Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Стандартизация сырья рожков спорыньи и анализ алкалоидов эрготоксиновой группы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

На правах рукописи

'Х-

ПИНЕЕВ Сергей Анатольевич

СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ РОЖКОВ СПОРЫНЬИ И АНАЛИЗ АЛКАЛОИДОВ ЭРГОТОКСИНОВОЙ ГРУППЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия Автореферат на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1997 г.

Работа выполнена в Научно-производственном объединении "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" (НПО "ВИЛАР").

Научные руководители: кандидат химических наук,

Воронцов Е.Д.

кандидат фармацевтических наук, , Сокольская Т.А.

Официальные оппоненты ч

- доктор фармацевтических наук, ст.научн.сотр. Дементьева H.H.

- кандидат химических наук Дегтярев Е.В.

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится " /У " ^¿ид_1997 года в W часов на

заседании Диссертационного Совета Д 074.28.01 при Научно-исследовательском институте фармации МЗ РФ (117418, г. Москва, Нахимовский пр. 45).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института фармации МЗ РФ.

Автореферат разослан " 7 " а^еА^ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 074.28.01 кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник

Л.М.Боброва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Анализ и стандартизация лекарственного растительного сырья является одной из главных задач при разработке и производстве лекарственных препаратов. Среди алкалоидов, имеющих практическое медицинское значение, выделяется группа алкалоидов спорыньи. В настоящее время алкалоиды спорыньи и их производные используются в акушерско-гинекологической практике, в хирургии, эндокринологии, дерматологии, офтальмологии, неврологии, психиатрии, гериатрии.

С целью поиска и поддержания штаммов при выращивании суперэлитных культур спорыньи для селекционно - генетических и физиолого -биохимических работ со склероциями необходимы достоверные и точные методики качественного и количественного определения содержания эрго-алкалоидов, причем в минимальных навесках лекарственного растительного сырья. Промышленное производство лекарственных средств на основе алкалоидов эрготоксиновой группы также нуждается в методиках входного аналитического контроля рожков спорыньи, поступающих на переработку.

Необходимо отметать, что существовавшие в России к моменту начала нашей работы методики количественного определения эргоалкалои-дов основывались на методе спектрофотометрий, который позволяет определять суммарное содержание эргоалкалоидов, крэме-этого, имелись методики, основанные на хромато-спсктрофотометрии, обладавшие недостаточной селективностью. Все эти методики не ставили, своей задачей определение содержания отдельных алкалоидов и их эпимеров в смесях.

Наиболее пригодным для решения подобных задач является современный полифункциональный физико-химический метод анализа - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), сочетающая широкий диапазон аналитических возможностей качественной и количественной оценки с возможностью структурно - химических исследований.

- 2 -

Цель работы. Целью настоящей работы явилась разработка но вых методик качественного и количественного анализа алкалоидов эрго токсиновой группы с использованием метода ВЭЖХ в рожках спорыны эргокриптинового и эргокристинового штаммов, а также унификация ме тодик анализа для различных штаммов эрготоксиновой группы, оптими зация номенклатуры товароведческих показателей качества в действующе!' НД на рожки спорыньи.

Основные задачи исследования. Для достижения поставлен ной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать номенклатуру показателей и требования к качеству эр гокристина - стандартного образца и рабочего стандартного образца сум мы а- и Р-эргокриптинов;

- подобрать условия разделения модельной смеси наиболее близки: по их составу к природному сырью набора эргоалкалоидов, представлен ных наиболее важными в практическом отношении соединениями;

- подобрать условия количественной экстракции эргоалкалоидов и рожков спорыньи;

- разработать методики количественного определения эргоалкалои дов, которые были бы пригодны для эргокриптинового и для эргокристи нового штаммов рожков спорыньи.

- разработать методики анализа алкалоидов эрготоксиновой групп! в небольшой части отдельных склероций, с целью аналитического обеспе чения сслскционно-гснетических и физиолого-биохимических работ о спорыньёй.

Научная новизна. С учётом особенностей хроматографическоп поведения эргоалкалоидов в обращённо-фазной ВЭЖХ разработаны услс вия разделения основных алкалоидов эрготоксиновой группы спорыны при использовании хроматографичсских колонок 4*250 мм, Диасорб С) Т, 10 мкм (АОЗТ "Элсико", Москва, Россия), в системе: ацетонитрш

- з -

>,01 М фосфатный буфер с рН=7,0 (48:52, по объему), при скорости элю-ши 1,5 мл/мин, позволяющая достичь оптимального внутрнгруппового зазделення.

На основании особенностей поглощения эргоалкалоидов в УФ-збласта спектра, определена длина волны 230 нм, при которой эргоалка-юиды имеют значительное поглощение, а собственное поглощение апсто-¡штрила минимально. Это позволило достичь значении открываемого минимума в 0,4 нг/мл для эргокристина и 0,5 нг/мл для p-эргокриптина соответственно.

В процессах хранения сырья спорыньи и производства происходит изменение эргоалкалоидов с образованием С8-эпимеров - эргопептини-иов. С целью определения содержания эргопептанинов разработаны условия их разделения при использовании хроматографичсских колонок 4*250 мм, Диасорб С16 Т, 10 мкм (АОЗТ "Элсико", Москва, Россия), в системе: ацетонитрил-0,01 М фосфатный буфф с рН=7,0 (48:52, по объёму), при скорости элюции 1,5 мл/мин, позволяющая достичь оптимального разделения.

При изучении хроматографичсского поведения 2-бром-сс-эргокриптина и 2-бром-р-эргокриптина установлены оптимальные параметры их разделения в условиях МКЖХ на хроматографе "Милихром" при использовании колонок КАХ-2, 2*64 мм, Силасорб С18, 5 мкм (АО "Научприбор", Орёл, Россия) в системе тетрагидрофуран - 0,01 М раствор гидрофосфата аммония (47:53, по объёму), при скорости элюции 30 мкл/мин и детекции при 254 нм.

С учётом химических особенностей эргоалкалоидов заключающихся в торможении образования С8-эпимеров в кислой среде, определены условия количественной экстракции суммы эргоалкалоидов из рожков спорыньи эргокриптинового и эргокристинового штаммов смесью ацетон -0,1 % серная кислота (1:1, по объему), позволившие значительно сократить

количество балластных веществ в экстракте и повысить устойчивость эр-гоалкалоидов в растворе элюента.

Практическая значимость раЗот. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения, номенклатура показателей качества сырья спорыньи (ТУ 64-4-96-93 "Рожки спорыньи эргокриптино-вого штамма", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г);

- методика количественного определения содержания суммы а- и ß-эргокриптинов в рожках спорыньи отечественной селекции эргокриптино-вого штамма ВКМ F-2642D методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ТУ 64-4-96-95 "Рожки спорыньи эргокриптанового штамма", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г);

- методика количественного определения содержания эргокристина в рожках спорыньи отечественной селекции эргокристинового штамма ВКМ F-340ID методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ТУ 644-124-95 "Рожки спорыньи эргокристинового штамма", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г);

- номенклатура показателей качества PCO (СТП 64-10-39-47-93, ТУ 64-4-121-95 "Сумма а- и ß-эргокриптинов - рабочий стандартный образец", ТУ 64-4-123-95 "Эргокристин - стандартный образец", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г).

- методики количественного определения содержания суммы а- и ß-эргокриптинов и суммы а, ß- эргокриптининов в сырье спорыньи эргокриптанового штамма ВКМ F-2642D, остаточных количеств суммы а- и ß-эргокриптинов в шроте, что является частью методик постадийного контроля производства (ОПР на производство препарата абергин, акт ПЭЗ НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г.);

- методика контроля содержания 2-бром-а-эргокриптина и 2-6poM-ß-эргокриптина мезилатов в субстанции аберпша и таблетках абергина на

некоторых стадиях технологического процесса, с применением микроколоночного хроматографа "Милихром" (Акт ПЭЗ НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г.);

- методики количественного определения содержания эргокрнстнна и эргокристинина в сырье рожков спорыньи эргокристинового штамма ВКМ Р-34010, остаточных количеств эргокристина в шроте, что является частью методик постадийного контроля производства (ОПР на производство препарата дигидроэргокристин, акт ПЭЗ НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г.);

- экспресс-методика количественного определения содержания эргокристина и эргокристинина в части отдельного склероция спорыньи эрго-кристинового штамма, экспресс-методика количественного определения содержания суммы а- и Р- эргокриптина и суммы а- и р-эргокриптининов в части отдельного склероция спорыньи эргокриптинового штамма. Методики внедрены в отделе биотехнологии НПО "ВИЛАР" для селекционно-генетических и физиолого-биохимических работ со спорыньёй (Акт НПО ВИЛАР 18 ноября 1996 г).

Поданы заявки на получение патента № 94041139 на "Способ получения эргокристина'' с приоритетом от 10 ноября 1994 года, положительное решение о выдаче патента от 30.01.1996 и №95117408 на "Способ получения нейрогормонального средства" (Абергин) с приоритетом от 6 октября 1995 года, положительное решение о выдаче патента от 12.02.1497 (Акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г).

Апробация работы. Отдельные части диссертационной работы представлены на "Первой Всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению"(Санкт-Петербург, 1996).

Связь задач исследования с проблемным планом . фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно - исследовательских работ научно - произвол-

ствснного объединения "Всероссийский научно - исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" (НПО "ВИЛЛР") по проблеме "Создание и организация производства диагностических и профилактических средств по фармакотерапевтическим группам. Препараты на основе эргоалкалоидов, полученных из спорыньи"(номер государственной регистрации 01890043151) и соответствует тематике Межведомственного Совета по фармации № 47 АМН РФ.

Публикации, Результаты работ опубликованы в 2 научных статьях, материалы работы включены в 6 угвержденных нормативных документа, поданы 2 заявки на получение патентов, на обе получено положительное решение о выдаче патента.

Основные положения, выносимые на защиту:

- методики качественного и количественного определения алкалоидов эрготоксиновой группы в рожках, спорыньи промышленных штаммов отечественной селекции, эргокриптинового штамма ВКМ Р-2642Б и эрго-кристинового штамма ВКМ Р-340Ю, методом ВЭЖХ;

- методики качественного и количественного определения алкалоидов эрготоксиновой группы в части отдельного склероция спорыньи отечественной селекции;

- номенклатура товароведческих показателей качества рожков спорыньи эргокриптинового и эргокристинового штаммов;

- методика контроля соотношения 2-бром-а-эргокриптина и 2-бром-Р-эргокриптина мезилатов в субстанции абергина и таблетках абергина.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), обсуждения результатов экпериментов (Глава 2), экспериментальной части (Глава 3), выводов, списка литературы и 3-х приложений. В тексте имеется 19 таблиц,

19 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 257 источников, из которых 146 на русском языке и 111 на иностранных языках.

Во введении обосновывается актуальность темы, формулируется цель и задачи исследования, отмечены новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены основные положения, выносимые на защиту.

Глава I представляет собой обзор литературы, посвященный описанию биологических особенностей рожков спорыньи, химическом составе, методов анализа эргоалкалоидов, биологической активности эргоалка-лоидов.

В главе 2 обсуждаются результаты разработки номенклатуры показателей качества рожков спорыньи, анализа стандартных образцов, разработки методик количественного определения содержания алкалоидов эр-готоксиновой группы в отечественном лекарственном растительном сырье методом ВЭЖХ с использованием сорбента отечественного производства.

Глава 3 - экспериментальная часть содержит описание используемых материалов, объектов исследования, аппараты и некоторых методик, разработанных в процессе проведения исследовательских работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка номенклатуры показателей качества рожков спорыньи для включения в нормативную документацию.

Подход к разработке показателей качества лекарственного сырья предназначенного для промышленной переработки должен учитывать физические и химические свойства сырья и его назначение. Разработка показателей качества была проведена на основании данных анализа 48 опытных партий рожков спорыньи эргокриптинового штамма урожая 19791988 годов и использованных как для разработки лабораторной методики, так и ОПР на производство препарата абергин.

- 8 -

Раздел "Внешние признаки" для различных штаммов практически одинаков, небольшие различия наблюдаются только в длине и диаметре рожков.

В ТУ 64-4-96-93 не был включен раздел 'Микроскопия" ,т.к. проведенные исследования анатомического строения рожков спорыньи различных штаммов на поперечном срезе, показали невозможность отнесения исследуемых рожков к определенному штамму по анатомическим признакам. Было показано, что рожки спорыньи достоверно отличаются от других видов сырь" по внешним признакам.

В ТУ 64-4-96-93 не был включен показатель "содержание золы общей", т.к. было учтено, что сырье предназначено только для переработки в промышленности, а существующая технология получения препарата Абер-гин позволяет избавляться от солей, обеспечивающих зольность, на стадиях очистки конечного продукта.

Содержание посторонних примесей представлено двумя показателями.

1. Содержание минеральной примеси. Микроскопические исследования позволили установить, что минеральная примесь в сырье представлена небольшими камешками, иногда кусочками глины, мелким песком. Содержание минеральной примеси в исследованных образцах колебалось от 0.00 до 0,81%.

2. Содержание органической примеси. Органическая примесь в сырье спорыньи представлена зернами ржи, остями колосьев и кусочками стеблей ржи. Содержание органической примеси колебалось от 0,04 до 2,34 %.

Содержание влаги. Содержание влага является показателем, наиболее сильно влияющим на сохранность сырья. По данным литературы при хранении нсизмсльчснного сырья с содержанием влаги менее 8 %, потери алкалоидов спустя 18 месяцев незначительны. Оптимальным содержанием влаги принято считать 4 %. Если хранить спорынью при такой влажности

сырья в течение нескольких лет в непроницаемых сосудах или в сухом месте, то в ней почти не происходит потери эргоалкалоидов. Максимально допустимое содержание влаги - 8 %; при этом происходит незначительная потеря эргоалкалоидов при хранении в течение нескольких месяцев.

Проведенные исследования по хранению рожков спорыньи эрго-кристинового штамма при комнатной температуре показали их устойчивость по содержанию эргоалкалоидов в течение 2 лет. В исследованных образцах влажность сырья колебалась от 3,52 до 8,00 %.

2.Разработка методик количественного определения содержания алкалоидов эрютокеннооой группы в лекарственном растительном сырье спорыньи.

Общая тенденция внедрения современных методов научных исследований способствует увеличению объема полезной аналитической информации, повышению се надежности и скорости получения. Одним из таких методов является высокоэффективная жидкостная хроматография.В нашей работе аналитические задачи разделения эргоалкалоидов решаются с помощью обращенно - фазового (ОФ) варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии с привитыми фазами. На сегодняшний день ОФ вариант является абсолютным лидером среди остальных типов ВЭЖХ по частоте применения.

2.1.Подбор условий разделения эргоалкалоидов. При подборе хрома-тографических условий анализа использовали модельную смесь эргоалкалоидов, состоящую из эргокристина, а - и р - эргокриптинов, эргокорнипа и эрготамина. Эти пять основных эргоалкалоидов содержатся в рожках спорыньи эрготокенновых штаммов и имеют близкие физико-химические характеристики. После варьирования состава элюента и типа колонок были выбраны оптимальные условия разделения: колонка 4 * 250 мм, Дна-сорб 130 С16 Т, 10 мкм, (АОЗТ "Элснко", Москва, Россия), подвижная фаза

- ю •

I (ПФ-1) - смесь ацстонитрила и 0,01 М фосфатного буфера с рН = 7,( (38:62), длина волны детектирования X = 230 нм. Так как значения рКа ад калоидов эрготоксиновой группы не превышают 5,5, то в фосфатном буфере с рН = 7,0 99 % детектируемых алкалоидов микропробы (объем вводимой пробы - 20 мкл) элюируются с хроматографической колонки в виде свободных оснований независимо от исходной формы. Типичная хромато-грамма модельной смсси приведена на рис. 1.

ВЭЖХ-хроматограмма модельной смсси эргоалкалоидов в ПФ-1.

I шнюцвнин, *> 100-, !

9080 70 60 50-11(1 30 20 10-

0-

л_и

.А.

I ■ ' ' ' I ' ' ' ■ I ' ■ ■ • I ■ ■ • ' I ■ ■ ■ • I ' • ■ • I '

В.ВО Б.ВВ 1В.08 15.0В 2В.0В 25.00 30.80 35.00

Время анализа, мин

1 - эргомстрин, 2 - эрготамин, 3 - эргокорнин, 4 - а-эргокриптии, 5 -Р-эр1 окриптин, 6 -эргокристин.

Рис.1.

Анализ эргопепгининов проводится в подвижной фазе 2 (ПФ-2) -аистонитрил н 0,01 М фосфатный буферный раствор с рН = 7,0 в соотно-

исини 48:52. Типичная хроматограмма модельной смеси приведена на эисунке 2.

ВЭЖХ-хроматограмма модельной смеси эргоалкалоидов в ПФ-2. Поглощение, %

109 90 80-/а 6050 «О 302010

4

э б

А А

8

А

1 ■ ' I 1 1 1 1 I ■ ■ ' 1 I ' ■ 1 1 I 1 1 ■ 1 I.....| ■ . . . | . . .

>.01 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00

Вреия, иин

1 - эрготамин; 2 - эргокорнин; 3 а-эргокриптин; 4 - ß-эргокриптин и (ргокристин; 5 - эрготаминин; 6 - эргокорнинин; 7 - а- и ß- эргокриптини-1ы; 8 - эргокристинин.

Рис.2.

2.2. Выбор аналитической длины волны.

Для выбора аналитической длины волны были сняты УФ-спектры рабочего стандартного образца суммы а- и ß-эргокриптинов сер. 270195 в юдвижной фазе 1 (ПФ-1) и подвижной фазе 2 (ПФ-2).

УФ-спектр PCO суммы а- и ß-эргокриптинов (С=0,00214%) в ПФ-1 imcct максимумы поглощения при длине волны Хши=240±1 нм -294,39), Лшах =267±1 нм и размытого мяксимумв при Хшх =3!3±3 нм

(^-111.21), плечо в области 218-231 им и минимумы при длине волны Хгат=233±1 нм, Л.т1п=265± 1 им, Л.тт=275±2 нм.

В ПФ-2 (С=0,00242 %) имеется максимум поглощения при длине волны а.т„=240±1 нм (е|^°м~243,80) и размытый максимум поглощения при

длине волны А.1Ши(=313±2 нм (н[^°м~96,28) и минимумы при длине волны А.шт=232±1 нм, Лт1п=273±1 нм (рис.3.).

УФ-спектр PCO суммы а- и ß-эргокриптинов в ПФ-1 и ПФ-2.

210 220 210 210 2W 280 270 210 240 100 «1« 120 SM МО 1*0 МО

Длине волны, им

Рис.3.

Удельные коэффициенты поглощения PCO суммы а- и р-.»ргокрнптинов при длине волны Х=230 нм в ПФ-1 (е{°/ом~318,69), в ПФ-2

(üj^-260,33).

УФ-спектр эргокристина-стандарта (С=0,002073 %) в ПФ-1 имеет максимум поглощения при длине волны Ä.n«u=240±l нм (Е}Д,~352,15) и

шмытый максимум при длине волны А«„=312±2 нм (в]^'м~135,07), плечо в

)бласти 263-271 нм и минимумы при длине волны Хт1П=233±1 нм, 1т1п=274,5±1,5нм.

В ПФ-2 (С=0,00278 %) эргокристин-стандарт имеет максимум погло-дения при длине волны Хшм=Й0±1 нм (е}^-187,05), размытый максимум

три длине волны Ят„=312±1 нм (Е^°м~71,94), плечо в области 263-271 нм и минимумы при длине ВОЛНЫ Хтт=233±1 НМ, А.пип=273±1 нм (рис.4).

УФ-спекгр эргокристина - стандартного образца в ГТФ-1 и ПФ-2.

Длима авлны, ни

Рис.4.

Удельные коэффициенты поглощения эргокристина при длине волны

/1=230 нм в ПФ-1 (Е}^м~434,15), в ПФ-2 (е}°/ом~230,22).

С целью обеспечения экономичности массовых анализов в методике количественного определения использован ацетонитрил с упрощенной очисткой.

• 14 -

2.3. Построение калибровочной кривой. Определение открываемого минимума эргоалкалоидов.

Принимая во внимание, что эргоалкалоиды, используемые в качестве стандартов, представляют собой сольваты с кристализационным растворителем, для точного определения содержания эргоалкалоидов применен метод абсолютной градуировки. Причем навески всщсств-стандартов для построения калибровочных кривых брались одновременно с навесками для определения содержания эргоалкалоидов методами неводного титрования, 'Н ЯМР-спсктроскопии, ВЭЖХ-опрсделсния хроматографнчсской чистоты и определения потерн в массе при высушивании. Количество кристаллизационного растворителя подтверждалось методами 'Н ЯМР-спсктроскопии и газо-жидкосгной хроматографией.

Для определения открываемого минимума была построена калибровочная кривая зависимости отклика детектора от концентрации эргокрис-тина-основания. Отклик детектора линеен в диапазоне исследованных концентраций 0,0016 - 1,674 мг/мл. Коэффициент парной корреляции R = 0,999. Открываемый минимум эргокристина-основания 0,4 нг/мл.

Калибровочная кривая PCO суммы а- и ß-эргокриптинов, расчитывалась исходя из содержания ß-эргокриптина. Отклик детектора линеен в диапазоне исследованных концентраций 0,0014 - 1,43 мг/мл. Коэффициент парной корреляции R = 0,998. Открываемый минимум ß-эргокриптина 0,5 нг/мл.

2.4. Отработка условий экстракции эргоалкалоидов из сырья.

Изучено влияние степени измельчения (размер частиц 0,5; 1,0; 2,0 мм) спорыньи на экстракцию эргокристина метиловым спиртом. Время экстракции методом настаивания при постоянном перемешивании -120 мин.

Экспериментально установлено, что максимальное извлечение эргокристина метанолом получено для фракции частиц проходящих сквозь си-

- 15 -

то с диаметром отверстий I мм (табл.2).

Таблица 2.

Влияние степени измельчения на экстракцию эргокристнна из рожков спорыньи.

Степень измельчения в Содержание эргокрис- Примечание

мм тина в %

0,5 0,18

1,0 0,21

2,0 0,15

1,0 0,09 С предварительным обезжириванием диэти-ловым эфиром

1,0 0,20 С разрушением клеток замораживанием в жидком азоте

Выбор растворителя был сделан на основании изучения влияние под-кисления различных растворителей на экстракцию эргоалкалоидов из сырья. Подкисление экстрагента должно препятствовать переходу эрго-пептинов в эргопептинины или значительно смещать равновесие в сторону эргопептинов. Экстракцию эргокристина проводили из рожков спорыньи эргокристинового штамма ВКМ Р-340Ш, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, методом настаивания в течение 2 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Полученные результаты представлены на рис.5. Экспериментально установлено, что применение в качестве экстрагента смеси ацетон -0,1 % серная кислота (1:1) повышает выход алкалоидов из сырья, по сравнению с экстракцией метиловым спиртом, примерно на 20 %.

В результате проведенной работы была разработана методика количественного определения эргокристина в сырье спорыньи эргокристинового штамма, основанная на экстракции сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, методом настаивания при постоянном перемешивании на магнитной мешалке смесью

ацетон - 0,1 % серная кислота (1:1) в течение 2 ч (наступление динамического равновесия) с последующим хроматографированием. Данная методик« была включена в действующие НД. Результаты исследований по экстракции эргокристина из сырья спорыньи эргокристинового штамма легли I основу заявки на патент на "Способ получения эргокристина" (№94041135 с приоритетом от 10 ноября 1994 года).

Результаты экстракции эргокристина из рожков спорыньи.

5 7 9 11 13 Номер экстрагонта

Экстрагенты: 1 - метанол-вода (1:1); 2 - ацетон-вода (1:1); 3 - этанол-вода (1:1); 4 - ацетон-2 % уксусная кислота (1:1); 5 -ацетон-2 % винная кислота (1:1); 6 - ацетон-1 % серная кислота (1:1); 7 - этанол-2 % уксусная кислота (1:1); 8 - этанол-2 % винная кислота (1:1); 9 - этанол-1 % серная кислота (1:1); 10 - ацетон-0,3 % серная кислота (1:1); 11 - ацетон-0,1 % серная кислота (1:1); 12 - ацетон-1 % ортофосфорная кислота (1:1); 13 - ацетон-0,3 "А ортофосфорная кислота (1:1); 14 - ацетон-0,1 % ортофосфорная кислотг (1:1); 15 - метанол (3 часа); 16 - ацетон (3 часа).

Рис.5.

- 17 -

Типичная хроматограмма извлечения из рожков спорыньи эргокрис-инового штамма ВКМ Р-340Ю представлена на рнс.6.

ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из рожков спорыньи эргокристн-ювного штамма ВКМ Р-340Ю в ПФ-1.

не-,

9880 70 68 50 М 302010 0

ч—л.

0.08

5.00

■ I ' 10.00

2

15.00

20.00

' I 1 25.80

38.00

35.08

4

1 - эрготамин, 2 - зргокорнин, 3 - а-эргокриптин, 4 - эргокристин.

Рис.6.

Аналогачные результаты были получены для экстракции суммм а- и 1-эргокриптинов из рожков спорьшьи эргокриптинового штамма. Типич-[ая хроматограмма извлечения из рожков спорыньи эргокриптинового цтамма ВКМ Р-26420 представлена на рис.7.

- 18 -

ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из рожков спорыньи эргокрипти нового штамма ВКМ Р-2642Э в ПФ-1.

подо вон

70 60

50-| «0 3020100

ж

' ' ' ' i ' ' ' ■ i.....

00 5.0В 10.00 5.01 20.00 25.00 30.00

-г-у-

95.00

1 - эрготамнн, 2 - эргокорнин, 3 - а-эргокриптин, 4 - (5-эргокрнптнн.

Рис.7.

2.5. Метрологические характеристики мегодик аналЬза.

Метрологические характеристики методики количественного опре^ деления содержания эргокрисгина рассчитывались из результатов анализг рожков спорыньи штамма ВКМ Р-340Ю, полученных от группы биотех> нологии лекарственных растений НПО "ВИЛАР". В 10 независимых ПО' вторностях одного образца, относительная ошибка единичного опрсдслс ния составила ± 5,59 % (табл.3).

а_А

Таблица 3.

Метрологические характеристики методики количественного опре-:еления содержания эргокристина в рожках спорыньи эргокристинового итамма ВКМ Р-340Ю.

{ X Б Р «Р,0 Дх е

9 0,214 0,000028 0,0053 95 2,26 0,00379 5,59

Метрологические характеристики методики количественного опре-хеления содержания суммы а- и Р-эргокриптинов рассчитывались из ре-|ультатов анализа 8 независимых повторностсй одного образца спорыньи фгокриптинового штамма ВКМ Р-26420, причём относительная ошибка ¡диничного определения составила ± 9,53 % (таблица 4).

Таблица 4.

Метрологические характеристики методики количественного опре-[еления а- и Р- эргокриптинов в рожках спорыльи эргокриппшового итамма ВКМ Р-26420.

Г X Б2. Б Р «Р,0 Дх 8

7 0.489 0.00039 0.01975 95 2.36 0.04662 9.53

Используя получе!шые результаты была разработана гэкспресс-1етодика количественного определения содержания эргокристина и эрго-гристинина в отдельных склероциях спорыньи эргокристинового штамма.

Для контроля эффективности экстракции эргокристина из рожков порыньи эргокристинового штамма ВКМ Р-340Ш была разработана ме-■одика количественного определения содержания эргокристина и эрго-:ристинина в шроте методом ВЭЖХ. Методика включена в лабораторный )егламент № 39-20-144 от 09.93 на получение дигидроэргокристина

• 20 -

2.7. Разработ ка методики определения соотношения 2-бром-о эргокршггнна мезилата и 2-бром-р-эргокри1гпша мезилата с использование) мнкроколоночного хроматографа "Милихром".

На различных стадиях получения препарата абергин, таких как вы деление алкалоидов из сырья, очистка, бромнрование - возможно измене пне соотношения изомеров алкалоидов. Таким образом, становится акту альной задача опр^челенчя и контроля возможных изменений соотноше ния 2-бром-а-эргокрппттша мезилата и 2-бром-Р-эргокриптина мезилата субсганцнп и таблетках збергнна.

2-бром-а-эргокриптин и 2-бром-Р-эргокриптин обладают близким физико-химическими свойствами, что затрудняет применение многих м< тодов анализа для определения содержания каждого алкалоида в смеси.

Для определения соотношения 2-бром-а-эргокриптина и 2-бром-р эргокриптниа в смеси был использован метод микроколоночной высокс эффективной жидкостной хроматографии (МКЖХ) на хроматографе on чоственпого производства Милихром (АПО "Научприбор", Орёл, Россия колонка КАХ-2 с Silasorb CI8 (Chtmapol,4CCP).

Для разделения смеси алкалоидов были подобраны следующие услс вия: колонка КАХ-2 с Silasorb С18, 5 мкм, размером 2* 64 мм, эффекта] ность 5700 тт., подвижная фаза - тетрагидрофуран - 0,01 М раствор гидре фосфата аммония (47:53); скорость потока 30 мкл/мин; детектор - УФ пр длине волны 254 нм; диапазон чувствительности 0,8; самописец J1KC4-00, скорость движения бумаги 180 мм/час; объем пробы 1 мкл.

Отклик детектора линеен в интервале исследованных концентраци от0,1до 1,0мг/мл.

Хроматограмма субстанции абергина представлена на рис.8. Расч< соотношения эргоалкалоидов на хроматограмме проводили методом но] мировки по высотам пиков.

- 21 -

МКЖХ-хроматограмма субстанции абсргина.

У

и

I 2»

1 - 2-бром-а-эргокриптин мсзилат, 2 - 2-бром-р-эргокрнптин мсзилат.

Рис.8.

2-бром-а-эргокриптин мезилат и 2-бром-р-эргокрпптин мсзилат легот одинаковые спектры поглощения в УФ-свете, учитывая равные ве-«чины показателей поглощения при длине волны 254 нм (которые состав-пот около 145), калибровочным коэффициентом при расчетах можно эенсбречь. Ошибка единичного определения составила ± 3,6 %: Метроло-гческие характеристики методики представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Метрологические характеристики методики определения соотноше-ля 2-бром-а-эргокриптана мезилата и 2-бром-Р-эргокриптина мезилата п 'бстапции и таблетках аббергина методом МКЖХ.

Г X Б2 Б Р% 1(Р,0 Дх Б

10 352 32,7 5,72 95 2,23 12,75 3,6

■ 22 -

По мсгодикс определения соотношения 2-бром-а-эргокриптана ме-зилата и 2-бром-р-эргокриптина мезилата были исследованы различные серии субстанции и таблеток абергина, наработанные в процессе отработки технологии получения препарата, а также заложенные для определения сроков хранения препарата.

Таким образом, методика определения соотношения 2-бром-а-эргокрнптина мезилата и 2-бром-р-эргокриптина мезилата в лекарственном веществе и таблетках абергина методом микроколоночиой высокоэффективной жидкостной хроматографии позволила контролировать различные стадии технологического процесса производства препарата, гарантируя содержание эргоалкалондов в конечном продукте приблизительно 1:1.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны показатели качества и подходы к стандартизации рожков спорыньи эргокриптинового штамма ВКМ Р-26420. На основании полученных данных разработаны ТУ 64-4-96-93 на рожки спорыны эргокриптинового штамма.

2. Изучено хроматографичсскос поведение эргоалкалондов методо!» ОФ ВЭЖХ на сорбенте Диасорб, подобраны условия ра[зделения алкалои дов эрготоксиновой группы. Разработана методика количсствснногс определения суммы а- и Р- эргокриптинов и а- и Р-эргокриптининов 1 рожках спорыньи эргокриптинового штамма и эргокристина и эргокрис тинина в рожках спорыньи эргокристинового штамма с помощью 04 ВЭЖХ. Методики включены в ТУ 64-4-96-95 на рожки спорыньи эрго криптонового штамма и в ТУ 64-4-124-95 на рожки спорыньи эргокристи нового штамма соответственно.

3. Изучены условия экстракции эргоалкалондов из рожков спорыны эргокриптинового штамма ВКМ р-2642Б и эргокристинового штамм;

ВКМ Р-340Ю. Результаты исследования экстракции эргокристина из рожков спорыньи эргокристинового штамма ВКМ Р-340Ю легли в основу разработки на "Способ получения эргокристина" (Заявка на патент № 94041139 с приоритетом от 10 ноября 1994 года, положительное решение о выдаче патента от 30.01.1996).

4. Обеспечен аналитический контроль содержания 2-бром-а,р-эргокриптинов в субстанции. Результаты, полученные при работе с 2-бром-а,Р-эргокриптинами включены в заявку на патент на "Способ получения нейрогормонального средства" (Абсргин) (Заявка № 95117408 с приоритетом от 6 октября 1995, положительное решение о выдаче патента от 12.02.1997).

5. Разработана экспресс-методика количественного определения эргокристина и эргокристинина в отдельных склероциях спорыньи эргокристинового штамма методом высокоэффективном жидкостной хроматографии. Внедрение данной методики способствовало улучшению контроля за сохранностью штаммов и повышению чистоты инфекционного материала спорыньи для культивирования.

6. Разработана методика количественного определения содержания эргокристина и эргокристинина в шроте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методика включена в лабораторный регламент № 39-20-144 от 09.93 на получение дигидроэргокристина.

7. Разработана методика определения соотношения 2-бром-а-эргокриптина мезилата и 2-бром-р-эргокриптина мезилата в смеси с использованием метода микроколоночной ВЭЖХ на хроматографе Мили-хром. Внедрение методики на ПЭЗ ВИЛАР позволило контролировать некоторые стадии технологического процесса производства нового лекарственного средства абергин.

- 24 -

8. Разработаны н утверждены: СТП 64-10-39-47-93, ТУ 64-4-121-95 н сумму а- и ß-зргокрнптлнов - рабочий стандартный образец; ТУ 64-4-123 95 на эргокриепш - стандартный образец.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Комарова Е.Л., Пинеев С.А. Применение микроколоночного хре

матодрафа Милихром для .определения соотношения 2-бром-а a

зргокриптина мезилата vi 2-бром-р-эргокриптина мезилата в лекарствен ном веществе и таблетках абергина //Химико-фармацевтический журнал. 1995.- Т.29, № 8.- С.54-55.

2. Волков С.К., Калько И.С., Пинссв С.А. Метод количественной определения эргоалкалоидов, применимый для селекции штаммов спо рыньи // Хнмико-фармацсвгичсский журнал,- 1996.- Т.30, № 2.- С.56-57.

З.Заявка на патент "Способ получения эргокристина" (№94041139 приоритетом от 10 ноября 1994 года, положительное решение о выдаче па тента от 30.01.1996). / Быков В.А., Звонкова E.H., Дубичев А.Г., Петухо! С.А., Монахова Т.Е., Ануфриев? В.В., Лапа Г.Б., Калько И.С., Пинее: С.А., Шаин С.С., Вандышев В.В., Либизова Л.Ф., Вечканова Л.Д., Соколь екая Т. А.

4. Заявка на патент "Способ получения нейрогормонального сред ства" (Абергин) (№95117408 с приоритетом от 6 октября 1995 года, поло житсльнос решение о выдаче патента от 12.02.1997)/ Быков В.А., Звонков: E.H., Трегубов В.М., Монахова Т.Е., Бурма О.И., Ануфриева В.В., Пинее! С.А., Шаин С.С., Шсйченко В.И

Подписано в печатьФормат 60*84/16 Усл. печ. я. У, 5"

Заказ ЧО Тираж Н5~

Типография Росссльхозакадемии 115598, Москва, ул. Ягодная, 12.