Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Аллергологический анализ гриппозных вакцин

Министерство здравоохранения и медицинской -i ОД промышленности РФ

. ГП НПО "Иммунопрепарат" Уфимский НИИВС им. И.И.Мечникова

На правах рукописи

Симонова Эмилия Станиславовна

АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН

14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа 1996

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат".

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор ВА.Стригин Научный консультант: кандидат медицинских наук, с.нх. А.И.Васяев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.А.Польнер доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Медведев

Ведущая организация: Московский НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится 1996 г. в "У& часов

на заседании диссертационного Совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат" по адресу: 450024, г.Уфа, ул. Новороссийская, 105, ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат".

Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат медицинских наук,

С.Н.С. В.П.Головин

© ГП НПО "Иммунопрепарат", 1996

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Непреходящая актуальность проблемы гриппа, связанная с его повсеместным распространением, высокой эпидемической заболеваемостью и тяжелыми последствиями для определенных групп населения, приобрела особую важность в связи с успехами, достигнутыми в последние годы в вакцинопрофилактике. В нашей стране были разработаны и внедрены в практику здравоохранения инактивированные гриппозные вакцины (Соколов H.H. и соавт., 1973; Исупов Ф.Г.,1973; Фридман Э.А. и соавт., 1976; Константинов В.К., 1979). Несмотря на улучшение качества инактивированных вакцин, чему способствовали возросшие технические возможности очистки и концентрирования вируса, получаемые препараты нуждаются в совершенствовании. В связи с массовым применением гриппозных вакцин различного типа необходимо всестороннее изучение их прививочных свойств и безвредности, так как они могут давать осложнения аллергической природы.

Проблема аллергенности гриппозных вакцин исследовалась многими авторами. М.А.Бичурина и соавт. (1981), Н.Р.Розаева (1985), Davies R. et al. (1976), Miller G.R. et al. (1983) и другие важнейшим фактором аллергенности гриппозных вакцин считают содержащийся в них яичный белок. Nyegres G. et al. (1982), Muller M. (1982) одну их причин аллергенности гриппозных вакцин видят в гидроокиси алюминия и фосфате алюминия, находящихся в вакцине в качестве сорбента. А.Т.Кравчеико и соавт. (1986), Weuffen W. (1975); Moller Н. (1977), Osanva J. et al. (1991) отмечают, что мертиолят, прибавленный к вакцинным препаратам, может вызывать аллергические реакции. Ж.Генци (1983) приводит данные по аллергенности самого вируса гриппа.

Указанные сведения заставляют более полно изучать эти препараты, обосновывать оптимальные комбинации компонентов инактивированных гриппозных вакцин и на основе этого разрабатывать новые их формы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось комплексное исследование основных факторов инактивированных гриппозных вакцин, способствующих проявлению аллергенного потенциала препарата. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Изучить основные факторы аллергенности адсорбированных гриппозных вакцин, их влияние на анафилактогенность и синтез гомоцитотропных антител.

2. Сравнить степень аллергенности гриппозных препаратов с полнотой очистки их от примесей овальбуминовой и неовальбуми-новой природы.

3. Провести сравнительный анализ аллергенности отечественных и зарубежных ИГВ.

4. Исследовать вероятность сенсибилизации людей, привитых адсорбированной гриппозной вакциной.

5. Провести сравнительную оценку аллергенности гриппозных вакцин в зависимости от способа их введения.

6. Экспериментально обосновать медико-биологические требования к мазевой форме ИГВ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые с использованием ряда аллергологических методов изучены сенсибилизирующие свойства сорбированных инактивиро-ванных гриппозных вакцин, показана роль сорбента как фактора аллергенности и установлена его доза в вакцине, не усиливающая сенсибилизирующих свойств препарата. Показана зависимость аллергенности ИГВ от вида сорбента.

Установлена обратная зависимость аллергенности современных ИГВ от степени очистки их от примесного овальбумина. Определены пороги сенсибилизирующих доз овальбумина в опытах на животных.

Исследована роль вируса гриппа в реактогенности ИГВ, выяснена способность вирнона вируса сенсибилизировать организм и его роль в аллергенности ИГВ.

Исследовано значение мертиолята, содержащегося в качестве консерванта в гриппозных вакцинах, в проявлении аллергенности препарата. Определены дозы компонентов ИГВ, являющиеся безопасными. Впервые оценено влияние компонентов гриппозных вакцин комплексно, с применением набора аллергологических тестов in vivo и in vitro. ИГВ оптимизированы по составу с учетом сниженной аллергенности и достаточной иммуногенности.

Дана аллергологическая оценка отечественных и зарубежных ИГВ. Впервые проведен сравнительный аллергологический анализ спо-

собов введения ИГВ. Показана перспективность применения интра-назальной аппликации мазевой формой ИГВ для иммунизации населения с целью формирования выраженного секреторного иммунитета.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Материалы, полученные в процессе выполнения данного исследования, позволяют:

- более обоснованно дозировать содержание овальбумина в ИГВ;

- при конструировании ИГВ учитывать преимущества фосфата алюминия как адьюванта, а также возможность выпуска вакцины без мертиолята;

- использовать наиболее безопасные способы аппликации вакцин, рекомендовать интраназальнуго аппликацию ИГВ как наиболее пер-спективщто;

- ставить вопрос о целесообразности выпуска мазевой формы препарата. По материалам работы подана заявка на изобретение «Средство для интраназалъной профилактики гриппа», получено положительное решите от от 03.96 г. № 94020944. Составлен проект временной фармакопейной статьи на препарат "Антигриппин", одобренный научно-техническим советом ГП НПО "Иммунопрепарат". Проблемная комиссия ГП НПО «Иммунопрепарат» своим решением от 15.09.95 г. предложила НИИВС и цеху гриппозных вакцин ускорить разработку новых лекарственных форм препарата, учитывая данные настоящей диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Безвредность инактивированных гриппозных вакцин обеспечивается высокой очисткой вируса от компонентов аллантоисного происхождения. Это положение позволило обосновать и сформулировать требования к степени очистки гриппозных вакцин от овальбумина.

2. Поскольку адьюванты минерального происхождения А1/ОН/3 и А1РО,, находящиеся в гриппозных вакцинах, усиливают аллерген-ность этих препаратов, необходимо нормирование содержания сорбентов в вакцинах.

3. Аллергенность ИГВ зависит во многом от содержания гемагглютинина в вирусе гриппа, поэтому необходимо оптимальное

соотношение его в вакцине с учетом сниженной аллергенности и достаточной иммуногенности.

4. Мертиолят, содержащийся в качестве консерванта в гриппозных вакцинах, не способствует повышению сенсибилизирующих свойств препарата, возможно исключение его из состава вакцины.

5. Современные ИГВ отечественного производства в сравнении с зарубежными образцами практически лишены аллергизирующе-го действия.

6. Интраназальное введение мазевой формы ИГВ является наименее сенсибилизирующим способом из числа изученных, обеспечивающих достаточно высокую иммуногенность и являющихся индивидуальным, наиболее доступным средством профилактики гриппа и ОРЗ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные материалы исследований доложены на:

- Республиканской научно-практической конференции «Научно-практические вопросы производства, контроля и стандартизации бактерийных и вирусных препаратов",Уфа, 1986 г.;

- Республиканской научно-практической конференции "Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопрепаратов", Уфа, 1987 г.;

- Республиканской научно-практической конференции "Вопросы гигиены в условиях научно-технического прогресса",Уфа, 1988 г.;

- Республиканской научно-практической конференции "Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопрепаратов",Уфа, 1988 г.;

- Международном симпозиуме "Актуальные проблемы практической аллергологии и клинической иммунологии", Алма-Ата, 1992 г.;

- Международной научной конференции "Актуальные вопросы современной вирусологии", Екатеринбург, 1995 г.;

- Международном симпозиуме, посвященном 150-летию со *дня рождения И.И.Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС

им. И.И.Мечникова ГП НПО "Иммунопрепарат", Уфа, 1995 г.

ОБЪЕМ II СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 145 страницах машинописи, иллюстрирована 25 таблицами и 6 рисунками. Она состоит из оглавления,

введения, обзора литературы (3 главы), раздела собственных исследований (2 главы), заключения, выводов, библиографического указателя, содержащего 278 источников (130 отечественных и 148 инострашгых).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучена аллергенность коммерческих и экспериментальных серий инактивированных гриппозных вакцин элюатно-центрифужных, полученных ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы /СССР, США/; хроматографических, полученных комбинацией методов гельфильтращш на МПС-2000 и улътрафильтра-ции на ядерных фильтрах; адсорбированных гриппозных химических вакцин, в которых обработанный эфиром очищенный концентрат вируссодержащего материала сорбирован на геле гидроокиси алюминия; вакцины элгоатно-центрифужной в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, полученной адсорбцией - эгаоцией на формализированных эритроцитах кур с последующим центрифугированием. В работе использованы оригинальные и эталонные штаммы вируса гриппа типа А /Ленинград/399/76/Н3 И,, А/Виктория Н,К, А/ХарьковН2М2, В/Харьков, А/Миссисипи Н,Н, и др. Мембранный белок вирусов, концентраты вирусов и ИГВ были получены в отделении гриппозных вакцин НПО «Иммуно-препарат» и НИИ гриппа (С-Петербург). В работе использованы следующие вещества:

- альбумин яичный 5-кратной (ТУ 10П-169-68 или производства ПНР) или 1-кратной (ТУ 10П-169-68) кристаллизации;

- гидроокись алюминия - А1/ОН/3;

- фосфат алюминия - А1Р04;

- гистамин дигидрохлорид - С5Н91Ч3 2НС1 по ФС 42-256-72 (0,1% раствор);

- синька Эванса - С34Н.,4М6Ка40|4*40, производства фирмы Исаи а] (Венгрия). Эксперименты выполнены на 1580 морских свинках массой (250±50 г), 30 кроликах породы шиншилла массой (1,5+0,5 кг), 40 крысах массой (150±30 г), 330 беспородных белых мышах из питомника лабораторных животных НПО «Иммунопрепарат», 100 мышах линии СВА массой (14±2) г, полученных из питомника лабораторных животных «Раппелово» РАМН.

В работе использовались следующие методы: 1 .Определение аллергенности гриппозных вакцин в системной анафилаксии.

Морских свинок иммунизировали внутримышечно, подкожно, интраназально или аэрозольно с интервалом 28±5 дней. Разрешали, вводя внутривенно 1 мл 0,1% или 1% раствора яичного альбумина (ЯА). Результаты учитывали по выживаемости в течение часа после разрешения антигеном и оценивали по индексу \VeigIe ^'.0 (1960,1961), который исчисляли по формуле:

4а+3в+2с+1д+0е WCД= -п-

где

А - число животных, погибших от анафилактического шока, В - число животных с тяжелыми симптомами (сильный зуд, боковое положение),

С - Число животных с умеренными симптомами (зуд, одышка, беспокойство),

О - число со слабыми симптомами (слабый зуд. взъерошенность шерсти),

Е - число животных без симптомов шока, П - общее количество животных.

2. Исследование сенсибилизирующих свойств мертиолята проводили по методике А.Т.Кравченко и соавт. (1986) на морских свинках.

3. Анафилактическую контрактуру подвздошной кишки воспроизводили по Шульц-Дейлу (Кэбот Е. и соавт., 1968; Блаттнер.Р. и соавт., 1983). Для количественной оценки контрактуры использовали метод "гистаминовых эквивалентов" (Halpern B.I. et al., 1959).

4. Пассивную кожную анафилаксию воспроизводили по Z.Ovary (1953, 1954, 1958) на морских свинках с белой шерстью. Через 3 и 7 суток реакцию оценивали по величине и интенсивности окраски пятна на месте введения иммунной сыворотки после внутривенного введения 0,1% ЯА по формуле:

ПКА=/Д, + Д2/ К 2

где

Д, и Д2 - взаимно перпендикулярные диаметры пятна (в мм)

К - степень окраски пятна по шкале Ovary (1959) (Стрнгин В .А., 1971).

На третьи сутки определяли уровень IgG-антитея, на седьмые - IgE-антител (Andersson Р; 1981).

5. Определения антител к овальбумину в сыворотках морских свинок, иммунизированных гриппозными вакцинами, проводили в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), используя в качестве сенситина яичный альбумин фирмы Fluka (Горбунова A.C. и соавт., 1960; Носков Ф.С. и соавт., 1979).

6. Метод непрямой дегрануляции тучных клеток крыс (I. Sthwarts et al., 1965) воспроизводили на беспородных крысах (самцах).

На предметное стекло, предварительно окрашенное 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного, наносили в строгой последовательности равное количество (0,02 мл) неразведенной исследуемой сыворотки, содержащей антитела (иммунная сыворотка морских свинок, реагиновая сыворотка человека), взвеси тучных клеток и аллергена под покровное стекло. Подсчитывали степень дегрануляции 100 клеток, используя, показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК), (С.Ф. Радунская, 1982).

7. Метод прямой дегрануляцни тучных клеток воспроизводили по модифицированной методике С.Ф.Радунской (1982).

На предметное стекло, окрашенное 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного, наносили 0,05 мл перитониаль-ной взвеси крыс, иммунизированных опытными сериями ИГВ и добавляли специфический антиген /0,05 мл/ - яичный альбумин. Подсчитывали степень дегрануляции на 100 клеток по формуле:

1а+2в+4с+8д Кпдпс = Щ

где а, в, с, д - число дегранулнрованных клеток соответствующей сте

пени дегрануляции, 1, 2, 4, 8 - выражение степени дегрануляции тучных клеток.

8. Непрямой базофильный тест воспроизводили по методике - Shelley \V.(1963) в модификации A.A. Польнера (1968).

На предметное стекло, предварительно окрашенное 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного, наносили 50 мкл лейкоцитарной взвеси, полученной из крови кролика, исследуемую сыворотку от людей или животных, иммунизированных гриппозными вакцинами или ее компонентами, и аллерген; осторожно смешивали и покрывали покровным стеклом. Подсчет результатов

производили, вычисляя на 100 базофилов процент морфологически измененных клеток в опьгге и контроле.

9. Прямой базофильный текст воспроизводили по методике Shelley W. (1963) и А.А.Польнера (1968). Лейкоциты для реакции получали из венозной крови лиц, иммунизированных ИГВ. На предметное стекло, окрашенное 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного, наносили 50 мкл лейкоцитарной взвеси больного и антигена. Подсчет производи.™ так же, как при постановке непрямого базофильного теста.

10. Радиоиммунный анализ. Для обнаружения в сыворотках привитых гриппозными вакцинами IgE-ангител применяли радиоаллергосорбентный тест (PACT) с наборами PACT фирмы Фадебас PACT (Швеция) в модификации Hamburger R et al. (1980), Thilmlier M. (1987). Для подсчета общего IgE - метод ПРИСТ с наборами Фадебас IgE ПРИСТ фирмы "Farmacia Diagnostics".

11. Определение общего белка в ИГВ осуществляли по методу Лоури, а также с помощью спектрофотометра СФ-16 и колориметра фотоэлектрического КФК-2МП.

Статистическою обработку результатов производили на основе общепризнанных статистических методов (Ойвин И.А., 1960; Ащ-марин И.П., 1962; Беленький М.А., ]963) на персональной ЭВМ с помощью разработанных программ. Достоверными считали различия при вероятности возможной ошибки (Р) меньше 0,05.

В таблицах приведены средние величины со стандартной ошибкой (М+м).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение основных факторов аллергенностп сорбированных гриппозных вакцин

Множеством исследований показана роль овальбумина как главного антигена жидкости куриного эмбриона, в аллергенностп гриппозных вакцин и необходимость его количественного контроля и нормированы в ИГВ (М.АБичурина и соавт., 1981; Ф.С.Носков и соавт., 1985; Jamane N., 1988 и др.).

Вначале нами были исследованы 10 производственных серий АГХ-вакцины, содержащие разное количество OA (от 0,05 до -1,0 мкг/мл) и одинаковое количество гидроокиси алюминия (1,14 мг/дозу). При этом была установлена зависимость анафилактогенности препарата от содержания OA и показано, что

наибольшей анафилактогенностыо обладали препараты, содержащие максимальное количество ОА (1,0 мкг/мл).

Нам представлялось необходимым установить пороговую максимально допустимую концентрацию ОА в ИГВ, не вызывающую сенсибилизацию.

В опытах на животных, иммунизированных экспериментальной ИГВ с одинаковым содержанием адыованта и с разными количествами ОА (от 0,5 мкг/мл до 0,004 мкг/мл), было установлено, что наибольшей анафилактогенностыо обладали модели вакцины с содержанием ОА 0,5 и 0,1 мкг/мл, концентрация же ОА - 0,004 мкг/мл была неаллергенной. Результаты исследований на модели анафилаксии коррелировали с данными ПКА и НДТК.

Сравнивая аллергешюсть экспериментальной ИГВ с уменьшенным содержанием ОА и чистого препарата яичного альбумина в одинаковых концентрациях, мы показали, что концентрации ОА в вакцине 0,001 и 0,0001 мкг/мл являются слабоаллергенными и не вызывают сенсибилизацию оргашпма животных. Учитывая данные литературы, максимальной неаллерг.ешюй дозой ОА в ИГВ определили 0,004 мкг/мл.

Результаты опытов отражены на рис.1.

РнсЛ. Зависимость аллергенное™ экспериментальной ЛГВ от содержания в

ней овальбумина, определяемая в реакциях ПКА >1 НДТК.

1 - показатели ПКА с -АТ.

2 - показатели НДТК.

Нами было обращено особое внимание на изучение сорбента как фактора, повышающего аллергенность вакцины. Были проведены эксперименты с препаратами, содержащими одинаковое количество ОА при различном содержании сорбента (от 0,1 до 3,0 мг/дозу). Мы установили, что и анафилактогенность вакцины, и уровень выработки гомоцитотропных антител повышались по мере увеличения содержания сорбента в вакцине. Данные клеточных тестов (НДТК, НБТ) подтвердили эти результаты: выраженные реа'кции дегрануляции тучных клеток и базофильных лейкоцитов наблюдались при более высоком содержании сорбента в вакцине (2,0 - 3,0 мг/дозу) и были минимальными при 0,5 и 0,1 мг/дозу.

Чтобы изучить влияние вида сорбента на аллергенность сорбированной ИГВ, были подготовлены экспериментальные серии этой вакцины, идентичные по всем параметрам, кроме адыованта -гидроокиси алюминия и фосфата алюминия. Показано, что вакцина, приготовленная на фосфате алюминия, была менее аняфилактогснной, чем содержащая гидроокись алюминия.

Для установления наиболее безопасной комбинации компонента в сорбированной ИГВ, мы провели ряд экспериментов, где использовали ИГВ типа А, сорбированную на гидроокиси алюминия и фосфате алюминия в различных концентрациях (от 0,5 до 3,0 мг/дозу). При этом явлений анафилаксии не было зарегистрировано в группе животных, получивших вакцину с небольшими дозами сорбента. Здесь также более безопасным оказался фосфат алюминия (рис.2).

В результате проведенных исследований было установлено, что 1,0 -1,14 мг/дозу гидроокиси алюминия и фосфата алюминия является оптимальной дозой по иммуногенности и не усиливающей сенсибилизацию организма.

В следующей части работы мы изучили влияние на аллергенность ИГВ неорганических (А1 (ОН)3, А1Р04, ГМДП, ДЕАЕ, сульфат-декстрана) и органических (НАФ, карбоксиметилцеллюлоза, метилцел-шолоза) адыовантов. При этом была показана незначительная аллергенность вакцины с неорганическими адыовантами. Вакцины с органическими адьювантами - метилцеллюлозой и карбоксиметилцеллюло-зой обладали как низкой аллергизирующей способностью, так и достаточной иммуногенностью, что делает эти адъюванты перспективными стимуляторами иммуногенеза (рис. 3).

К и IV

пка Д

5,0 5.0

4,0 __

3,0 2,0 1,0 0,5

-1-1-1-1-

0,1 0,5 1,0 2,0 3,0

Рнс.2. Зависимость аллергенности экспериментальной А1 Л-вакцины от содержания в ней сорбента А1 (ОН)3 и Л1РО^, определяемая в реакциях ПКА и 1ЩТК.

1 - показатели ПКА с ¡£Е-АТ

2 - показатели НДТК

А,В - сыворотки морских свинок, иммунизированных ИГВ А1(ОН), Б,Г - сыворотки морских свинок, иммунизированных ИГВ с А1РО^

1УС 3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

Г)

Ж

ш

ш

11 ёШ

Шг

ш Шё

ш

Рис. 3 Аллергснность ИГВ с различными адыовантами

1-ИГВсНАФ Р, ,<0,001

2 - ИГВ с А1/ОН/, Р2 , <0,01

3 - ИГВ с А1 /ОН/, Р,',<0<01

4 - ИГВ с ДЕАЕ Р4,!><0'01

5 - ИГВ с карбокслметллцеллюлозоп

Р„<0,05

6 - ИГВ с метнлнелгаолозой

Р4,<0.05 7-ИИГВсГМДП Р,',>0,1 8 - ИГВ с су льфатдекстраном Р,9>0,1 9-ИГВ

* достоверность (Р)

* *

(6 |р|

—йс ¡1(3;.:

л 6

Эффективность использования липосом в качестве адъювантов показана для ряда вирусных антигенов, в том числе для поверхностных гликопротеидов вируса гриппа. Нами исследовалось протектив-ное действие антигенов вируса гриппа при включении их в липосомы. Была проведена иммунизация мышей антигеном вируса гриппа в свободном виде, антигеном, включенным в липосомы, и липосомами без антигена. Липосомы получали методом обращенных фаз из яичного лецитина и холестерина в малом соотношении 10:4 в НИИ гриппа (С.-Петербург). При 2-кратной (25 мкг/мышь внутрибрюшинной иммунизации гемагглютинина (ГА) наибольшее защитное действие против заражения оказывали антигены, включенные в липосомы. Липосомы без антигена не влияли на размножение вируса в легких на 5 сутки. В неиммунизированной контрольной группе выживало лишь 5% мышей. Выживаемость мышей, иммунизированных антигеном вируса гриппа, включенным в липосомы, составила 88%, тогда как у иммунизированных животных антигенами вируса без липосом - 50%. У животных, иммунизированных ИГВ и ИГВ с липосомами, явлений анафилаксии не отмечено.

Противоречивость данных литературы (Ж.Генци, 1983; М.А.Бичурина, 1987; А.Б.Жебрун и соавт., 1987 и др.) побудила нас провести исследования роли самого вируса гриппа в аллергешюсти гриппозных вакцин. Наши опыты показали, что вирусы гриппа А/Виктория Н^ и В/Панама при больших концентрациях ГА способны сенсибилизировать морских свинок к гомологичному антигену. Весь использованный вирусный материал сенсибилизировал животных к ОА, как мы полагаем за счет примесей невирусной природы. Результаты опытов' приведены в таблице 1.

Далее наши исследования проводились с использованием одного из вирусных компонентов - мембранного белка. Животных иммунизировали АГХ-вакциной с добавлением мембранного белка и без него, а также одним мембранным белком (300 мкг/мл). Было установлено, что мембранный белок обладал достаточно выраженной аллергенностыо (индекс - 2,0), а добавленный к сорбированной

гриппозной вакцине увеличивал ее аллергенный потенциал.

При изучении роли полноты расщепления вирионов три группы морских свинок были иммунизированы интактным и расщепленным вирусом гриппа А/Миссисипи Н^ 3, ГА-150 мкг/мл, ОА-0,1 мкг/мл. Отмечено, что расщепленный вирус гриппа был менее аллергенен, чем интактный.

Таблица 1

Изучение вирусного компонента гриппозной вакцины

Кол- Кол- Индекс V/СД

Препарат во жи- во ГА Разрешение НДТК (Кд) с ОА

вотных мкг/ мл вирусом Л/Виктория вирусом В/Панама ОА

Контроль ОА 0,01 мкг/мл 10 0 0 2.2 0,56 ± 0.03

Вирус А/Виктория Н N /ОА-0,01 мкг/мл 10 140 1.0 0 1.4 0.36 ± 0.063 Р, <0.01

И II 10 36 0 0 1.0 0.11 ±0.01 Р;;<0.01

10 14 0 0 0 -

Вирус №сВ-31 ОА -0,01 мкг/мл 10 36 0 0 1.0 0.18 ± 0.024 Р <0.01

Вирус В/Панама О А - 0,01 мг/мл 10 50 0 1.0 1.2 0.26 ± 0.043 Р, <0.05 1,6

АГХ-вакщша с А/Викторией ОА - 0,004 10 36 - - 4.0 0.62 ± 0.032 Р <0,1 1,7

мкг/мл

Далее нами было предпринято исследование по выяснешпо влияния на аллергенносгь ИГВ вида штамма вируса гриппа и количества ГА в нем. Животных иммунизировали подкожно и интраназально 2-кратно концентратом вируса гриппа А и В с содержанием ГА от 36 до 750 мкг/мл (общий белок 40-50 мкг), а разрешали ЯА. Полученные результаты свидетельствуют о том, что аллергенносгь всех использованных штаммов вируса была незначительной и зависела от концентрации ГА. Здесь наблюдалась прямая корреляция между

выраженностью анафилаксии и количеством ГА в вирусе. При увеличенных дозах ГА в концентрате соответственно увеличивалась сенсибилизирующая способность вируса.

Обобщая данные, полученные в ходе эксперимента, можно заключить, что хотя вирус гриппа может сенсибилизировать организм к гомологичному вирусу, 1ю все же роль собственно антигенов вируса гриппа в аллергенности ИГВ незначительна, с учетом вероятности контаминации невирионньши примесями, а также регулярной замены штаммов, входящих в состав вакцин, производимой ввиду естественной изменчивости возбудителя. Здесь также необходимо иметь ввиду то, что вирус гриппа является интерфероногеном, способным подавлять аллергические феномены (В.А.Пшеничников и соавт., 1988; Е.Мирчинк и соавт., 1991; В.А.Стригин и соавт., 1993 и др.).

Учитывая полемику среди исследователей (А.Т.Кравченко и соавт., 1986; Ф.Н.Рейзин, 1987; В.А.Фрадкин и соавт., 1994 и др.) о сенсибилизирующих свойствах мертиолята (тимеросала), применяемого в качестве консерванта МИБП, дальнейшие наши исследования мы посвятили этому вопросу. В проводимых опытах мы стремились выяснить сенсибилизирующие и токсические свойства мертиолята в составе ИГВ, а также возможность их выпуска без добавления консерванта.

Результаты экспериментов показали, что сенсибилизацию животных с помощью мертиолята, а также мертиолятом с добавлением гомологичной сыворотки или гидроокиси алюминия вызвать не удается. Не выявлено различий в интенсивности проявлений анафилаксии у морских свинок, иммунизированных АГХ-вакциной с мертиолятом и без него (Р<0,1).

С целью проверки возможности выпуска ИГВ без мертиолята в условиях производства НПО "Иммунопрепарат", были изготовлены 4 серии АГХ-вакцины с добавлением и без добавления консерванта. Препараты закладывали на хранение и по истечении 7-10 месяцев было показано, что вакцина без мертиолята по всем параметрам (стерильность, иммунногеность, безвредность и др.) существенно не отличалась от консервированной.

Специальные исследования были проведены для выяснения токсичности мертиолята. Отмеченная токсичность мертиолята для животных при введении им больших доз консерванта (до 500 мкг), не проявлялась при использовании его в малых концентрациях (50 и 100 мкг).

Исследования цитотоксичности мертиолята на культуре

клеток Ь-41 (дериват НеЬа) и куриных фибропластах показали, что доза консерванта 1:10000 обладала выраженным цитотоксическим эффектом, более высокие разведения мертиолята не позволяли выявить видимых изменений клеточных культур.

2. Аллергенность различных видов ИГВ

Нами проведен сравнительный анализ аллергенностн. современных отечественных и зарубежных ИГВ, изготовленных с применением различных технологий. Все изученные нами серии ИГВ (до 5 на каждый вариант) содержали не более 150 мкг/мл общего белка и до 0,004 мкг/мл OA, тогда как в требованиях к зарубежным вакцинам допускается наличие 280-300 мкг/мл общего белка и до 0,1 мкг/мл OA (Женева, 1991). В результате было отмечено, что отечественные ИГВ имеют преимущества по сравнению с зарубежными современными препаратами. Очищенные трехкомпонентные элюатно-центрифужные и хроматографические ИГВ НПО "Иммунопрепарат" (Уфа) и НИИЭМ им.Пастера (С.-Петербург) были наименее аллергенными из исследованных вакцин. Результаты исследования представлены на рисунке 4.

WCD

3,0

2,5 _.

2,0 ..

1,5 ._

1,0

ш в

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Анафнлатгогенность отечественных

зарубежных ИГВ По оси абцпсс - ИГВ

По оси ординат-величина индекса \\'СП

1 - АГ-вакцина (НПО "Иммунопрепарат"

2 - ИГВ А,А, (НПО "Иммунопрепарат")

3 - ИГВ А(А,В (НПО "Иымунопрепрат"

4 - ИГВ А 1! В (НИИЭМ. С.-Петербург)

5 - "Мутагрппп" А^Ч^ (Германия)

6 - "Ваксигрипп" -3 А,А2В (Германия)

7-ИГВ А, А2 (США)

8-ИГВ А л В (США)

Уфа)

P,'5j<0,05

Р,4>0,1 Р, 5<0.001 Р,,<0,001 Р, ,<0,05

i

3. Исследование возможной сенсибилизации людей, привитых гриппозными

вакцинами

На Международном симпозиуме по стандартизации МИБП и совещании ВОЗ (1982) поднимались вопросы по профилактике аллергических заболеваний и было обращено серьезное внимание на необходимость детального изучения влияния вакцинации (особенно противовирусной) на уровень IgE и формирование аллергического фенотипа.

Для установления аллергизирукяцего действия вакцинации АГХ-вакциной мы определяли общий IgE в сыворотках привитых людей с наборами Фадебас IgE ПРИСТ фирмы «Фармация» и специфические IgE-антитела с наборами PACT фирмы Фадебас PACT (Швеция). IgE определяли в сыворотках людей, привитых вакциной и плацебо, а также в парных сыворотках до и после вакцинации. Вторые сыворотки брали через месяц после вакцинации. В части опытов исследовали только вторые сыворотки, и в этом случае сравнивали средние показатели в группах. Сыворотки шифровались и расхождений в результатах не было. Результаты исследования показали, что существенной разницы в суммарном содержании IgE в сыворотках людей, получивших вакцину или плацебо, а также в парных образцах не обнаружено. Анализ парных сывороток установил, что вакцинируемые неоднозначно отвечали на препараты. Так, в 20-25% случаев обнаружено повышение уровня IgE на 10% и более. В 38% отмечено снижение уровня в тех же пределах. В контрольной группе в 60% исследоваш£Ых сывороток достоверных изменений не обнаружено.

В аллергологическое обследование привитых ИГВ в последнее время активно включаются клеточные тесты (Т.В.Тенькова и соавт., 1985; Г.Ф.Шпилюк и соавт., 1986 и др.).

Нами в тесте НДТК были исследованы сыворотки людей, привитых АГХ-вакциной, с различным содержанием общего IgE и различным уровнем IgE-антител. В опыте были задействованы лишь вторые сыворотки привитых. Полученные данные свидетельствуют о том, что существует прямая корреляция между содержанием в сыворотках общего IgE и реагиновыми антителами, вызывающими дегрануляцию тучных клеток при воздействии специфических антигенов. С помощью теста НДТК было также установлено аллер-гизирующее действие вакцины на привитых, если у них был повышенный уровень общего IgE и специфических IgE-антител (табл.2).

В данных исследованиях было замечено, что часть сывороток, взятых до прививки у волонтеров, давала положительные реакции в

тесте НДТК. У этих же людей отмечался повышенный уровень содержания общего 1§Е. В наших наблюдениях отмечено 20% таких случаев. Эти материалы свидетельствуют, по-видимому, о наличии у части населения сенсибилизации к вирусу гриппа или яичному альбумину, а также об общем повышенном аллергическом фоне.

Таблица 2

Исследование сывороток привитых АГХ-вакцинон в тесте НДТК и определение общего и специфических ^Е-антптел

№ сыворотки Концентрация общ. ^Е ед/мл Спсцнфич. 1§Е (класс) НДТК(Кд)

с ОА с ЦЯ

1 16 0 0.10 ± 0.020 0.2 ± 0.018

2 23 1 0.20 ± 0.03 0.23 ± 0.024

3 28 1 0.25 ± 0.08 0.29 ± 0.03

4 40 1 0.32 ± 0.07 0.33 ± 0.08

5 43 1 0.39 ± 0.02 0.38 ± 0.04

6 98 2 0.48 ± 0.08 0.42 ± 0.07

7, 112 2 0.49 ± 0.02 0.45 ± 0.06

8 123 2 0.53 ± 0.09 0.58 ± 0.04

9 127 2 . 0.54 ± 0.04 0.58 ± 0.03

10 320 3 0.79 ± 0.06 0.83 ± 0.08

Примечание. Уровень общего в сыворогке крови у здоровых лиц -265-65 ед/л.

Уровни специфических ^Е-АТ:

0 - атопическое происхождение маловероятно,

1 класс - низкая степень сенсибилизации,

2 класс - средняя,

3 класс - высокая,

4 класс - очень высокая степень сенсибилизации.

4. Влияние способа аппликации ИГВ на их аллергенность

Актуальной задачей является разработка методов аппликации ИГВ, изучение их иммуногенного эффекта и безопасности.

Нами были проведены исследования по изучению зависимости аллергенности ИГВ от способа их введения. Первоначально исследовали сенсибилизирующие свойства сорбированной ИГВ при парентеральном введении животным. Вакцина, введенная шгьектором БИ-3, обладала большей аллергенностыо, чем при шприцевых инъекциях. Причем, частота и интенсивность местных реакций на введение АГХ-вакщшы с помощью безыгольного инъектора была выше, чем при введении шприцем. Несмотря на некоторые технические преимущества, применение иньекторов сейчас запрещено в целях недопустимости распространения таких заболеваний, как гепатит и ВИЧ-инфекция.

Учитывая слабую изученность аллергенности ИГВ при пероральном введении (Х.Тишнер и соавт., 1985), нами была проверена аллергенность ИГВ при таком способе ее аппликации. Исследовалась жидкая и таблетированная формы ИГВ (ИГЭЦВ). В результате сенсибилизацию организма удалось уловить лишь в реакции НДТК с сыворотками животных, иммунизированных перорально инкапсулированной или таблетированной формой ИГВ. В то же время как жидкая, так и таблетированная формы ИГВ не индуцировали каких-либо признаков анафилаксии т \1\о.

Были проведены исследования аллергенности ИГВ при аэрозольном введении. АГХ-вакцина, ИГХВ, концентрат вируса гриппа А/Виктория и ЯА морским свинкам вводили аэрозольно в камере (время иммунизации 15-25 минут). Аспирационная доза антигена для животных была от 140 до 1900 Ге/л. Степень сенсибилизации определяли в тесте анафилаксии. В результате была отмечена незначительная аллергешшеть ИГХВ и более высокая АГХ-вакцины, по-видимому, за счет содержания в ней сорбента. Аэрозольное введение животным очищенного концентрата вируса гриппа А/Виктория (ОА - 0,004 мкг/мл) при разрешении им же сенсибилизации не давало. Низкая анафилактогенность ИГВ при аэрозольном введении позволяет рекомендовать этот способ введения вакцины.

Учитывая малочисленность данных об интраназальной аппликации ИГВ, мы сочли необходимым провести исследования ре-актогенности жидкой формы ИГВ при интраназальной аппликации. Результаты этого исследования показали, что такое введение жидкой

ИГВ не вызывало у животных аллергических реакций при введении специфического антигена или степень их проявления была незначительной. Однако при этом титры антивирусных антител оказались очень низкими, по-видимому, из-за потери вакцины за счет ее вытекания.

Руководствуясь этими данными, мы сочли целесообразным предложить мазевую форму ИГВ, которая бы обладала пролонгированным действием, была безвредной и обеспечивала выработку достаточно сильного иммунного ответа. Разработанное нами средство для интр а назально и профилактики гриппа состоит из ИГВ (типов А и В) и мазевой основы - ланолина безводного и вазелинового масла. Мазевая форма ИГВ была исследована на иммуно-генность и аллергенность. Результаты исследования свидетельствуют, что опытные серии ИГВ (8 серий) в мазевой форме позволили получить высокие титры антигемагтлютиннр\тоших антител и не были аллергенными.

Анализ антигенной, активности мазевой формы ИГВ показал, что титры противовирусных антител у животных, имм\тшзированных интраназально мазевой формой ИГВ, были выше, чем у животных, вакцинированных жидкой ИГВ. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Мазевые компоненты (ланолин безводный и вазелиновое масло) предложенной формы ИГВ были проверены в реакциях ГНТ и ГЗТ, но не выявили их аллергенностн. Данные литературы (Муравьев И.А. и соавт., 1988) об аллергнзирующем действии ланолина были учтены, но в концентрации, которая содержится в мазевой форме ИГВ (30 мг/дозу) он не является аллергенным.

Далее было проведено обследование 15 волонтеров, привитых мазевой формой ИГВ интраназально. У всех добровольцев титры противовирусных антител были достаточно высоки (при 2-кратной иммунизации - до 835).

При наблюдении за привитыми побочного действия препарата не отмечено. Результаты опроса показали, что у испытуемых жалобы на катаральные явления в носоглотке, головную боль и незначительное повышение температуры тела встречались в единичных, случаях (2 случая). Заболеваемость же гриппом и ОРЗ наблюдаемых волонтеров в течение 6 месяцев после введения вакцины не превышала 0,3-0,4%.

Достаточная иммуногенность, отсутствие реактогенности, безвредность и удобство применения мазевой формы ИГВ позволяют рекомендовать ее для индивидуальной профилактики гриппозной инфекции и ОРЗ.

Таблица 3

Антигенность мазевой формы гриппозной вакцнны в реакции РТГА

\го Тип вводимой вакцины Кол-во животных Доза вакцины, мл Кол-во ГА мкг/мл Титры антивирусных АТ

п/к введение интра-назальное

1 ИГВ типа В /В/Харьков/ 12 10 10 10 0.5 0.5 1.0 1.0 3.5 7.0 7.0 14.0 112 195 676 1280 315 388 838 1512

2 ИГВ типа А /А/Ленинград ^ / ооо 0.5 0.3 0.2 37.5 22.5 15.0 388 158 320 1458 1224 1280

3 ИГВ типа А /А/Виктория Н 1 иммунизация 2 иммунизация 10 10 0.2 0.2 20.0 20.0 - 158 515

4 ИГВ типа А;А2иВ /А/Ленинград Н^ N , А/Виктория / В/Харьков/ 10 0.2 20.0 116 132 364 377 258 580

По материалам проведенных исследований подана заявка на изобретение "Средство для интраназалъной профилактики гриппа", получено положительное решение от 03.96 г. № 94020944.

Данные диссертационной работы учтены в рекомендации проблемной комиссии НПО "Иммунопрепарат" от 15.09.95 г. в адрес НИИВС и цеха гриппозных вакцин для разработки новых лекарственных форм препарата.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведен комплексный аллергологическш! анализ основных компонентов инактивированных гриппозных вакцин. Установлена обратная зависимость между аллергенностью ИГВ и степенью очистки их от примесного овальбумнна. В опытах на животных определена пороговая максимально допустимая концентрация овальбумнна в вакцине, не вызывающая сенсибилизации организма.

2. Показана роль сорбента как фактора аллергешюсти и установлена его доза в вакщше, не усиливающая ее сенсибилизирующие свойства. Установлена зависимость аллергенности ИГВ от вида сорбента, показана большая безопасность сорбента фосфата алюминия. Дана аллергологическая и иммунологическая оценка неорганических и органических адъювантов. Исследовано действие штосом как адъювантов.

3. Исследована роль вируса гриппа в реактогешюсти гриппозных вакцин. Выяснено, что он может сенсибилизировать оргашим к гомологичному антиген}-, но в то же время и не усиливает сенсибилизацию к овальбумину.

4. Определена роль мертиолята, содержащегося в качестве консерванта гриппозных вакцин, в аллергенности препарата. Показано, что он не способствует повышению сенсибилизирующих свойств вакцины, но токсичен для животных. Отмечено, что отсутствие консерванта в препарате на протяжении 10 месяцев наблюдения не отражалось на качественных показателях вакцины.

5. Показана большая аллергологическая безопасность отечественных ИГВ по сравнению с зарубежными образцами.

6. Выявлена корреляция между содержанием в сыворотках вакцинируемых общего ^Е и уровнем специфических ^Е-антител и

реагиновых антител, вызывающих дегрануляцию тучных клеток при воздействии специфического антигена. Выявлена аллергизация привитых, у которых еще до вакцинации регистрировался высокий уровень общего ^Е. Проведение вакцинации ИГВ этой категории лиц не рекомендуется.

7. Впервые осуществлен аллергологический анализ способов введения ИГВ. Показана перспективность применения интраназальной аппликации мазевой формы ИГВ для иммунизации людей.

Впервые экспериментально обоснована целесообразность введения в практику здравоохранения мазевой формы гриппозной вакцины для интраназального применения - препарата с пролонгированным действием, высокоиммуногашого и слабоаллергенного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Э.С.Сгшонова, А.И.Васяев, Л.Р.Гафароеа, В.А.Стригин. Изучение сенсибилизирующих свойств гриппозных вакцин. //Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопрепаратов: Тезисы докладов республиканской научной конференщш. - Уфа, 1987. С.44-45/.

2. А.И.Васяев, М.А.Пушкарев, Л.Ф.Бердникова,

B.В.Петухов, А.Р.Власов, В.А.Стригин, Э.С.Симонова. Опыт применения АГХ-вакщшы и перспективы ее совершенствования. //Актуальные вопросы биотехнологии:Материалы Всесоюзной научной конференции. - Ленинград, 1987. С.43-45/.

3. Э.С.Симонова, В.А.Стригин, И.Б.Ишкияъдин, А.И.Норов, М.А.Пушкарев, Л.И.Еремеева. Изучение основных факторов аллерген-ности АГХ-вакцины. //Вопросы медицинской биотехнологии и им-мунопрепараты: Тезисы докладов респу бликанской научной конференции. - Уфа, 1987. С.68-70/.

4. А.И.Васяев, Э.С.Сгшонова, Л.Р.Гафароеа, Л.Ф.Бердникова. Изучение содержания общего иммуноглобулина Е и реагиновых антител в сыворотках привитых АГХ-вакциной. //Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопрепаратов. - Уфа, 1988. С.67-68/.

5. Э.С.Симонова. Влияние консерванта (мертиолята) на сенсибилизирующие свойства МИБП. //В сб.:Молодые ученые Башкирии. - Уфа, 1988. С.36-37/.

6. В.А.Стригин, Э.С.Сгшонова, Н.А.Штритер, Н.С.Нейгитадт, М.А.Пушкарев. Оценка токсических и сенсибилизирующих свойств мертиолята. //Актуальные вопросы гигиены в условиях НТП: Тезисы докладов республиканской научной конференции. - Уфа, 1988. С.89/.

7. В.А.Стригин,' Н.В.Загидуллин, В.А.Трофимов, Э.С.Симонова, Н.В.Кызина, Т.А.Евстифеева. Интерферон как модулятор иммунитета и аллергии. //Оптимальные средства и методы иммунокоррегирующей противовоспалительной и противомикробной терапии: Тезисы докладов Международной научной конференции. - Харьков, 1993.

C.247/.

8. Э.С.Симонова, В.А.Стригин, А.И.Васяев. Аллергологический анализ гриппозных вакцин. //Актуальные вопросы современной вирусологии: Тезисы докладов Международной научной конференции. - Екатеринбург, 1995. С.87-88/.

9. Э.С.Симонова, В.А.Стригин, А.И.Васяев, И.Б.Ишкильдин. Роль вида и количества адыованта в проявлешш аллергенности гриппозных вакцин. //Актуальные вопросы современной вирусологии: Тезисы

докладов Международной научной конференции. - Екатеринбург, 1995. С.92-93/.

10. Э.С.Симонова, В.Л.Стригип, Л.И.Васяее. Опыт аллергологического анализа современных гриппозных вакцин. //Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы Международного симпозиума. - Уфа, 1995. С..241-245/.