Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Изучение структурных особенностей MMTV и иммунорегуляторных аспектов жизненного цикла вируса

Иммунная система это основное орудие борьбы организма с патогенными агентами, такими как бактерии и вирусы, а так же с опухолевыми клетками. В процессе эволюции патогены постоянно приспосабливаются к жизни во внутренней среде организма и используют всевозможные стратегии для преодоления барьеров иммунитета. Понимание механизмов взаимодействия иммунной системы с патогенами позволяет наилучшим образом использовать её в борьбе против патогенных микроорганизмов. С другой стороны, изучение механизмов адаптации патогенов к иммунитету, несомненно, способствует углублению знаний об иммунной системе.

MMTV (вирус рака молочной железы мышей) принадлежит к семейству ретровирусов. Необычной особенностью этого вируса является его способность использовать иммунную систему хозяина в процессе своего жизненного цикла. Взаимодействие с иммунной системой оказывается возможным благодаря наличию в геноме вируса гена вирусного суперантигена (Sag), вызывающего пролиферацию клеток, в которых происходит его размножение. Интегрированный неинфекционный провирус Mtv передается потомству с геномом половых клеток. Вертикальная передача инфекционного MMTV в форме экзогенной вирусной частицы происходит алиментарно с инфицированным молоком. Презентация Sag в комплексе с молекулами МНС II класса (преимущественно с молекулой 1-Е) на поверхности инфицированной клетки приводит к обширной стимуляции Т клеток CD4+ с определёнными VJ3 сегментами TCR (рис.1). Т клетки активируют В-лимфоциты, которые, в свою очередь, стимулируют дальнейшую пролиферацию Т клеток. Таким образом, создаётся пул пролиферирующих клеток, необходимый для амплификации MMTV. Хотя многое уже известно,,^ о механизмах презентации Sag и о Т-В-клеточных взаимодействиях во время инфекции MMTV, вопрос о связи презентации обычных антигенных пептидов молекулами МНС с презентацией вирусных суперантигенов не изучен. Возможность для выяснения этой связи открывается с созданием генетических нокаутов, лишенных экспрессии молекул, участвующих в продессинге антигенов, и трансгенных мышей, экспрессирующих единственный инвариантный комплекс молекулы МНС класса II с пептидом.

В клетка v-Sag

Т клетка рис.1 Схема презентации вирусного суперантигена

Janeway С.A. Jr. et al, 2001] .

Особенностью MMTV является то, что вирус с самого рождения оказывается в организме. Поэтому появляется возможность проследить взаимодействие MMTV с организмом в неонатальном периоде, когда происходит развитие всех систем, в том числе и иммунной, и вирус приспосабливается к происходящим изменениям.

MMTV это онкогенный вирус. На последнем этапе жизненного цикла вирус попадает в эпителиальные клетки молочной железы, встраивается в геном и индуцирует образование опухолей. Поскольку MMTV не имеет собственного онкогена, для индукции канцерогенеза требуется активация клеточных протоонкогенов. Однако, трансформация это сложный многоступенчатый процесс, поэтому в нем принимают участие и другие факторы. Определение факторов, влияющих на амплификацию вируса и его онкогенные свойства представляет интерес с точки зрения теоретических знаний о механизмах канцерогенеза, что в свою очередь может способствовать разработке методов противоопухолевой терапии. Возможности для этого открываются в связи с обнаружением сублиний мышей, различающихся по частоте возникновения опухолей молочной железы.

Таким образом, MMTV является удобной моделью, с одной стороны, для изучения работы иммунной системы, а, с другой стороны для изучения молекулярных механизмов возникновения опухолей молочной железы. Целью планируемого исследования является изучение иммунорегуляторных аспектов жизненного цикла MMTV и структурных особенностей отдельных форм вируса, связанных с канцерогенезом. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние ограничения репертуара пептидов, представляемых в контексте молекул МНС класса II, на способность презентировать вирусные и бактериальные Sag, а также изучить возможность вирусной инфекции у мышей с ограниченным репертуаром пептидов. В качестве экспериментальных моделей мышей с ограниченным репертуаром пептидов использованы мыши с нокаутированным геном молекулы DM (DM КО) и трансгенные мыши АьЕр. У мышей DM КО все молекулы МНС класса II связаны с пептидом инвариантной цепи CLIP (рис.2) [Martin W.D. et al., 1996], и комплекс молекула MHC/CLIP распознаётся антителами 25-9-17 [Ozato К. et al., 1980]. У трансгенных мышей АьЕр, где в качестве трансгена используется комплекс молекулы МНС II Аь с пептидом из а цепи молекулы Еь (Еа52-68) МНС класса II, все молекулы МНС класса II тоже связаны с одним единственным пептидом Еа52-68 [Ignatowicz L. et al., 1996], и комплекс АьЕр распознаётся антителами Y-Ae [Murphy D. et al., 1989].

Эндоцитированные антигены деградируют до пептидов в эндосомах, CLIP блокирует связывание пептидов с молекулой МНС класса И

DM связываетсяс молекулой МНС класса II и вытесняет CLIP, позволяя другим пептидам связываться. Затем молекула МНС класса II транспортируется на поверхность клетки. антиген пептиды

МНС рис.2 Схема презентации антигена молекулами МНС класса II [Janeway С.A. Jr. et al, 2001].

2. Определить возможность инфицирования 1-Е-негативных мышей и мышей, у которых отсутствуют Sag-специфические Т клетки, I-E-зависимыми вирусами и вирусами со специфичностью к данным Т клеткам, соответственно, в присутствии MMTV, которые не имеют ограничений для инфицирования, а также выяснить, имеются ли отличия в инфицировании новорождённых и взрослых мышей.

3. Воспроизвести эксперименты, показывающие увеличение латентного периода и уменьшение частоты возникновения опухолей молочной железы у сублинии мышей C3H/HeJ по сравнению с C3H/HeN. Клонировать и секвенировать MMTV, присутствующие у этих мышей, и сравнить последовательности вирусов с целью идентификации гена, ответственного за резистентность мышей линии C3H/HeJ к канцерогенезу, индуцированному MMTV".

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Вирус рака молочной железы мышей (MMTV, mouse mammary tumor virus) принадлежит к семейству ретровирусов. MMTV был открыт ещё в 193 6 году как фактор, вызывающий карциномы молочной железы у мышей [Bittner J., 1936]. MMTV существует в двух формах. Во-первых, это эндогенные вирусные последовательности, которые присутствуют в геноме почти всех инбредных линий мышей. Они не инфекционны и передаются с половыми клетками от поколения к поколению [Kozak С. et al., 1987]. Во-вторых, это экзогенные MMTV, которые имеются у мышей некоторых линий и передаются в виде инфекционных вирусных частиц с молоком матери кормящемуся потомству. Таким образом, вирус попадает в организм через желудочно-кишечный тракт.

Необычайной особенностью экзогенного MMTV является то, что он использует иммунную систему хозяина для успешного завершения жизненного цикла и установления продуктивной инфекции. Это оказывается возможным благодаря гену вирусного суперантигена (v-Sag), кодируемого в геноме MMTV [Marrack P. et al., 1991/ Choi Y. et al., 1991]. Дело в том, что конечной мишенью MMTV являются клетки молочной железы, которые начинают делиться только в возрасте 3-4 недель. Ретровирусы могут встраиваться в геном только делящихся клеток. Таким образом, MMTV оказывается в организме в то время, когда его главные мишени ещё не могут быть инфицированы. Чтобы решить эту временную проблему MMTV с помощью Sag инициирует мощный В- и Т-клеточный ответ и амплифицируется в пролиферирующих лимфоцитах [Waanders G.A. et al., 1993; Held W. et al., 1993a; Acha-Orbea H. et al., 1999]. Затем инфицированные лимфоциты переносят вирус в развивающуюся молочную железу (МЖ), позволяя тем самым преодолеть и проблему переноса вируса в ткань-мишень . Попав в клетки МЖ и пройдя этап обратной транскрипции, ДНК провируса интегрируется в геном рядом с клеточными протоонкогенами и индуцирует образование опухолей (см. раздел 12) .

1. Геном MMTV и вирусные белки.

MMTV это РНК-содержащий вирус. Как и любой ретровирус MMTV состоит из генов gag, pol и env. С двух сторон РНК фланкирована областями 3' и 5' LTR (long terminal repeat). 3'LTR имеет в своём составе открытую рамку считывания, которая кодирует белок Sag.

Белки MMTV транслируются с трёх транскриптов мРНК [Calafat J. & Hageman P., 1969]. Во-первых, образуется полноразмерный геномный транскрипт, с которого происходит трансляция полипептидов, продуктов генов gag и pol. Полипептид массой 77 kD (продукт гена gag) впоследствии расщепляется с помощью вирусной протеазы (которая уже присутствует в вирусной частице) и формирует внутренние структурные белки: матрикс (МА) , капсид (СА) и нуклеокапсид (NC) . МА инициирует сборку вирусной частицы и находится под оболочкой вируса, белок СА формирует зрелую вирусную сердцевину, и NC участвует в упаковке вирусной РНК. Полипептид массой 180 kD (продукт гена pol) является предшественником обратной транскриптазы. Третий продукт этого транскрипта - это вирусная протеаза массой 30 kD.

Во-вторых, образуется транскрипт, с которого транслируется полипептид массой 7 0 kD. Он является предшественником белков оболочки Env, gp52 (SU) и gp3 6 (ТМ) . gp3 6 это трансмембранный домен Env, а др52 образует экстраклеточный домен, который взаимодействует с клеточными рецепторами для MMTV.

Наконец, с третьего короткого транскрипта транслируется предшественник Sag массой 45 kD, который в результате расщепления образует функциональный Sag массой 18.5 kD.

2. Эндогенные Mtv.

Все инбредные линии мышей и большинство диких мышей имеют в геноме интегрированные провирусы MMTV (от 2 до 8) [Kozak С. et al., 1987]. Эти локусы получили название Mtv. Большинство эндогенных Mtv не образует инфекционных вирусных частиц из-за мутаций в кодирующих областях [Kozak С. et al.,1987] и не обладают трансформирующей активностью. Исключение составляет MMTV(GR), спонтанно активированный провирус Mtv2 в линии мышей GR, ответственный за высокую частоту возникновения опухолей молочной железы [Michalides R. et al., 1981]. Mtv продолжают экспрессировать вирусные белки и, в том числе, функциональный Sag.

Всего было обнаружено более 30 разных провирусов, локализующихся на различных хромосомах [Kozak С. et al.,1987]. При этом некоторые Mtv индивидуальны для соответствующих линий мышей. Так Mtv44 экспрессируется только в мышах NZW [Fairchild S. et al., 1992], a Mtv21 характерен только для мышей NZB [Tomonari К. et al., 1993]. Другие Mtv встречаются чаще. Например, Mtvl экспрессируется у мышей СЗН/Не и DBA/2. A MtvQ, Mtv9 и Mtvl7 есть почти у всех линий лабораторных мышей.

3.Открытие вирусного суперантигена.

Наличие Sag в геноме MMTV было показано сравнительно недавно, хотя интерес иммунологов к явлениям, вызванным v-Sag, появился почти 3 0 лет назад. В 1966 году было сделано интересное наблюдение, которое заключалось в том, что спленоциты некоторых линий мышей вызывают мощную пролиферацию Т клеток других линий мышей в смешанной культуре лимфоцитов (MLR) между клетками полностью идентичными по МНС. [Festenstein Н., 1973]. Поэтому антиген, вызывающий пролиферацию, был назван Mis (согласно разным источникам, от англ. mixed lymphocyte stimulation или minor lymphocyte stimulating antigen). Позднее было показано существование разных Mis [Abe R. et al., 1987], и их иммуногенные свойства были подтверждены во многих работах [Lynch D. et al., 1985; Abe R. et al., 1989]. Наиболее мощным активатором T клеток был Mlsla.

Следующим шагом в понимании феномена Mis был тот факт, что только Т клетки, которые несут Т-клеточные рецепторы (TCR), имеющие определённые VP, способны распознавать Mis. Так в 1988 году одновременно двумя группами было показано, что Mlsla вызывает пролиферацию Т клеток Vf38.1+ [Kappler J. et al.,

1988] и V(36+ [MacDonald H.R. et al., 1988b]. Более того, в мышах, экспрессирующих Mlsla, эти Т клетки подвергаются клональной делеции, определяя тем самым толерантность к собственному антигену [Kappler J. et al., 1988; MacDonald H.R. et al., 1988b]. Такое поведение Mis, а именно стимуляция значительного числа определённых V(3+ Т клеток, позволило провести аналогию с бактериальными Sag - стафилококковыми энтеротоксинами [Marrack P. et al., 1990; White J. et al.,

1989] .

В 1990 году впервые было показано, что Mtv9 содержит ген, определяющий делецию Т клеток V{}5.2+ [Woodland D. et al.,

1990]. W. Frankel в 1991 г. подтвердил связь Mis с эндогенными Mtv и показал, что Mlsla является продуктом одного из генов Mtv7. В это же время P. Marrack et al. . [1991] показали на примере мышей C3H/HeJ, у которых наблюдается делеция Т клеток V(3l4+, что способность к элиминации Т клеток передаётся потомству алиментарно. Хорошо известно, что некоторые линии мышей, включая СЗН, инфицированы экзогенными MMTV, и вирусные частицы в большом количестве присутствуют в молоке [Bittner J., 1936]. Таким образом, было получено доказательство наличия v-Sag в геноме экзогенных вирусов. Сейчас номенклатура Mis уже не используется за исключением Sag вируса Mtv7 - Mlsla.

MMTV в отличие от других ретровирусов имеет открытую рамку считывания (ORF, open reading frame) в области LTRs. Долгое время функция кодируемого белка оставалась невыясненной, и он был единственным кандидатом на роль Sag. Действительно, клетки, трансфецированные белком ORF из экзогенного MMTV мышей СЗН, стимулировали гибридомные и наивные Т клетки CD4+V|3l4+ [Choi Y. et al., 1991]. В другой работе было показано, что в мышах, трансгенных по целому вирусу MMTV(GR) или только по белку ORF из этого вируса, одинаково делетированы Sag-специфические Т клетки vpi4+ [Acha-orbea Н. et al., 1991a].

4. Тримолекулекулярное взаимодействие Sag с МНС и TCR.

Кроме вирусных Sag, существует ещё группа бактериальных Sag (b-Sag), которые продуцируются Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes. К ним относятся стафилококковые энтеротоксины (от SEA до SEM, кроме F), стафилококковый токсин синдрома токсического шока (TSST-1), стрептококковый суперантиген (SSA) и стрептококковые пирогенные экзотоксины (SPE-A,С,G,Н и J) [Kotb М., 1998].

Многие b-Sag, такие как SEA и SEB, очень схожи по аминокислотной последовательности, тогда как TSST-1 имеет совершенно другую первичную структуру [Acha-Orbea Н. & Palmer Е., 1991b; Janeway С. et al., 1989; Marrack P. & Kappler J., 1990]. Последовательности всех v-Sag отличаются от b-Sag, но очень похожи между собой, за исключением последних 20-30 аминокислотных остатков С-концевого участка. v-Sag и b-Sag отличаются друг от друга и по третичным структурам. Если b-Sag - это секретируемые глобулярные белки массой 25 kD [Marrack P. et al., 1993], то v-Sag - это трансмембранные белки II типа. Несмотря на такую разницу в первичных и третичных структурах, биологическая активность всех Sag одинакова. Все суперантигены связываются с молекулами МНС класса II и с Т-клеточными рецепторами а/р, стимулируя при этом большой процент Т клеток, экспрессирующих определённые V(3. Однако, презентация Sag и их взаимодействие с TCR отличается от обычных пептидов по нескольким параметрам.

Прежде чем описывать молекулярные взаимодействия Sag с МНС и TCR, следует вспомнить строение самих молекул МНС и Т-клеточного рецептора. Молекула МНС класса II является гетеродимером, состоящим из двух цепей а и Р [Paul W.E., 1998]. Каждая цепь, в свою очередь состоит из двух доменов. Домены a.i и Pi образуют пептид-связывающий район, имеющий на рентгеноструктурных реконструкциях вид желобка, дно которого представляет из себя антипараллельные р-слои, а стенки образованы a-спиралями. В желобке имеется ряд полиморфных участков, с которыми взаимодействует пептид. TCR тоже состоит из а и Р цепей, каждая из которых содержит один константный и один вариабельный (V) домен. V домены обеих цепей образуют четыре CDR района (районы определяющие комплементарность). Район CDR3 содержит гипервариабельный участок (HVR), ответственный за распознавание. Известно, что CDR2 контактируют только с МНС, а CDR1 и CDR3 взаимодействуют и с молекулой МНС и с пептидом.

Во время внутриклеточного транспорта с молекулами МНС класса II происходят структурные изменения. Эти изменения выражаются в приобретении комплексами молекула МНС/пептид стабильности в буферах, содержащих SDS [Germain R.N. & Hendrix L.R., 1991; Germain R.N., 1995; Bonifac J.J. et al., 1996; Runnels H.A. et al., 1996; Rotzschke 0. et al., 1999; Sadegh-Nasseri S. et al., 1994] и изменении связывания с некоторыми из моноклональных антител [Peterson М. & Miller J., 1990; Mellins Е. et al., 1990; Chervonsky A.V. et al., 1998, Zarutskie J.A. et al., 1999]. В эндосомах при понижении рН происходит частичное нарушение третичной структуры молекулы, и она приобретает *рыхлую" конформацию [Bonifac J.J. et al.,

1996; Runnels H.A. et al., 1996]. Такое изменение облегчает удаление CLIP и связывание с пептидом. Дальнейшая ассоциация с пептидом приводит к стабилизации комплекса и формированию, так называемых "'компактных" или стабильных димеров молекул МНС. Во время SDS-PAGE молекулы МНС остаются интактными (в виде оф гетеродимеров), если пептид-связывающий район связан с пептидом [Stern L.J. & Wiley D.C., 1992]. В отсутствие антигена димеры оказываются нестабильными и диссоциируют на а и Р цепи. SDS-стабильные димеры гетерогенны, начиная от очень "плотных" и заканчивая "рыхлыми" [Chervonsky A.V. et al., 1998] . При исследовании зрелых молекул МНС класса II, представленных на поверхности клеток, оказалось, что эти молекулы тоже имеют разные конформации, определяемые природой пептида [Chervonsky A.V. et al., 1998]. Например, комплекс MHC/CLIP имеет "рыхлую" конформацию и распознаётся антителами 25-9-17 [Murphy D. et al., 1989], а комплекс молекулы Аь с пептидом из а-цепи молекулы Еь (АьрЕа) представляет из себя очень плотный димер, который распознаётся антителами Y-Ae [Ozato К. et al., 1980], но не распознаётся антителами 25-917. Для МНС класса I тоже было показано, что пептиды способны менять структуру молекул, что обнаруживается по взаимодействию с соответствующими антителами.

Влияние связывания с пептидом на конформацию молекулы МНС может быть показано и на уровне взаимодействия с рецепторами Т-клеток. В литературе описаны примеры, когда один и тот же TCR распознаёт разные пептиды в контексте разных молекул МНС класса I [Tallquist M.D. et al., 1998]. Это может говорить о сходстве конформаций разных комплексов молекул МНС с пептидами, которые распознаются Т-клеточным рецептором одинаково.

В отличие от обычных Ag b-Sag не требуют дополнительного процессинга [Marrack Р. & Kappler J., 1990; Dellabona P. et al., 1990]. Напротив, v-Sag проходят определённый путь процессинга, но пути презентации обычных Ад и v-Sag не пересекаются, и комплексы Sag/MHC II формируются на поверхности [Grigg М.Е. et al., 1998].

К настоящему моменту несколько комплексов b-Sag/MHC и Ь-Sag/TCR кристаллизованы, и исследована их структура [Jardetzky T.S. et al., 1994; Fields В.A. et al., 1996; Kim J. et al., 1994; Dessen A. et al., 1997; Li Y. et al., 2001]. Есть много работ по идентификации аминокислотных остатков молекул МНС, ответственных за связывание с Sag [Herman A. et al., 1991; Karp D.R. & Long E.O., 1992; Panina-Bordignon P. et al., 1992]. Установлено, что молекулы МНС имеют сайты низкоаффинного связывания с b-Sag на (Xi домене а цепи, и сайты связывания с высокой аффинностью, зависимые от ионов цинка (Zn2+) , на (3i домене Рцепи. Некоторые b-Sag связываются исключительно с * низко-аффинными сайтами" (SEB, TSST-1), в то время как другие контактируют и с *низко-аффинными" и с * высоко-аффинными сайтами" (SEA) или только с * высокоаффинными" (SPE-C) [Hudson K.R. et al., 1995; Kozono H. et al., 1995]. Сайты связывания некоторых b-Sag, как например SEB и TSST-1, практически полностью перекрываются [Thibodeau J. et al., 1994a; Thibodeau J. et al. 1994b], несмотря на разные последовательности этих суперантигенов. Мутационный анализ а-цепи молекулы HLA-DR1 показал, что Lys39, Val42 и Glu4 6 критичны для связывания с SEB и TSST-1. С другой стороны, SEB и SEA, имея высокую гомологию в аминокислотных последовательностях и похожие трёхмерные структуры [Jardetzky T.S. et al., 1994], взаимодействуют с разными районами молекулы МНС с низкой аффинностью [Herman A. et al., 1991; Karp D.R & Long E.O., 1992; Panina-Bordignon P. et al., 1992, Jardetzky T.S. et al., 1994]. * Низко-аффинные сайты" связывания для SEA и TSST-1 тоже отличаются [Jardetzky T.S. et al. 1996; Kozono H. et al., 1995]. В то же время *высоко-аффинный сайт" связывания с SEA (His81) аналогичен таковому для SPE-C. Вариации наблюдаются также и в количестве сайтов связывания для разных Sag. Так SEA имеет два сайта связывания с молекулой МНС, зависимых от Zn2+ [Hudson К.R. et al., 1995], a SEB и TSST-1 имеют по одному сайту связывания, не зависимые от ионов цинка [Jardetzky T.S. et al., 1994; Acharya K.R. et al., 1994].

Очень мало известно о взаимодействии v-Sag с молекулами МНС, и до сих пор не кристаллизовано ни одного комплекса v-Sag/MHC. Тем не менее, непосредственная ассоциация v-Sag с молекулами МНС класса II была продемонстрирована in vitro с использованием растворимых форм молекул МНС [Mottershead D.G. et al., 1995]. Мутационный анализ отдельных аминокислотных остатков молекул МНС класса II позволил определить, что Mtvl, например, имеет общий сайт связывания с SEA [Torres В. A. et al., 1993], а сайты связывания Sag Mtvl и Mtv9 отличаются от сайтов связывания SEA, SEB и TSST-1 [Thibodeau J. et al., 1994b].

В отличие от обычных пептидов Sag взаимодействуют с молекулами МНС класса II вне пептид-связывающего района [Dellabona P. et al., 1990]. Мутации в пептид-связывающем районе не влияют на презентацию Sag Т клеткам. Непосредственный контакт с аминокислотными остатками пептида показан только для двух суперантигенов: TSST-1 [Kim J. et al., 1994] и SPE-C [Li Y. et al., 2001], причём для TSST-1 критичны С-концевые остатки пептида [vonBonin A. et al., 1995; Wen R. et al., 1997], a SPE-C взаимодействует с N-концевой частью пептида [Li Y. et al., 2001]. Эти факты указывают на возможность связывания этих Sag с молекулами МНС класса II, зависимого от пептида. В одной из работ было подтверждено, что пептиды действительно влияют на презентацию Sag. Степень влияния оценивали по активации гибридом, реактивных к Sag [Wen R. et al., 1996] . В то время как одни пептиды усиливали презентацию TSST-1 в 5000 раз, другие способствовали презентации SEA, несмотря на отсутствие непосредственного контакта этого Sag с пептидом. В ряде случаев Sag могут влиять на распознавание комплексов молекула МНС/пептид Т клетками, непосредственно не контактируя с пептидами. Например, при исследовании способности SEA, SEB и TSST-1 влиять на стимуляцию аллоспецифических Т-клеточных клонов, было показано, что SEA сильно ингибирует ответы на молекулы DQ и DP, в то время как SEB и TSST-1 обладают очень слабой ингибирующей способностью [Mazewicz S. et al., 1993]. Другая группа авторов показала, что эти Sag могут ингибировать пептид-специфическую активацию Т-клеточного клона CL-1, распознающего пептид из гемагглютинина вируса гриппа (НА 307319) в контексте HLA-DR1 [Dowd J.E. et al., 1995]. Влияют ли пептиды, ассоциированные с молекулами МНС II, на связывание с v-Sag, неизвестно.

В распознавании суперантигенов принимают участие районы Т-клеточного рецептора, отличные от антиген-распознающих участков. В отличие от обычных комплексов МНС/пептид, комплексы МНС/Sag взаимодействуют не со всеми вариабельными компонентами TCR. В распознавании б- и v-Sag Т-клеточным рецептором основную роль играет вариабельная часть 3 цепи TCR (V3). Было показано, что HVR4 3 цепи TCR, не участвующий в ответах на обычные Ад, определяет взаимодействие с в- и b-Sag [Pullen A. et al., 1990; Choi Y. et al., 1990]. Для SEA и SEC2, например, критичны аминокислотные остатки 57-7 7, включающие HVR4 [Pontzer С.Н. et al., 1992]. CDR3, определяющий специфичность взаимодействия TCR с классическими Ад, не играет роли в распознавании Sag. Для некоторых Sag (SEB, SEC1,2,3) показано участие глицина в позиции 51, входящего в состав CDR2, в связывании TCR с Sag [Pontzer С.Н. et al., 1992]. Для вирусного Sag Mls-la показана роль аминокислотных остатков 24, 4 8 и 74, поскольку мутации этих остатков приводили к отсутствию распознавания Mls-la, но не влияли на ответы на стафилококковые энтеротоксины [Pullen А. et al., 1990]. Таким образом в- и b-Sag взаимодействуют с различными районами Т-клеточного рецептора. Взаимодействие с VP строго специфично. Каждый Sag стимулирует Т клетки, имеющие определённый VP [Irwin M.J. et al., 1993]. В отдельных случаях показано участие ос цепи TCR в распознавании как v-Sag [Vacchio M.S. et al., 1992/ Smith H.P. et al., 1992], так и b-Sag [Deckhut A.M. et al., 1994].

Итак, каждый Sag имеет свои особенности взаимодействия с молекулами МНС и TCR, но результатом этого взаимодействия всегда является vp-рестриктированная активация Т клеток.

5. Участие v-Sag в позитивной и негативной селекции.

Функциональный Т-клеточный репертуар образуется в тимусе посредством позитивной и негативной селекции. Позитивная селекция позволяет дубль-позитивным Т клеткам (CD4+CD8+) с TCR, способным взаимодействовать со слабой аффинностью с собственными молекулами МНС, дифференцироваться в зрелые Т клетки CD4+ или CD8+. Большинство Т клеток не удовлетворяет этому требованию и умирает. Некоторые Т клетки, наоборот, имеют очень сильную аффинность к собственным молекулам МНС. Такие Т клетки тоже удаляются в результате негативной селекции. Sag, кодируемые эндогенными Mtv, имеют очень высокую аффинность к VP районам TCR, поэтому тоже вызывают негативную селекцию Т клеток.

Как уже говорилось в предыдущем разделе, первичные аминокислотные последовательности разных v-Sag имеют высокую степень гомологии за исключением последних 30 аминокислотных остатков С-конца. Этот участок называется гипервариабельный район (HR), и именно он определяет vp-специфичность Sag. Все v-Sag можно разделить на несколько групп согласно последовательности HR и VP-специфичности. Например, Mtv8, Mtv9 и Mtvll, которые приводят к делеции Т клеток vpil+, имеют идентичные СООН-концы [Dyson P.J. et al., 1991]. Они, в свою очередь, отличаются от С-концов Mtvl, Mtv3, Mtv6 и Mtvl3, которые способны вызывать делецию Т клеток vp3+, VP5+ и

Vpl7(cz)+ [Pullen A. et al., 1992]. Mtv7, который имеет самый сильный Sag (Mlsla) , ответственен за делецию Т клеток Vp6+, V|37+, VP8.1+ и VP9+ [Tomonari К. et al., 1993]. В то же время, есть примеры, когда Sag с различными HR взаимодействуют с одинаковыми районами vp. Так Sag Mtv3, Mtv8 и Mtv9 взаимодействуют с Vpl7a, хотя СООН-конец Mtv3 отличается от СООН-конца Mtv8 и Mtv9 [McDaffie М. et al., 1992; Blackman M.A. et al., 1992]. Точно также Mtv6 и Mtv9 кодируют Sag, которые вызывают делецию Т клеток vp5+, не имея гомологий в СООН-концах [Gollob K.J. & Palmer Е., 1992]. Эти наблюдения могут объясняться похожими третичными структурами белков вне зависимости от первичных последовательностей.

Важно отметить, что у мышей, экспрессирующих Mtv, отсутствуют как Т клетки CD4+, так и Т клетки CD8+. Поскольку Т клетки CD8+ не могут распознавать комплекс молекула МНС II/v-Sag, делеция в тимусе, по всей видимости, происходит на дубль-позитивной стадии. Необходимо также упомянуть, что Sag, в основном, связываются с молекулой 1-Е МНС класса II. Линии мышей, не экспрессирующие I-E-молекулы, как правило, не способны презентировать Sag, и делеции Sag-реактивных Т клеток у них не происходит (подробнее см. раздел 8.3).

Что касается позитивной селекции, то в литературе имеется лишь одно указание на участие v-Sag в позитивной селекции vp. Было показано, что экспрессия Mlsla приводит к увеличению частоты Т клеток V]3l4+ [Liao N.S. & Raulet D.H., 1992]. Пока нет данных об участии лигандов, отличных от МНС, в негативной и позитивной селекции Va, хотя влияние v-Sag не исключается.

6. Экзогенные MMTV.

Существует ряд линий мышей, инфицированных экзогенными MMTV. Форм этих вирусов известно не так много, как эндогенных локусов Mtv. Sag MMTV тоже имеют различную Vp-специфичность.

Наиболее известные и-'давно изучаемые вирусы - это MMTV(C3H), продуцируемый мышами. СЗН/Не, и MMTV(GR), имеющийся у мышей GR. Sag этих вирусов специфичны к Т клеткам vpi4+ [Choi Y. et al., 1991; Acha-Orbea H. et al., 1991a].

Отдельные колонии мышей линии BALB/с инфицированы экзогенными вирусами. Так, в одной из колоний двумя независимыми группами был обнаружен экзогенный вирус, MMTV(SW) [Held W. et al., 1992; Tucek C.L. et al., 1993]. Его Sag имеет высокую гомологию с Mls-la (Mtv7) и, соответственно, ответственен за делецию Т клеток v£6+, 7+, 8.1+ и 9+.

Другая сублиния мышей BALB/c, называемая BALB/cT, инфицирована двумя MMTV, BALB 2 и BALB 14, со специфичностями к Т клеткам V32+ и V014+, соответственно [Goldman A. et al., 1995]. Самки BALB/cT были скрещены с самцами AKR, которые экспрессируют эндогенный Mtv7. Вскармливание самок BALB/c на молоке (BALB/cTx AKR)Fx привело к созданию новой сублинии -BALB/cLA, которая содержала помимо BALB 2 и BALB 14, новый экзогенный MMTV BALB LA [Piazzon I. et al., 1994]. Этот вирус оказался рекомбинантом между BALB 14 и эндогенным Mtv7 [Golovkina T.V. et al., 1997]. Sag вируса BALB LA происходит из Mtv7, поэтому этот MMTV специфичен к Т клеткам V06+.

Ещё одна известная линия мышей, II TES, инфицирована двумя вирусами MMTV(IITES2) и MMTV(IITES14), которые тоже имеют Sag, взаимодействующие, соответственно с Т клетками V02+ и VP14+ [Ando Y. et al., 1995].

7 . Жизненный цикл MMTV.

Жизненный цикл MMTV тесно связан с иммунной системой хозяина, которая, как это ни парадоксально, помогает вирусу в процессе инфекции. Как уже говорилось, MMTV передаётся кормящимся детям с молоком матери. Через желудочно-кишечный тракт вирус попадает в Пейеровы бляшки (лимфатические органы кишечника). Там происходит инфицирование В клеток. Sag презентируется в комплексе с молекулами МНС класса II на поверхности инфицированных клеток, взаимодействует с отдельными популяциями Т клеток CD4+, имеющих TCR с определёнными районами Vp, к которым специфичен данный Sag, и активирует эти Т клетки. Частота Sag-реактивных Т клеток составляет от 2 до 20%, что превышает частоту предшественников, отвечающих на классические комплексы МНС/пептид [Acha-Orbea Н. et al., 1999]. Т клетки затем стимулируют больше В клеток, а В клетки, в свою очередь, больше Т клеток. Таким образом, создаётся пул пролиферирующих клеток, за счёт которого происходит амплификация вируса. Впоследствии происходит клональная делеция Sag-специфических Т клеток.

На последнем этапе жизненного цикла MMTV транспортируется инфицированными лимфоцитами в молочную железу, попадает в эпителиальные клётки и встраивается в геном. Интеграция происходит случайным образом, и когда MMTV оказывается рядом с клеточным протоонкогеном, происходит индукция образования опухолей. Во время лактации зрелые вирусные частицы попадают в протоки МЖ, и цикл начинается заново.

В последующих разделах отдельные этапы жизненного цикла будут рассмотрены подробнее.

8. Факторы, определяющие развитие инфекции MMTV.

8.1 SAG.

Инфекция MMTV - это многоэтапный процесс, который зависит от выполнения ряда условий. Как уже неоднократно упоминалось, с помощью Sag MMTV осуществляет взаимодействие с клетками иммунной системы. Долгое время было неизвестно, является ли это взаимодействие неотъемлемой частью жизненного цикла MMTV, или есть какие-то альтернативные возможности инфекции. Доказательство необходимости Sag было получено на трансгенных f мышах C3H/HeN, которые экспрессировали провирус MMTV с мутацией в области Sag, которая в результате сдвига рамки считывания приводила к появлению стоп-кодона и отсутствию функционального Sag [Golovkina T.V. et al., 1995]. Однако, при скрещивании трансгенных мышей с нетрансгенными уже в следующем поколении в нетрансгенных потомках функция Sag была восстановлена за счёт рекомбинации с эндогенным провирусом Mtvl, присутствующим в геноме мытттей C3H/HeN. Эти данные указывают на наличии селекции, направленной на отбор MMTV с функциональным суперантигеном. Для того, чтобы показать, что MMTV без Sag является неинфекционным, трансгенных мышей скрестили с мышами BALB/c {Mtvl') [Golovkina T.V. et al., 1998a] . Ни одна из Mtvl~ мышей, вскормленных на молоке, содержащем дефектный вирус, не инфицировалась.

Интересно, что в лимфоидных органах таких мышей была обнаружена ДНК интегрированных провирусов, что указывает на то, что интеграция вируса в геном происходит независимо от Sag. В другой работе для выяснения роли Sag блокировали синтез вирусных белков, используя ингибитор обратной транскриптазы AZT (3'-азидо-31-деокситимидина) [Held W. et al., 1994]. Было установлено, что у мышей, предварительно получивших инъекцию AZT, не наблюдается пролиферации и делеции Sag-специфических Т клеток в регионарных лимфатических узлах после введения инфицированного молока в подушечки лап, в то время как провирусная ДНК обнаруживается в лимфоцитах. Таким образом, функция Sag, по всей видимости, не нужна на начальных стадиях инфекции, но абсолютно необходима для последующей амплификации вируса и попадания его в молочную железу.

8.2 Роль В и Т лимфоцитов в инфицировании MMTV.

Бестимусные (nude) или неонатально тимектомированные мыши, у которых отсутствуют Т клетки, не инфицируются MMTV [Squartini F. et al., 1970; Tsubura A. et al., 1988]. Ключевую роль в инфицировании играют именно Sag-реактивные Т клетки. Строгая зависимость инфекции от Sag-специфических Т клеток была продемонстрирована на мышах, экспрессирующих эндогенные Mtv или трансгенный Sag, в которых происходит клональная делеция Sag-специфических Т клеток CD4+CD8+ [Golovkina T.V. et al., 1992/ Held W. et al., 1993]. Мыши MTV-ORF, трансгенные no Sag из экзогенного вируса MMTV(C3H), не имеют Т клеток vpi4+. В результате вирус MMTV(C3H) не может инфицировать трансгенных мышей [Golovkina T.V. et al., 1992]. Аналогично в мышах BALB.D2, экспрессирующих эндогенный Mtv7, делетированы Т клетки Vp6+. Эти мыши не заражаются вирусом MMTV(SW), тоже имеющим Sag с vpe'''-специфичностыо [Held W. et al., 1992].

Функциональные В клетки тоже необходимы при инфекции MMTV, поскольку мыши, не имеющие В клеток из-за делеции в трансмембранной области тяжёлой цепи IgM не инфицируются MMTV [Beutner U. Et al., 1994]. Более того, в работе Held et al. [Held W. et al., 1993b] было показано, что инъекция экзогенного MMTV в подушечки лап вызывает мощную пролиферацию В клеток, которая зависит от присутствия и активации Т клеток, специфичных к Sag. Это свидетельствует о необходимости Т-В-клеточных взаимодействий при инфекции MMTV. Механизм этого взаимодействия стал понятен, когда обнаружили, что мыши с нокаутированным геном CD4 0L резистентны к инфекции [Chervonsky А. V. et al., 1995].

Последовательность событий при инфекции MMTV, скорее всего, напоминает клеточный ответ на обычные Ад. АПК стимулируют Т клетки, в которых индуцируется экспрессия CD40L. Через взаимодействие CD4 0L с CD4 0, экспрессирующимся на В клетках, происходит активация В клеток. На В клетках в результате этого увеличивается плотность поверхностной экспрессии молекул семейства В7(В7-1, В7-2), которые, в свою очередь, через рецептор CD2 8 стимулируют Т клетки, создавая таким образом пул пролиферирующих Т и В клеток, необходимый для репликации вируса.

Следует отметить, что участие CD2 8 в инфекции MMTV остаётся спорным. С одной стороны, используя трансгенных мышей mCTLA4-Hyl, доказано, что клеточные взаимодействия, зависимые от В7, критичны для развития инфекции. CTLA4, как известно, тоже является рецептором для В7. Более того, аффинность взаимодействия В7 и CTLA4 выше, чем B7/CD2 8. У трансгенных мышей наблюдается высокий уровень секреции продукта трансгенного локуса, поэтому все возможные молекулы В7 оказываются заблокированы. В результате у мышей mCTLA4-Hyl сильно подавлены активация Т и В клеток, дифференцировка В клеток и делеция Sag-специфических клеток при инфекции MMTV [Champagne Е. et al., 1996]. С другой стороны мыши, дефицитные по CD2 8, чувствительны к MMTV [Palmer L.D. et al., 1996]. Скорее всего, это говорит о наличие других рецепторов, компенсирующих отсутствие CD2 8.

Т и В лимфоциты оказываются необходимыми также и для инфицирования молочной железы, поскольку инъекция вируса напрямую в молочную железу не приводит к инфекции, если у мышей отсутствуют В клетки или Т клетки, специфичные к Sag [Golovkina T.V. et al., 1998а]. И T и В лимфоциты инфицируются вирусом и способны образовывать вирусные частицы [Dzuris J.L. et al., 1999] и передавать инфекцию [Waanders G.A. et al., 1993]. Однако, к моменту, когда эпителиальные клетки МЖ начинают пролиферировать, Т клетки уже делетированы. Поэтому наиболее вероятно, что MMTV переносится в молочную железу именно В клетками, а Т клетки необходимы для амплификации вируса.

8.3 Молекулы, участвующие в презентации Sag.

Молекулы МНС класса II.

Презентация Sag невозможна без молекул МНС класса II. Например, распознавание v-Sag Т клетками блокируется mAb к молекулам МНС II [Peck А.В. et al., 1977]. В мышах, дефицитных по МНС класса II, экспрессирующих Mtvl, не происходит делеции Т клеток, специфичных к Sag, а В клетки этих мышей не стимулируют Т гибридомы, реактивные к Sag [Beutner U. Et al., 1996] . Молекулы МНС класса II экспрессируются в виде гетеродимеров AaA0 (I-A) или ЕаЕР (1-Е) . Среди молекул МНС класса II существует иерархия по способности презентировать Sag. Лучше всего Sag связывается с 1-Е, и в большинстве случаев экспрессия этой молекулы является необходимым условием для презентации [Acha-Orbea Н. et al., 1991а; Kappler J. et al., 1988; Marrack P. et al., 1993]. Так у трансгенных мышей I-E~MMTV(GR) (гаплотип Н^2Ь) не наблюдается клональной делеции Т клеток, специфичных к Sag даже в возрасте 1 года, в то время как скрещивание с мышами, экспрессирующими 1-Е, приводит к делеции [Acha-Orbea Н. et al., 1993; Acha-Orbea Н. et al., 1991a]. Кроме того, отсутствие 1-Е сказывается на инфицировании MMTV. Например, вирус MMTV(C3H) не может инфицировать мышей C57BL/6J (Н-2Ь 1-Е") , но экспрессия Еа в виде трансгена восстанавливает чувствительность к вирусной инфекции [Pucillo С. et al., 1993]. Более того, аллельные формы молекулы I-A тоже по-разному презентируют Sag. Наименее эффективной является молекула I-Aq [Marrack P. et al., 1993]. У мышей гаплотипа H-2q, экспрессирующих Mtvl, даже не наблюдается делеции Т клеток [MacDonald H.R. et al., 1988а; Anderson G.D. et al., 1989]. Зависимость b-Sag от молекул МНС класса II, видимо, менее строгая, поскольку в ряде случаев была показана активация Т клеток без их участия [Hamad A.R. et al., 1994; Avery А.С. et al., 1994]. Тем не менее, b-Sag, так же, как и v-Sag, лучше презентируются в комплексе с 1-Е [Marrack P. et al., 1993]. Что касается человеческих молекул МНС класса II, то из трёх вариантов b-Sag предпочитают HLA-DR (которая имеет 75% гомологии с мышиной 1-Е), несколько хуже связываются с HLA-DQ и имеют слабую аффинность к HLA-DP [Marrack P. et al., 1993].

Env.

Участие белка Env в презентации Sag было показано с использованием трёх трансгенных мышей: MTV-ORF экспрессируется только Sag вируса MMTV(C3H) [Golovkina T.V. et al., 1992]), LEL (экспрессируются LTRs и env [Golovkina T.V. et al., 1994a]) и HYB PRO (экспрессируется полный гибридный провирус, включая гены LTRs, gag, pol и env [Shackleford G.M. & Varmus H.E., 1988]). Оказалось, что в отличие от спленоцитов мышей LEL и HYB PRO, спленоциты мышей MTV-ORF не способны стимулировать наивные лимфоциты лимфатических узлов и селезёнки и активировать гибридомы, специфичные к Sag [Golovkina T.V. et al., 1994а]. Уровень транскрипции Sag был одинаковым у всех мышей, что указывает на участие других генов MMTV в презентации Sag. Гены gag и env, входящие в состав гибридного провируса, происходят из эндогенного Mtvl, который присутствует также и у мышиной линии C3H/HeN, на основе которых сделаны мыши MTV-ORF. Поэтому единственным кандидатом был ген env. Действительно, антитела к др52 блокировали ответ на АПК из LEL и HYB PRO на 50-75%. Конкретная роль Env в презентации пока не выяснена, но Env может, например, стабилизировать комплекс МНС/Sag или являться костимулирующим лигандом, взаимодействуя с неизвестным рецептором на поверхности Т клеток.

Костимуляторные молекулы.

Участие пар CD4 0/CD4 0L и B7/CD2 8 было рассмотрено в разделе 8.2. Для презентации b-Sag SEC была показана возможная роль адгезионных молекул VLA-4/VCAM-1. SEC, в отличие от других стафилококковых энтеротоксинов, имеет последовательность из б аминокислот, которая идентична последовательности одного из доменов VCAM-1 [Cantor Н. et al., 1993], что может указывать на возможное взаимодействие SEC с

VLA4. При сравнении клеточных линий, экспрессирующих и не экспрессирующих VLA4, по способности презентировать SEC, оказалось, что мышиные линии Р815 и М12 и человеческая линия Jurkat (VLA-4+) чувствительны к SEC-зависимому лизису, а мышиная линия EL4 и человеческая линия К562 (VLA-4") не чувствительны. Другая молекула, играющая определённую роль при активации Т клеток, адгезионная молекула LFA-1, может быть тоже задействована при презентации Sag . В пользу этого свидетельствует, во-первых, отсутствие делеции Т клеток vpi7a+, специфичных к Sag Mtv9 у мышей С57Вг, получивших инъекцию антител к LFA-1 [Quddus J. et al., 1994], а, во-вторых, подавление пролиферации и секреции IL-2, опосредованной Sag, антителами к LFA-1 in vitro [De Waal Malefyt R. et al., 1993].

9. Как MMTV попадает в организм?

Вирусы попадают в клетки, связываясь с клеточными рецепторами посредством белка Env. Для многих вирусов эти рецепторы известны. Ранее было показано, что MMTV может связываться с клетками многих тканей, включая слюнные железы, яичники, надпочечники, печень, но больше всего вирусных частиц связывается с клетками молочной железы и селезёнки, что коррелирует с экспрессией MMTV только в МЖ, лимфоидных органах и в некоторых эпителиальных клетках [Ross S., 1997]. Рецептор MTVR был клонирован недавно [Golovkina T.V. et al., 1998b]. Было показано, что MTVR экспрессируется во многих тканях, что не соответствует ограниченному числу типов клеток, инфицируемых MMTV. На этот счёт есть несколько предположений. Возможно, что в некоторых типах клеток блокируются последующие стадии инфекции, или MMTV использует дополнительный корецептор для попадания в клетку, который не экспрессируется убиквитарно. Альтернативное объяснение тканеспецифичной инфекции MMTV, это блокирование на уровне транскрипции. Даже если вирус инфицирует клетку и интегрирует в геном, экспрессии вирусных генов не произойдёт. Недавно было получено подтверждение тому, что транскрипция контролируется в разных тканях по-разному. Большинство эндогенных Mtv экспрессируется как в лимфоидной ткани, так и в МЖ. Но некоторые Mtv транскрибируются только в лимфоидных клетках [Ross S. et al., 1997]. Сравнивая аминокислотные последовательности Mtv, специфического для лимфоидной ткани, и экзогенного рекомбинантного MMTV, была обнаружена лишь одна замена в области LTR [Qin W. et al., 1999]. Этот участок соответствовал месту связывания с транскрипционным фактором STAT5. Мыши с нокаутированными генами STAT5a или STAT5b имели очень низкий уровень транскриптов MMTV в МЖ, но не в лимфоидных тканях. Таким образом, транскрипционные факторы семейства STAT могут участвовать в контроле тканеспецифичной экспрессии MMTV. Убиквитарная экспрессия MTVR может говорить о роли этой молекулы в нормальном функционировании клеток. Является ли MTVR единственным рецептором^неизвестно.

Экзогенный MMTV попадает в организм с молоком матери через желудочно кишечный тракт. В тонком кишечнике есть специализированные лимфоидные образования, называемые Пейеровыми бляшками. Они окружены эпителием, ассоциированным с фолликулами (ФАЭ). ФАЭ состоит из энтероцитов (эпителиальных клеток кишечника) и М клеток. М клетки способны *проводить" патогены через цитоплазму к базальной мембране, которая имеет глубокие инвагинации, позволяющие близкий контакт с лимфоцитами и макрофагами. Недавно было показано, что MMTV попадает в Пейеровы бляшки именно через М клетки [Golovkina T.V. et al., 1999]. На 5-й день после рождения в Пейеровых бляшках уже можно обнаружить активацию Т клеток, специфичных к Sag [Karapetian О. et al., 1994]. Ответ достигает максимума на 6-9 день. В этот период ДНК интегрированных провирусов можно обнаружить только в Пейеровых бляшках. На 14-й день слабая амплификация наблюдается в мезентериальных лимфатических узлах, а позднее во всех остальных лимфоидных органах. При более детальном исследовании клеточных популяций, содержащих интегрированные провирусы, оказалось, что провирусная ДНК и экспрессия вирусной мРНК на начальных стадиях инфекции наблюдается только в В клетках. [Held W. et al., 1993b; Held W. et al., 1994]. На этих данных была основана гипотеза о том, что первыми мишенями MMTV являются В клетки.

Однако, существуют факты, указывающие на возможность участия других клеточных популяций в инициации ответа на Sag и примировании Т клеток. Например, непосредственная ассоциация клеток специфичных к Sag с дендритными клетками была показана на 3 день после инъекции MMTV взрослым мышам в подушечки лап [Luther S.A. et al., 1997]. Такая ситуация очень напоминает Т клеточные ответы на обычные Ад, при которых дендритные клетки являются первыми АПК, презентирующими Ад и активирующими Т клетки [Steinman R.M., 1991]. Другой пример демонстрирует, что В клетки не являются необходимыми для презентации эндогенных Sag. У мышей, экспрессирующих Mtv и дефицитных по В клеткам, наблюдается делеция Т клеток специфичных к Sag [Beutner U. et al., 1994]. Аналогично у мышей нокаутов по CD40L происходит нормальная делеция Т клеток, вызванная экспрессией трансгенного Sag [Chervonsky A.V. et al., 1995]. Конечно делеция на эндогенные Sag, происходящая в тимусе, может отличаться от механизмов периферической активации и делеции при инфекции экзогенным MMTV. Но в любом случае В лимфоциты -не единственные клетки, способные презентировать Sag Т клеткам.

10. Цитотоксические ответы при инфекции MMTV.

Большинство вирусных инфекций сопровождается активацией цитотоксических Т лимфоцитов (ЦТЛ) и последующей элиминацией вируса. При инфекции MMTV, напротив, не возникает эффективных цитотоксических ответов.

In vitro было показано, что при стимуляции Т лимфоцитов лимфатических узлов мышей BALB/c спленоцитами конгенных MtvT мышей BALB.D2 образовывались Sag-реактивные Т клетки CD8+, секретирующие IFN-y и пролиферирующие в ответ на MtvT, но не обладающие цитотоксической активностью [Herrmann Т. et al., 1992]. Это было удивительным, поскольку порог индукции цитотоксичности обычно ниже, чем порог секреции цитокинов или пролиферации [Valitutti S. et al., 1996; Hemmer A. et al., 1991]. При исследовании примирования T клеток CD8+ in vivo было показано, что во время первых 12 дней после введения вируса не наблюдается значительного увеличения процента Т клеток, как экспрессирующих Sag-специфические TCR, так и посторонние [Acha-Orbea Н. et al., 1999]. Для сравнения, на начальной стадии инфекции LCMV детектируется, по одним данным, 4 0% активированных вирус-специфических Т клеток CD8+ [Gallimore А. et al., 1998], по другим данным, 50-70% [Murali-Krishna К. et al., 1998]. Во время первичного ответа на EBV обнаруживается более 40% антигенспецифических Т клеток CD8+ [Callan M.F. et al., 1998], а при инфекции HIV - до 70% [Pantaleo G. et al., 1994]. Кроме того, в присутствии MMTV не наблюдается экспрессии активационных маркёров [Acha-Orbea Н. et al., 1999] . Поэтому, в сравнении с другими вирусами, ответ на MMTV оказывается невероятно низким.

Наличие слабых ЦТЛ также описано у мышей, имеющих опухоли МЖ [Blair Р.В. & Lane М.А., 1975; Wei W.Z. et al., 1986]. В некоторых работах проводились попытки индуцировать цитотоксические Т клетки CD8+ in vitro на конкретные пептиды из белка Env MMTV [Malarkannan S. et al., 1996; Wei W.Z. et al., 1996]. Введение этих ЦТЛ мышам перед введением опухолевых клеток приводило к замедлению роста опухоли.

Многие вирусы используют всевозможные стратегии, чтобы избегать ответа ЦТЛ, в основном ингибируя транспорт молекул МНС класса I на поверхность клеток [Andersson М. et al., 1985] или нарушая процесс презентации вирусных антигенов [Rotem

Yehudar R. et al., 1996; Gilbert M.J. et al., 1996]. В случае MMTV было показано, что экспрессия молекул МНС класса I даже немного повышается на инфицированных В клетках [Acha-Orbea Н. et al., 1999], так что подавление экспрессии молекул МНС класса I не является причиной слабых ответов ЦТЛ. Возможным объяснением может быть присутствие эндогенных Mtv, которое, скорее всего, приводит к частичной толерантности к антигенам MMTV, поскольку вирусные белки высоко гомологичны среди разных вариантов MMTV. Действительно, при вирусной инфекции у мышей, экспрессирующих Mtv, титр вируса и количество продуцируемых антител были в 100 раз ниже, чем у мышей, не имеющих эндогенных Mtv [Acha-Orbea Н. et al., 1999]. Пока неизвестно, использует ли MMTV какие-то дополнительные механизмы для того, чтобы избежать цитотоксического ответа иммунной системы.

11. Судьба Т клеток после встречи с Sag.

Как уже неоднократно отмечалось, эндогенные Sag Mtv вызывают клональную делецию популяций Т клеток, к которым специфичен данный Sag. На примере Mls-la было показано, что в первые дни после рождения часть Эад-реактивных Т клеток ещё присутствует в тимусе и на периферии, но к 10 дню наблюдается полная элиминация Т клеток V(36+ [Schneider R. et al., 1989].

Оказывается, Sag индуцируют клональную делецию и на уровне зрелых Т клеток на периферии. Так, при переносе Mls-la + спленоцитов мыши, не экспрессирующей Mls-la, наблюдается пролиферация, приводящая к увеличению Т клеток V|36+ до 30-4 0% (по сравнению с начальным уровнем 10%) на 2-4 день после переноса. Через три недели количество клеток, специфичных к Sag, падает до 2-3% [Webb S.R. & Sprent J., 1993].

Аналогичная ситуация наблюдается при инфекции экзогенными MMTV. Кинетика делеции отличается для разных MMTV. Например, MMTV(СЗН) и MMTV(GR) вызывают медленную делецию Т клеток, которая продолжается в течение нескольких месяцев [Ignatowicz

L. et al., 1992; Choi Y. Et al., 1991; Acha-Orbea H. et al., 1991a]. Медленная делеция объясняется тем, что Sag почти всех экзогенных вирусов слабее чем Mls-la, и они не вызывают сильных ответов в MLR. Исключение составляет MMTV(SW), Sag которого имеет высокую степень гомологии с Mls-la. У мышей, инфицированных неонатально естественным путём, полная делеция (остается менее 0.5% Т-клеток, реактивных к Sag) наблюдается в возрасте б месяцев [Held W. et al., 1992; Tucek C.L. et al., 1993]. А инфицирование взрослых мышей этим вирусом приводит вначале к значительной пролиферации Т клеток vp6+, а затем к почти полной делеции (1.5%) уже через б недель [Held W. et al., 1992]. Здесь следует отметить, что при инфекции экзогенными вирусами естественным путём, т.е. неонатально, происходит элиминация обеих популяций Т клеток (CD4+ и CD8+) , что говорит о передаче Sag в тимус, где делеция происходит на дубль-позитивной стадии развития тимоцитов. Однако, у взрослых мышей, получивших инъекцию вируса или инфицированных спленоцитов, исчезают только Т клетки CD4+.

При встрече с b-Sag тоже наблюдается мощная пролиферация Т клеток, специфичных к Sag, и последующая их элиминация [Webb S.R. et al., 1990; Kawabe Y. & Ochi A., 1991; MacDonald H.R. et al., 1991]. При этом in vitro наблюдалась фрагментация ДНК [Kawabe Y. & Ochi A., 1991], из чего был сделан вывод, что клетки погибают по механизму апоптоза. А поскольку делеции Т клеток, реактивных к Sag, как правило, предшествует пролиферация, то считают, что гибель является естественным следствием пролиферации. Однако, существуют данные, свидетельствующие о том, что делеция и пролиферация это необязательно взаимосвязанные процессы. Во-первых, делеция, опосредованная Sag, была также отмечена в отсутствие значительной пролиферации [McCormack J.E. et al., 1993; Waanders G.A. et al., 1993]. Второй пример демонстрирует, напротив, отсутствие делеции Т клеток, отвечающих одновременно на Sag и обычный Ag [McCormack J.E. et al., 1994]. Пептид цитохрома С голубя (pcytC) в контексте I-Ek распознаётся Т клетками Vp3+Vall+. SEA тоже взаимодействует с Т клетками Vp3+. Было показано, что одновременное введение pcytC и SEA мышам B10.Br (Н-2к) приводит к делеции значительной части популяции V03+ за исключением Т клеток Vp3+Vall+. Предполагается, что Sag даёт очень сильный сигнал отвечающей Т клетке, который в отсутствие дополнительных сигналов ведёт к ее гибели. Наличие второго сигнала, в данном случае исходящего от АПК, презентирующих pcytC, может "спасти" клетку от делеции, опосредованной Sag.

При нормальном ответе на Sag без участия каких-либо посторонних антигенов часть Т клеток специфичных к Sag, всё-таки избегает делеции. Оказалось, что в первое время после пролиферации в ответе на Sag эти клетки не способны отвечать на него, что похоже на состояние анергии [Webb S.R. & Sprent J., 1993]. Однако, через 1 год после первой встречи с Sag, оставшиеся клетки способны пролиферировать в ответ на него, но пролиферация быстро снижается, отсутствует продукция IL-2 и экспрессия CD25 (рецептор IL-2). Другая группа исследователей обнаружила, что у мышей BALB/c, инфицированных MMTV(SW), есть небольшое количество Т клеток Vp6+CD25+ [Papiernik М. et al., 1997]. Но эти клетки экспрессируют супрессорные цитокины IL-4 и IL-10. Предполагается, что во время делеции удаляются Т клетки с высокооафинными рецепторами, а оставшаяся популяция обладает низкой аффинностью к Sag.

Элиминация Т клеток, отвечающих на Sag, после фазы пролиферации согласуется с тем, что большинство эффекторных клеток, возникающих в ответах на вирусные инфекции, являются относительно короткоживущими [Webb S.R. & Sprent J., 1993]. Парадокс, однако, состоит в том, что встреча с вирусами (и с другими Ад) обычно приводит к индукции Т-клеточной памяти, в то время как суперантигены индуцируют толерантность.

12. Роль MMTV в канцерогенезе молочной железы.

MMTV является онковирусом, вызывающим образование аденокарцином молочной железы. MMTV не кодирует онкогена. Индукция образования опухолей происходит после интеграции провирусной ДНК рядом с клеточными протоонкогенами и активации их транскрипции [NusseR., 1988]. Интеграция MMTV в геном не является сайт-специфической и происходит случайным образом. Поэтому чем больше продуцируется вируса, тем выше вероятность встраивания провирусной ДНК рядом с протоонкогеном. В области LTR MMTV имеются специфические последовательности, так называемые респонсивные элементы, для связывания с гормонами лактации, в частности прогестероном и глюкокортикоидами [Yamamoto K.R., 1985]. Поэтому во время беременности продукция вируса сильно возрастает [Nandi S. & McGrath С.М., 1973]. Показано, что у нерожавших мышей частота возникновения опухолей ниже, чем у самок, рожавших много раз [Nandi S. & McGrath С.М., 1973] .

Механизм канцерогенного действия MMTV связан с генами int. Наиболее изучены гены int-1 и int-2. Обычно опухоли экспрессируют либо int-1, либо int-2, но у некоторых линий мышей эти гены экспрессируются вместе. Активация int это ранний этап канцерогенеза. Онкогенные свойства int-1 были показаны в экспериментах, где с помощью трансгена трансформировали клеточные линии, полученные из МЖ. [Brown A.M.С. et al., 1986; Rijsewijk F. et al., 1987a]. Трансформированные клетки могли расти в большей плотности, нежели нетрансформированные. Позднее на трансгенных мышах, экспрессирующих int-1, было показано развитие опухолей МЖ и у самок и у самцов [Tsukamoto A.S. et al., 1988].

В норме гены int не экспрессируются во взрослом организме мышей, за исключением яичек, где int-1, видимо, принимает участие в созревании спермы [Shackleford G.M. & Varmus Н.Е., 1987]. Однако, экспрессия int наблюдается во время развития в мышиных эмбрионах. Ген int-1 экспрессируется между 8 и 14 днями эмбрионального развития и играет определённую роль в формировании нервной трубки. Функции int-1, видимо, связаны не с пролиферацией, а с дифференцировкой. Ген int-2 экспрессируется примерно до 9 дня эмбрионального развития и принимает участие в миграции клеток во время гаструляции [Wilkinson D.G. et al., 1988]. Позднее было показано, что int-2 принадлежит к семейству факторов роста фибробластов (FGF) [Shakleford G.M. et al., 1993; Lee F.S. et al., 1995].

Гомолог int-1 имеется у Drosophyla, это ген wingless. Он необходим для морфогенезе на разных стадиях развития [Rijsewijk F. et al., 1987Ь]. Сейчас ген int-1 называется Wnt-1. MMTV активирует также гены int-3, int-4 и int-41, функция которых в норме не известна [Nusse R., 1988]. Интересно, что другие протоонкогены не индуцируются MMTV. А гены int, в свою очередь, никогда не экспрессируются в других опухолях [Nusse R., 1988].

Каков механизм действия генов int при канцерогенезе? Предполагается, что, как и в развитии, гены int действуют не как митогенные факторы роста, а в качестве морфогенных факторов, которые ведут к неправильному росту тканей с нестабильными клеточными популяциями. Опухоли, индуцируемые MMTV, в основном, появляются у мышей после нескольких циклов гормональной стимуляции во время беременности. А гормоны сами по себе вызывают массивную пролиферацию клеток МЖ. Во время гормон-зависимой фазы канцерогенеза гены int уже активированы [Peters G. et al., 1986; Mester J. et al., 1987], но опухолевые клетки всё ещё зависимы от стимуляции гормонами. Другой предполагаемый механизм основан на ряде наблюдений. Во-первых, было показано, что FGF может задерживать клеточное старение [Gospodarowicz D. et al., 1987]. Во-вторых, отсутствие функции wingless ведёт к смерти клеток [Perrimon N. & Mahowald А.P., 1987]. Поэтому после лактации может происходить задержка клеточной смерти, и такие клетки будут значительно легче подвергаться трансформации.

13. Другие вирусы, экспрессирукщие Sag.

MMTV это не единственный вирус, имеющий Sag. Развитие синдрома иммунодефицита мышей, вызываемого вирусом лейкоза мышей (MuLV), ассоциировано с быстрой активацией и пролиферацией Т клеток CD4+vp5+, которая зависит от присутствия В клеток [Hugin A.W. et al., 1991]. Пролиферация in vitro блокируется шАЬ, специфичными к продукту гена gag рЗО, что указывает на суперантигенные свойства этого белка.

Многие исследования демонстрируют участие Sag при инфекции вирусом HIV-1. Так, при изучении репертуара Т клеток пациентов, инфицированных HIV, обнаруживается отсутствие определённых vp-популяций Т клеток [Imberti L. et al., 1991]. В других случаях, наоборот, наблюдается селективная пролиферация Т клеток CD4+Vpl2+ [Laurence J. et al., 1992]. Более того, HIV-1, в основном, инфицирует именно эту популяцию Т клеток in vivo. По последним данным неизвестный белок цитомегаловируса из семейства вирусов герпеса является причиной селективной репликации HIV-1 [Dobrescu D. et al., 1995].

Более 90% взрослых людей инфицированы вирусом Эпштейн-Барра (EBV). In vitro при ответе на В клетки, инфицированные литической формой EBV, была показана строгая зависимость от молекул МНС класса II и активации Т клеток vpi3+ [Sutkowski N. et al., 1996], что указывает на экспрессию Sag инфицированными В клетками.

Ещё один вирус, кодирующий белок со свойствами Sag, это вирус бешенства. Белок NC этого вируса способен стимулировать пролиферацию Т клеток VP8+, причём презентация NC не требует процессинга. NC связывается с различными МНС класса II независимо от аллеля [Lafon М. et al., 1992]. В комплексе эти данные свидетельствуют о том, что белок NC является экзогенным Sag.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Используемые материалы.

Лабораторные животные.

В работе использованы мыши инбредных линий, полученные из вивария Лаборатории Джексона (Бар Харбор, США): BALB/cJ, CBA/CaJ, СБА/J, DBA/2J, I/LnJ, FVB/NJ, LP/J, Dl.LP/J, C57BL/6J, 129/J. Кроме того использованы нокауты по молекуле DM (DM КО [Martin W.D. et all, 1996]) и инвариантной цепи (Ii КО [Viville S. et all, 1993]), трансгенные мыши (AbEp [Ignatowicz L. et all, 1996], MTV-ORF [Golovkina T.V. et all, 1992] и HP [ Shakleford G.M. et all, 1993]) и линии мышей, инфицированные MMTV (C3H/HeN, C3H/HeJ, BALB/cLA).

Буферы.

STE 0.1M NaCl, 0.01M Tris (pH8.0), 0.001M EDTA

ТЕ 0.01M Tris (pH8.0), 0.001M EDTA

SSC 10X 87.65r NaCl и 44.lr Na-cytrate на 1л H20

ТВЕ 5Х 54г Tris (рН8.0), 27.5г борной кислоты и 20мл 0,5М EDTA

ТАЕ 50Х 242г Tris (рН8.0), 57.1мл уксусной кислоты и 100мл 0,5М EDTA

Антитела.

Неконьюгированные антитела: против МНС II - Y3JP (IgG2a,K), 25-9-17 (IgG2a,K) [Ozato К. et all, 1980] и Y-Ae [Murphy D. et all, 1989], против CD8 [клон 53-6.72 (IgG2a,K>]n CD4 [клон GK1.5 (IgG2b,K)].

Коньюгированные антитела: анти-Fc/FITC (2.4G2, Sigma, USA), анти—CD4 / РЕ (H129.19, Sigma), анти-СВ4/ПТС (H129.19, Sigma), анти-С08/РЕ (53-6.7, Sigma), анти-СОЗ/РЕ (145-2C11, PharMingen, USA), анти-Мас1/РЕ (Ml/70, PharMingen), анти-Grl/PE (RB6-8C5, PharMingen), анти-TCRp/PE (H57-597, PharMingen), анти-В220/РЕ (RA3-6B2, PharMingen) и

TCRVp-специфические mAb, коньюгированные с FITC (PharMingen): aHTH-Vp6 (RR4-7), aHTH-Vp2 (B20.6), aHTH-vpi4 (MR14-2).

Выделение ДНК.

Ткань органа (100-200 мг), из которого выделяли ДНК, помещали в 2 мл лизирующего буфера, содержащего 1% SDS и 300 мкг/мл протеиназы К в буфере STE, гомогенизировали и инкубировали при 55°С в течение 1бч. Непосредственно для выделения ДНК отбирали 200 мкл лизата, добавляли 200 мкл STE и 4 00 мкл фенол-хлороформа (1:1 по объёму) и экстрагировали ДНК при б0Од в течение 5 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, переносили в чистую пробирку Эппендорфа и повторяли экстракцию ещё два раза. После этого ДНК осаждали, добавляя 2.5 объёма 96% этанола (-20°С) , центрифугировали бООд 5 мин, промывали 70% раствором этанола и растворяли в буфере ТЕ. Концентрацию определяли, измеряя оптическую плотность при длине волны 2 60 нм.

Выделение РНК.

Все растворы для работы с РНК, включая воду, предварительно обрабатывали 0.1% DEPC (ингибитор РНКаз).

Желудки 1-2-дневных мышей, наполненные молоком, или лактирующие молочные железы (ЛМЖ) гомогенизировали в 3 мл лизирующего буфера, содержащего (на 100 мл раствора) 60 г гуанидинтиоцианата, 0.5 г лаурилсаркозилата натрия, 5 мл ацетата натрия (1М, рН7) и 0.5 мл (3-меркаптоэтанола. В центрифужные пробирки помещали 2 мл раствора хлорида цезия (5.7М CsCl2 в 0.05М EDTA) и наслаивали на него гомогенизированный лизат. Центрифугировали при 90000 g в течение 16-2 0 часов при 25°С. Аккуратно удаляли надосадочную жидкость, содержащую фракции белков и ДНК. Осадок, представляющий из себя РНК, разводили в 3 00 мкл воды, аккуратно переносили в пробирку Эппендорфа и прогревали при 65°С в течение 10 мин до полного растворения РНК. Затем, предварительно отобрав 5 мкл для определения концентрации, добавляли 30 мкл (0.1 объёма) ЗМ ацетата натрия (рН4.8-5.2) и 750 мкл (2.5 объёма) этанола (-20°С) , тщательно перемешивали и хранили при -2 0°С. Концентрацию определяли, измеряя оптическую плотность при длине волны 2 60 нм.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью Taq-полимеразы (GIBCO/BRL, USA) в буфере (с МдС12) , прилагаемом фирмой-производителем, в присутствии 2мМ dNTP и ЮмкМ каждого праймера в следующем режиме (для всех праймеров): денатурация 94 °С - 2мин; далее следовало 35 циклов: 94 °С - 1мин, 55 °С -1мин, 72 °С - 1мин; и, наконец, последний синтез 72 °С - Юмин. Продукты ПЦР анализировали в 0.8% агарозном геле в буфере ТАЕ. Праймеры составляли, используя последовательности LTR, приведённые в работе Brandt-Carlson et al. [Brandt-Carlson С. et al., 1993], и последовательность провируса BR6 (номер в базе данных GenBank М15122)

Праймеры, использованные в работе:

Назва ние Структура праймеров Размер Продукта kb

Mtv7 п.(Sag) 51-TAAACAATTCGGAGAACTCGACCTTCC-31 о.(Sag) 5'-GAAGATCTCCCCCATGAGTATATTTCA-3' 0. 693

ORF п.(Sag) 5'-GAGACGCTCAACCTCAATTGA-31 о.(Sag) 51-GAGCCCATCAGACAAAGA-3' 0.319

РАВ А:п.(Sag MMTV(C3H)) 5'-GACAGТGGCТGGACТААТAGAACAT Т-3' В:о.(gag)51-CTCCTTCTTCGGGAAACCAAG-3' 0.759

PCD С:п.(gag) 5'-ATGGGGGTCTCGGGCTCAAAAGGG-3' D:о.(gag)5'-GGGACTGCCCCTTTACAAGTTTTTTGA-3' 0.381

PEF Е:п.(gag) 51-GATGGGAATCCACTTCCTCCC-3' F:о.(env) 51-GGACCCAGATTGGTGTTTCGGCAT-3' 4.861

PGH1 G:n.(env) 5'-ATGCCGAAACACCAATCTGGG-3' HI:о.(Sag MMTV(C3H)) 51-AATGTTCTATTAGTCCAGCCACTGTC-31 2 . 935

PJK J:n.(LTR) 5'-GAACTCCCGAGAGTGTCCTACAC-31 К:о. (LTR) 5 r-GGACTGTTGCAAGTTTACTC-3' 1.176

PGH2 G:n.(env) 51-ATGCCGAAACACCAATCTGGG-3' H2 : о . (Sag Mtvl) 5'-GAAAGCTAAGGGCAAAGCCTT-3' 2 . 935

PIF I:п.(pol)5'-GGGAAATGCCTATGCCTATGCAGATTC-3' 0.562

F:о.(env) 5'-GGACCCAGATTGGTGTTTCGGCAT-3' п. - прямой, о. - обратный.

ОТ-ПЦР. cDNA получали, используя обратную транскриптазу superscript II в буфере, предлагаемом фирмой производителем (GIBCO/BRL, USA) и (dT)15. 10 мкг РНК ресуспендировали в 15.5 мкл воды, прогревали 5 мин при 65°С и добавляли 14.5 мкл смеси, содержащей 1мкл superscript, 1 мкл RNAsin (40 ед/мкл), 6 мкл 5Х буфера, 3 мкл DTT (ЮОмМ) , 1.5 мкл каждого dNTP и 2 мкл oligo dT (0.5 мг/мл) . Инкубировали 4 мин при 45°С. Затем брали 2-3 мкл и проводили ПЦР, как описано выше.

Гибридизация по Саузерну.

Для обработки рестриктазами брали 2 0 мкг ДНК. Добавляли 20 ед нужного фермента в соответствующем буфере, предоставляемом фирмой-производителем (Promega, USA) . Реакцию проводили в течение 16ч. После этого образцы ДНК, обработанные рестриктазами, разделяли методом электрофореза на 0.8% агарозном геле. Затем проводили денатурацию ДНК, инкубируя гель в растворе, содержащем 0.3N NaOH и 1.5М NaCl в течение 50 мин. Последующую нейтрализацию проводили в растворе, содержащем 0. 5М Tris рН 7.0-8.0 и 1. 5М NaCl в течение 50 мин. Далее осуществляли перенос ДНК на нейлоновые мембраны (Schleicher & Schuell, Germany) в 10Х SSC (87.65g NaCl и 44.lg Na-cytrate на 1л H20) в течение, по крайней мере, 12ч. Фиксацию перенесённой ДНК проводили при помощи УФ (254 нм, 1.5 Дж/см2) . Фильтры прегибридизовали в буфере, содержащем 5Х раствор Denhardt (50Х раствор Denhardt содержит по 10 мг/мл фикола, поливинилпирролидина и BSA) , 5Х SSC, 50% формамид, 1% SDS и 10 Омкг/мл оцДНК.

Для радиоактивного мечения зонда брали 10-20 нг ДНК и доводили объём водой до 15 мкл. Кипятили 2 мин и быстро охлаждали на льду. Затем добавляли 1 мкл (2ед) фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы, 5 мкл (50мкКи) 32P-dATP и 5 мкл раствора OLB. Для приготовления OLB готовили раствор №1, содержащий 1.45М Tris рН 8.0 и 0.145М МдС12. Затем делали раствор №2: к 865 мкл раствора №1 добавляли 18 мкл 2-меркаптоэтанола и по 50 мкл dCTP, dGTP и dTTP (ЮмМ) . Далее готовили раствор №3, содержащий 2М HEPES рН 6.6, и раствор №4, содержащий 90 U/мл гексануклеотидов, бмМ Tris, 0.2мМ EDTA рН 7.5. Затем смешивали растворы №2, 3 и 4 в соотношении 100:250:150. Инкубировали при 37°С от 5 до 30 мин. Очистку зонда от невключившейся метки проводили на колонке, заполненной сефадексом G50.

Для гибридизации брали 5x10б срш/мл меченного зонда и гибридизовали в буфере для прегибридизации при 42°С в течение 16ч. Затем отмывали фильтры в растворе, содержащем 1% SDS и IX SSC один раз при комнатной температуре в течение 15 мин и два раза при 60-65°С по 15 мин. Далее фильтры высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой при -70°С в течение 244 8ч. В качестве зондов использовали ранее синтезированные конструкции gag-pol и елv [Golovkina T.V. et al., 1994а].

Нозерн-гибридизация.

Образцы РНК (20 мкг) разделяли методом электрофореза на 0.8% агарозном геле, содержащем 6% формальдегида. Перенос на нейлоновые мембраны проводили в 2OX SSC. Мечение зонда, дальнейшую прегибридизацию и гибридизацию проводили согласно протоколу гибридизации по Саузерну. В работе использовали зонд, специфичный к гену Wnt-1 [Nusse R. & Varmus H., 1982].

RNAse Ti protection analysis.

Мечение зонда (20-25 нг) проводили в реакционной смеси, содержащей следующие компоненты (Promega, USA) : ЮОмМ DTT, 2. 5мМ рибонуклеозидтрифосфатов (rCTP, rATP, rGTP), 1мМ rUTP, 0.5 мкл RNAsin (40ед/мкл), 5 мкл (50мкКи) 32P-UTP, 0.5 мкл

2ед) ДНК-полимеразы ТЗ или Т7 (в зависимости от ориентации вставки в векторе) в течение 1ч при 37°С. Затем добавляли дрожжевую тРНК (конечная концентрация 0.5 мг/мл), доводили объём смеси водой до 2 00 мкл. После этого добавляли равный объём фенол-хлороформфа и экстрагировали РНК при 600д в течение 5 мин. РНК осаждали из водной фазы, добавляя 2 0 мкл (0.1 объёма) ЗМ ацетата натрия и 550 мкл (2.5 объёма) этанола (-20°С) , и центрифугировали при бООд в течение 10 мин. Осадок разводили в 100 мкл воды. В работе использовали ранее синтезированные зонды, специфичные к Sag вирусов BALB 2, BALB 14, BALB LA [Golovkina T.V. et al, 1997] и MMTV(C3H) [Golovkina T.V. et al, 1994a].

Для гибридизации брали 5 мкг РНК из молока или 4 0 мкг суммарной РНК (из ЛМЖ) и 6x1О5 ерш меченного зонда и инкубировали около 16ч при 56°С в 30 мкл гибридизационного буфера, содержащего 40мМ пиперазин-Ы,Ы'-бис (рН6.4), 0.4М NaCl, 1мМ EDTA и 80% формамида. Затем обрабатывали РНКазой Т1 (500ед/мл в буфере, содержащем 0.01М Tris (рН7.6), 0.005М EDTA и 0. ЗМ NaCl, при 37°С в течение 1ч. После этого добавляли 10 мкл протеиназы К (5 мг/мл, 10-20 ед./мг; Sigma, USA) и 10 мкл 2 0% SDS и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Далее вносили 0.5 мг/мл дрожжевой тРНК. Затем экстрагировали фенолхлороформом и осаждали, как описано ранее. Осадки разводили в 5 мкл буфера (120 мкл буфера содержит 90 мкл формамида, 10 мкл 2% ксилен-цианола,10 мкл 2% бромфенолового синего и 10 мкл 5Х ТВЕ), прогревали при 8 5-90°С в течение 5-7 мин и наносили на 6% полиакриламидный гель. После электрофореза гель экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 12ч при -7 0°С. Для приготовления 6% полиакриламидного геля смешивали 9 мл 20% акриламида (96.5 г акриламида, 3.35 г бис-акриламида, 233 г мочевины и 100мл 5Х ТВЕ на 500мл Н20) , 21 мл раствора мочевины (233 г мочевины и 100 мл 5Х ТВЕ на 500 мл Н20) , 0.3 мл 10% персульфата аммония и ЗОмкл TEMED.

Клонирование и секвенировнаие.

Последовательности вирусов MMTV(C3H), MMTV(HeJ) и Mtvl были получены при помощи панели плазмид (рис.30), содержащих перекрывающиеся фрагменты вирусного генома. Для получения плазмид (кроме рАВ) были использованы матрицы вирусной РНК, выделенной из наполненных молоком желудков мышей, инфицированных MMTV(C3H), MMTV(HeJ) и неинфицированных мышей. ДНК, амплифицированную методом ОТ-ПЦР, клонировали в вектор pCR-Script Amp SK(+) с использованием набора для клонирования PCRScript, согласно протоколу фирмы-производителя (Stratagene, USA). Для клонирования гена gag вируса MMTV(C3H) (плазмида pCD) использовали однокопийный вектор pACYC177 (New England Biolabs, USA) . Для получения плазмиды рАВ в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из селезёнок 2-3-месячных инфицированных мышей C3H/HeN и СЗН/НеJ, поскольку праймер А специфичен к гипервариабельной области Sag U3 LTR, отсутствующей в РНК. Вирусы MMTV(C3H) и MMTV(НеJ) были секвенированы с помощью плазмид рАВ, pCD, pEF, pGHl и pJK. Эндогенный Mtvl секвенировали, используя плазмиду рНР [Shakleford G.M. & Varmus Н.Е., 1988], в состав которой входит часть Mtvl от 51LTR до сайта EcoRI гена pol, и плазмиды pIF, р JK и pGH2. Три последние плазмиды были клонированы с использованием РНК, выделенной из молока MMTV-негативных мышей C3H/HeN (небольшое количество РНК Mtvl присутствует в молоке неинфицированных мышей СЗН/Не). Секвенирование проводили при помощи набора по протоколу, предлагаемому фирмой-производителем (Amersham, UK) . Секвенировали 2-3 независимых клона каждой плазмиды.

Выделение вируса из молока.

Желудки 1-3-дневных мышей, наполненные молоком, гомогенизировали в 10 объёмах PBS и центрифугировали 15 минут при 600g, затем убирали жировую фракцию и оставшееся молоко опять центрифугировали 1 час при 129000 д. Полученные осадки, содержащие вирусные частицы, разводили в PBS, и вводили по 50мкл мышам в подушечки лап. Через 4 дня выделяли лимфоциты из подколенных лимфатических узлов и анализировали активацию Т клеток на проточном цитофлуориметре.

Приготовление клеточных суспензий.

Отвечающие и стимулирующие лимфоциты выделяли из лимфатических узлов и селезёнок, соответственно, в чашках Петри осторожным выдавливанием из стромы органов при помощи пестика от шприца в фосфатном буфере (PBS). Полученные клетки осаждали центрифугированием (600 д, 5 мин). Лимфоциты из лимфатических узлов ресуспендировали в полной среде для культивирования Click's (Irvine Scientific, USA), содержащей 5% FCS (Sigma, USA), 20мМ L-глутамина (Life Technologies, USA) , 5xl0~5 M 2-ME (Bio-Rad, USA) и 100 U/мл смеси пеницилина и стрептомицина (Life Technologies, USA) . В суспензии клеток селезёнки дополнительно лизировали эритроциты, добавляя к осадку последовательно 360 мкл Н20, 40 мкл 10Х PBS и 5 мл IX PBS. Затем спленоциты осаждали центрифугированием (600 д, 5 мин) и тоже ресуспендировали в полной среде. Далее суспензии клеток очищали с помощью магнитных бус. Для получения отвечающих клеток выделяли популяцию лимфоцитов CD4+ (см.ниже). Для получения АПК в экспериментах с активацией Sag выделяли популяцию лимфоцитов без Т клеток (см.ниже). В остальных экспериментах в качестве стимуляторов использовали неочищенную популяцию спленоцитов.

Для выделения лимфоцитов периферической крови кровь, взятую из орбитального венозного синуса при помощи капилляров, обработанных гепарином, центрифугировали на фиколе (плотность 1.09) с добавлением 20 мкл гепарина (5000 ед/мл), чтобы отделить эритроциты. Лимфоциты, находящиеся в интерфазе, отмывали один раз PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре

Очистка клеточных популяций с помощью магнитных бус.

Очищенные клеточные популяции получали методом негативной селекции с помощью магнитных бус. Для этого суспензии клеток инкубировали с необходимыми антителами при 4°С в течение ЗОмин (107/мл) . Для получения Т клеток CD4+ брали лимфоциты, выделенные из лимфатических узлов, и инкубировали с неконьюгировэнными mAb против МНС II Y3JP и 25-9-17 и против CD8. Для получения популяции стимуляторов, очищенных от Т клеток, брали лимфоциты, выделенные из селезёнок, и инкубировали с неконьюгированными mAb против CD4 и CD8. Затем отмывали в PBS один раз при бООд и инкубировали со смесью магнитных бус (PerSeptive Biosystems, USA) разной специфичности (анти-мышиные IgG, анти-мышиные 1дМ, антикрысиные IgG) при 4°С в течение 4 5мин. Далее с помощью магнита удаляли бусы с прикрепившимися к ним клетками.

Реакция MLC.

Для активации Т клеток, имеющих определённые TCRVP, очищенные Т клетки CD4+ (2-3 х 106 на лунку) инкубировали с облучёнными (20 Гр) спленоцитами (5 х 106 на лунку) в 24-луночных планшетах в течение 3 дней в общем объёме 2мл полной среды. Активацию Т клеток оценивали на проточном цитофлуориметре по изменению доли Т клеток CD4+, специфических к Sag.

Для активации Т клеток при помощи b-Sag очищенные Т клетки CD4+ (2 х 105 на лунку) инкубировали с облучёнными (20 Гр) спленоцитами (3-4 х 105 на лунку) в 96-луночных планшетах в течение 3 дней в присутствии различного количества b-Sag (Toxin Technology, Sarasota, FL) в общем объёме 150мкл полной среды. Пролиферацию Т клеток оценивали по включению [3Н]тимидина. Индекс стимуляции (ИС) рассчитывали следующим образом: ИС = (а - Ь) / (с - d) , где а - это срт в культурах со стимуляторами из мышей дикого типа и мутантных мышей (IiKO, DMK0 и АьЕр) в присутствии b-Sag, с - это срт в культурах со стимуляторами из мышей нокаутов по молекуле МНС II в присутствии b-Sag, Ь и d это ерш в соответствующих культурах без b-Sag.

Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре.

Для определения мышей DM КО и трансгенных мышей АьЕр использовали неконьюгированные шАЬ 25-9-17, специфически распознающие комплекс МНС II/CLIP, и mAb Y-Ae, специфически распознающие комплекс АьЕр, с последующим окрашиванием шАЬ анти-Fc/FITC. Окрашивание проводили при 4°С в течение 20-30 мин. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре (Весton Dickinson, Mountain View, CA) с использованием программного обеспечения CellQuest.

Мечение спленоцитов CFSE (5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) (Molecular Probes, USA) проводили при 37°C в течение 10 мин в PBS в концентрации красителя ЮмкМ. Затем отмывали клетки один раз в PBS центрифугированием при 15000 g 5мин и ресуспендировали в полной среде для культивирования (см. Приготовление клеточных суспензий). После инкубации меченных клеток в течение 4 дней in vitro клетки окрашивали различными антителами (см. гл. Результаты) и анализировали на проточном цитофлуориметре. CFSE флуоресцирует в зелёной области спектра (FL1). Поэтому все антитела, используемые для окрашивания клеток, меченных CFSE, были коньюгированы с РЕ, который флуоресцирует в красной области спектра (FL2).

выводы.

1. Пептиды, представляемые в контексте молекул МНС класса II, влияют на способность этих молекул связываться с v-Sag. В частности комплекс молекула MHC/CLIP и АьЕр не могут представлять v-Sag, что приводит к отсутствию инфицирования экзогенными MMTV мышей, АПК которых экспрессируют эти комплексы.

2. В неонатальном периоде сопутствующая инфекция вирусами, не имеющими генетических ограничений, способствует амплификации рестриктированных вирусов.

3. У мышей C3H/HeJ происходит селекция нового экзогенного вируса MTV(HeJ), который является результатом рекомбинации между высококанцерогенным экзогенным MMTV(HeN) и неканцерогенным эндогенным Mtvl. Наличие гена gag из Mtvl возможно является причиной увеличения латентного периода и снижения частоты возникновения опухолей молочной железы у мышей C3H/HeJ, по сравнению с мышами C3H/HeN.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко благодарна своим научным руководителям Казанскому Д. Б. и Головкиной Т. В. - за мудрое руководство, всестороннюю помощь, заботу и поддержку на всех этапах создания этой работы. Я также очень признательна Червонскому А.В., обучившему меня ряду иммунологических методов. Я выражаю свою благодарность Lauren Hook, которая клонировала гены gag, и Stephanie Turner за помощь в работе. Я также благодарю рецензентов - Шарову Н.И и Маливанову Т.Ф. - за обсуждение диссертации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Данные, полученные при изучении роли пептидов, презентируемых в контексте молекул МНС класса II, в связывании этих молекул с Sag, указывают на то, что природа пептида оказывает существенное влияние на презентацию как v-Sag, так и b-Sag. Комплексы молекула MHC/CLIP и АьЕр не могут презентировать v-Sag, в результате чего мыши DMKO и АьЕр-трансгенные мыши оказываются резистентными к инфекции MMTV. Согласно данным литературы, увеличение аффинности взаимодействия b-Sag с молекулами МНС приводит к усилению активации Т клеток. Таким образом, можно предположить, что v-Sag имеет слабую аффинность к комплексам молекула MHC/CLIP и АьЕр, что делает невозможным нормальную презентацию Sag. То, что MHC/CLIP и АьЕр представляют собой крайние варианты конформации молекул МНС по степени компактности, может свидетельствовать о том, что Sag предпочтительно связываются с димерами молекул МНС промежуточной между этими двумя вариантами степени компактности. Тот факт, что b-Sag тоже плохо презентируются клетками из мутантных мышей, подтверждает это предположение.

Исследование чувствительности мышей разного возраста, у которых нет молекулы 1-Е МНС класса II или отсутствуют Т клетки с vp6+, к инфицированию комплексом из трёх вирусов, один из которых (BALB LA) не зависит от 1-Е и имеет Sag с данной VP специфичностью, а два других вируса (BALB 2 и BALB 14) являются I-E-зависимыми, но не ограничены отсутствием специфических Т клеток, показало, что только новорождённые мыши, вскормленные инфицированным молоком, содержащим одновременно три вируса, чувствительны к этим MMTV независимо от ограничений, накладываемых генотипом. Мы полагаем, что чувствительность к инфекции связана с изменениями, происходящими во время развития организма. Мы обнаружили, что спленоциты новорождённых мышей, имеющие фенотип Mac-1+Gr-1+ спонтанно пролиферируют в культуре in vitro. Пролиферация постепенно снижается и прекращается на 17-18 день неонатального развития, что коррелирует с переходом к резистентному фенотипу взрослых мышей. Возможно, наличие интенсивно делящихся клеток в новорождённом организме наряду с другими особенностями неонатального периода способствует проникновению рестриктированных вирусов. Необходимость сопутствующей инфекции нерестриктированными MMTV может свидетельствовать о роли Sag-специфических Т клеток, активированных этими вирусами, в инфицировании MMTV, амплификация которых ограничена теми или иными факторами.

При исследовании причин снижения частоты возникновения опухолей у мышей C3H/HeJ по сравнению с мышами C3H/HeN было показано, что редкие & опухоли, возникающие у СЗН/НеJ вызваны экзогенным вирусом, который отличается от исходно высококанцерогенного вируса MMTV(C3H), имеющегося у мышей C3H/HeN. Методами клонирования этих вирусов и секвенирования их нуклеотидных последовательностей было установлено, что MMTV(HeJ) является рекомбинантом между экзогенным MMTV(C3H) и эндогенным Mtv-2. Сравнение последовательностей позволило выявить ген, ассоциированный с канцерогенезом, которым оказался ген gag. Таким образом, наряду с активацией клеточных протоонкогенов, для процесса трансформации требуется участие белков Gag. Исходя из того, что белки Gag взаимодействуют с различными внутриклеточными белками, можно предположить, что у мышей СЗН/НеJ вирусный белок Gag, часть которого происходит из Mtvl, не связывается со своими мишенями, что влияет на канцерогенность вируса. По всей видимости, рекомбинантный вирус MMTV(HeJ) с изменённой трансформирующей способностью обладает преимуществами перед высококанцерогенным MMTV(C3H) у мышей СЗН/НеJ. Селекция нового вируса именно у мышей C3H/HeJ может быть обусловлена особенностями иммунной системы этих мышей. У них имеется мутация в локусе lps, кодирующем белки семейства Toll-like-рецепторов, которые являются первыми молекулами, распознающими чужеродные структуры микроорганизмов. Поскольку не исключено, что функция TLR так же задействована в инфекции MMTV, как и в иммунном ответе, можно предположить, что их отсутствие способствовало выживанию рекомбинантного вируса. Потеря трансформирующей способности, скорее всего, является случайным следствием адаптации вируса.