает содержание клеток-предшественников грануло-моноцитопоэза в костном мозге, а в периферической крови модулирует функциональную активность лимфоидных и гранулоцитарных клеток.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы. Список литературы содержит 237 литературных источника (69 отечественных и 168 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на 825 мышах линии СВА, 166 мышах линии (СБА х C57BDF1 и 150 морских свинках. Использованы самцы с массой тела : мыши - 18-20 г, морские свинки - 150-200 г. Все животные были получены из питомника РАМН "Рапполово", содержались в условиях вивария при одинаковом уходе и соответствующем режиме.

С целью изучения влияния пептидов костного мозга на функциональную активность лейкоцитов и миелокариоцитов ВИЧ-инфицированных было проведено исследование периферической крови 29 человек. В соответствии с классификацией ВИЧ-инфекции В.И.Покровского (1989) обследуемые распределялись следугаим образом: стадия ПБ-17 человек, стадия IIB-12 человек. У 2 больных в стадии ИВ были получены миелокариоциты (стернальная пункция).

Фракционирование пептидов костного мозга проводили в два этапа ( данный фрагмент работа был выполнен в институте биорга-нической химии (г.Москва) в отделе Михалевой И.И. под руководством директора института академика РАН Иванова В.Т.).

На первом этапе проводили гельфильтрацию полипептидной смеси, полученной путем уксуснокислой экстракции исходного 2 i.fcvb

сырья, в качестве которого использовали красный костный мозг крупного рогатого скота (Морозов В.Г., Хавинсон В. X., 1981). Экстракцию проводили на колонке с биогелем Р-2. На втором этапе из установленных активных полипептидных фракций выделяли индивидуальные пептиды методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления на установке фирмы "Gilson" с использованием колонки "Nukleosil" 7/С -18 . Выход пептидов регистрировали при длине волны 280 нм. Синтез осуществляли классическим методом в растворе с активированными эфирами.

Скрининговые исследования биологической активности пептидных препаратов костного мозга включали в себя метода изучения экспрессии мембранных Е-рецепторов тимоцитов морской свинки (Herman R. Н. et al., 1976), исследования функциональной активности кроветворной ткани в реакции торможения миграции миело-кариоцитов (РТММ), изучение колониеобразующей активности стволовых кроветворных клеток (Till J.E., McCulloch Е.А., 1961) , фибробластоподобных и макрофагальных клеток костного мозга (Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984). Дополнительно изучали влияние препаратов на состав и содержание изоферментных фракций лактатдегидрогеназы в миелокариоцитах методом электрофореза в агаровом геле (Маркелов И. М., 1966). В качестве контрольных препаратов при проведении скрининговых исследований использовали полипептидный препарат костного мозга (ППКМ),< полученный по методу Морозова В. Г., Хавинсона В. X. и являющийся источником получения активных фракций и полипептидный препарат тимуса - ти-малин.

Гемостимулирующую активность индивидуальных пептидов изучали в модели экспериментальной гемодепрессии у мышей линии СБА. вызванной однократным внутрибрюшинным введением 5-фторура-цила (5-ФУ) в дозе 170 мг/кг массы тела (Reissmann К.R., Sairo-rapoompichit S., 1969). На 5 сутки после введения цитостатика животным однократно внутрибрюшинно вводили исследуемые препараты (выделенный индивидуальный пептид костного мозга, а также дипептид тимуса - тимоген) в дозе 1,0 мкг/кг. Исследования проводили на 3 и 6 сутки с момента окончания применения препаратов. В дальнейшем, с целью определения пролонгированное™ действия препаратов, каждые двое суток в течение 14 дней у животных определяли в периферической крови общее содержание лейкоцитов, а в костном мозге - удельную концентрацию миелокариоцитов.

Оценку состояния геыопоэза у животных проводили на основе

исследования морфологического и функционального состояния кроветворной ткани.

Изучение морфологического состава периферической крови и костного мозга включало определение общего содержания лейкоцитов и подсчет формулы крови, а в костном мозге - определение удельной концентрации миелокариоцитов и исследование миелограм-мы.

Для оценки функционального состояния кроветворения изучали напряженность метаболизма нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов периферической крови на основе определения активности ключевых ферментов основных обменных циклов : сукцинатдегидрогена-зы и лактатдегидрогеназы. О напряженности гемопоэза судили по результатам анализа фаз клеточного цикла с помощью лазерного проточного цитофлюориметра FACScan (Becton Dickinson, США). В данном случае определяли процентное содержание клеток костного мозга, находящихся на разных стадиях клеточного деления (Friea J., Perez A.G., Сiarson В.D., 1976). Также определяли содержание клеток-предшественников грануломоноцитопозза методом культивирования миелокариоцитов в двухслойной агаровой системе (Bradley Т.R., Metcalf D., 1966).

Изучение иммуностимулирующей активности препаратов проводили также в модели экспериментальной гемодепрессии. В данном случае на 3 сутки после введения исследуемых веществ животных внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана и на 7 сутки после иммунизации проводили оценку иммунологического статуса на основании анализа показателей клеточного и гуморального иммунитета, а также неспецифической резистентности.

При исследовании клеточного иммунитета изучали пролифера-тивный ответ лимфоцитов на Т-клеточный митоген - фитогемагглю-тинин Р (ФГА-Р) в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), а также способность лимфоцитов продуцировать лимфокины - в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ).

Изучение гуморального иммунитета проводили на основе определения титра гемагглютининов, образующихся в сыворотке крови в ответ на иммунизацию животных корпускулярным антигеном в реакции гемагглютинации (Malberg К., 1987) и путем подсчета антите-лообразующих клеток селезенки методом локального гемолиза в геле (Jerne N., Nordin А., 1963).

Неспецифическую резистентность оценивали в лизосомально -катионном тесте (ЛКТ), отражающем активность катионных белков

¿к

нейтрофильных гранулоцитов, опосредующих кислороднезависиные процессы микробиоцидносги (Пигаревский Б.Е., Мазинг Ю. А., 1981), а также в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), указывающим на напряженность кислородзависимых механизмов антимикробной активности фагоцитов (Нагоев Б.С., Шубин М. Г., 1981).

Об иммуностимулирующем действии пептидов костного мозга на лейкоциты периферической крови ВИЧ-инфицированных лиц судили на основании изменения активности лимфоцитов, определяемой в РТМЛ с КонА, РБТЛ с ФГА, а также по напряженности процессов внутриклеточного метаболизма (определения активности ЛДГ и СДГ). О влиянии пептидов на нейтрофильные гранулоциты судили по. изменению напряженности НСТ и ЛКТ-тестов. Гемостимулирующие свойства изучали в культуре клеток костного мозга . В данном случае исследовали влияние пентапептида на колониеобразующую способность клеток-предшественников грануломоноцитопозза (КОЕ-ГМ).

Статистическую обработку данных проводили с помощью параметрических и непараметрических критериев вариационно-статистического анализа.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С целью локализации поиска биологически активных пептидов костного мозга, суммарный полипептидный препарат (ППКМ) был разделен с помощью гель-фильтрации на три фракции (А, В, С). Фракция А представляла собой полипептидное соединение с молекулярной массой более 5000 D, фракция В - более 1000 D и фракция С - менее 5000 D. Выделенные фракции исследовали на наличие ти-мической и миелопоэтической активностей. Исследование показало, что биологической активностью обладали две фракции (А и С), однако, при этом обнаружилась разнонаправленность их действия (табл.1).

Полипептидная фракция А, также как и фактор тимуса - тима-лин, стимулировала экспрессию мембранных Е-рецепторов тимоци-тов, а также вызывала тканеспецифическое изменение содержания изоферментов ЛДГ в миелокариоцитах. При этом появлялись две новые фракции дегидрогеназы. Содержание изоферментов ЛДГ в клетках костного мозга как качественно, так и количественно становилось соответствующим тимоцитам. Напротив, фракция С и суммарный полипептидный препарат костного мозга, не проявляли активности в данных тестах, а регулировали адгезионно-миграционные

процессы в кроветворной ткани, а также стимулировали колониеоб-разование клеток-предшественников макрофагов.

Таблица 1

Биологические эффекты полипептидов костного мозга и тимуса

Метод исследования Препарат (фракция)

ППКМ Тималин А В С

Экспрессия мембранных Е-рецепторов тимоцитов - + + - -

Тканеспецифическое изменение энергетического фенотипа миелокариоцитов (трансформация миелокариоцитов в предшественники Т-лимфоцитов) - + + - -

Регуляция адгезионно-миграционных свойств гранулоцитарных клеток + - - - +

Активация колониеобразования клеток-предшественников макрофагов + - - - +

"+" - наличие эффекта; "-" - отсутствие эффекта;

Полученные результаты позволили предположить, что полипептидный препарат костного мозга содержит в себе две биологически активные фракции, одна из которых обладает активностью, присущей факторам тимуса и принимает участие в регуляции лимфопоэза (фракция А), а другая (фракция С), непосредственно участвует в поддержании миелопоэза.

В связи с этим дальнейшая работа по выделению и идентификации пептидов костного мозга проводилась с фракцией С.

Следующим этапом выделения индивидуальных пептидов из костного мозга являлось разделение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии фракции С на ряд фрагментов с изучением их биологической активности (рис.1). Выявленные активные фрагменты подвергались дальнейшему делению с последующей оценкой их биологической активности. В результате последовательного разделения и исследования 96 пептидных фракций были выделены следующие индивидуальные пептиды и установлена их первичная структура : Ме^Ьеи-Тге-А1а-С1и-С1и-1уз-А1а (МШЕЕКА), Тге-А 1а-С1и-С1 и-ЬуБ (ТАЕЕК) и Уа1-ЫуЧПу-С1и-А1а-1,еи (УССЕАЬ).

Сопоставление аминокислотных последовательностей выделенных пептидов с известными эндогенными пептидами показало, что полученные вещества представляют собой фрагменты р-цепи гемоглобина быка.

ПОЛИПЕПТИДНЫЙ ПРЕПАРАТ КОСТНОГО МОЗГА

ФРАКЦИЯ

А < 5000 В < 1000 С > 5000

1

т /

96

Ме1-Ьеи-Тге-А1а-С1и-С1и-Ьуз-А1а (М-Ь-Т-А-Е-Е-К-А) — — Тге-А^-Ши-Ии-Ьуз (Т-А-Е-Е-К)

Уа1-«у-С1у-С1и-А1а-1еи (V - С - С - Е - А - и

Рис. 1 Схема выделения биологически активных пептидов костного мозга

Сравнительная оценка биологической активности выделенных веществ, проведенная методом лимитирующих разведений показала, что активность пептидов МЬТАЕЕКА и ТАЕЕК сохраняется при разведении препаратов до 10"27 мкг/мл. При этом, в данном разведении пептиды регулировали как адгезионно-миграционные процессы в костном мозге, так и активировали колониеобразование клеток-предшественников моноцитопозза. Пептид \?йСЕА1 также проявлял активность в указанных тестах, однако для достижения аналогичного положительного эффекта его концентрация должна была в 100 - 1000 раз превышать концентрацию МЬТАЕЕК и ТАЕЕК. Суммарный полипептидный препарат был активен в данных скрининговых моделях лишь в разведении 10"18 мкг/мл, что в 10000-100000 раз больше необходимых концентраций исследуемых пептидов.

В связи с тем, что пептид МЬТАЕЕКА имеет в своем составе аминокислотные последовательности, соответствующие пентапептиду

ТАЕЕК, а также исходя из того, что биологическая активность обоих пептидов равнозначна, все последующие исследования проводили только с пептидом ТАЕЕК.

В дальнейшем было исследовано влияние пентапептида на содержание и пролиферативную активность стволовых кроветворных клеток (СКК) летальнооблученных мышей методом экзогенного коло-ниеобразования. Установлено, что после летального облучения СКК костного мозга практически исчезают. В наших исследованиях этот показатель составлял всего лишь 1,1+0,2 на 20 х 1О6 кл, в то время как в контрольной группе содержание стволовых клеток было на уровне 18,5±1,3 на 20 х 106 кл. Обработка миелокариоцитов пентапептидом с последующим внутривенным их введением летально-облученным животным, приводила к достоверному увеличению выхода стволовых клеток, что проявлялось в повышении числа КОЕ-с до 9,4+0,7 на 20 х 105 кл.

Таким образом, проведенное исследование показало, что пен-талептид ТАЕЕК in vitro обладает гемостимулирующим эффектом, который проявляется в регулирующем влиянии на адгезионно-миграционные процессы гранулоцитарных клеток костного мозга, активацией процессов колониеобразования клеток-предшественников макрофагов. а также влиянием пентапептида на ранние предшественники КОЕ-с, находящиеся в G0-Gj фазах клеточного цикла (фаза покоя), тем самым переводя последние в активнопролиферирующую популяцию.

На основании полученных материалов, следующим этапом исследования явилось изучение влияния препарата на течение и исход экспериментальной гемодепресси.

Установлено, что введение животным 5-ФУ в дозе 170 мг/кг сопровождалось значительными нарушениями функционирования кроветворной ткани и развитием выраженного агранулоцитоза. При этом на фоне 4-х кратного снижения содержания лейкоцитов периферической крови (1,61+0,19), лимфопении (1,42+0,38), практически полного исчезновения нейтрофильных гранулоцитов (содержание палочкоядерных и сегмектоядерных нейтрофилов составило соответственно 2,7% и 2.1% от контрольного уровня), наблюдалось угнетение процессов анаэробного (активность Л.ДГ) и аэробного окисления (активность СДГ) в лимфоцитах и нейтрофильных грану-лоцитах. Исследование костного мозга показало, что содержание

миелокариоцитов составляло всего 30% от контрольного уровня. Наблюдалось резкое снижение количественных показателей молодых Форм клеток (миелобластов, промиелоцитов, миелоцитов и метамие-лоцитов). Содержание нейтрофильных гранулоцитов костного мозга определялось в пределах 3% от контроля. Пролиферативная активность кроветворной ткани также была резко снижена, при этом практически полностью отсутствовали клетки, находящиеся в фазе митоза (1,04+0.03% по сравнению с 10,71+0,05% в контроле).

К 3 суткам после однократного применения пентапептида костного мозга в морфологическом составе периферической крови еще не отмечалось выраженных изменений. В тоже время, полностью восстанавливалась активность дегидрогеназ лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов. В костном мозге на фоне незначительного повышения общей клеточности и неизменном сохранении зрелых клеточных форм, содержание клеток пролиферирующего пула резко возрастало, что характерно для промиелоцитарно-миелоцитарного криза (рис.2).

исследуемые препараты

££¡1] миелохариоциты РЯЯ регакул. клетки ииелобласты -в— промиелоциты на- миелощгш меггаииел одеты

Рис.2 Влияние пептидов костного мозга и тимуса на содержание клеток пролиферирующего пула миелокариоцитов

На активацию пролиферативных процессов кроветворной ткани указывало также и 1,5-2-х кратное превышение контрольного уровня в содержании миелокариоцитов, находящихся в фазе синтеза ДНК и фазе митоза. Однако, уже к 6 суткам исследования полностью восстановился не только клеточный, ко и морфологический состав как периферической крови, так и костного мозга. Сохранялась ранее нормализовавшаяся активность дегидрогеназ лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов. Пролиферативная активность миелокариоцитов не отличалась от контрольных показателей.

Использование в качестве контрольного препарата дипептида тимуса EW (тимогена) только к 6 суткам исследования вызвало значительное превышение контрольного уровня в содержании проми-елоцитов костного мозга, а также активацию пролиферативных процессов миелокариоцитов. Полное восстановление гематологических показателей произошло только к 14-18 суткам, что почти втрое дольше аналогичного эффекта, достигаемого после применения пен-талептида ТАЕЕК. Вместе с тем, в группе животных с индуцированным 5-ФУ агранулоцитозом полного востановления кроветворения за весь период наблюдения не установлено.

Так как любое нарушение функционирования кроветворной ткани сопровождается изменением в системе иммунитета, было проведено изучение иммуностимулирующих свойств пентапептида ТАЕЕК при вторичном иммунодефиците, сопряженном с гемодепрессией.

Установлено, что развитие острого миелотоксического агра-нулоцитоза сопровождается выраженным иммунодефицитньш состоянием .организма, характеризующимся угнетением гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа (табл.2). Снижение функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, свидетельствует об угнетении как бактерицидной, так и антигенпрезентирующей функции фагоцитов. Возникающий при этом дисбаланс иммунной системы препятствует развитию адекватного иммунного ответа на антигенную нагрузку.

Введение животным на фоне глубокой депрессии кроветворения тимического пептида EW не только не оказывало иммуностимулирующего действия, но и. напротив, усугубляло имеющий место дисбаланс системы иммунитета. Данное явление, вероятно, связано с отсутствием непосредственного влияния препарата на стволовые кроветворные клетки (Ярилин A.A. и соавт., 1992), а также с дополнительной активацией пептидом EW антигеннеспецифической Т-супрессии, индуцируемой в острую фазу стрессорной реакции,

что является усугубляющим моментом развития патологического процесса. Подобные эффекты наблюдались и у больных острой лучевой болезнью, которым в стадии разгара заболевания применяли в качестве иммуностимулирующей терапии пептиды тимуса (Смирнов B.C. и соавт., 1992).

Напротив, применение животным пентапептида костного мозга ТАЕЕК позволило восстановить уровень клеточного и гуморального

Таблица 2

Влияние пептидов костного мозга и тимуса на показатели гуморального и клеточного иммунитета мышей линии СБА с острым агранулоцитозом (Х+и)

Препарат Титр сывороточных гемагглютининов (lg) Содержание А0К (на 105 спленоцитов) РБТЛ с ФГА (ИС)

Контроль 9,53+0,48 121.45+9,53 5,51+0,61

5-ФУ 6,25+0,37* 31,12+5,06* 1,06+0,09*

ТАЕЕК 9,47+0. 44** 109,73+8,12** 7.03+0,58**

EW 4,13+0,41* 22,01+5, 74* 1,49+0,35*

* - Статистически достоверно по сравнению с контролем (Р< 0,05) ** - Статистически достоверно по сравнению с действием 5-ФУ (Р< 0,05)

звеньев иммунитета. Контрольных значений достигали также и показатели неспецифической резистентности. Известно, что миело-лептиды, продуцируемые клетками костного мозга способны восстанавливать уровень антителопродуцентов, активируя как их функциональную активность, так и продукцию in situ (Петров P.B. и соавт., 1981). Аналогично этому, по всей видимости, действует и исследуемый пентапептид, который, обладая гемостимулирующими свойствами, корригирует нарушенные процессы цитогенеза иммуно-комлетентных клеток в костном мозге. Положительные результаты применения пептида ТАЕЕК в острой фазе стрессорной реакции, вероятно, объясняются отменой или снижением антигеннеспецифичес-кой Т-супрессии, так как известно, что миелопептиды вступают в конкурентные взаимоотношения с Т-супрессорами (Михайлова A.A. и соавт., 1976).

Изучение гематологических показателей у ВИЧ-инфицированных лиц позволило выявить у них выраженное угнетение кроветворения. Установлено значительное снижение содержания как колониеобразу-ющих (КОЕ), так и кластеробразующих (КлОЕ) единиц грануломоно-цитопоэза в костном мозге, что указывает на поражение наиболее ранних клеток-предшественников кроветворения. В периферической крови угнетается функциональная активность нейтрофильных грану-лоцитов и лимфоцитов. Анализ напряженности процессов внутриклеточного метаболизма (цикл Кребса и гликолиз) указывает на истощение компенсаторных механизмов, обеспечивающих клетки энергией. Пентапептид костного мозга вызывал активацию пролифератив-ной активности КОЕ-ГМ, восстанавливая до 70X содержание колони-еобразуюцих единиц, тогда как количество кластеробразующих единиц грануломоноцитопоэза восстанавливалось в полной мере. Так как КлОЕ являются менее зрелыми по сравнению с КОЕ, можно предположить, что пентапептид оказывает воздействие на наиболее ранние предшественники грануломоноцитопоэза. Под влиянием пен-талептида костного мозга происходит восстановление функциональной активности как лимфоцитов, так и нейтрофильных гранулоци-тов, при этом препарат оказывает модулирующее действие на пораженные клетки (рис.3).

ВИЧ ВИЧ+ТАЕЕК

-■¿г- КОЕ-ГМ — КлОЕ-Ш

Контроль "Р52РГШ1 ЩРШ

Рис.3 Влияние пептидов костного мозга на функциональную активность лимфоидной и кроветворной тканей ВИЧ-инфицированных лиц

Результаты проведенных исследований позволяют считать, что в гемопоэтической ткани присутствуют низкомолекулярные вещества пептидной природы, которые обладают различной направленностью спектра биологического действия. Первая группа веществ (фракция А) с молекулярной массой более 5000 Д характеризуется наличием активности, свойственной факторам тимуса. При этом под ее воздействием происходит восстановление экспрессии Е-рецепторов ти-моцитов, что свойственно известным препаратам тимуса (тималин, тимозин. тимопентин и др.). Наряду с этим фракция А, также как и тималин, вызывает тканеспецифическую трансформацию миелокари-оцитов в предшественники Т-лимфоцитов, при этом изоферментный спектр ЛДГ костного мозга соответствовал тимическому. По всей видимости, здесь имеет место факт трансформации миелокариоцитов в предшественники Т-клеток, ранее описанный в отношении факторов тимуса (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1984; Мартынов В.Ф. и соавт., 1986). Известно, что неприлипающие к пластику клетки костного мозга продуцируют фактор, стимулирующий рост Т-клеток и имеющий молекулярную массу от 5000 до 10000 D (Bains M.A., et al., 1986). Вероятно, полученная нами пептидная фракция А родственна (а, возможно, и идентична) данному фактору, продуцируется Т-клеткаыи, присутствующими в костном мозге и принимает участие в регуляции лимфопоэза. Неисключено, что и миелопепти-ды, продуцируемые миелокариоцитами и обладающие иммуностимулирующей активностью, также входят в состав данной фракции.

Другая полипептидная группа (фракция С) обладает тканеспе-цифическим действием на кроветворную ткань, что проявляется в регуляции адгезионно-миграционных свойств гранулоцитарных клеток костного мозга, а также активацией процессов колониеобразо-вания клеток-предшественников макрофагов. Установлено, что биологическая активность фракции связана с двумя пептидами Tre-Ala-Glu-Glu-Lys и Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu, первый из которых был наиболее активен. Анализ аминокислотной последовательности показал, что пептида представляют собой фрагменты в-цепи молекулы глобина быка, из костного мозга которого и был получен суммарный полипептидный препарат. Этот, на первый взгляд, неожиданный факт, вероятно,. объясняется следующим. Известно, что в нормальных условиях, в костном мозге происходит активное разрушение незрелых эритрокариоцитов (10-15%). Лизис клеток происходит через их фагоцитирование макрофагами, фибробластами и другими стромальными фагоцитами. Следующий за фагоцитозом катабо-

A f-1 - i I -

лизи гемоглобина завершается секрецией низкомолекулярных пептидов, специфически регулирующих кроветворение.

Активация пролиферации ранних колониеобразующих единиц селезенки, отмечавшаяся после влияния пентапептида Tre-Ala-Glu-Glu-Lys на миелокариоциты леталькооблученных животных позволяет высказать предположение либо о непосредственном-воздействии препарата на стволовые кроветворные клетки, либо об его индукции синтеза и секреции колониестимулирующих факторов. О влиянии пентапептида на стволовую кроветворную клетку (прямом или опосредованном) говорит и тот факт, что уже через 72 часа после его введения животным с индуцированной 5-фторурацилом ми-елотоксической гемодепрессией, регистрируется наличие промиело-цитарно-миелоцитарного криза, во время которого кроветворная ткань из стадии аплазии переходит в стадию регенерации (Алмазов В.А. и соавт., 1981). При этом значительно возрастает доля стволовых клеток, которые из фазы "покоя" вступают в клеточный цикл. Одновременно с этим происходит и восстановление основных энергоемких внутриклеточных процессов: цикла Кребса и гликолиза как в лимфоидных, так и в гранулоцитарных клетках и уже к 6 суткам исследования кроветворная ткань начинает нормально функционировать. Для достижения положительного эффекта достаточно одной-двух инъекций препарата, что выгодно отличает его от ко-лониестимулирующих факторов. Для получения аналогичного эффекта требуется как комплексное использование колониестимулирующих факторов, так и многократное применение последних (Welte К. et al., 1988; Du Х.Х. et al., 1995; Farese A.M. et al.. 1996).

Восстановление иммунопоэтической активности костного мозга (генерация функционально полноценных иммуноцитов) после применения пентапептида Tre-Ala-Glu-Glu-Lys сказывается и на напряженности иммунного ответа на антигенное воздействие. В данном случае, использование препарата в острую фазу стрессорной реакции позволяет адекватно восстановить активность клеточного и гуморального звеньев системы иммунитета, а также и неспецифической резистентности. Это выгодно отличает пентапептид костного мозга от дипептида тимуса Gln-Trp (тимоген), применение которого в аналогичных условиях усугубляло течение патологического процесса. По всей вероятности, подобные эффекты связаны с дополнительной активацией тимическими пептидами антигеннеспеци-фической Т-супрессии, развивающейся в процессе становления стрессорной реакции. Отмена этого явления после воздействия на

организм пептидов костного мозга, по всей видимости, и объясняет положительные результаты их. применения в острую фазу патологического процесса. На рис.4 обобщены выявленные биологические эффекты активных пептидов костного мозга.

Гемопозтическая ткань

Низкомолекулярные пептиды

Фракция С фрагменты молекулы глобина

Тканеспецифическое действие на кроветворную ткань

ТАЕЕК ЧййЕАЬ

. ...... 1 _;

Регуляция адгезионно-миграционных свойств гранулоцитарных клеток

Активация колониеобразования клеток-предшественников макрофагов

Регуляция колониеобразования клеток-предшественников грануломоноцитопоэза

Генерация функционально зрелых иммуноцитов

Ингибиция антигеннеспецифической _Т-супрессии

Восстановление активности клеточного и гуморального иммунитета в острую фазу стрессорной реакции

Рис.4 Биологические эффекты активных пептидов костного мозга

Таким образом, пептиды костного мозга. представленные фрагментами молекулы глобина (Тге-А1а-С1и-С1и-ЬуБ) обладают как гемостимулирующим, так и иммуностимулирущим действием. Гемости-мулирующий эффект достигается прямым, либо опосредованным действием пентапептида на стволовые кроветворные клетки. Иммуностимулирующий же эффект препарата, вероятно, не является результатом прямого воздействия пептидов на иммнокомпетентньге клетки, а проявляется как следствие восстановления функционирования кроветворной ткани и активации цитогенеза грануломоноцитов.

Эти пептиды не единственные из фрагментов глобина, облада-

Фраи М.вГс уия А 5000 Б

тималиь актис подобная ность

Восстановление экспрессии Е-рецепторов тимоцитов

Тканеспецифическое изменение энергетического фенотипа миелокариоцитов (трансформация миелокариоцитов в предшественники Т-лимфоцитов)

ющих биологической активностью. Из миелопептидов (препарат мие-лопид), продуцируемых миелокариоциташ свиньи, выделены также активные пептиды, представляющие участки гемоглобина и проявляющие иммуностимулирующую активность, сходную с тимической (Ре1-гоу К.У. еЪ а1., 1995). В наших исследованиях аналогичной активностью обладала пептидная фракция А, и, хотя из нее не было выделено активных компонентов, результаты исследования допускают предположение о родстве миелопептидов и данной фракции.

Таким образом, имеющиеся данные позволяют говорить о целой регулягорной системе, эволюционно сложившейся в результате катаболизма эндогенных высокомолекулярных соединений. В процессе фагоцитирования стромальными клетками костного мозга эритрока-риоцитов, стареющих эритроцитов происходит специфическое разрушение молекулы гемоглобина. При этом образуются низкомолекулярные пептиды, непроявляющие видоспецифичности. но обладающие различным спектром биологического действия, а также клеточной и тканевой специфичностью. Регуляция кроветворения, вероятно, осуществляется в результате диалектического взаимодействия пептидных медиаторов, обладающих разнонаправленным действием. Этим достигается поддержание популяционного состава различных ростков кроветворения на необходимом уровне.

Вероятно, выделенные пептиды не являются единственными, образующимися при катаболизме глобина. Такая сложная в иерархическом строении система как костный мозг требует и соответствующей регуляции. Возможно, что не только фрагменты гемоглобина обладают биологической активностью. Множественность надкле-точной регуляции, представленной высокомолекулярными гуморальными факторами (гормоны, иммуноглобулины, ферменты и т.д.) в процессе катаболизма, возможно, также является поставщиком низкомолекулярных соединений, обладающих новыми регуляторными свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Клетки костного мозга продуцируют гуморальные низкомолекулярные факторы пептидной природы, участвующие в регуляции гемо-поэза: а) Полипептидная фракция А (м. м. <5000 Б) проявляет активность, характерную для факторов тимуса и участвует в поддержании лимфопоэза; б) Низкомолекулярная полипептидная фракция С (м.м. > 5000 О и выделенные из нее пептиды

Met-Leu-Tre-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala, Tre-Ala-Glu-Glu-Lys и Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu принимают участие в регуляции миелопоэ-за; в) Индивидуальные биологически активные пептиды костного мозга Met-Leu-Tre-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala Tre-Ala-Glu-Glu-Lys и Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu являются фрагментами fl-цепи молекулы глобина.

2. Спектр биологической активности пептидов Met-Leu-Tre-AlaG-lu-Glu-Lys-Ala, Tre-Ala-Glu-Glu-Lys и Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu одинаков, однако для достижения аналогичного положительного эффекта концентрация пептида Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu должна в 100-1000 раз превышать таковую пептидов Met-Leu-Tre-Ala-GluG-lu-Lys-Ala и Tre-Ala-Glu-Glu-Lys.

3. Пентапептид Tre-Ala-Glu-Glu-Lys является активным центром молекулы Met-Leu-Tre-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala, однократное применение которого у экспериментальных животных в условиях гемодеп-рессии, индуцированной 5-фторурацилом, вызывает активацию пролиферации стволовых кроветворных клеток, что позволяет значительно сократить сроки цитопении и к 6 суткам после введения препарата вызывает полное и стойкое восстановление функционирования кроветворной ткани.

4. На фоне вторичного иммунодефицита, вызванного введением массивных доз 5-фторурацила, применение пентапептида Tre-Ala-Glu-Glu-Lys восстанавливает напряженность как клеточного, так и гуморального звеньев иммунного ответа на корпускулярный антиген.

5. В культуре клеток больных ВИЧ-инфекцией пентапептид костного мозга восстанавливает функциональную активность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза и оказывает модулирующее действие на функционирование лимфоидных и гранулоцитарных клеток периферической крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Морозов В. Г., Хавинсон В.Х., Супиев Т.К., Михальцов А. Н., Малинин В. В. Влияние пептидных медиаторов, выделенных из тимуса и костного мозга на иммунитет морских свинок//Известия АН КазССР. -1986. - N5,- С. 83-87.

2. Котов В.А., Михальцов А. Н., Жухина Г.Б. Влияние на кроветворение пептидов из костного мозга и вилочковой железы// 2 Все-росийский съезд гематологов и трансфузиологов. Тез. докл. - Че-

лябинск, 1986. С, 268-269.

3. Михальцов А.Н., Ромашкин М. С. Оценка влияния цитомединов костного мозга на продукцию лимфокинов //Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза. Тез. науч. конф. Л., 1987, С.69-70.

4. Михальцов А.Н. Фенотипическая коррекция функциональной активности костного мозга//Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза. Тез.науч.конф. Л., 1987,0.68-69..

5. Дейгин В, .И., Бобиев Г. М.. Коротков A.M., Помогайло С. В., Гречанинова Л.М.. Михальцов А.Н., Титов М.И. Синтез и исследование биологической активности иммуноактивных пептидов//Роль пептидных биорегуляторов (цитомединов) в регуляции гомеостаза. Тез. науч. конф. Л.. 1987, С.34.

6. Морозов В.Г., Михальцов А. Н. Избирательность действия пептидных биорегуляторов на энергетические процессы в клетках//Би-охимия - медицине, . Молекулярные механизмы формирования патологических состояний..:Тез.науч.конф. - Л., 1988, С. 137-138.

7. Михальцов А.Н. Способ регулирования функциональной активности нейтрофилов пептидами костного мозга//Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. Л., BMA им. С.М.Кирова - 1988,- С.70.

8. Михальцов А. Н., Петленко С. В., Малахова Е. А., Фоменко М. Г. Регуляторная роль пептидов костного мозга при депресии гемопоэ-за и иммуногенеза, вызванной применением антиметаболитов пири-мидиновых оснований//Опыт медицинского обеспечения войск округа. Материалы XVIII окружной научно-практической конференции врачей ЛенВО. Л., 1990, С.75-76.

9. Михальцов А. Н., Долгий О.Д. Влияние регуляторных пептидов костного мозга на развитие стромальных элементов кроветворного микроокружения//Реактивность и регенерация тканей. Тез. конф. Л., 1990, С.45.

10. Иванова Т. А., Котов В. А., Жухина Г. Е., Хавинсон В. X., Михальцов А.Н. Цитологическая характеристика периферической крови, костного мозга и некоторые иммунологические показатели здоровых морских свинок//Физиологические и биохимические основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей. Сб. науч. трудов - Л.-1990.-С. 44-49.

11. Ivanov V.T.. Karelin A.A., Karelina Е. V.. Ulyashln V. V., Khavinson V.Kh., Morozov V.G., Mikhaltsov A.N. // Novel active peptides fron bovine brain and bone narrow : Proceedings of the Twenty-First European Peptide Symposium.- Barcelona, 1990.-

P.813-815

12. Ivanov V. Т., Karelin A.A.. Karelina E.V., Ulyashin V. V., Khavinson V.Kh.. Morozov V.G., Mikhaltsov A.N. // Total skree-ning of bovine brain and bone marrow extracts for active peptides : Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium.-Boston. 1991,- P. 618-625.

13. Михальцов A. H.. Булатов К. Б. Оценка биологической активности препаратов костного мозга //Пептидные биорегуляторы - цитоме-дины. Тез. симп.- С.-Петербург, 1992, С. 102-103.

14. Кишиневский Р. Н.. Васьковский Б. В.. Михалева И.И., Иванов

B.Т., Михальцов А.Н. Биологически активные вещества из экстракта костного мозга крупного рогатого скота//Пептидные биорегуляторы - цитомедины. Тез. симп. - С.-Петербург, 1992, С. 75-76.

15. Vaskovsky В.V.. Kishinevsky R.N., Mlkhaleva 1.1., Ivanov V.T., Khavinson V. Kh., Morozov V.G.. Mikhaltsov A.N.. Anisimov V.N. // Bioactive peptides from bovine pineal gland and bone narrow extracts. - J. Chemistry of Peptides and Proteins. -1993,- V. 5/6,- Part.-В.- P.- 309-316.

16. Митин Ю.A.. Дмитриев В.И., Касьянов А.Д., Кузьмич А.Н., Бо-лехан В. Н., Малков А.Н., Михальцов А. Н., Змушко Е.И. Иммунологический мониторинг в диагностике и изучении патогенеза ВИЧ-инфекции// III Международная конференция " СПИД, рак и родственные проблемы". Тез. конф. - С.-Петербург, - 1995,- С. 87.

17. Змушко Е. И., Дмитриев В. И., Касьянов А. Д., Болехан В.Н., Малков А.Н., Михальцов А.Н. Мононуклеарные фагоциты и патогенез ВИЧ-инфекции//Инфектология, достижения и перспективы. Тез. конф. - С. - Петербург, 1996. - С. 96-97.

18. Змушко Е.И., Михальцов А.Н. Перспективы применения пептидов костного мозга при ВИЧ-инфекции //IV Международная конференция " СПИД, рак и родственные проблемы. Тез.конф. - С,- Петербург, 1996.- С. 71.

19. Змушко Е.И., Дмитриев В. И.. Михальцов А.Н. Влияние пептидов костного мозга на функциональную активность кроветворной ткани при ВИЧ-инфекции // Военно-медицинские аспекты ВИЧ-инфекции Тез. конф. - С-Петербург. 1997.- С. 9.

20. Михальцов А.Н. Активность нуклеиновых кислот при ВИЧ-инфекции //Военно-медицинские аспекты ВИЧ-инфекции.Тез.конф.- С.-Петербург, 1997,- С. 9.

21. Михальцов А. Н., Смирнов В. С. Влияние пептидов костного мозга и тимуса на иммунологическую реактивность животных с острым миелотоксическим агранулоцитозом // Иммунология.- 1997,- N3.-

C. 21-23.