Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Анксиолитическое действие и влияние на биоэнергетику головного мозга экстракта лабазника обыкновенного при моделях тревоги и экспериментальной энцефалопатии

005003568

Кайгородцев Алексей Владимирович

АНКСИОЛИТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ И ВЛИЯНИЕ ИА БИОЭНЕРГЕТИКУ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЭКСТРАКТА ЛАБАЗНИКА ОБЫКНОВЕННОГО ПРИ МОДЕЛЯХ ТРЕВОГИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 4 НОЯ 2011

Томск-2011

005003568

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Венгеровский

заслуженный работник высшей школы РФ Александр Исаакович

Научный консультант: Суслов

доктор медицинских наук, профессор Николай Иннокентьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Плотников

заслуженный деятель науки РФ Марк Борисович

доктор биологических наук Новожеева

Татьяна Петровна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 12 » 3 £ £> р 9- 2011 года в 10 ~ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан « 3 » Н О-Л О [Э 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многоплановые и интенсивные нагрузки, испытываемые современным человеком, сопряжены с высоким уровнем психоэмоционального напряжения и риском развития пограничных психопатологических состояний. В популяционных исследованиях синдромально очерченные тревожные расстройства диагностируются у 6,5% населения (Kessler R. et al., 2002), а в течение жизни - у 25-50% (Воробьева О.В., 2006; Strine T. et al., 2005). Отдельные симптомы тревоги или субсиндромальные тревожные расстройства проявляются свыше, чем у 70% населения (Рачин А.П., 2004; Sansone R. et al., 2003).

Тревожные расстройства встречаются как в рамках нарушений психической деятельности, так и входят в структуру многих соматических и неврологических заболеваний. Они являются одним из самых распространенных психопатологических состояний у пациентов соматической сети (Акарачкова Е.С. и соавт., 2007; Медведев В.Э., 2007). Медико-социальные исследования показывают, что повышенная тревожность увеличивает вероятность инфаркта миокарда в 2,3 раза и внезапной смерти в 4,5 раза. Треть от всех затрат на лечение психических заболеваний приходится на лечение тревоги (Воробьева О.В., 2006; Zwanzger P. et al., 2007).

Тревожные расстройства являются пограничным состоянием системы психической адаптации и характеризуются обратимостью изменений в интегративной деятельности, прежде всего, нарушаются поиск, восприятие, переработка информации и эмоциональное реагирование (Александровский Ю.А., 2007). В развитии тревожных расстройств значительную роль играет дефицит энергетического обеспечения психофизиологических процессов (Александров Ю.И., 2003).

Известен широкий спектр лекарственных средств - анксиолитиков, ослабляющих не только психические проявления тревоги, но и процесс ее соматизации. Наиболее популярны анксиолитики бензодиазепиновой структуры (Fricchione G., 2004; Rouillon F., 2004). Они оказывают выраженное противотревожное действие - уменьшают тревогу, беспокойство, повышают резистентность к стрессогенным факторам, но не лишены побочных эффектов - вызывают дневную сонливость, нарушение когнитивных процессов, формирование лекарственной зависимости (Fassaert T. et al., 2007; Barbui С. et al., 2011). Перечисленные побочные эффекты ограничивают применение синтетических анксиолитиков, так как они нарушают важные функции высшей нервной деятельности и снижают качество жизни пациентов. Кроме того, столь активные лекарственные средства, как бензодиазепиновые анксиолитики, в основном рекомендуются больным с клинически очерченными синдромами тревожного расстройства.

В настоящее время в психофармакологии приоритетное значение придается безопасности лечения, акцентируется внимание на важности сопоставления клинической эффективности (польза лечения) и нежелательного, побочного действия (риск лечения). Отсутствие безопасных анксиолитиков, не оказывающих побочных эффектов, делает актуальным разработку и внедрение во врачебную практику новых препаратов с противотревожным действием (Штрыголь С.Ю. и соавт., 2005).

С целью коррекции легких субсиндромальных и вегетативных проявлений тревоги успешно используют лекарственные средства растительного происхождения (Медведев В.Э., 2007; Sarris J., 2007; Khanum F. et al., 2010). В клинической практике применяют препараты валерианы, пустырника, шлемника байкальского и другие растительные средства для уменьшения внутреннего беспокойства, страха и тревоги. По данным ВОЗ предпочтение лекарственным средствам растительного происхождения отдают 80% населения планеты, при этом доверие пациента к лекарству - важный фактор, способствующий успеху лечения (Ушкалова А.В. и соавт., 2007; Werneke U., 2009).

Перспективным растением является лабазник обыкновенный (Filipéndula vulgaris, сем. Rosaceae). Водный экстракт надземной части лабазника обыкновенного обладает антиоксидантным, противогипоксическим и ноотропным действием (Шилова И.В. и соавт., 2010). Представляется актуальным изучить в эксперименте противо-тревожные эффекты экстракта лабазника обыкновенного и его влияние на биоэнергетику головного мозга при моделях тревоги и энцефалопатии.

Цель работы. Изучение влияния экстрактов лабазника обыкновенного и фракций наиболее активного экстракта на поведение животных при моделях тревоги и на биоэнергетику головного мозга при экспериментальной энцефалопатии.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение животных при моделях тревоги.

2. Исследовать фитохимический состав экстракта лабазника обыкновенного, обладающего наибольшим противотревожным действием. Определить группы биологически активных веществ экстракта лабазника обыкновенного, отвечающие за про-тивотревожный эффект.

3. Исследовать противосудорожное влияние водного экстракта лабазника обыкновенного при экспериментальных судорожных состояниях, вызванных нейро-токсинами бикукуллином и тиосемикарбазидом.

4. Изучить влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на функциональное состояние системы митохондриальной энергопродукции и перекисное окисление липидов в головном мозге при экспериментальной энцефалопатии, вызванной

4

гипоксической травмой и нарушением р-окисления средне- и длинноцепочечных жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой).

Научная новизна.

Впервые изучено влияние водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение животных при моделях тревоги. Установлено, что водный экстракт лабазника в дозе 50 мг/кг обладает максимальной про-тивотревожной активностью при стрессе новизны, снижает эмоциональную реакцию на внешние раздражители и уровень агрессии при попадании животных в конфликтную ситуацию. В составе водного экстракта лабазника обыкновенного наиболее полную сумму веществ фенольной природы содержит этилацетатная фракция, она оказывает более выраженный противотревожный эффект при моделях тревожных состояний по сравнению с действием бутанольной фракции и водного остатка. Впервые показано, что водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели митохондриального дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирования, снижает интенсивность процессов липопероксидации при энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением р-окисления жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой). Энерготропное действие водного экстракта лабазника обыкновенного сопровождается активацией быстрого пути поставки восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь митохондрий головного мозга.

Практическая значимость работы.

Водный экстракт лабазника обыкновенного оказывает выраженное противотре-вожное действие при моделях тревожных состояний в эксперименте. В отличие от экстракта валерианы водный экстракт лабазника обыкновенного не угнетает исследовательскую активность животных. Водный экстракт лабазника обыкновенного улучшает биоэнергетический метаболизм головного мозга при моделях постгипоксиче-ской и токсической энцефалопатии. Установленные особенности механизма противо-тревожного действия и выраженный положительный энерготропный эффект обосновывают необходимость углубленного доклинического исследования водного экстракта лабазника обыкновенного для создания фитоанксиолитика, эффективного при невротических и тревожных расстройствах, сопряженных с нарушениями биоэнергетики головного мозга.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, «открытое поле», тест эмоциональной реакции) наибольшее противотревожное действие оказывают водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного. Основными компонентами водного экстракта надземной части лабазника обыкновенного,

оказывающими противотревожное действие, являются простые фенолы, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые и тритерпеновые кислоты.

2. Водный экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг повышает эффективность ориентировочно-исследовательского поведения, увеличивает двигательную активность животных в условиях стресса новизны, снижает проявления агрессии при воздействии внешних раздражителей, повышает стрессоустойчивость в конфликтной ситуации.

3. При моделях энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением Р-окисления жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой), водный экстракт лабазника обыкновенного проявляет более выраженные энерготропные и ан-тиоксидантные свойства по сравнению с действием экстракта валерианы. В механизме противотревожного действия этих растений участвуют антиоксидантный эффект и восстановление регуляции энергетического обмена в головном мозге.

Апробация работы. Материалы работы обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета и лаборатории физиологии, молекулярной и клинической фармакологии НИИ фармакологии СО РАМН (2008-2011), научно-практической конференции «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009), Российском XI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), симпозиуме «Фармакологическая регуляция энергетического обмена» (Томск, 2010), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010), Российском XII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2011), региональном семинаре «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (Томск, 2011), конкурсе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2011). Материалы диссертации опубликованы в 10 научных статьях и материалах конференций, в том числе 5 статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатской диссертации.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, характеризующей результаты экспериментальных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 125 страницах, иллюстрирована 20 таблицами, 6 рисунками и схемой. Библиография включает 182 источника, из них 99 - зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для оценки фармакологического действия получали экстракты из надземной части лабазника обыкновенного, собранного в период цветения в июле 2009 г. в экологически чистом регионе Томской области. Измельченное воздушно-сухое сырье настаивали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин при 80°С. В качестве экстрагентов использовали воду очищенную и водно-спиртовые растворы с содержанием этанола 40, 70 и 95%. Выходы экстрактов, полученных экстракцией водой очищенной, 40, 70 и 95% водно-этанольными растворами, составили 27,5; 27,1; 24,4 и 12,9% соответственно от массы исходного сырья.

Для выявления биологически активных веществ (БАВ) водный экстракт лабазника обыкновенного обрабатывали последовательно этилацетатом (4x100 мл) и бута-нолом-1, насыщенным водой (5x100 мл). Таким образом, получали этилацетатную, бутанольную фракции и водный остаток с выходами 1,0; 6,0 и 93,0% соответственно от массы исходного экстракта. БАВ лабазника обыкновенного в этилацетатной, бута-нольной фракциях и водном остатке исследовали общепринятыми методами фитохи-мического анализа с использованием качественных химических реакций и молекулярной адсорбционной спектроскопии (Ладыгина Е.Я. и соавт., 1983; Шилова И.В. и соавт., 2010). Стандартизацию надземной части лабазника обыкновенного проводили по суммарному содержанию флавоноидов (1,7±0,1%) с использованием метода дифференциальной спектрометрии (Никитина B.C. и соавт., 2008).

Анксиолитические и противосудорожные свойства экстрактов лабазника обыкновенного изучали в экспериментах на 300 белых аутбредных мышах обоего пола массой 20-25 г. Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на метаболизм головного мозга исследовали в экспериментах на 60 белых аутбредных крысах самцах массой 200-220 г. Животных получали из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется); содержали в стандартных условиях при свободном доступе к воде и без ограничения в приеме пищи. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» (2005).

Для исследования анксиолитического действия мышам вводили в желудок экстракты лабазника обыкновенного (дозы соответствуют выходу экстрактов от массы сырья, дозы фракций - от массы экстракта) (схема) или препарат сравнения - экстракт корня валерианы (Дальхимфарм, Россия) в дозе 50 мг/кг (Murphy К. et al., 2009). Экстракты растворяли в воде очищенной. Во всех поведенческих методиках введение фитопрепаратов начинали за 4 дня до исследования, в 4-й день - за 1 ч до исследования. Мыши контрольной группы получали эквиобъемное количество воды очищен-

ной. Компоненты поведения регистрировали с 10 до 15 ч, в тот период суток, когда активность животных достаточно выражена и значимо не изменяется.

Анксиолитические эффекты оценивали по поведению животных в приподнятом крестообразном лабиринте, установке «открытое поле», в тесте эмоциональной реакции и при модели конфликтной ситуации (Суслов Н.И., 1995; Волчегорский И.А. и соавт., 2000; Лапин И.П., 2000; Prut L. et al., 2003; Carobrez A. et al., 2005).

Схема

Исследование влияния экстрактов лабазника обыкновенного на поведение мышей при моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, открытое поле, тест эмоциональной реакции)

é X

водный (мг/кг) водно-этанольные

/ I ч

10 50 200

/ I \

этилацетатгая бутанольвая водный остаток 40% 70% 95%

(0,5 мг/кг) (3 мт'кг) (46,5 мг/я) (49 мг/кг) (44ыг/хг) (24 мг/кг) фрайщн

Для оценки возможного влияния экстракта лабазника обыкновенного на ГАМК-ергическую систему исследовали его противосудорожное действие при моделях первично-генерализованных судорог. Судорожное состояние вызывали у мышей введением бикукуллина (Sigma-Aldrich, USA) в дозе 7 мг/кг под кожу или тиосеми-карбазида (Реактив, Россия) в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно (Воронина Т.А. и соавт., 2005; Chapman A. et al„ 1983).

Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг на биоэнергетику головного мозга исследовали на крысах при экспериментальных постги-поксической и токсической энцефалопатии. Крыс декапитировали под эфирным наркозом. Для исследований использовали гомогенат головного мозга.

Постгипоксическую энцефалопатию моделировали помещением крыс в термокамеру объемом Зле герметически закрывающейся крышкой. После появления первого атонального вдоха животных извлекали и обеспечивали свободное дыхание (Зюзьков Г.Н. и соавт., 2003). Начиная с 14-го дня после гипоксической травмы, крысам в течение 5-и дней вводили в желудок экстракты лабазника обыкновенного и валерианы в дозе 50 мг/кг.

Токсическую энцефалопатию моделировали у крыс ежедневными внутрибрю-шинными инъекциями ингибитора Р-окисления жирных кислот - 4-пентеноевой (ал-лилуксусной) кислоты (ISN, США) в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней (Sakaida N. et al., 1990; Sugimoto Т. et al., 1990). С 8 дня эксперимента на протяжении 14 дней живот-

ным вводили в желудок экстракты лабазника обыкновенного и валерианы в дозах 50 мг/кг. Контрольные животные получали 1% крахмальную слизь в эквиобъемном количестве.

Функциональное состояние системы энергопродукции митохондрий гомогена-та головного мозга оценивали полярографическим методом с помощью электрохимического анализатора «Эксперт-001» (Россия, НПФ «Эконикс-Эксперт») по скорости потребления кислорода в различных метаболических состояниях по Б. Чансу (Chance В. et al., 1961; Johnson G. et al, 1986).

В качестве субстратов окисления использовали сукцинат (1 • 10~3 М), глутамат и малат (по 3-103 М), анализаторами служили активатор сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - изоцитрат (1,5-10~3 М) и ее ингибитор - малонат (2-10"3 М). Рассчитывали скорости потребления кислорода в нанограмм-атом 02/мин/мг белка митохондрий до (V4n), во время (V3) и после (V^) цикла фосфорилирования добавленного АДФ (50 мкМ) при окислении эндогенных и экзогенных субстратов.

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате головного мозга исследовали по скорости образования спонтанного и аскорбатзависимого малонового диальдегида (МДА), содержанию диеновых конъюгатов и оснований Шиффа (Владимиров Ю.А. и соавт., 1972).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью математического пакета STATISTICA 6.0 методом парных сравнений с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при вероятности ошибочного вывода, не превышающей 5% (р<0,05) (Хафизьянова Р.Х. и соавт., 2006). Результаты исследований представлены в виде средней арифметической (X) и стандартной ошибки средней арифметической (Sx).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие патологической тревоги связано с нарушением деятельности эмоциональной системы поведенческого торможения, недостаточной резистентностью систем психической адаптации, ухудшением функциональной активности систем ЦНС, отвечающих за восприятие и переработку информации. В результате нарушаются системные механизмы высшей нервной деятельности, интеграция структурных, функциональных элементов и нервных цепей. Деятельность функциональных систем головного мозга рассогласуется, нарушается нейрональный метаболизм, повышается неупорядоченность поведения (Балунова Е.В. и соавт., 2007; Корабельникова Е.А. и соавт., 2009; Sansone R. et al., 2003; Fricchione G., 2004). При экспериментальном моделировании тревоги животных помещают в незнакомую среду или воздействуют на

них аверсивными стимулами, что сопровождается развитием стресса новизны и последующей активацией механизмов тревоги.

Приподнятый крестообразный лабиринт является одним из наиболее часто применяемых тестов для оценки действия анксиолитиков, позволяющий моделировать острую ситуативную тревожность (Воронина Т.А. и соавт., 1998). В лабиринте мыши попадают в условия переменного стресса при свободном выборе комфортных условий. Водный экстракт лабазника в дозе 50 мг/кг удлинял нахождение в открытых рукавах в 2,2 раза, в центре - на 48% по сравнению с этими показателями у животных контрольной группы. Водно-этанольный экстракт лабазника, приготовленный экстракцией 95% этанолом в дозе 49 мг/кг, и экстракт корня валерианы в дозе 50 мг/кг соответственно на 42% и 32% увеличивали время пребывания в центре. 70% водно-этанольный экстракт в дозе 44 мг/кг и 40% водно-этанольный экстракт в дозе 24 мг/кг не вызывали значимых изменений поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте (табл. 1).

Увеличение времени нахождения мышей, получавших водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного, в центральной части и открытых рукавах лабиринта указывает на снижение уровня тревожности.

Таблица 1

Влияние экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на поведение мышей в приподнятом крестообразном лабиринте (Х±8х; п=12)

Экспериментальная группа Время нахождения, с

в открытых рукавах в закрытых рукавах в центре лабиринта

Контроль 6,5±1,8 241,7±6,0 51,8±6,6

Экстракты лабазника Водный 14,1 ±4,4 1 209,2±4,8 и 7б,7±4,2 и

водно-этанольные 40% 4,0±0,7 2 232,8±8,7 63,2±6,8

70% 10,7±3,1 240,2±5,72 49,1 ±3,52

95% 5,4±1,22 221,3±8,4 1 73,4±7,3 1

Экстракт валерианы 12,3±2,2 1 225,1 ±3,5 1 68,5±3,0 1

Примечание. Различия статистически значимы при р£0,05 по сравнению с показателями: 1 - контрольных животных,2 - животных, получавших экстракт валерианы.

В открытом поле в вынужденной ситуации новизны формируется базовый тип тревожности, проявляющийся модуляцией ориентировочно-исследовательского поведения. Характер деформации эксплоративного поведения в условиях данной методики позволяет судить об уровне тревоги. В первую минуту нахождения в открытом поле у животных, получавших водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного, число горизонтальных перемещений увеличивалось соответственно в

10

1,6 и 1,4 раза, суммарная двигательная активность повышалась на 27% и 21% по сравнению с этими показателями в контроле (табл. 2). Эти данные свидетельствуют о способности экстрактов лабазника уменьшать уровень тревоги: выраженная тревога в первую минуту после помещения животных в новые условия подавляет двигательную активность. В обеих экспериментальных группах коэффициент асимметрии поведения (отношение показателя горизонтальной активности к суммарной двигательной активности) возрастал на 25%. Остальные водно-этанольные экстракты лабазника обыкновенного значимо не влияли на суммарный показатель двигательной активности животных в первую минуту эксперимента. У животных, получавших экстракт валерианы, суммарное число локомоторных актов существенно не изменялось. Показатель норкового рефлекса уменьшался на 38%, горизонтальная активность возрастала в 1,5 раза, коэффициент асимметрии поведения увеличивался на 35% (табл. 2).

Таблица 2

Влияние экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на поведение мышей в «открытом поле» (X ±£>х; п=12)

Экспериментальная группа Суммарная двигательная активность Горизонтальная активность Вертикальная активность Норковый рефлекс Коэффициент асимметрии, %

первая мин! да

Контроль 28,5±2,6 16,0±1,8 2,9±0,5 9,4±0,9 55±3

Экстракты лабазника Водный 36,2±4,7 1 24,3±2,91 2,7±0,72 8,0±1,02 69±2 '

водно-этанольные 40% 31,2±2,9 19,4±1,82 1,5 ±0,2 1 9,0±1,12 64±2 1,2

70% 28,2±2,5 20,2±1,1 и 2,3±0,5 2 6,0±1,2 1 72±4 1

95% 34,5±1,91 22,9±0,7 1 3,0±0,42 7,6±0,7 69±3 1

Экстракт валерианы 32,5*3,2 24,2±1,5 1 1,1±0,3 1 5,8±0,6 1 75±5 1

Вторая-третья минуты

Контроль 56,0±6,3 27,9±3,8 5,9±1,1 18,3±1,9 55±4

Экстракты лабазника Водный 59,1±5,2 31,1±3,2 5,2±0,9 18,4±1,32 55±22

водно-этанольные 40% 49,8±5,3 26,8±2,62 5,2±0,9 14,0±2,5 59±32

70% 47,4±8,9 25,5±4,8 3,4±1,0 14,2±2,2 60±3

95% 62,5 ±3,82 35,8±2,8 1 6,7±0,82 16,6±1,42 61±22

Экстракт валерианы 50,1±5,5 33,7±3,5 3,0±0,9 1 10,7±2,4 1 68±2 1

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05 по сравнению с показателями: 1 - контрольных животных,2 - животных, получавших экстракт валерианы.

На второй и третьей минутах эксперимента показатели поведения мышей, получавших экстракты лабазника, были близки к их значениям в контрольной группе (табл. 2). Изменения вызывал только 95% водно-этанольный экстракт. Он повышал горизонтальную активность на 28% и коэффициент асимметрии на 11%. При введении экстракта валерианы на фоне неизмененной суммарной двигательной активности уменьшалось количество вертикальных стоек и обследований отверстий в 2 и 1,7 раза соответственно.

Таким образом, водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного оказывают противотревожный эффект, не подавляя ориентировочно-исследовательской активности животных (табл. 2). Экстракт валерианы увеличивает горизонтальную активность, но тормозит такие важные проявления ориентировочно-исследовательского поведения, как вертикальная активность и норковый рефлекс. В связи с этим у мышей, получавших экстракт валерианы, развивается значительная асимметрия поведения.

Экстракты лабазника обыкновенного существенно изменяли эмоциональную реакцию мышей, оцененную по методике J. Brady и W. Nauta (1953). У мышей, получавших водный и 95% водно-этанольный экстракты, суммарный показатель эмоциональной реакции становился в 1,5 раза меньше, чем в контроле (рис.). Реакция на захват рукой вне клетки у животных, получавших водный экстракт лабазника, уменьшалась вдвое, при введении экстракта, полученного с помощью 95% этанола, - ослаблялась в 1,5 раза. В обеих группах мышечный тонус уменьшался в 1,5 раза. Действие на эмоциональную реакцию экстрактов, полученных с помощью 40% и 70% этанола, было незначительным. Экстракт валерианы снижал суммарный показатель эмоциональной реакции только на 16%.

Водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного значимо тормозили эмоциональную реакцию мышей, что указывает на ослабление симптомов тревоги. На рисунке показано, что характер эмоциональной реакции мышей в динамике был сходным во всех экспериментальных группах. У животных, получавших водный, 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного и экстракт валерианы, существенно уменьшалась амплитуда реакции при разных по характеру воздействиях.

Полученные данные о влиянии водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение мышей в условиях моделей тревоги говорят о наличии у исследуемых экстрактов противотревожной активности. Наиболее выраженное противотревожное действие оказывают экстракты, полученные экстракцией водой и 95% этанолом. По противотревожной активности они превосходят действие экстракта валерианы.

Использование этанола для получения экстрактов из растительного сырья значительно увеличивает себестоимость лекарственного препарата, усложняет технологическую схему производства, создает необходимость соблюдения дополнительных мер контроля и учета расходуемого этанола. По противотревожной активности водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного сопоставимы, поэтому для дальнейшиего фармакологического исследования использовали водный экстракт.

40% идм-эташшным экстракт лабашха

30 -2,5 -2,0 -

1,5 -

■

0.5 ■

70% кода», этанол* нын экстр акт лабазшска

9№в о дао- эташль шй экстр акт лаб аника

зл -

2,5 -

2 Л -

1,5 "

10 "

Экстракт шалерманы

3,0 •

2,5 ■

2.0 •

1,5 •

1,0 -

0,5 -

Рис. Динамика эмоциональной реакции (в баллах) у контрольных мышей и мышей,

получавших экстракты лабазника обыкновенного и валерианы. Примечание. Типы воздействия: А - захват в клетке, Б - захват на ровной поверхности, В - мышечный тонус, Г - приближение пинцета, Д - толчок пинцетом. Кривые, выделенные жирными линиями, отражают полиноминальную линию тренда.

Исследования токсичности водного экстракта лабазника обыкновенного показали, что его введение в желудок или внутрибрюшинно в дозах до 10000 мг/кг не вызывает гибели мышей и крыс в течение 2-х нед наблюдения. У животных не нарушалась координация движений, сохранялись рефлексы.

Разные БАВ одного и того же растительного экстракта могут оказывать противоположно направленные эффекты, поэтому преобладание депримирующего или активирующего ЦНС действия нередко зависит от дозы. Для оценки дозовой зависимости противотревожного эффекта водный экстракт лабазника обыкновенного исследовали в интервале доз - 10, 50 и 200 мг/кг. Установлено, что во всем диапазоне выбранных доз водный экстракт лабазника обыкновенного оказывает противотревожное действие. Наибольшую противотревожную активность экстракт проявлял в дозах 50 и 200 мг/кг. Однако в дозе 200 мг/кг экстракт лабазника снижал ориентировочно-исследовательскую активность, регистрируемую в методике «открытое поле», что свидетельствует о появлении седативного эффекта. Для расширенного фармакологического изучения водный экстракт лабазника обыкновенного вводили в дозе 50 мг/кг.

В условиях конфликтной ситуации водный экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг увеличивал основной показатель, характеризующий анксиолитическое действие, - число наказуемых взятий воды в 2,7 раза по сравнению с числом в контрольной группе (табл. 3). Экстракт валерианы в дозе 50 мг/кг повышал этот показатель в 1,7 раза. При введении экстракта лабазника значимо не изменялось количество подходов животных к поилке, понижались показатель суммарной двигательной активности на 22% и число горизонтальных перемещений на 25%. Экстракт валерианы сокращал число подходов к поилке на 33%, понижал суммарное количество двигательных актов на 29%, главным образом, за счет уменьшения числа горизонтальных перемещений на 31%.

Таблица 3

Влияние водного экстракта лабазника обыкновенного и экстракта валерианы на поведение мышей в условиях конфликтной ситуации (X±Sx;n = 8)

Группа Количество подходов Число взятий воды Суммарная двигательная активность Горизонтальные перемещения

Контроль 6,0±0,6 6,2±0,4 160,0±6,3 123,5±12,9

Экстракт лабазника обыкновенного 6,8±0,9 " 16,5±2,7 u 124,7±5,2 w 92,4±10,5 1

Экстракт валерианы 4,0±0,4 1 10,6±0,8 1 П3,2±4,6 1 85,5±5,8 1

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05 по сравнению с показателями:1 - контрольных животных,2 - животных, получавших экстракт валерианы.

Известно, что анксиолитики активируют ГАМК-ергическую систему, поэтому для оценки механизма противотревожного эффекта экстракта лабазника обыкновенного исследовали его противосудорожное действие при моделях первично-генерализованных судорог, вызванных инъекциями антагонистов ГАМК - бикукул-лина и тиосемикарбазида.

На фоне индуцированного бикукуллином или тиосемикарбазидом судорожного состояния экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг не влиял на латентное время наступления первых судорог. Среднее время гибели животных снижалось на статистически незначимую величину. Экстракт лабазника не изменял количество судорожных припадков по сравнению с их числом у контрольных мышей, либо понижал этот показатель при одновременном сокращении времени жизни животных после введения нейротоксинов. Таким образом, в механизме депримирующего влияния на ЦНС экстракта лабазника обыкновенного не участвует ГАМК-ергическая система головного мозга.

Для установления БАВ водного экстракта лабазника обыкновенного, отвечающих за противотревожный эффект, было проведено его фракционирование с помощью жидкость-жидкостной экстракции. Полученные этилацетатную, бутанольную фракции и водный остаток изучали химико-фармакологическими методами.

При фотохимическом анализе обнаружено, что в этилацетатной фракции водного экстракта надземной части лабазника обыкновенного содержатся простые фенолы, флавоноиды, кумарины, фенолкарбоновые и тритерпеновые кислоты, тритерпеновые сапонины. Бутанольная фракция содержит простые фенолы, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, тритерпеновые сапонины, дубильные вещества гидролизуемой группы, углеводы и аминокислоты. В водном остатке обнаружены дубильные вещества, тритерпеновые сапонины, водорастворимые полисахариды, углеводы и аминокислоты.

Фармакологическое действие фракций водного экстракта лабазника обыкновенного оценивали этологическими методами при моделях тревоги в сравнении с эффектами суммарного водного экстракта в дозе 50 мг/кг. Этилацетатную, бутанольную фракции и водный остаток вводили в дозах, пропорциональных их содержанию в суммарном экстракте, - 0,5; 3,0 и 46,5 мг/кг соответственно.

Фракции водного экстракта лабазника обыкновенного оказывают неодинаковое действие при моделях тревоги. По показателям поведения в приподнятом крестообразном лабиринте и «открытом поле» максимальную противотревожную активность проявляет этилацетатная фракция, наиболее богатая соединениями фенольной природы.

Для оценки метаболических эффектов водного экстракта лабазника обыкновенного изучали его влияние на деятельность системы митохондриальной энергопродукции в головном мозге крыс при экспериментальной постгипоксической и токсической энцефалопатии.

Гипоксические состояния сопутствуют многим патологическим процессам, возникают при экстремальных нагрузках, в том числе при таких пограничных психических заболеваниях, как тревожные расстройства. На фоне снижения доставки кислорода ниже физиологической нормы инициируется каскад биохимических реакций, лежащих в основе тканевой деградации. Механизмы нейронального повреждения включают истощение энергетических ресурсов, нарушение ионного гомеостаза, накопление возбуждающих медиаторов и гиперпродукцию активных форм кислорода (Киселева A.A. и соавт., 2006). В результате подавления аэробного синтеза энергии и дефицита АТФ происходит ингибирование специфических для нервной ткани энергозависимых функций (Лукьянова Л.Д., 2004).

В наших экспериментах энцефалопатия, вызванная гипоксической травмой, сопровождалась существенными изменениями энергопродукции в головном мозге (табл. 7). При окислении эндогенных субстратов скорости окислительного фосфори-лирования V4n и V^ возрастали вдвое, скорость V3 повышалась на 14% по сравнению со скоростями у интактных животных. Коэффициент АДФ/О снижался на 18%. При субстратной нагрузке сукцинатом активное фосфорилирование (V3) ускорялось на 22%, сопряженность окисления с синтезом АТФ возрастала в 1,5 раза. Добавление изоцитрата ускоряло активное фосфорилирование сукцината. НАД-зависимое дыхание характеризовалось ростом скоростей V4n и V*, в 1,2 и 1,6 раза соответственно и тенденцией к увеличению скорости V3. Коэффициент АДФ/О снижался на 17%. Ма-лонат замедлял активное фосфорилирование на 26% по сравнению с интенсивностью этого процесса в тесте без ингибирования СДГ.

Таким образом, при экспериментальной постгипоксической энцефалопатии в митохондриях головного мозга активируется энергопродукция в результате увеличения вклада СДГ в поставку восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь. Однако это сопровождается разобщением окисления и фосфорилирования, поэтому расход энергии становится повышенным и неэкономичным.

Экспериментальная терапия постгипоксической энцефалопатии экстрактами лабазника обыкновенного и валерианы улучшала дыхательную функцию митохондрий головного мозга (табл. 7). Скорость дыхания V3 при окислении эндогенных субстратов повышалась на 20% при введении экстракта лабазника и на 17% при введении экстракта валерианы по сравнению со скоростью, измеренной у крыс, перенесших

гипоксию головного мозга и оставленных без лечения. В этом эксперименте прослеживалась тенденция к росту коэффициента АДФ/О.

Таблица 7

Влияние экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на митохондриальное дыхание в гомогенате головного мозга крыс при постгипоксической энцефалопатии

(Х±5х; п=6)

Параметры дыхания митохондрий Интактные животные Постгипокси-ческая энцефалопатия Постгипоксическая энцефалопатия +

экстракт лабазника экстракт валерианы

Окисление эндогенных субстратов

У,„ 5,2±0,6 10,2±0,1 ' 10,1±0,3 и 9,5±0,2 1

У, 14,7±0,9 16,8±2,0 20,1±1,0 и 19,6±0,7 1

V*, 4,6±0,2 8,1 ±0,4 1 8,7±0,4 и 10,0±0,5 '

АДФ/О 2,8±0,2 2,3±0,2 1 2,4±0Д 1 2,5+0,1

Окисление сукцината

У4„ 12,6±0,6 17,4±1,1 1 18,6± 1,0 и 15,5±0,5 1

Уз 26,4±1,3 32,3±1,7 1 37,1±0,6 33,5±1,2'

У4„ 11,0±0,8 14,2±0,8 1 18,9±1,9 и 15,3±0,7 1

АДФ/О 1,5±0,2 2,2±0,1 ' 2,2±0,1 ' 2,0±0,2'

Окисление сукцината в присутствии изоцитрата

У,„ 14,9±2,8 20,9±0,4 1 21,3±0,1 и 17,6±0,5 1,2

Уз 30,8±4,7 38,6±0,6 1 42,6±1,9 37,1±1,6 1

V*, 12,8±3,0 16,2±0,3 1 20,9±0,7 18,2±0,9

АДФ/О 2,0±0,1 2,2±0,11 2,3±0,1 и 1,9±0,12

Окисление малата и глутамата

У4п 8,6±0,1 11,1 ±0,7 1 8,4±1,6 2"" 12,1 ±0,61

Уз 23,4±1,1 24,8±0,9 26,8±1,2 1 24,1 ±2,0

У4о 9,2±0,4 14,5±1,3 1 12,5±0,6' 13,4+1,1 1

АДФ/О 2,9±0,2 2,4±0,1' 2,7±0,12 2,5±0,1 1

Окисление малата и глутамата в присутствии малоната

У,„ 10,2±0,3 14,2±0,1 1 12,1±0,6 и 11,4*1,22

V, 20,7±0,2 18,3±0,1 ' 20,1±1,3 23,8±0,32

V*, 14,6±1,3 15,4±0,5 11,4±1,1 16,7±0,3 1

АДФ/О 2,7±0,1 2,2±0,2' 2,4±0,1 1 2,6±0,12

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05 по сравнению с показателями: 1 - интакгных животных,2 - при постгипоксической энцефалопатии,3 - при введении экстракта валерианы. Размерности ед.: скорости дыхания (У4п, Уз, Ук,) - нг-ат. Ог/мин/мг белка митохондрий.

В митохондриях головного мозга крыс, получавших экстракт лабазника, ФАД-зависимое дыхание сопровождалось ускорением активного фосфорилирования (У3) на 15% по сравнению с его интенсивностью при постгипоксической энцефалопатии. Введение экстракта валерианы не увеличивало данный показатель. Коэффициент АДФ/О оставался таким же, как у животных с гипоксией, не защищенных фитопрепаратами. При активации СДГ изоцитратом скорость дыхания У3 повышалась на 15% и 11% при экспериментальной терапии экстрактом лабазника и экстрактом валерианы

соответственно по сравнению со скоростью, измеренной в отсутствии изоцитрата. Окисление малата и глутамата не сопровождалось значимым изменением скоростей фосфорилирования. Коэффициент АДФ/О возрастал (на 13%) только при введении экстракта лабазника. Фосфорилирование в тесте с утилизацией НАД-зависимых субстратов на фоне ингибирования СДГ малонатом замедлялось на 17% при введении экстракта лабазника и на 11% под влиянием экстракта валерианы по отношению к данным показателям, определенным в суспензии митохондрий без добавления ингибитора. При лечении экстрактом лабазника коэффициент АДФ/О в НАД-оксидазном пути окисления возрастал на 13%, терапия экстрактом валерианы повышала его незначительно.

При модели постгипоксической энцефалопатии значительно усиливалось ПОЛ головного мозга. Спонтанное и аскорбатзависимое образование МДА ускорялось в 2,1 раза. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа повышалось в 2,4-2,5 раза. Экспериментальная фитотерапия ослабляла липопероксидацию, активированную в головном мозге при постгипоксической энцефалопатии. Экстракт лабазника снижал интенсивность спонтанной и аскорбатзависимой продукции МДА на 36%-40%, содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа - на 33%-34%. Антиоксидаитный эффект экстракта валерианы был выражен слабее (табл. 8).

Таблица 8

Влияние экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на перекисное окисление липидов в гомогенате головного мозга крыс при экспериментальной постгипоксической энцефалопатии (X ±5 х; п=6)

Параметры интенсивности ПОЛ Интактные животные Постгипокси- Постгипоксическая энцефалопатия +

патия экстракт лабазника экстракт валерианы

МДА, нмоль/мг белка/мин спонтанный 0,19±0,02 0,39±0,01 1 0,25±0,02 13 0,30±0,04 12

аскорбат-зависимый 0,45±0,03 0,96±0,02 1 0,58±0,02 из 0,66±0,05 и

Диеновые коньюгаты, ед. оптич. плУмг липидов 0,26±0,03 0,63±0,04 1 0,42±0,04 1-3 0,51±0,02 13

Основания Шиффа, ед. оптич. пл7мг липидов 1,04±0,06 2,6±0,11 1,72±0,061"3 1,94±0,09 и

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05 по сравнению с показателями: 1 - интактных животных,2 - при постгипоксической энцефалопатии,3 - при введении экстракта валерианы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что экстракт лабазника обыкновенного эффективнее экстракта валерианы восстанавливает функции системы мито-хондриальной энергопродукции на фоне постгипоксической энцефалопатии. Анксио-литики растительного происхождения как мощные антиоксиданты активируют кинетику энергопродукции в головном мозге, повышают сопряженность окислительного фосфорилирования, скорости активного ФАД- и НАД-зависимого дыхания и препятствует переходу системы энергопродукции в состояние истощения. Митохондрии головного мозга крыс, подвергнутых гипоксии, продолжают функционировать в фазе резистентности. Это позволяет удовлетворять энергетические запросы нейронов.

Более тяжелая энцефалопатия развивается при интоксикации 4-пентеноевой кислотой (4-ПК). Преобладающим патологическим процессом является дефицит кар-нитина с последующим ингибированием р-окисления длинно- и среднецепочечных жирных кислот в митохондриях (обеспечивает свыше 50% энергии в клетках). Жирные кислоты повреждают митохондрии гепатоцитов, нейронов и нейроглии. Инакти-вируется пируватдегидрогеназный комплекс (блокируется превращение пирувата в ацетилкоэнзим А), ингибируются цитратсинтаза и глутаматдегидрогеназа, вследствие чего развиваются энергетический дефицит и лактат-пируватный ацидоз (Bennett М. et al., 2000; Rao К. et al., 2001). Повышение уровня свободных жирных кислот активирует процессы ПОЛ, что совместно с дефицитом макроэргических соединений усиливает нарушение биоэнергетики головного мозга.

В эксперименте энцефалопатия, вызванная введением 4-ПК, сопровождалась значительными патологическими изменениями энергопродукции (табл. 9). На 14-й день после начала инъекций 4-ПК в головном мозге крыс скорость дыхания митохондрий в активном состоянии (V3) уменьшалась на 22%, в состоянии покоя (V4[I) - на 28%, в состоянии отдыха (V^) - на 17% по сравнению со скоростями у интактных животных. Коэффициент АДФ/О снижался в 1,9 раза (табл. 9). После добавления сук-цината в суспензию митохондрий скорость V3 увеличивалась значительно меньше, чем в норме. Напротив, сопряженность дыхания с окислительным фосфорилировани-ем возрастала в 1,6 раза. Активация СДГ изоцитратом приводила к значительному росту скорости активного дыхания в митохондриях мозга животных с энцефалопатией, что указывает на торможение СДГ. Метаболические состояния митохондрий при утилизации маната и глутамата характеризовались значительным уменьшением скоростей дыхания V3, V4„, V4<) и коэффициента АДФ/О. В реакции НАД-оксидазного окисления добавление ингибитора СДГ малоната существенно не влияло на скорость потребления кислорода митохондриями, что связано с выраженным торможением СДГ.

При экспериментальном нарушении р-окисления жирных кислот, вызванном 4-ПК, снижаются скорости дыхания и коэффициент АДФ/О во всех моделируемых метаболических состояниях митохондрий головного мозга. Это указывает на низкоэнер-гизованное состояние митохондрий. ФАД-зависимый путь транспорта восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь тормозится из-за ингибирования СДГ, система митохондриальной энергопродукции функционирует в фазе истощения. Нарушение биоэнергетики головного мозга крыс, подвергнутых интоксикации 4-ПК, сопровождалось угнетением поведенческой активности.

Таблица 9

Влияние экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на митохондриальное дыхание в гомогенате головного мозга крыс при экспериментальной энцефалопатии, вызванной 4-пентеноевой кислотой (X ±5 х; п=6)

Параметры дыхания митохондрий Интактные животные 4-ПК спустя 14 дней 4-ПК спустя 14 дней +

экстракт лабазника экстракт валерианы

Окисление эндогенных субстратов

У>„ 12,7±0,6 9,1 ±0,3 1 10,5±0,3 9,6±0,3 1

Уз 17,6±0,8 13,8±0,5 1 17,3±0,4 и 15,2±0,7 и

V*, 12,8±0,4 10,6±0,21 11,6±0,72 10,4±0,41

АДФ/О 1,7±0,2 0,9±0,1 1 1,2±0,1 и 1,2±0,21

Окисление сукцината

У.П 12,6±0,5 9,5±0,4 1 8,7±1,2' 9,6±0,4'

Уз 30,6±2,2 14,7±0,61 25,2±1,2" 20,7±1,2и

У40 12,1 ±0.4 10,1±0,5 1 11,8±1,4 10,5±0,5'

АДФ/О 2,1 ±0,2 1,4±0,2 1 1,8±0,12"1 1,5±0,1'

Окисление сукцината в присутствии изоцитрата

У4„ 15,9±0,3 14,5±0,41 12,2±1,0 13,9±0,8 1

Уз 34,7±1,7 32,1±1,6 29,7±1,612 27,3±1,5 и

У4о 15,3±1,0 13,3±0,5 1 12,5±1,3' 14,5±0,9

АДФ/О 2,0±0,2 1,5±0,11 2,1±0,1" 1,8±0,12

Окисление малата и глутамата

У4„ 11,2±0,4 5,4±0,3 1 10,8±0,8" 8,9±0,4 и

Уз 28,3±2,1 10,1 ±0,5 1 23,0±1,2 и 20,6±1,112

У4о 9,9±0,7 5,4±0,4 1 10,9±0,72 10,3±0,72

АДФ/О 2,7±0,1 1,3±0,1 1 1,8±0,2 и 1,4±0,2'

Окисление малата и глутамата в присутствии малоната

У4п 9,7±0,9 5,4±0,5 1 6,3±0,6 и 10,9±1,12

Уз 26,5±1,6 9,4±0,7' 15,3±1,1 17,8±1,2 и

Ую 9,8±0,4 4,6±0,2 1 8,0±1,0'-3 11,4±1,0 ы

АДФ/О 2,4±0,2 1,2±0,1 1 1,6±0,1 и 1,5±0,1 и

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05 по сравнению с показателями: 1 - интактных животных,2 - при введении 4-пентеноевой кислоты 3 - при введении экстракта валерианы. Размерности ед.: скорости дыхания (У4„, Уз, У^,) - нг-ат. Ог/мин/мг белка митохондрий.

Введение крысам экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на фоне энцефалопатии, вызванной 4-ПК, приводило к улучшению функционального состояния митохондрий головного мозга (табл. 9). При утилизации эндогенных субстратов возрастали скорости активного дыхания митохондрий на 20% (лабазник) и 10% (валериана). В обеих группах на 33%> увеличивался коэффициент сопряженности окислительного фосфорилирования. Скорости поглощения кислорода митохондриями в тесте с активным ФАД-зависимым дыханием увеличивались на 71% при введении экстракта лабазника и на 41% у животных, получавших экстракт валерианы. Добавление активатора СДГ изоцитрата повышало скорости ФАД-зависимого дыхания митохондрий головного мозга, но они были ниже, чем скорости при модели энцефалопатии. Такие результаты отражают способность фитопрепаратов, введенных с лечебной целью, снижать ингибирование СДГ в митохондриях головного мозга.

Терапия экстрактами лабазника обыкновенного и валерианы увеличивала скорость дыхания митохондрий в активном состоянии при утилизации малата и глутама-та в 2,3 и 2,1 раза соответственно по сравнению с этим показателем у животных, оставленных без лечения. Экстракт лабазника обыкновенного увеличивал коэффициент АДФ/О на 29%, экстракт валерианы его не изменял. НАД-зависимое дыхание в присутствии ингибитора СДГ малоната характеризовалось снижением скоростей У4п, У3 и Уд,, при введении обоих экстрактов, что указывает на включение компенсаторных процессов в виде активации быстрого пути поставки восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь.

При интоксикации 4-ПК активировалось ПОЛ в головном мозге крыс. Спонтанное и аскорбатзависимое образование МДА ускорялось более чем вдвое. Количество диеновых конъюгатов становилось в 4,6 раза, оснований Шиффа - в 1,8 раза больше, чем в норме. Фитотерапия экспериментальной энцефалопатии экстрактами лабазника обыкновенного и валерианы замедляла спонтанное и стимулированное ас-корбатом образование МДА на 21-40%. Количество диеновых конъюгатов уменьшалось на 41 и 32%, оснований Шиффа - на 24 и 16% при лечении экстрактами лабазника обыкновенного и валерианы соответственно (табл. 10).

Таким образом, экстракты лабазника обыкновенного и валерианы оказывали терапевтическое влияние на показатели митохондриальной энергопродукции на фоне экспериментальной энцефалопатии, вызванной ингибированием р-окисления жирных кислот. Водный экстракт лабазника обыкновенного ослаблял торможение СДГ, увеличивал сопряженность окислительного фосфорилирования в большей степени, чем экстракт валерианы. Терапия экстрактом лабазника обыкновенного сопровождалась также более выраженным антиоксидантным эффектом.

Полученные данные о влиянии водного экстракта лабазника обыкновенного на биоэнергетику головного мозга животных, перенесших гипоксическую травму, либо получавших ингибитор р-окисления жирных кислот - 4-ПК, демонстрируют способность фитопрепарата компенсировать нарушения деятельности системы митохондри-альной энергопродукции и регулировать энергетический метаболизм головного мозга.

Водный экстракт лабазника обыкновенного активирует систему митохондри-альной энергопродукции головного мозга за счет увеличения вклада в дыхание быстрого метаболического пути доставки восстановленных эквивалентов и компенсации энергозатрат на функционирование нейронов. В механизме противотревожного действия экстрактов лабазника и валерианы участвует антиоксидантный эффект.

Таблица 10

Влияние экстрактов лабазника обыкновенного и валерианы на перекисное окисление липидов в гомогенате головного мозга крыс при экспериментальной энцефалопатии, вызванной 4-пентеноевой кислотой (X ±Бх; п=6)

Параметры интенсивности ПОЛ Интактные животные 4-ПК спустя 14 дней 4-ПК спустя 14 дней +

экстракт лабазника экстракт валерианы

МДА, нмоль/мг белка/мин спонтанный 0,14±0,01 0,39±0,041 0,24±0,0313 0.31±0.0213

аскорбат-зависимый 0,28±0,03 0,94±0,05 1 0,56±0,011"3 0.61±0.0113

Диеновые коньюгаты, ед. оптич. пл7мг липидов 0.24±0.03 1,10±0,09 1 0,65±0,07 и 0,75±0,07 13

Основания Шиффа, ед. оптич. пл7мг липидов 1.57±0.09 2,80±0,08 1 2,12±0,09 " 2,34±0,0912

Примечание. Различия статистически значимы при р<0,05 по сравнению с показателями: 1 - интактных животных,2 - при введении 4-пекгеноевой кислоты,3 - при введении экстракта валерианы.

Таким образом, водный экстракт надземной части лабазника обыкновенного обладает большей противотревожной активностью по сравнению с действием водно-этанольных экстрактов. Анксиолитические свойства водного экстракта лабазника обыкновенного обусловлены эффектами фенольных БАВ растения, которые максимально переходят в этилацетатную фракцию. При моделях постгипоксической и токсической энцефалопатии водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели митохондриального дыхания, сопряженность окислительного фосфорили-рования, снижает интенсивность ПОЛ в головном мозге животных. По противотре-вожному, энерготропному и антиоксидантному эффектам водный экстракт лабазника обыкновенного превосходит действие препарата сравнения - экстракта валерианы.

выводы

1. Экстракты надземной части лабазника обыкновенного, полученные извлечением водой очищенной, 40%, 70% и 95% этанолом, оказывают противотревожное действие при моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, «открытое поле», тест эмоциональной реакции). Наибольшее противотревожное действие без подавления ориентировочно-исследовательского поведения оказывает водный экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг.

2. Водный экстракт лабазника обыкновенного увеличивает двигательную активность и эффективность ориентировочно-исследовательского поведения животных на фоне повышенной психо-эмоциональной нагрузки, вызванной стрессом новизны, снижает эмоциональную реакцию на внешние раздражители и уровень агрессии в конфликтной ситуации.

3. В составе водного экстракта лабазника обыкновенного максимальное снижение тревожности вызывает этилацетатная фракция, содержащая наиболее полную сумму биологически активных веществ фенольной природы, включая простые фенолы, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые и тритерпеновые кислоты.

4. В механизме анксиолитического действия водного экстракта лабазника обыкновенного не участвует влияние на ГАМК-ергическую систему.

5. Водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели энергетического метаболизма и снижает интенсивность липопероксидации в головном мозге при экспериментальной постгипоксической и токсической энцефалопатии.

6. По противотревожному, антиоксидантному действию и способности улучшать биоэнергетику головного мозга водный экстракт лабазника обыкновенного превосходит препарат сравнения - экстракт валерианы.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние экстрактов лабазника обыкновенного на поведение при моделях тревожных состояний // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - Т. 9, № 6. - С. 93-98.

2. Влияние экстракта лабазника обыкновенного на биоэнергетику головного мозга при экспериментальной постгипоксической энцефалопатии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 151, № 4. - С. 401-405 (соавт.: Венгеровский А.И., Суслов Н.И.).

3. Коррекция тревожного поведения экстрактами лабазника обыкновенного в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, № 9. - С. 3-6 (соавт.: Венгеровский А.И., Суслов Н.И.).

4. Новые фитопрепараты с церебропротекториым эффектом // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - Т. 10, № 5. - С. 29-35 (соавт.: Буркова В.Н., Венгеровский

A.И., Суслов Н.И.).

5. Противотревожные и энергорегуляторные свойства водного экстракта из Filipéndula vulgaris (Rosaceae) // Растительные ресурсы. - 2011. - Т. 47, № 3. - С. 136-145 (соавт.: Венгеровский А.И., Суслов Н.И., Удут В.В., Гурто Р.В., Слепичев

B.А., Поломеева Н.Ю.).

6. Анксиолитическое действие экстрактов надземной части лабазника обыкновенного в экспериментах на животных // Науки о человеке: материалы XI конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, JI.B. Капилевича. -Томск: СибГМУ, 2010. - С. 73-74.

7. Фармакологическое исследование экстрактов лабазника обыкновенного // Актуальные вопросы медицинского обеспечения войск, подготовки и усовершенствования военно-медицинских кадров: материалы научно-практической конференции- Томск: Военно-медицинский институт, 2010. - С. 96-98 (соавт.: Поломеева Н.Ю.).

8. Анксиолитические свойства экстрактов лабазника обыкновенного // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых / Под. ред А.В. Силина, И.Ю. Стюф. - СПб: СПбМАПО, 2010. - С. 54-56 (соавт.: Поломеева Н.Ю.).

9. Лабазник обыкновенный - перспективное растение для лечения тревожных расстройств в детском возрасте // Здоровье детей - наше будущее: сб. научных трудов VIII межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров. - Томск: СибГМУ, 2011. - С. 30-32.

10. Энергорегуляторные свойства водного экстракта лабазника обыкновенного // Сборник статей по материалам XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СибГМУ, 2011. - С. 79-80.

Список сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

БАВ - биологически активные вещества

МДА - малоновый диальдегид

4-ПК - 4-пентеноевая кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

Тираж 100 экз. Заказ 1099. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. (3822) 533018.

Актуальность проблемы.

Многоплановые и интенсивные нагрузки, испытываемые современным человеком, сопряжены с высоким уровнем психо-эмоционального напряжения и риском развития пограничных психопатологических состояний. В популяционных исследованиях синдромально очерченные тревожные расстройства диагностируются у 6,5% населения [128], а в течение жизни - у 25-50% [16, 90]. Отдельные симптомы тревоги или субсиндромальные тревожные расстройства проявляются свыше, чем у 70% населения [56, 85].

Тревожные расстройства встречаются как в рамках нарушений психической деятельности, так и входят в структуру многих соматических и неврологических заболеваний. Они являются одним из самых распространенных психопатологических состояний у пациентов соматической сети [6, 42]. Медико-социальные исследования показывают, что повышенная тревожность увеличивает вероятность инфаркта миокарда в 2,3 раза и внезапной смерти в 4,5 раза. Треть от всех затрат на лечение психических заболеваний приходится на лечение тревоги [16, 182].

Тревожные расстройства являются пограничным состоянием системы психической адаптации и характеризуются обратимостью изменений в инте-гративной деятельности, прежде всего, нарушаются поиск, восприятие, переработка информации и эмоциональное реагирование [8]. В развитии тревожных расстройств значительную роль играет дефицит энергетического обеспечения психофизиологических процессов [7].

Известен широкий спектр лекарственных средств - анксиолитиков, ослабляющих не только психические проявления тревоги, но и процесс ее соматизации. Наиболее популярны анксиолитики бензодиазепиновой структуры [120, 163]. Они оказывают выраженное противотревожное действие -уменьшают тревогу, беспокойство, повышают резистентность к стрессоген-ным факторам, но не лишены побочных эффектов - вызывают дневную сонливость, нарушение когнитивных процессов, формирование лекарственной зависимости [115, 158]. Перечисленные побочные эффекты ограничивают применение синтетических анксиолитиков, так как они нарушают важные функции высшей нервной деятельности и снижают качество жизни пациентов. Кроме того, столь активные лекарственные средства, как бензодиазепи-новые анксиолитики, в основном рекомендуются больным с клинически очерченными синдромами тревожного расстройства.

В настоящее время в психофармакологии приоритетное значение придается безопасности лечения, акцентируется внимание на важности сопоставления клинической эффективности (польза лечения) и нежелательного, побочного действия (риск лечения). Отсутствие безопасных анксиолитиков, не оказывающих побочных эффек-тов, делает актуальным разработку и внедрение во врачебную практику новых препа-ратов с противотревожным действием [81].

С целью коррекции легких субсиндромальных и вегетативных проявлений тревоги успешно используют лекарственные средства растительного происхождения [24, 41, 64, 129, 166, 180]. В клинической практике применяют препараты валерианы, пустырника, шлемника байкальского и другие растительные средства для уменьшения внутреннего беспокойства, страха и тревоги. По данным ВОЗ предпочтение лекарственным средствам растительного происхождения отдают 80% населения планеты, при этом доверие пациента к лекарству - важный фактор, способствующий успеху лечения [72, 179].

Перспективным растением является лабазник обыкновенный (Filipéndula vulgaris, сем. Rosaceae). Водный экстракт надземной части лабазника обыкновенного обладает антиоксидантным, противогипоксическим и ноотропным действием [80]. Представляется актуальным изучить в эксперименте противотревожные эффекты экстракта лабазника обыкновенного и его влияние на биоэнергетику головного мозга при моделях тревоги и энцефалопатии.

Цель работы.

Изучение влияния экстрактов лабазника обыкновенного и фракций наиболее активного экстракта на поведение животных при моделях тревоги и на биоэнергетику головного мозга при экспериментальной энцефалопатии.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение животных при моделях тревоги.

2. Исследовать фитохимический состав экстракта лабазника обыкновенного, обладающего наибольшим противотревожным действием. Определить группы биологически активных веществ экстракта лабазника обыкновенного, отвечающие за противотревожный эффект.

3. Исследовать противосудорожное влияние водного экстракта лабазника обыкновенного при экспериментальных судорожных состояниях, вызванных нейротоксинами бикукуллином и тиосемикарбазидом.

4. Изучить влияние водного экстракта лабазника обыкновенного на функцио-нальное состояние системы митохондриальной энергопродукции и перекисное окисление липидов в головном мозге при экспериментальной энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением (3-окисления средне- и длинноцепочечных жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой).

Научная новизна.

Впервые изучено влияние водного и водно-этанольных экстрактов надземной части лабазника обыкновенного на поведение животных при моделях тревоги. Установлено, что водный экстракт лабазника в дозе 50 мг/кг обладает максимальной противотревожной активностью при стрессе новизны, снижает эмоциональную реакцию на внешние раздражители и уровень агрессии при попадании животных в конфликтную ситуацию. В составе водного экстракта лабазника обыкновенного наиболее полную сумму веществ фенольной природы содержит этилацетатная фракция, она оказывает более выраженный противотревожный эффект при моделях тревожных состояний по сравнению с действием бутанольной фракции и водного остатка. Впервые показано, что водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели митохондриального дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирования, снижает интенсивность процессов липопероксидации при энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением (3-оки-сления жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой). Энерготроп-ное действие водного экстракта лабазника обыкновенного сопровождается активацией быстрого пути доставки восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь митохондрий головного мозга.

Практическая значимость работы.

Водный экстракт лабазника обыкновенного оказывает выраженное противотре-вожное действие при моделях тревожных состояний в эксперименте. В отличие от экстракта валерианы водный экстракт лабазника обыкновенного не угнетает исследовательскую активность животных. Водный экстракт лабазника обыкновенного улучшает биоэнергетический метаболизм головного мозга при моделях постгипоксической и токсической энцефалопатии. Установленные особенности механизма противо-тревожного действия и выраженный положительный энерготропный эффект обосновывают необходимость углубленного доклинического исследования водного экстракта лабазника обыкновенного для создания фитоанксиолитика, эффективного при невротических и тревожных расстройствах, сопряженных с нарушениями биоэнергетики головного мозга.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, «открытое поле», тест эмоциональной реакции) наибольшее противотревож-ное действие оказывают водный и 95% водно-этанольный экстракты лабазника обыкновенного. Основными компонентами водного экстракта надземной части лабазника обыкновенного, оказывающими противотревожное действие, являются простые фенолы, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые и тритерпеновые кислоты.

2. Водный экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг повышает эффективность ориентировочно-исследовательского поведения, увеличивает двигательную активность животных в условиях стресса новизны, снижает проявления агрессии при воздействии внешних раздражителей, повышает стрессоустойчивость в конфликтной ситуации.

3. При моделях энцефалопатии, вызванной гипоксической травмой и нарушением (3-окисления жирных кислот (интоксикация 4-пентеноевой кислотой), водный экстракт лабазника обыкновенного проявляет более выраженные энерготропные и антиоксидантные свойства по сравнению с действием экстракта валерианы. В механизме противотревожного действия этих растений участвуют антиоксидантный эффект и восстановление регуляции энергетического обмена в головном мозге.

Апробация работы.

Материалы работы обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета и лаборатории физиологии, молекулярной и клинической фармакологии НИИ фармакологии СО РАМН (2008-2011), научно-практической конференции «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009), Российском XI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), симпозиуме «Фармакологическая регуляция энергетического обмена» (Томск, 2010), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010), Российском XII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2011), региональном семинаре «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (Томск, 2011), конкурсе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2011). Материалы диссертации опубликованы в 10 научных статьях и материалах конференций, в том числе 5 статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатской диссертации.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, характеризующей результаты экспериментальных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 125 страницах, иллюстрирована 20 таблицами, 6 рисунками и схемой. Библиография включает 182 источника, из них 99 - зарубежных.

6. ВЫВОДЫ

1. Экстракты надземной части лабазника обыкновенного, полученные извлечением водой очищенной, 40%, 70%) и 95% этанолом, оказывают противо-тревожное действие при моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, «открытое поле», тест эмоциональной реакции). Наибольшее противотревожное действие без подавления ориентировочно-исследовательского поведения оказывает водный экстракт лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг.

2. Водный экстракт лабазника обыкновенного увеличивает двигательную активность и эффективность ориентировочно-исследовательского поведения животных на фоне повышенной писхо-эмоциональной нагрузки, вызванной стрессом новизны, снижает эмоциональную реакцию на внешние раздражители и уровень агрессии в конфликтной ситуации.

3. Максимальное снижение тревожности вызывает этилацетатная фракция водного экстракта лабазника обыкновенного, содержащая наиболее полную сумму биологически активных веществ фенольной природы, включая простые фенолы, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые и тритерпено-вые кислоты.

4. В механизме анксиолитического действия водного экстракта лабазника обыкновенного не участвует влияние на ГАМК-ергическую систему.

5. Водный экстракт лабазника обыкновенного восстанавливает показатели энергетического метаболизма и снижает интенсивность липопероксидации в головном мозге при экспериментальной постгипоксической и токсической энцефалопатии.

6. По противотревожному, антиоксидантному действию и способности улучшать биоэнергетику головного мозга водный экстракт лабазника обыкновенного превосходит препарат сравнения - экстракт валерианы.