Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Антигены, иммунологически родственные структурным белкам вируса рака молочной железы мышей (MMTV) их ассоциация с опухолями молочных желез человека

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

•' ; . .■ ■ ; На правах рукописи

2 3 ДПР Ш:

МАЛИВАНОВА Татьяна Федоровна

АНТИГЕНЫ. ИММУНОЛОГЧЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ СТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЫШЕЙ (ЮТУ): ИХ АССОЦИАЦИЯ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ ЧЕЛОВЕКА

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории Иммунологии онкогенных вирусов НИИ Канцерогенеза Онкологического Научного Центра РАМН

Научный руководитель -

доктор биологических наук И.Н.Крюкова -

Официальные оппоненты:-

доктоо медицинских наук В.Э.Гурцевич, кандидат биологических наук Е.С.Иевлева

Ведущая организация -

Институт Эпидемиологии и Микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится " ^" с**^**^ 1996г. в час, на заседании специализированного Совета(К. 001.17.01) Онкологического научного центра РАМН (Москва. Каширское ш.,24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН. Автореферат разослан " ^" 1996г. .

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук, профессор

В. С.Турусов

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МЖ - полочная железа

РМЖ - рак молочной железы

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

MMTV - вирус рака молочной железы мышей

1—Ар - интрацитоплазматические А-частицы

R-MuLV - вирус лейкоза мышей Раушера

BoLV - вирус .лейкоза крупного рогатого скота

SSV - вирус саркомы обезьян

М-7 - эндогенный вирус павианов

МЫ 14 - эндогенный вирус кошек

MPMV - вирус Мезон-Пфайцер

ЧСАг-MMTV— антигёны из сывороток крови человека, несущие антигенные детерминанты, общие с детерминантами структурных белков MMTV

Актуальность проблемы. Вирус рака молочной железы мышей (MMTV) является одним из хорошо изученных ретровирусов В типа. Предполагается, что у человека механизмы развития опухолей МЖ во многом схожи с мышиной моделью вирусного канцерогенеза.

В геноме, человека были найдены нуклеотидные последовательности с различной степенью гомологии с MMTV (И.Ono et al.. 1986; F.May etal.. 19S6; O.Faffetal., 1992), что может являться основой экспрессии белков человека, иммунолог'ически родственных белкам этого ретровируса. Косвенным указанием на синтез подобных антигенов у человека является также активность клеточного и гуморального иммунного ответа. Суммируя известные данные' можно заключить, что белки человека, иммунологически родственные по крайней мере одному из белков MMTV - гликопро-теиду оболочки gp52 MMTV, выявляются в тканях РМЖ. и ассоциированы с канцерогенезом эпителия МЖ (A.Dion et al, 1976; И.Н.Крюкова, Е.А.Комарова, 1980; P.levlne ef. al., 1980; I.Keydar et al.. 1982). Экспрессия же антигенов, родственных р27 MMTV (структурному белку нуклеоида ретровируса), связывалась исследователями с пролиферативными процессами в эпителии MJK, но не РМЖ (A.Tsubura et al., 1986; I.Kryukova et al.. 1981; S.Zotter et al., 1980). До настоящего времени не известно, ограничена ли экспрессия белков человека, родственных MMTV, клетками эпителия МЖ. Попытки обнаружить подобные антигены в сыворотках крови принесли как положительные (M.Muller et al., 1972), так и отрицательные результаты (P.Zangerle et al.. 1977; J.HendrlcK et al., 1978). До настеящего времени также остается открытым вопрос о специфичности антител к белкам MMTV, выявляемых как при РМЖ, так и в небольшом проценте случаев в сыворотках крови здоровых доноров (С.В.Литвинов, 1980; М. Hoshlno. L.Dmochowskl, 1973; S.Wltkln et al., 1980; M. Tomana et al.. 1981; S.Zotter et al., 1981; A.S.Dion et al., 1987). .Кроме того не исследовалась экспрессия антител к структурным белкам других ретровирусов при РМЖ.

Таким образом, к настоящему моменту белки человека, иммунологически родственные структурным белкам MMTV, ' изучены не7 достаточно и исследование экспрессии таких белков, а также иммунного ответа на них как фактора риска развития РМЖ, продолжает оставаться актуальным.

- г -

Цела и задачи исследования. Целью настоящего исследования было исследование антигенов человека, иммунологически родственных структурным белкам MMTV и гуморалвного иммунного ответа на них. а также изучение ассоциации их с РМЖ.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) определение особенностей гуморального иммунного .твета на белки, иммунологически родственные белкам MMTV, в зависимости: а) от особенностей возникновения и развития РМЖ - в группе больных РМЖ, б) от факторов риска возникновения данного заболевания - в группе здоровых доноров;

2) определение специфичности антител к структурным белкам MMTV - р27 и gp52 - в группах здоровых доноров и больных РМЖ;

3) определение частоты обнаружения антител, к белкам других ретровирусов в сыворотках крови больных РМЖ;

4) изучение возможности связывания антигенов, родственных MMTV, и антител к ним в циркулирующие иммунные комплексы;

5) выделение белков человека, иммунологически родственных структурным белкам MMTV. их физико-химическая и иммунохимичес-кая характеристика;

6) изучение возможности экспрессия антигенов, родственных MMTV, в лимфоцитах человека.

Научная новизна. Впервые, методом иммуноблоттинга была показана специфичность направленности гуморального иммунного ответа на р27 MMTV у здоровых доноров, на gp52 - у больных РМЖ и в "группе риока". Впервые показано, что антигены, иммунологически родственные белкам MMTV, и антитела против них формируют циркулирующие иммунные комплексы в сыворотках крови больных РМЖ. Методом аффинной хроматографии были выделены и охарактеризованы антигены, родственные белкам MMTV, с молекулярными массами 60 и 68 кД. Методом иммуноблоттинга впервые показано, что такие антигены экспрессируются в лимфоцитах человека: как в Т-, так и В-лимфоцитах - у больных РМЖ; только в В-лимфоцитах - у здоровых доноров. Впервые было показано, что gp52 и р27 (продукты генов env и gag MMTV, соответственно) имеют общие антигенные детерминанты.

Практическая ценность. У 72% больных РМЖ и у 41% клинически здоровых женщин с наследственным фактором риска заболевания- РМЖ методом ELISA были выявлены антитела к MMTV, по сравнению с 5% здоровых доноров. Были получены данные, указы-

вающие, что для уточнения диагноза РМЖ, а также для выявления группы риска важно определение специфичности антител к gp52 MMTV методом иммуноблоттинга.

У всех обследованных больных РМЖ. но не с другими локализациями опухолей, была выявлена экспрессия белков с мол.массой 60 и 68кД. иммунологически родственных MMTV, как в Т-. тйк и в B-лимфоцитах, тогда как у здоровых доноров - в 21% случаев и только в В-лимфоцитах.

Представленные исследования дают теоретическую основу для разработки диагностических тестов на РМЖ.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на VIII Int.Congress of Immunology, 1992 (Будапешт. Венгрия); II и III Int.Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", 1993, 1995 (Ст.-Петербург, Россия); XXI Meeting of the European Tumor Virus Group. 1995 (Иннсбрук, Австрия).

Диссертация апробирована на совместной научной конферен-. ции лабораторий: Иммунологии онкогенных вирусов. Вирусного канцерогенеза. Иммунохимии, Молекулярной биологии вирусов и Регуляции клеточных и вирусных онкогенов 12 марта 1996 г.

Объем и структура работы. Материал диссертации изложен на 148 страницах машинописного текста и состоит из Введения. Обзора литературы, описания Материалов и методов. Результатов собственных исследований. Обсуждения и Выводов. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 16 таблицами. Библиографический указа-, тель содержит ссылки на 213 отечественных и зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.,

В работе использовались сыворотки крови: 1) от больных с подозрением на РМЖ из отделения Опухолей молочной железы ОНЦ РАМН (до проведения терапии). Данные обрабатывались на основании послеоперационного заключения гистолога (ТЛИ классификация ВОЗ-"1981 года); 2) сыворотки крови здоровых женщин получали при проведении диспансеризаций на предприятиях г.Москвы. В эксперименте использовались сыворотки женщин без патологий МЖ или с мастопатиями. по заключению маммолога; 3) образцы сывороток крови от здоровых женщин с семейной предрасположенность

к РМЖ O.K.Хинт. 1990) предоставлены Институтом экспериментальной и клинической медицины. Таллинн, Эстония. Образцы -цельной гепаринизированной крови онкологических больных и здоровых доноров были получены из итделений НИИ Клинической онкологии ОНЦ РАМН. Препараты опухолей МЖ были получены из Отделения патологической анатомии ОНЦ РАМН.

Препараты ретровирусов В типа - MMTV RUI. MMTV СЗН. С типа - R-MuLV, М-7, SSV, BoLV, RD-114. D типа - MPMV получены из National Cancer Institute, Bethesda, США.

Антисыворотки к белкам ретровирусов С типа получены из National Cancer Institute, Bethesda. США. Кроличья сыворотка против интрацитоплазматическух A-частиц предоставлена S.Zotter (Institute of'Patology. Karl-Gustav Karus. Dresden. Германия). Гипериммунные кроличьи сыворотки: против белков B-частиц MMTV из молока мышей RIII; против белков разрушенных эфиром частиц MMTV СЗН («з культуральной среды клеток inm5/mt): против белков молока мышей С57В1 были получены ранее в лаборатории Иммунологии онкогенных вирусов ОНЦ РАМН. Иммуноглобулины, конъюгиро-ванные с пероксидазой хрена: крэлика против иммуноглобулинов человека (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, Москва); козы против igG кролика. истощенные иммуноглобулинами человека (Sigma, США).'

Используемые методы

МоноспециФические по/иклональные кроличьи сыворотки к р27 и gp52 MMTV СЗН были получены методом иммунизации индивидуальными вирусными белками, электрофоретически разделенными и перенесенными на нитроцеллюлозные мембраны (К.A. Knudsen, 1985).

Выделение ЦИК проводили осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) (I.Rlha et al., 1979). Для выделения иммуноглобули-новой фракции препараты ЦИК диссоциировали в буфере - 0.15М NaCl, 0.2М Глицин-HCl pH 3.5, и разделили на хроматографичес-кой колонке с Sephadex G-200 в присутствии того же буфера. Для получения Fab'-фрагментов иммуноглобулинов из ЦИК препараты обрабатывали трипсином в 0.1М На-ацетатном буфере pH 4.5 в

течение ночи при 37°С (соотношение белок/фермент - 100/1). pH препаратов доводили до,8.0 1М раствором Tris, затем осветляли.

Для получения обогащенных фракций Т- и В- лимфоцитов на чашку Петри наслаивали кроличью антисыворотку против IgM человека в разведение 1:20 в 0.2М боратном буфере, pH 8.2, и инкубировали 45 минут. После отмывки РВ° в чашку Петри вносили и

инкубировали 1 час при комнатной температуре клеточную суст-пензию в PBS, выделенную в градиенте Flcoll-Hlpaque (Serva) или в полиглюкине (комбинат "Красноярскмедпрепараты"). Непрек-репившиеся клетки ^обирали (фракция, обагащенная Т-лимфоцита-ми), клетки..связавшиеся с антителами к IgM, снимали пипетти-рованием (фракция, обогащенная В-лимфоцитами). Полученные фракции лизировали, осветляли центрифугированием, уравнивали по содержанию белка методом дот-блоттинга на нитроцеллюлозных фильтрах ври окраске раствором Ponceau (Sigma, США) и использовали в иммуноблоттинге с антисывороткой против gp52 MMTV.

Непрямой иммуноФерментный анализ (ELISA) использовали в классической модификации по A.Vollar (1976): 1) для определения антител к белкам ретровирусов в сыворотках крови человека. Препараты ретровирусов иммобилизовывались на полистироловых микропланшетах (Dlnatech, США) по 0.4 мкг белка üpenapaTa MMTV или по 2 мкг белка препаратов р'етровирусов С и D типов на лун' ку. Сыворотки крови использовали в разведении 1/200; в некоторых экспериментах уровень специфической реакции определяли как отношением реакции в тесте к реакции с блокировкой, когда исследуемые сыворотки преинкубировали с MMTV в расчете по 5 мкг белка препарата на 100 мкл разведенной сыворотки, после чего проводили основную реакцию; 2) для анализа препаратов, полу-■ ченных из ЦИК, препарат MMTV-C3H вносили по 0.75 мкг на лунку, препараты иммуноглобулинов или Fab'-фрагментов использовали в разведении 1/20 - 1/100.

Для обнаружения ЦИК в сыворотках крови использовали метод ELISA в модификации H.Schetters et al. (1985). На иммуноплан-шете иммобилизовывали IgG кролика против белков MMTV-RUl'no 4 мкг на лунку. Тестируемые сыворотки вносили в лунки в разведении 1/10 на буфере, содержащем 10% неиммунной кроличьей сыворотки (или 10% кроличьей антисыворотки против белков MMTV-RIII в контроле). Количество связавшихся ЦИК выявляли реакцией с пероксидазным коныогатом. против иммуноглобулинов человека.

Сыворотки признавались положительными, если уровень их реакции превышал (х ± 2о) - в тесте на антитела, или (х + Зо) - в тесте на ЦИК (соответственно р=0,95 или р=0.997).

■ Специфичность антител : 1Ложительных по ELISA сывороггок человека к индивидуальным белкам препаратов ретровирусов определяли методом иммуноблоттинга (D.DuBols. R.Rossen. 1983).

Препараты антигенов - 5 мкг белка препарата ретровируса на трек, или 200 мкг на карман шириной 10 см для серийного имму-ноблоттинга разделяли в 15% полиакриламидном геле по U.Laemmli (1970), после чего переносили tía нитроцеллюлозные фильтры в электрическом поле напряженностью 10 в/см (H.Towbln, 1979). Тестируемые сыворотки использовали в титре 1/100 - 1/30Q

Для характеристики ЧСАг-MMTV брали 5-20 мкг белка препарата на трек. АНтисыворотки и соответствующие конъюгаты использовали в рабочих разведениях.

Приготовление иммуносорбентов: 1) CNBr-Sepharose 4В конъ-югировалась в соответствии с предложенной фирмой методикой (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция) с препаратами IgG из сыворотки кролика против MMTV-RIU или из пула сывороток крови больных РМЖ: 2) глютар-активированный иммуносорбент использовали в соответствии с методикой предложенной фирмой (Boehrlnger Mannhelm, Германия) для конъюгации с IgG кролика против gp52 MMTV.

' АФФинная хроматография. Исследуемые препараты (сыворотки .крови больных РМЖ или лизаты ткани РМЖ) разводили буфером 50мМ Трис-HCl pH 7.5, 0.5М NaCl. 0.5% Тритон-ХЮО вдвое и инкубировали с иммуносорбентом. Колонку промывали тем же буфером, а связавшиеся антигены элюировали 0.2М-Глицин-НС1 pH 3.0, 0.15М NaCl. Фракции. содержащее антигены. определяли методом дот-блоттинга с соответствующими иммунными сыворотками. ' Препараты аффинно очищенных антигенов использовали в иммуноблоттин-ге и в радиоиммунопреципитации.

Для определения наличия перекрестных антигенных детерминант у gp52 и р27 MMTV использовали метод аффинной хроматографии на нитроцеллюлозных мембранах (Е.P.Ryblkl, 1986).

Иммунопреципиташго меченых I125 препаратов нормальной и опухолевой ткани МЖ и аффинно очищенного препарата ЧСАг-MMTV провопили с помощью антисывороток к белкам ретровирусов В. С, D типа и к белкам молока мышей С57В1. В качестве сорбента-использовали St.aureus (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). Отмытый преципитат ресуспендировали з диссоциирующем буфере с 2% бета-меркаптоэ-танола. прогревали и разделяли в 15% полиакриламидном геле по U.К.Laemmli (1970). Гели высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку 0RW0 HS 11.

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Факторы, определяющие продукцию антител к MMTV.

К началу проведения наших исследований, в лаборатории Иммунологии онкогенных вирусов ОНЦ Р/МН был установлен факт выявления антител к белкам MMTV у больных РМЖ в 55% случаев и в 5% случаев среди здоровой популяции {С.В.Литвинов и др., 1984). Нас интересовал ряд ропросов: а) какие факторы определяют появление антител к MMTV у женщин в отсутствие РМЖ, б) каковы биологические особенности развития РМЖ у женщин, имеющих антитела к MMTV.' Скрининг сывороток на наличие антител к MMTV проводили методом ELISA.

Гриппа здоровых женщин и больных мастопатиями. Всего было проанализировано 404 сыворотки. 16 сывороток оказались положительными по антителам к MMTV (4$), причем 11 из них было от женщин без каких-либо патологий МЖ, а 5 - от женщин с диффузными фиброзно-кистозными мастопатиями. Достоверных отличий в частоте обнаружения антител к MMTV между группами здоровых женщин и с патологиями ПК (4% и 4,6% случаев соответственно) выявлено не было.

Анализ анкетных данных показал, что частота выявления антител к MMTV в исследованной группе не коррелирует с такими Факторами риска РМЖ, как возраст, раннее менархе, малое число родов, число абортов. Однако, у женщин, рожавших более 2 раз. частота обнаружения антител к MMTV была достоверно выше (20% случаев), чем у не рожавших (2.1%). или у рожавших один (4,1%) и два раза (4,6%) (р<0,05). Кроме того, в возрасте после 40 лет, частота выявления антител к MMTV у женщин с ранним менархе была достоверно выше, чем у женщин со средним и поздним Менархе (9% и 0% соответственно) (р<0,01); в возрасте до 40 лет наблюдалась обратная тенденция (2,7% - у женщин с ранним менархе, 7.5% - со средним и поздним).

Таким образом частота обнаружения антител к MMTV в этой выборке зависела от гормональных факторов' (рис.1).

Гриппа жентн с наследственной предрасположенность к заболеванию рш. Отдельно исследовалась группа клинически здоровых женщин, чьи матери болел;. РМЖ. Методом ELISA из 56 сыверо-ток от дочерей пробандов было выявлено 23 положительных, содержащих антитела к структурным белкам MMTV (41%).

Не удалось выявить корреляции наличия антител к МИТУ ни с возрастом, ни с числом беременностей и абортов, ни с возрастом менархе. Однако, оказалось, что такой фактор риска как повышенный уровень свободного 17-бета-эстрадиола был выявлен у большего количества женщин из положительной по 'антителам к ММТУ группы в обеих фазах менструального цикла, по сравнению с отрицательной группой (табл.1).

При анализе особенностей развития заболевания в семьях, для группы больных РМЖ, чьи дочери имели антитела к ММТУ. были выявлены следующие особенности: 1) большее число женщин имели родственниц (первой степени родства), болевших РМЖ или раком органов женской половой сферы; 2) преимущественно в этой группе присутствовали женщины с РМЖ, возникшими до наступления менопаузы и 3) в раннем возрасте (табл.2).

Таблица 1. Случаи выявления повышенного уровня свободного 17о-эстрадиола у здоровых женщин, чьи матери болели РМЖ.

Случаи выявления Повышенного-уровня 17о-эстрадиола в фазах менструального цикла: По тесту на антитела к MMTV: положительная отрицательная группа группа

фолликулярная * 68,4% 36,7% 13/19 11/30

лютеинизирующая * 42,1% 13,3% 8/19 4/30

Таблица 2. Анализ данных анамнеза больных РМЖ, чьи дочери тестировались на наличие антител к ММТУ.

Показатели особенностей развития РМЖ в семьях: Больные РОТ, чьи дочери по. тесту на антитела к MMTV были: положительными отрицательными

наличие родственниц с РМЖ и раками женской половой сферы * 33,3% 6,9% 7/21 2/29

случаи возникновения РМЖ- до менопаузы * 70% 40% 14/20 10/25'

случаи РМЖ до 40 лет 4/20 0/25

*' различия между положительной и отрицательной группами достоверны (р<0,05) Таким образом, частота обнаружения антител к ММТУ коррелировала как с гормональными, так и наследственными факторами риска (рис.1).

Гутпа больных с подозрением на РМЖ. С использованием теста на антитела к MMTV было проведено тестирование кодированных образцов сывороток от первичных больных, поступавших в отделение Опухолей молочной железы ОНЦ РАМН.

Частота обнаружения положительных сывороток для случаев РМЖ составила 72,2% (26 из 36). Были также выявлены все случаи (3 из 3) РМЖ как первичного очага метастазирования. В группе больных с доброкачественными опухолями и дисплазиями МЖ положительная реакция сывороток наблюдалась в 13.95S случаев, однако только при пролиферации эпителия в мелких протоках и в случае атипичной дольковой гиперплазии, что значительно повышает относительный риск заболевания РМЖ (табл.3).

При рассмотрении особенностей развития РМЖ оказалось, что большая часть положительных случаев в тесте на антитела к MMTV приходится на ранние и/или возникшие в репродуктивном периоде опухоли (что соответствует нашему наблюдению в группе женщин с семейными РМЖ), а также характеризуется высокой скоростью роста (по анализу продолжительности anamnesis morbl) (табл.4).

Таблица 3. Случаи • обнаружения антител к ММТУ у больных с подозрением на РМЖ в зависимости от послеоперационного диагноза.

Диагноз Аэтитела к MMTV

Рак молочной железы Доброкачественные опухоли и дисплазии молочной железы Метастазы без выявленного первичного очага: рак молочной железы другие карциномы Липома Лимфосаркома 26/36 5/36 3/5 3/3 0/2 • • 0/1 O/i •

Таблица 4. Особенности развития опухолей в группе больных РМЖ.

Показатели особенностей развития РМЖ По тесту на антитела к MMTV. группы: положительная отрицательная

случаи РМЖ до менопаузы 15/26 4/10

случаи РМЖ до 40 лет 4/2Г 0/10

anamnesis morbl до 3 месяцев * 84,6% 40%-22/26 4/10

» различия между положительной и отрицательной группами достоверны (р<0,05)

- 10 -

По-видимому, приходится говорить об эффективном выявлении больных РМЖ с определенными особенностями развития опухоли •(рис.1) и, возможно, об определенной нозологической форме РМЖ, ассоциированной с экспрессией белков, имеющих общие эпитопы со структурными белками ММТ7 (С.В.Литвинов, 1990). Такая форма РМЖ, исходя из наших экспериментальных данных, должна составлять более половины всех опухолей, и выявляться, как правило, в ранние сроки и в репродуктивном периоде.

. 2. Специфичность антител к структурным белкам MMTV.

Специфичность антител положительных по ELISA сывороток к индивидуальным структурным белкам MMTV идентифицировали методом иммуноблоттига. Сводные данные представлены на рис.1.

Основная активность в 14 из 16 положительных сывороток от здоуовых жентн и больных мастопатиями была направлена против р27 MMTV. Для большинства сывороток реакция против gp52, если вообще отмечалась, была выражена значительно слабее. В двух случаях реакция была направлена против gp52, причем это были сыворотки от женщин с мастопатиями. Однако, достоверных различий в специфической направленности реакции антител между группами здоровых женщин и с мастопатиями не выявлено.

. Было протестировано 8 положительных сывороток от зборовш: жентн. чьи матери болели РМЖ. В этой группе активность была направлена против р27 и gp52 примерно в равном количестве случаев (соответственно 3 и 4 случая, и еще 1 сыворотка реагировала с обоими белками в равной степени). Интересно, что наблюдалась тенденция обратной зависимости интенсивности реакций с gp52 и р27 одной и той же сыворотки.

В . 18 проверенных положительных сыворотках от больных РМЖ основная активность была направлена против gp52 MMTV.. Некоторые сыворотки также реагировали и с'р27, но в значительно меньшей- степени.

Дополнительно в ELISA и в иммуноблоттинге исследовалась частота обнартения антител к уетоовирисам С и D типа у больных с доброкачественными и злокачественными опухолями ОТ. Оказалось, что среди 89 сывороток специфически реагируют с белками - продуктами гена gag различных ретровирусов С типа: SSV. М-7, BoLV - по две сыворотки для каждого из вирусов (по 2.3%). RD-11 - пять сывороток (5.7%). и ни одной сыворотки с МРМ.

Рисунок 1. Анализ частоты обнаружения и специфичности антител к структурным белкам MMTV 6 исслебобанных группсх.

Частота обнаружения антител к MMTV 6 исслебоЬанных группах

100 ео 60 40 20 о

эЭороЬые женщины группа риска больные РМЖ и с мастооатиями

Антитела к ретро-bUDvcoM с типа -yZ-6x больных РМЖ

антитела к р27

"(Ж:

4 17/-Г.Ч«,'"

антитела к др52 Специфичность антител к MMTV

хх положительжх сыЬороток

особенности раэдития опухол!

(ретровирус D типа). Частота обнаружения антител к SSV, М-7 и BoLV в нашей выборке мала и может интерпретироваться как сбще-■популяционная. Различий между группами больных со злокачественными и доброкачественней опухолями МЖ не выявлено.

Таким образом, тест ELISA на наличие антител к белкам MMTV, но не других ретровирусов. специфичен для РМЖ. Особенно специфична для РМЖ продукция антител, направленных против gp52, выявляемая в иммуноблоттинге. Обнаружение антител к р27 может быть связано с гормональными воздействиями. В любом случае, антитела к MMTV, и особенно повышение частоты обнаружения антител к gp52 может являться маркером групп повышенного риска заболевания РМЖ (рис.1).

3. -Циркулирумще иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотках

крови больных РМЖ.

ЦИК, предположительно содержащие в качестве антигена белки, иммунологически родственные MMTV, определяли методом ELISA. Положительными оказались 25 из 85 (29,4%) сывороток от больных РМЖ разных стадий заболевания/ 1 из 3 - от больных с интрадуктальной папилломой (с высокой интенсивностью реакции) и 2 из 15 - от больных с фиброзно-кистозной мастопатией (уровень реакции был близок к пороговой).

В группе больных РМЖ была выявлена зависимость частоты обнаружения ЦИК от размера опухолевого узла (классификация TNM). Частота обнаружения ЦИК в группе Tl-была достоверно выше, чем в группах Т2 и ТЗ (р<0,001), однако в группе Т4 она снова повышалась (табл.5).

Таблица 5. Частота обнаружения ЦИК в сыворотках крови больных РМЖ в зависимости от размера опухоли (классификация ТЛИ).

Гистологический диагноз Т1 Т2 ТЗ. Т4

Количество 40% 26,1% 0% 35,1%

положительных

сывороток 6/15 6/23 0/10 13/37

Для ряда сыворо-ток больных РМЖ была показана обратная зависимость между содержанием свободных антител к ММТУ и содержанием ЦИК (рис.-2). Сыворотки полностью отрицательные по антителам, не содержали и иммунных комплексов. Таким образом, ая-

Рисунок 2. Корреляция соЭержания Ь сыборотках кроби больных РМЖ ЦИК и сЬобобных антител к ММТУ.

25

20

15

10

% специфической .уооЬень реакции > реакции опт ич.плот н.,

Зо

5

- \ ■ ©§о ® ' © ' 0) X

■ ©%) -:—-—1

антитела к ММТУ ЦИК (Ц) - положительные сыЬоротки

О - отрицательные сыЬоротки

по тесту на антитела к ММТУ

тигены, иммунологическч родственные MMTV, могут'связывать антитела в циркулирующие иммунные комплексы.

Далее, иммуноглобулиновую фракцию и препараты Fab'-фрагментов полученные из ЦИК исследовали в ELISÁ на'активность, направленную против эпитопов структурных белков MMTV. Антитела, реагирующие с белками MMTV, содержались в иммуноглобулино-вой фракции.ЦИК из пула сывороток. Среди индивидуальных препаратов Fab'-фрагментов только в 1 из 22 исследованных препаратов обнаруживалась такая активность. Связывание антител и Fab'-фрагментоь с белками MMTV было специфичным, т.к. блокировалось только препаратом MMTV, но не контрольными препаратами ретровирусов типа С (RaLV) и D (MPMV), молока мышей С57В1 и экстрактом ткани нормальной молочной железы мышей Balb/c.

4. Антигены, имеющие общие эпитопы со структурными белками MMTV. у человека.

Для характеристики белков человека, иммунологически родственных структурным белкам MMTV, были получены моноспецифические кроличьи пвликлональные антисыворотки против р27 и gp52 MMTV СЗН. На иммуносорбенте с Igfl кролика против gp52 из сывороток крови больных РМЖ был выделен аффинно очищенный препарат антигенов. В препарате методом иммуноблоттинга выявлялись белки с мол.массой 60 и 68кД. причем последний был гликозилиро-ван. Оба белка в равной степени выявлялись антисыворотками как против р27, так и против gp52 MMTV, возможно, за счет общих антигенных детерминант у белков-продуктов генов gag и env рет-ровируса, наличие которых было нами показано методом аффинной хроматографии на нитроцеллюлозных фильтрах. В кровотоке выделенные . полипептиды, по-видимому, могут циркулировать как в свободном виде, так и в виде иммунных комплексов, поскольку с ними совыделялись и некоторые компоненты сыворотки крови, в том числе иммуноглобулины.

Были использованы и другие антисыворотки. На иммуносорбенте с IgG кролика против белков В-частиц MMTV RUI также был получен аффинно очищенный препарат антигенов. В реакции ради-оиммунопреципитации ан.исыворотка против белков В-частиц MMTV RUI (как env, так и gag - продуктов) выявляла в препарате ЧСАг-MMTV также два белка - с мол.массой 60 и 68кД: антисыворотка против 1-Ар (то есть против внутренних белков Еириона)

также реагировала с белком 68кД и в значительно меньшей степени - бОкД. Теми же антисыворотками белок с мол.массой 68кД вы-, являлся методом радиоиммунопреципитации также в препарате ли-зата ткани РМЖ, но не нормальной прилежащей ткани №.

В аффинно очищенном препарате антигенов из лизата ткани РМЖ, выделенном на иммуносорбенте с иммуноглобулинами из сыао-роток больных РМЖ (т.е. с антителами против ир52 ММТУ), присутствовал белок с мол.массой 68кД. Было показано, что положительные сыворотки крови здоровых доноров, содержащие антитела к р27 МИТУ, но не отрицательные (не содержащие таких антител), также способны связывать белки из препарата ЧСАг-ММТУ. Это свидетельствует о том, что данный белок присутствует в ткани РМЖ, и, кроме того, является одним из антигенов, на которые направлен гуморальный иммунный ответ.

Таким образом, антигены. иммунологически родственные структурным белкам ММТУ, и выделяемые нами как ЧСАг-ММТУ, экс-прессируются тканью РМЖ, циркулируют в кровеносном русле и, по-видимому способны вызывать гуморальный иммунный ответ, вследствие которого происходит продукция антител"как к |го52. так и к р27 ММТУ.

Поскольку в последнее время стало ясно, что у мышей клетки иммунной системы принимают непосредственное участие в жизненном цикле ММТУ (и.ВеиШег е1 а1.. 1994: Т.Со1оук1па еЬ а1., 1994), мы решили проверить не происходит ли экспрессии белков, родственных ММТУ, в периферических лимфоцитах человека при РМЖ.

Действительно, белки с мол. весом 60 и 68кД выявлялись в лизатах лимфоцитов методом иммуноблоттинга с антисывороткой против £п»"52 ММТУ СЗН. Результаты анализа в иммуноблоттинге представлены в сводной таблице (табл.6). В группе больных из отделения Опухолей молочных желез положительными были все образцы, .причем реакция наблюдалась как в обогащенных В-, так и Т-лимфоцитарных фракциях. Полностью отрицательной была группа из отделения Гинекологии, взятая как контрольная по принципу гормонзависимости опухолей. В группе здоровых доноров положительный результат составил 21,4%, однако, в отличие от больных РМЖ. положительная реакция наблюдалась только в обогащенных В-лимфэцитарных фракциях. Антигены также были выявлены у значительной части больных с В-клеточной детской лимфосаркомой (в

этом случае тестировались неразделенные препараты лимфоцитов) и у больного в группе взрослых с лимфосаркомами, причем в пос-■леднем_ случае интенсивность реакции была крайне низкой, однако, статистический анализ показал, что группа больных из отделения' Опухолей молочных желез достоверно отличалась (р<0,005) от всех контрольных групп, включая В-клеточные детские лимфо-саркомы и группу лимфосарком взрослых.

Таблица 6. Выявление полипептидов с молекулярным весом 60 и 68кД в обогащенных препаратах Т- и В-лимфоцитов от доноров различных групп в иммуноолоттинге.

Исследуемые группы Положительная р-я /всего в группе Тип реакции в преп. Т- и В-лимфоцитов

Рак молочной железы 13/13: 12/13 1/13 Т-лц +++ + В-лц +++ -г

Фиброаденома молочной железы 1/1 ++ +++

Рак шейки матки 0/8 Т-лц - В-лц -

Рак яичников 0/4 - -

В-клеточная детская лимфосаркома 3/4 Неразделенный преп.' ++

Гемобластозы взрослых (острые и хронические миело-и лимфобластные лейкозы. 0/7 Т-лц - В-лц -

лимфосаркомы) 1/3 68кД ±

Здоровые доноры 3/14: 1/14 1/14 1/14 Т-лц В-лц ++ + 68кД ++

- 17 -

Пока мы не можем говорить с уверенностью о вирусной природе выявляемых белков. Однако несомненно, что выявление анти-. генов, иммунологически родственных gp52 MMTV, в лизатах лимфоцитов из периферической крови, и особенно их выявление в обогащенной Т-лимфоцитарной Фракции, коррелирует с РМЖ, а дальнейшее изучение условий экспрессии антигенов, иммунологически родственных структурным белкам MMTV, позволит приблизиться к пониманию механизмов развития опухолей МЖ человека, поскольку есть основания полагать, что они схожи с мышиной моделью вирусного канцерогенеза эпителия МЖ.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружение антител к MMTV ассоциировано с РМЖ, поскольку, методом ELISA, такие антитела выявлены у 72% больных РМЖ, 41% клинически здоровых женщин, чьи матери"болели PMS, и только у 4% здоровых женщин и 4, 655 женщин с мастопатиями: час-, тота обнаружения антител к белкам ретровирусов С и D типов в сыворотках крови больных РМЖ не превышает 6%.

2. Частота обнаружения антител к MMTV в группе здоровых женщин и больных мастопатиями ассоциирована с гормональными факторами, тогда как у клинически здоровых женщин, чьи матери болели РМЖ, коррелирует как с гормональными, так и наследственными ' факторами. Положительная по антителам к MMTV группа больных РМЖ характеризовалась быстрым ростом опухоли и случаями возни, .новением опухоли в ранние сроки и/или в репродуктивном периоде.

3. Методом иммуноблоттинга показано, что специфичность антител в сыворотках крови больных РМЖ направлена против gp52, а здоровых доноров - против р27 MMTV. У женщин с наследственной предрасположенностью к РМЖ наблюдается оба типа реакции.

4. ЦИК, содержащие антигены, иммунологически родственные MMTV. выявлены в сыворотках 29.4% больных РМЖ. В состав ЦИК входят антитела, способные связываться с белками MMTV. Показана обратная корреляция содержания в сыворотках крови ЦИК и свободных антител к MMTV. '

- 18 -

5. Из сывороток крогзи больных РМЖ выделены и охарактеризованы белки, иммунологически родственные структурным белкам MMTV. Мол. масса полипептидов - 60 и 68кД. Белок 68кД гликози-лирован. Белки имеют общие антигенные детерминанты и выявляются поликлональными сыворотками против белков - продуктов как гена env (gp52), так и гена gag tp27) MMTV.

6. Белки, иммунологически родственные структурным белкам MMTV, помимо сывороток крови больных РМЖ. присутствуют также в ткани РМЖ, но не в нормальной прилежащей ткани. Выявление таких белков в лимфоцитах периферической крови, и особенно во Фракции обогащенной Т-лимфоцитами, коррелирует с РМЖ. поскольку оба белка выявлены у всех исследованных больных РМЖ в обогащенных как Т-, так и В-лимфоцитарных фракциях, тогда как у здоровых доноров эти антигены обнаружёны лишь в 21,4% случаев и только в В-лимфоцитарных фракциях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.В.Литвинов, Т.Ф.Маливанова. Т.П.Рябых, И.Н.Крюкова. Специфичность антител к структурным белкам вируса рака мелочной железы мышей у здоровых женщин и при мастопатии.- Вопросы ОНКОЛОГИИ, 1988, Т.34, N 4. с.417-421.

2. С.В.Литвинов, Т.Ф.Маливанова. Ю.В.Чуев, И.Н.Крюкова. -Присутствие антител, специфически реагирующих со структурными белками MMTV, среди антител, входящих в состав циркулирующих иммунных комплексов у больных раком молочной железы. - БЭБиМ. 1988, т. 105, N 4, с. 475-477.

3. Т.Ф.Малиёанова, С.В.Литвинов, Е.К.Хинт. М.Эомойс, М.Пурде. И.Н.Крюкова. - Антитела к белкам, имеющим общие эпи-топы со структурными белками вируса рака молочной железы мышей, у здоровых дочерей женщин, больных раком молочной железы. Корреляция с гормональным статусом и наследственностью. -Вестник ОНЦ АМН России. 1994, N 1, с.13-17.

4. И.Н.Крюкова. Т.Ф.Маливанова. О.М.Кондрашова. Е.Б.Полевая. В.В.Евтушенко. - Возможные пути циркуляции MMTV-п'одобного эндогенного ретровируса человека. - БЭБиМ, 1995, т.120. К 11, с.554-556.

- 19 -

5. T.F.Mallvanova,^ S.V.Lltvlnc/, E. B. Polevaya, I.N.Kryu-kova. - Detection In the blood serum of breast cancer patients of circulating Immune complexes containing antigens showing common epitopes with structural proteins of MMTV. - Acts Virol.. 1988, 32, p..129-137.

6. T.F.Mallvanova, S. V. Lltvlnov. - Antibodies tc retroviruses of types C and D In female patients with benlgr and malignant mammary tumours. - Acta vlrol., 1990, 34, N 1, p.19-26.

7. T.Mallvanova. S.Lltvlnov, L.Bobrovskaya. - Proteins, lmmunologocally related to structural proteins of MMTV it human. - Abstr. 8th International Congress of Immunology, 1992, p. 421.

8. A.Buntsevlch. T.Mallvanova, I.Kryukova, S.Lltvlnov. • Immunological cross-reactlvlty between env and gag products o; some retroviruses. - Abstr. 8th International Congress o; Immunology, 1992, p.414.

9. I.Kryukova, S.Lltvlnov. T.Mallvanova. - Endogenou: MuMTV-releated human retrovirus: whether or not its expressloi correlates whlth presence of mammary carcinoma? - Abstr. 2ni Int. Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", 1993 p. 31.

10. I.Kryukova, T.Mallvanova, E.Polevaya, O.Kondrashova

- Possible Involvement of human lymphocytes In the HMT pathway. - Scl.Proc. XXI Meeting of the European Tumor Vlru Group in "J. Cancer Res. and Clin. Oncology". ,1995. 121. Sup. 1 p. 6.

11. I.Kryukova, T.Mallvanova, O.Kondrashova, E.Polevaya

- Llmphol^ cells - a possible key point of MMTV-relate Endogenous Human Retrovirus circulation. - Abstr. 3-rd Int Conference "AIDS, Cancer and Related Problems". 1995, p.68.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Тираж 'ЮО

Заказ 5 Б

Подп к печати 5 Ч 96