Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка методик и исследование качества сырья и препаратов пиона уклоняющегося

1ШИСТЕРСТ30 ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОШШШНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФВДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИСОДЩЮВАТЕДЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАЦИИ

па правах руиопиои

К 0 1 П А К О В А Марина Вячеславовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК И ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВА СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ ИОНА УМОЮШЩЕГОСЯ

Специальность 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических неук

Москва-1994

Работа выполнена в Научно-иоследовагельском институте фармации Министерства здравоохранения и медицинокой промышленности Российской федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, отарший научный сотрудник Д.М. Попов

О ф и ц и ал ьные оппоне н-т ы:

" доктор фармацевтических наук, професоор Н.С. Фурса

кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник Т.Д. Даргаева

Ведущая организация - Московская медицинская акаде-■> мия им. И.М. Сеченова

Защита состоится "__1994г.

в часов на заседании специализированного Совета

Д 074.28.01 при Научно-исследовательском институте фармации по адресу: 117418, Москва, Ул. Красикова, 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан "_"_1994г.

Ученый секретарь специализированного Совета Д 074.28.01, кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник

Л.М. Боброве

кислоты, кумарины, иридоцды, бензойная и аскорбиновая кислоты, полисахарида). Методом ТСХ выявлено, что флавонодда представлены 6-7 соединениями, основными из которых явялются рутин, кве-рцетин и кверцетрин. Учитывая способность флавоноидов образовывать комплекс с алюминия хлоридом в уксусно-уротропиновом буферном растворе в среде 40-45£ этанола, разработана методика спе-ктрофотоколориметрического количественного определения флавоноидов в оырье и наотойке пиона, с помощью которой установлено, что в траве пиона содержание флавоноидов колеблется от I до 3%, в настойке - от 0,03 до 0,055?.

Для выделения иридоидов из сырья пиона, их очистки подобраны оптимальные условия: экстрагент - 40$ этанол, степень измельчения сырья - 2 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:50, температура экстракции - 20-25°С, время экстракции - 45 мин, с учетом которых и на осноео взаимодействия сложноэфирной группы иридоидов с жвяеза окисного хлоридом и гидроксиламином разработана методика фотоколориметрнческого количественного опредетаия. Содержание арвдоидов в корневищах о корнями составляет 0,9-1,356, в траве 0,5-0,855, в настойке - 0,04-0,0655.

С помощью фракционирования различными системами растворителей и колоночной хроматографии водяо-сшгртового экстракта корней пиона выделен фенолышй гликоэид - пеоновицианоэид и с использованием физических (t плавления), химических (реакции по-дяинностк, гидролиз) * физико-хямнческих (ТСХ, УФ-, ИК-спектро-метрия, Я?ЛР) методов установлено, что он имеет структуру метил-оалицилат-2-0-(б'-0-^- L-арабинопиранозал)-fe-D -глюкотгранозЕ*-да. Для выделения пеоновицаанозида из сырья использованы колоночная и тонкослойная хроматографии и определена его способность поглощать в УФ-области спектра при длине волш 231,5 им, кото-

рая положена в основу методики количественного определения пе-оновицианозида в сырье, содержание которого в корневищах с корнями пиона составляет 0,9-1,0$.

Выделение кислоты аскорбиновой из сырья проводили при следующих оптимальных условиях: экстрагент - вода, соотношение сырья и экстрагента 1:20, температура экстракции 20-25°С, время экстракции - 60 мин, измельчение сырья - 0,5-3,0 мм, и по реакции окисления-восстановления с желтым фосфорномолибденовым гете-рокомплексом разработана методика ее количественного определения, содержание кислоты аскорбиновой в корневищах с корнями составляет 0,5-0,9$, в траве - 0,3$.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены: •

- методики качественного и количественного анализа фпавоноидов в сырье пиона (Проект ФС на "Траву пиона уклоняющегося" направлен в Фармакопейный комитет. Письмо № 7-12/929 от 6.07 1994г).

- методики качественного и количественного анализа иридоидов

в сырье пиона (Проект ФС на "Корневище и корень пиона уклоняющегося. Акт о внедрении результатов от 9.06 1994 Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова. Акт о внедрении результатов от5.07 1994г Рязанского медицинского института им.И.П. Павле

Публикации. По диссертации опубликовано 6 работ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научной республиканской конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 1993).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работы выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ фармации. Номер государстве-

нной регистации 0192.0 017260.

На защиту выносятся:

- методики качественного анализа и результаты по изучению химического состава травы и корневищ с корнями пиона;

- методики количественного определения флавоноидов, иридоидов, пеоновицианозида и кислоты аскорбиновой в сырье и настойка пиона;

- результаты количественного содержания флавоноидов, иридоидов, пеоновицианозида и кислоты аскорбиновой в сырье и настойке шока.

Объем и структура диосертации. Работа изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 26 рисунков.. Работа соотоит из введения, обзора литературы, 4 экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы (136 наименований, из них 28 на иностранных языках) я приложений.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе, на основании данных литературы, рассмотрены: фармакогностическое описание, химический состав, фармоколо-гия и методы анализа пиона.

Вторая глава посвящена разработке методик качественного анализа действующих веществ и изучению химического состава.

В третьей главе изложены результаты исследования по разработке методик количественного определения флавоноидов в сырье и.настойке пиона.

Четвертая глава посвящена подбору условий и разработке методик количественного определения иридоидов в корневищах с кор*

нями и настойке пиона.

В пятой главе приведены результаты исследования содержания

кислоты аскорбиновой и пеоновицианозида в сырье пиона.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА СЫРЬЯ ПИОНА УКЛОНЯЮЩЕГОСЯ

В связи с противоречивостью литературных данных о химическом составе сырья пиона, а также необходимостью разработки методик количественного определения действующих веществ наш было проведено изучение качественного соотава сырья пиона.

Приготовление спирто-водного экстракта. 10 г сырья, измельченного до 3,0 .мм заливают 60- мп .40$ этанола и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником 30 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют 40 мл 40$ этанола в течение 15 мин. Извлечение.выпаривают до водного остатка (40 мл) и после охлаждения фильтруют.

Фракционирование природных соединений. Водные извлечения обрабатывают шестикратно хлороформом в делительной воронке, порциями по 30 мл. После обработки водные остатки нагревают на кипящей водяной бане до полного удаления хлороформа, охлавдают и последовательно обрабатывают этилацетатом и бутанолом.

■■ В полученных фракциях проводят определение природных соединений. В водном извлечении, определяют углеводы, аминокислоты, дубильные вещества; в хлороформной фракции - фитостеролы, стероиды, терпеноиды; в этилацетатной - дубильные вещества, фено-льные соединения; в бутанольной фракции - фенольные соединение

Общей реакцией на фенольные соединения является взаимодействие с 1$ раствором железа окисного хлорида. Бутанольные извлечения из корневищ с корнями с 1$ раствором железа окисного хлорида образуют зеленое окрашивание (производные пирокатехина). Этилацетатное извлечение образует синее окрашивание (произвол-

ные пирогаллола).

-Следовательно, в траве и корневищах присутствуют вещества фенолыюй структуры, в том числе, производные пирокатехина и пирогаллола.

Флавоиоиды. Исследование на флавоноада проводилось в несколько этапов: приготовление извлечения, проведение качественных реакций, идентификация флавоноядов методом тонко-олойной хроматография.

Приготовление извлечения: 3 г травы пиона, измельченной до 2 мы помещают в круглодонную колбу вместимостью 200 ил к заливают 50 ил 40% этанола. Колбу соединяют о обратным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин с момента закипания спирта в колбе. После охлаждения полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр.

Качественные реакции: цианядинсвая проба, с раствором основного ацетата свинца, борно-лимонная реакция, реакция с тре-ххлористой сурьмой, взаимодействие с раствором аммиака, с 1% раствором ванилина в концентрированной соляной кислоте подтве-рвдают наличие флавоноидов в траве пиона. Об их структуре можно сказать, что они относятся к 5-оксифлавонолам, 5-оксифлаво-нам и катехинам. " *

Идентификация флавоновдов методом тонкослойной хроматографии: перед хроматографированием проводят фракционирование фяавоноидов. 10 мл спирто-водного извлечения выпаривают на водяной бане до 4 мл, доводят водой до 10 мл, экстрагируют этил-ацетатом трижды по 20 ил, затем бутаполом и диэтиловым эфиром. ' Полученные фракции выпаривают на водяной бане до 10 мл и пропускают через бумажный фильтр о безводным сульфатом натрия. По данным литературы в этилацетатной фракции находятся монозида,

-ь-

в бутан ольной фракции - биозида и триозиды, в диэтиловый эфир извлекаются агликоны.

Хроматографирование проводят на пластинках "Силуфол" в различных системах растворителей: хлороформ-толуол-метанол (15:2:3), хлороформ-этанол (7:3), хлороформ-гексан-метанол (86:4:3), хлороформ-метанол (8:2) в присутствии свидетелей: рутин, кверцетин и кверцетрин. Проявляют в УФ-свете.

Полученные хроматограммы свидетельствуют о том, что в эти' . лацетатной фракции содержится кверцетин, во фракции диэтилового эфира - кверцетрин, в бутан ольной фракции - рутин.

Для подтверждения присутствия в траве пиона рутина как основного флавоноидного соединения, нами использовалась высокоэф-- фективная жидкостная хроматография.

Работа выполнялась на хроматографе "Hewlett-Packard" с УФ-детектором с переменной длиной волны. Детектирование проводили при длине волны 280 нм с применением колонки длиной 25 см

0 внутренним диаметром 2,5 мм, заполненной адсорбентом лихросорб

-8 с диаметром частиц 10 мкм; дозированное устройство настроенное на 10 мкл. Температура колонки 35°С. Элюент ацетонитрил--вода-уксусная кислота (20:76:4). Скорость потока элюента

1 мл/мин. Площадь пиков на хроматограмме измеряли с помощью интегратора "Terminal" LC 79850В.

Расвор рутина стандартного образца 0,0555 готовили на 70$ этаноле.

Результаты хроматогрфических исследований раствора рутина стандартного образца и рутина, выделенного из травы пиона представлены на рис. I.

Хромагограммы растворов

^-frW

Mi ms-;

fU

4J1 '

—1 10

ilfnV

C.J-r.r^

VfH

r

-1 10

Villi

Х- рутина стандартного образца;

2 - рутина, выделенного из травы пиона..

Рис. I

Как видно на рис. I, время удерживания PCO рутина и рутина, выделенного из травы пиона практически одинаково, следовательно, основным флавоноидом в траве пиона является рутин.

Иридоиды. В сырье пиона содержатся иридоида, которые определяют его фармакологическое действие. В связи с этим, были проведены качественные реакции на иридоиды и их хроматог-рафическое определение.

Приготовление извлечения. I г измельченного сырья смешивают с 0,2 г карбоната кальция и помещают в .коническую колбу вместимостью 100 Ш1, прибавляют 10 мл 50$ этанола. Колбу поме-

щают на кипящую водяную баню на 10 мин, затем извлечение фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 100 мл. Эктсра-кцию повторяют 3 таза. Объединенные водно-спиртовые вытяжки выпаривают до удаления этанола и взбалтывают в делительной воронке с 20 мл петролейного эфира. Очищенный водный остаток фильтруют через колонку с окисью алюминия. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл этанола и проводят качественные реакции.

На основании проведенных реакций можно предположить наличие иридоидов в сырье пиона, но•полученные окраски неустойчивы и малохарактерны, поэтому необходимо проведение хроматографии.

Хроматографирование проводили на пластинках "Силуфол УФ--254" в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (70:23:4). Хроматограмму высушивают и обрабатывают реативом Шталя. После обработки на пластинке проявляются две зоны адсорбции светло-сиреневого цвета в извлечении из травы и корневищ с корнями пиона. По данным хроматографии можно сказать, что иридоида входят в состав сырья пиона уклоняющегося, но их содержание'невелико, о чем свидетельствует интенсивность окраски после проявления реактивом Шталя.

С помощью реакций подлинности и хроматографии в тонком слое сорбента в сырье пиона определены углеводы, аминокислоты, фитостеролы, стероиды, тритерпеноида, оксикоричные и фенолкар-боновые кислоты, дубильные вещества пирокатехиновой природы, салициловая и бензойная кислоты.

Совместно с сотрудниками ВИЛАРа изучен химический состав корневищ с корнями пиона. Для чего были выделены действующие вещества в чистом виде и с помощью физических, химических и фа-

¿ико-химических методов установлен их состав.

•Воздушно-сухие измельченные корневища с корнями пиона исчерпывающе извлекали водным спиртом при нагревании. Экстракты •яюривали в вакууме до сиропообразного остатка, который высуши-г г!ли на сяликагеле и хроматографировали на колонке силикагеля ' Л 100/250 с использованием градиентной смоси хлороформ-метанол.

В ходе хроматографии водно-спиртового экстракта корневищ с юрнями пиона на силикагеле, полиамиде и сефадексе ьН-20 получены 6 индивидуальных соединений, среди которых одно соединение является новым и названо нами пеонсвицианозидом.

С помощью гидролиза, качественных реакций, хроматографии в тонком слое сорбента, ЯМР показано, что пеоновицианозид имеет структуру метилсалицилат-2-0-(б'-0-<^- ь-араб:шопиранозил)-

Б-глюкопиранозпда. Пеоновицианозид - белые, блестящие, пластинчатые кристаллы состава ^19^26^12' темиеРатура плавления 165,5-1Б8°С (этанол) й^5 - 28,93°, (с, 1,62, вода) Ц 232, 288.

Фракции, содержащие пеонифяорин,.многократно хроматографи-ровали на различных сорбентах: полиамид (вода), силикагель (хлороформ-метанол), полиамид (хлороформ-метанол), софадекс (хлороформ-метанол) . При этой получен пеонифлорин. Белый аморфный порошок состава Ср^З^в®!! - 13,17 (с, 3,23, этанол),

/[ Ш0Н 230, 275, 282. тих

Кроме того выделаны в. чистом виде я охарактеризованы:Р --ситостсрин, бензойная кислота, галлоЕая кислота, этиловый эфир галловой кислоты.

В результате проведенных исследований установлпн качественный состав травы и корневищ с корнями пиона1 уклоняющегося, вы-

делены в чистом виде и установлен химический состав некоторых основных действующих веществ - пеонифлорин и пеоновицианозид.

ПОДБОР УСЛОВИЙ И РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В СЫРЬЕ И НАСТОЙКЕ ПИОНА

Сырье пиона, представленное травой и корневищ с корнями, применяется при изготовлени настойки . Действующая в настоящее время нормативно-техническая документация на сырье пиона не предусматривает определения действующих веществ. Фармакопейная статья на настойку регламентирует содержание сухого остатка, определение экстрактивных веществ.

Постоянно повышающиеся требования к качеству растительного сырья и препаратов из него вызывает необходимость количественной оценки содержания действующих веществ, а использование современных методов анализа позволяет проводить ее с максимальной точностью и надежностью. Основными действующими веществами пиона являются флавоноиды и иридоиды.

Разработанные ранее методы определения флавоноидов и иридо-идов в пионе обладают рядом недостатков. Иодометрический метод, предложенный Алпысбаевой С.И. практически невоспроизводим и не исключает полностью влияния сопутствующих веществ. Фотоколориметрический метод определения флавоноидов по реакции азосочетания с новокаином и натрия нитритом требует очень точного соблюдения всех условий проведения реакции и не обладает высокой чувствительностью.

В связи с этим, целью настоящего исследования являлось: подбор условий извлечения флавоноидов из сырья и разработка методик количественного определения флавоноидов в траве и настой-

ке пиона.

Для количественного определения флавонолдов нами использован спектрофотометрический метод после проведения реакции комп-лексообразования с алюминия хлоридом, который вызывает батохро-мный сдвиг одной полосы поглощения флавоноидов с 333-350 до 390-410 нм. Это позволяет применять в качестве контроля испытуемый раствор без реактива и тем самым исключить влияние окрашенных сопутствующих веществ. Для получения более воспроизводимых результатов реакцию комплексообразования проводили в уксусно-уротро-пиновом буферном растворе в среде 40-45$ этанола.

В качестве стандартного вещества выбран рутин, т.к. он является основным флавоноидом и его дифференциальный спектр поглощения с алюминия хлоридом в предлагаемых условиях совпадает с дифференциальным спектром поглощения флавоноидов пиона.

При выборе концентрации этанола были исследованы следующие концентрации: 25; 40; 70; 96%, и установлено, что максимальное извлечение достигается при экстрагировании 40$ этанолом.

При выборе степени измельчения травы пиона исследовано сырьё, проходящее через сито с диаметром отверстий: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0. Показано, что максимальное извлечение действующих веществ достигается при измельчении травы проходящей через сито с диаметром отверстий 1,0-2,0 мм.

При выборе времени экстракции извлечение проводили в течение 15, 30 и 45 мин и определили, что максимальное извлечение достигается при экстрагировании в течение 45 мин.

Для установления рабочих концентраций был построен калибровочный график зависимости оптической плотности от концентраций растворов. Калибровочная кривая зависимости между оптичес-

кой плотностью и концентрацией растворов рутина носит линейный характер в пределах концентраций 0,0002-0,0020$. Чувствительность определения 0,002 мг/мл рутина.

Полученные результаты были использованы при разработке методики спектрофотометрического количественного определения фла-воноидов в сырье пиона.

Для определения чувствительности методики был использован метод добавок рутина стандартного образца. Результаты представлены в табл. I.

Тао'лица I

Результаты количественного определения флавоноидов в траве пиона с использованием метода добавок рутина

рутина,! ! Д* ! А,$ 1 ! ! *"г ! ! ! !

Номер'Найдено ! Введено1 Найдена ! Метрологические

б Гфяазоно- ! путиня ! сумма ! характеристики

"** ,идов в , флавоно-

зца -сырье, • г ' идов и

'г/100 г ! '

.1/0.ии Д. ! . рубила

Найдено! р

I 2,6154 1,5000 4,1791 1,5637 0,030 0,007 ¿4,93

2 2,5587 0,6500 3,1620 0,6033 0,013 0,032 ± 5,41

3 2,5200 2,5200 . 5,0400 2,5200 0,022 0,058 1 2,33

4 2,2983 . 2,2500 4,5182 2,2340 0,020 0,052 ± 2,34

5 . 2,9565 1,000 3,8521 0,9453 0,016 0,039 ± 4,13

Как видно из табл I, получены удовлетворительные результаты. Разработанная методика позволяет сумму флавоноидов в траве пиона с высокой степенью точности. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышала 5,5$.

С помощью разработанной методики было изучено накопление' флавоноидов в различных частях растений. Полученные результаты представлены в табл. 2

Таблица 2

Изучение накопления флавоноидов в различных частях растений

-1-

Чягти пяртйния 1 Содержание флавоноидов ¿асхи растения в ^ | пересчете на аб-

| солютно сухое сырье

Процентное содержание относительно общего количества. сЬлавоноидов

Стебли 0,672 10,77

Цветки 2,321 37,21

Листья 3,174 50,88 Корневища

и корни 0,070 4 1,120.

Из табл. 2 видно, что самое большое количество флавоноидов

50,88$ содержится в листьях, в цветках - 37,21/1, в стеблях -- 10,77$. 3 корнях и корневищах содержание флавоноидов очень маленькое, около 1%.

;;чя получения лечебного эффекта пион применяется в виде настойки. Действующая нормативно-техническая документация предусматривает определение сухого остатка в настойке, не менее 2$ (К 42-588-72). В связи с этим была разработана методика количественного определения флавоноидов в настойке пиона (см. гл.З).

ПОДБОР УСЛОВИЙ И РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИРИДОИДОВ В СЫРЬЕ И НАСТОЙКЕ ПИОНА

Кок било установлено, основными действующими веществами сырья пиона являются иридоиды. В связи с этим, целью напего исследования было: подобрать условия ц разработать методики количественного определения иридоидов в сырье и настойке пиона. Ири-доиды пиона - это циклические монотерпены с циклопентановым кольцом, тлеющие в своей структуре сложно-эфирную группировку.

<1о этому, для колачестзеного опредсле1Шя иридоидив нами выброс

фотометрический метод на основе проведения гидроксамовой реакции. 3 качестве стандарта использовался пеонифлорин, выделенный в ШО ВИМР. Была установлена его химическая структура, охарактеризована чистота и индивидуальность.

При снятии спектра поглощения продуктов реакции пеонифлори-на с гкдроксиламином и железа окисного хлоридом установлено, что .максимум поглощения наблюдается при длине волны 530 нм.

Для установления линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией растворов был построен калибровочный график. Подчиняемость закону Бугера-Ламберта-Берз соблюдается в пределах концентраций 0,004-0,024$. Наименьшее определяемое количество пеонифлорина - 0,004 мг/мя.

На следующем этапе была изучена устойчивость фотоколориме-трируемого раствора во времени и установлено, что максимальная оптическая плотность достигается через I мин после добавления реактивов и сохраняется неизменной в течение 30 мин, после чего идет снижение оптической плотности.

Удельный показатель поглощения Еравный Х6,2, средний от 20 определений.

Оптимальные условия экстракции иридоидов из сырья пиона были подобраны'нами экспериментально: степень измельчения сырья 2 мм,' экстрагент - 40$ этанол, соотношение сырья и экстрагента 1:50, экстракцию ведут при комнатной температуре в течение 45 ним. Полученные результаты были использованы при составлении методик количественного определения иридоидов в сырье и настойке пиона.

Методика количественного определения иридоидов в корневищах с корнями была апробирована на 3 сериях сырья с использованием метода добавок пеонифлорина. Полученные результаты преде-

тавлены в табл. 3------------------- _ Таблица

Результаты количественного определения иридоидов в сирье пиона с использованием метода добавок пеонифлорина

Номер'Найдено • Введено • Найдено • Метрологические

обта-!иРВД0" ! пеониФ" ! I хагактетшстики

,идов в , лорина, , ирвдои- , харакхерисшки

• _______• тглта т» ттг»__ 1

зца 'сырье ; /т00 г дов и пе- ! 5 !

а г, -л» ■ онЖ ц», , д. i кл

1_!_s_! х i ? i

1 0,9570 0,2500 1,1990 0,2481 0,003 0,007 ±3,19

2 1,2560 0,5000 1,4930 Ü,4760 0,00S 0,015 ¿3,06

3 1,1450 0,3000 1,4550 0,307 0;003 0,009 ±2,75

Из табл. 3 видно, что с помощью -разработанной Методики можно определять ирядоэды в корневищах с корнями пиона с достаточной точностью. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ±4$.

С целью использования для расчета содержания иридоидов удельного показателя поглощения, был проведен обсчет двумя методами: по сравнению с раствором пеонифлорина стандартного образца и удельному показателю поглощения. Результаты методов практически совпадают, что дает возможность в дальнейшей работе использовать метод расчета по удельному показателю поглощения. Кроме того,установлено, что содержание иридоидов в корневищах с корнями пиона колеблется от 0,9 до 1,3$, а в траве от 0,5 до 0,8$.

ПЗСЛаДОЗЖГЕ СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОТЫ АСКОРБШЮЗОЯ И 1ГГО-

¡кищьишц^ з сурье пиона шонящегося

Количественное фотоколориметрическое определение кислоты аскорбиновой в сырье пиона проводили по известному методу, ос-

нованному на реакции с желтым фосфорномолибденовым гетерокомп-лексом.

Оптимальными условиями извлечения кислоты аскорбиновой из сырья, очистки ее от баластных веществ являются: экстрагент -- вода, соотношение сырья и экстрагента 1:20, температура экстракции 20-25°С, время экстракции 60 мин, очистка от баластных веществ проводилась на колонке с окисью алюминия.

Результаты количественного определения кислоты аскорбиновой в сытзье пиона представлены в табл. 4.

Таблица 4

Содержание кислоты аскорбиновой в сырье пиона

Номер • Содержание кислоты аскорбиновой, %

образца , в корневищах с корня- * в траве _!_ми_!_

1 0,899 0,296

2 0,581 0,344

3 0,713 0,311

Как видно из табл. 4, количественное содержание кислоты аскорбиновой в корневищах с корнями колеблется от 0,5 до 0,9$, в траве от 0,2 до 0,3$.

• Пеоновицианозид выделен из корневищ с корня..л пиона уклоняющегося впервые. Следовательно методик его количественного определения не существует. В связи о этим целью данного исследования было: подобрать условия выделения пеоновицианозида из корневищ с корнями, очистки от сопутствующих веществ и разработать методику его количественного определения. .

Был снят спектр 0,01$ раствора поонбвицианозида в 40$ этаноле и установлено, что пеоновицианозид имеет в УФ-области три

полосы поглощения при длинах волн 286нм, 231,5 шл и 207,5 нм.

Для установления линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией растворов пеоновициакозида был построен калибровочный график и установлено, что подчиняемость закону Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах концентраций 0,0005-0,005$. Наименьшее определеяемое количество пеоновицианозида 0,005 мг/мл.

Для количественного определения пеоновицианозида в корневищах с корнями возможно использовать хроматоспектрофотометри-ческий метод на пластинках "Силуфол УФ-254".

При подборе системы растворителей определено: в системе хлороформ-этанол =0,48; в системе бензол-этанол =0,16;

в системе хлороформ-гоксан-метанол ЯЛ =0,41; в системе хлоро-

ми использовалась система растворителей хлороформ-этанол, как наиболее доступная и имеющая оптимальное . Наиболее полно пеоновицианозид из корневищ с корнями извлекается 40$ этанолом. 3 связи с этим, в дальнейшей работе наш использовался 40$ этанол.

Для отделения флавоноидов и окрашенных веществ применялась колоночная хроматография с использованием полиамида. Полученные результаты были использованы при разработке методики количественного определения пеоновицианозида в корневищах с корнями

пиона. Разработанная методика была апробирована на 3 сериях сырья с использованием метода добавок пеоновицианозида. Полученные результаты представлена в табл. 5

форм-уксусная кислота-метанол

дальнейшей работе на-

Таблица 5

Результаты анализа к рневищ с корнями с использованием метода добавок пеоновицианозида стандартного образца

-!-!-—!-!-:-

Номер Найдено Введено Найдена Метрологические .

! пеонови- ! пеоно- ! сумма 1 хагоктеоичтики_

оцра- гданози- вициано- пеонови- Найдено!Т! зца ! да.г/ЮОг ! зида, г ¡цианози- ! пеоно- . О •

; ! ¡да.гДООг, зида, г' Д^ { к,%

X , ,

I • 1,02 0,25 1,25 0,242 0,010 0,04 ¿5,3

2 0,98 0,50 1,48 0,496 0,009 0,03 ±5,2

3 1,10 0,25 1,36 0,254 0,049 0,01 ¿5,5

Как показывают результаты табл. 5, с помощью разработанной методики можно определять пеоновицианозид в корневищах с корнями пиона с удовлетворительной точностью. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 на превышает ±5,5^. .

ВЫВОДЫ

1. Обзор литературы показал, что качественный состав пиона уклоняющегося изучен недостаточно. В нормативно-технической документации на сырье отсутствует раздел "Количественное определение", а в настойке предусмотрено определение сухого остатка и экстрактивных веществ, В связи с этим, изучение химического состава сырьи и разработка методик количественного определения основных действующих веществ представляет актуальную проблему.

2. Установлено, что в траве пиона содержатся: аминокислоты, фитостеролы, флавоноиды, фенолкарбоновые и оксикоричные кислоты, кумарины, иридоиды, салициловая, бензойная и аскорбиновая кислоты.

3. Качественный состав корневищ с корнями отличается от хи-

мического состава травы. 3 корневищах с корнями содержатся: свободные сахара, полисахарида, аминокислоты, фитостеролы, фе-нолкарбоновые и оксикоричные кислоты, дубильные зещестза ппро-катехиновой группы, иридоиды, леоновицианозид, салициловая, бензойная и аскорбиновая кислоты.

4. Показано, что флавоноиды пиона представлены 6-7 соединениям, основными из которых являются рутин, кверцетпн л кве-рцетрин. Иридоиды представлены пеонифлорином.

5. Подобраны условия и разработаны методики количественного определения флавоноидов в траве и настойке пиона. Оптимальными условиями являются: измельчение сырья 2 мм, экстрагент -

- 40$ этанол, соотношение сырья и экстрагента 1:50, температура экстракции - Ю0°С, время экстракции - I час.

Подчиняемость закону Бугера-пЛамберта-Бера соблюдается в пределах концентраций 0,0002-0,002$. Наименьшее определяемое количество рутина - 0,002 мг/мл.

6. С помощью- разработанных методик количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин возможно определять малые количества флавоноидов с достаточной точностью. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ¿5,5$. Содержание флавоноидов в траве колеблется от

I до 3%, в настойке от 0,03 до 0,05$. Методика включена в проект фармакопейной статьи на траву пиона уклоняющегося.

7. Подобраны условия выделения иридоидов из корневищ с корнями а травы пиона, их очистки, а также разработаны методики количественного определения иридоидов в сырье и настойке с помощью гидроксамопой реакции. Установлено, что подчиняемость закону Бутера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах концентраций

0,004-0,024$. Наименьшее определяемое количество пеонифлорина - 0,004 мг/мл. Относительная ошибка определения при доверитель-•ной вероятности 0,S5 не превышает ¿4$. Содержание иридоидов, определенное в корневищах с корнями пиона колеблется в пределах 0,9-1,3$, в настойке 0,04-0,06$, з траве 0,5-0,8$.

8. Подобраны условия выделения кислоты аскорбиновой из сырья пиона, условия ее очистки и разработана методика количественного определения в корневищах с корнями и траве. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ±5,0$. Установлен нижний предел содержания кислоты аскорбиновой: в корневищах с корнями не менее 0,5$, в траве не менее 0,2$ в пересчете на абсолютно сухое сырье.

9. Подобраны условия выделения и очистки пеоновицианозида из корневищ с корнями пиона. Разработана методика хроматоспект-рофотометрического количественного определения пеоновицианозида в сырье. Подчиняемость закону Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах концентраций 0,0005-0,0Q5Í. Наименьшее определяемое количество пеоновицианозида 0,005 мг/мя. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не'превы* шает ¿5,5$. Установлено, что содержание пеоновицианозида в корневищах с корнями пиона колеблется от 0,9 до 1,0$.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TIME ДИССЕРТАЦИИ

1. Химическое изучение корней Paeonia anómala / Запесо-чная Г.Г., Куркин В.А., Авдеева Е.В., Попов Д.М., Колпакова М.В. // ж. Химия природных соединений. - 1992. ft 1. - С. 55-59.

2. Контроль качества настоев и отваров, содержащих флаво-ноиды и кислоту аскорбиновую / Аносова О.Г., Колпакова У.З.,

Мухамедасанова Д.М., Попов Д.М.,- Приступа S.A., Хахимова Д.?.// Проблемы фармации, подготовки л использования провизорских кадров (материалы республиканской научной конференции по фармации и фармакологии), Пятигорск, 1993. - G. 134-135.

3. Исследование качественного состава травы и корневищ с корнями пиона уклоняющегося / Качко Ю.А., Колпакова .М.В., Подов Д.М., Коваленко Л.И. // Фармацевтический анализ на ре и практике: Научн. тр. ШИ фармации. - М., I99I.-t. ШХ.-С.144-150.

4. Исследование количественного содержания флавоноидов в траве пиона уклоняющегося/ Колпакова М.В., Качко Ю.А., Коваленко Л.И., Попов Д.М. // Фармацевтический анализ науке и-практике: научн. тр. НИИ фармации.^., 1992.-г-. XXX, - С. 69-74.

5. Колпакова М.В., Попов Д.М. Исследование количественного содержания иридоидов в пионе уклоняющемся // Хим.-фзрм. ж,- 1994. - й 7.

6. Аносова О.Г., Колпакова М.В., Попов Д.М. Совершенствование анализа и технологии изготовления настоев и отваров, содержащих фяавоноиды // Фармация. - 1994. - й I.