Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Применение метода ВЭЖХ в изучении фармакокинетики домперидона улиц с различным генотипом

На правах рукописи

ии^и58712 ФАЙНШТЕЙН СВЕТЛАНА ЛЕОНИД6ЙНА

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ВЭЖХ В ИЗУЧЕНИИ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ДОМПЕРИДОНА У ЛИД С РАЗЛИЧНЫМ

ГЕНОТИПОМ

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА-2007

003058712

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московская Медицинская Академия им И М Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Казьмина Эма Максимовна

кандидат фармацевтических наук Нечаева Екатерина Борисовна

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН (ГУ НИИФ ШЦ СО РАМН)

Защита состоится <$/» uiC'CtM- 2007 г В часов на заседании диссертационного совета Д 208 040 09 при ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им И М Сеченова по адресу 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им И М Сеченова, по адресу 117998, г Москва, Нахимовский проспект, д 49

Автореферат разослан « // » ¿¿t/^Utf 2007

г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208 040 09, Доктор фармацевтических наук, Профессор

Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Домперидон, являясь антидопаминершческим препаратом периферического действия, в настоящее время широко используется в РФ при нарушениях моторики желудочно-кишечного тракта. Являясь производным бензимида-зола, молекула домперидона липофильна, обладает большой конформацион-ной вариабельностью и имеет большое сродство к транспортному белку Р-гликопротеину [Е1 Е1а А, 2004, А С Логинов 1996, А.А Шептулин, 1996]

Р-гликопротеин играет важнейшую роль в фармакокинетике ЛС Он препятствует проникновению, распределению ЛС и способствует их выведению из клетки Если активность Р-гликопротеина в тканях снижена, то концентрация ЛС в организме может увеличиться, что приведет к развитию побочных эффектов Известно, что активность Р-гликопротеина зависит от генетических особенностей, влияя тем самым на фармакокинетику ЛС, в том числе домперидона [Е1 Е1а А, 2004, Т8и]'Пса\уа К, 2003, РааБэеп Б., 2003]

Одним из самых распространенных и перспективных методов для изучения фармакокинетики ЛС является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Метод ВЭЖХ имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с другими1 отсутствие ограничений по термоустойчивости и летучести анализируемого препарата, возможность работы с водными растворами, возможность собирать разделённые фракции для их последующей идентификации, анализировать большое количество проб, а также высокая чувствительность, точность, скорость, и экономичность анализа

Таким образом, исследование применения метода ВЭЖХ в изучение фармакокинетики домперидона у лиц с различным генотипом Р-гликопротеина представляется актуальным

Цель и задачи исследования

Целью исследования является исследование применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в изучении фармакокинетики дом-перидона у лиц с различным генотипом.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• Изучить хроматографическое поведение домперидона и обосновать условия его определения в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

• Разработать методику экстракции домперидона из плазмы крови

• Изучить фармакокинетику домперидона после его однократного перо-рального приема

• Провести генотипирование гена МОЮ, кодирующего Р-гликопротеин, методом ПЦР у лиц московской популяции из этнической группы русских

• Сопоставить результаты фармакокинетического исследования домперидона после его однократного приема у лиц с различным генотипом гена МЛК1

Научная новизна

Изучены хроматографические свойства домперидона методом ВЭЖХ

Определены фармакокинетические параметры домперидона в плазме крови после однократного перорального приема

Изучено распределение ТТ, СТ и СС генотипов по полимофному маркеру С3435Т гена МЛЯ1, кодирующего Р-гликопротеин, у лиц московской популяции из этнической группы русских

Впервые проведено сопоставление результатов фенотипирования и гено-типирования Р-гликопротеина у лиц московской популяции из этнической группы русских.

Практическая значимость

Разработана оригинальная доступная методика определения домперидо-на в плазме крови методом ВЭЖХ, характеризующаяся быстротой анализа, чувствительностью, высокой точностью и воспроизводимостью результатов измерений

Показана необходимость оценки активности Р-гликопротеина у лиц с различным генотипом гена МОЮ путем генотипирования (методом полиме-разной цепной реакции) или определения концентрации домперидона в плазме крови (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии) при назначении лекарственных средств-субстратов Р-гликопротеина

Методика количественного определения домперидона методом ВЭЖХ в плазме крови используется при проведении фармакокинетических исследований в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН

Апробация работы

Апробация работы проведена на кафедре фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА имени И М.Сеченова

Результаты работы доложены на XIII конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006); на Всероссийской конференции Государственного регулирования в сфере обращения лекарственных средств и медицинских изделий-«ФармМедОбращение - 2006» (Москва, 2006), на эллективах кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им И М Сеченова (Москва, 2006).

Публикация результатов исследования

По результатам проведенных исследований опубликовано 3 печатных работ.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацев-

тического факультета ММА им И М.Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01 200.110545)

Основные положения, выносимые на защиту

1 Разработанная методика определения домперидона в плазме крови с помощью метода ВЭЖХ

2. Результаты фармакокинетического исследования домперидона, проведенного на Зб-и здоровых испытуемых московской популяции из этнической группы русских после однократного перораль-ного приёма домперидона в дозе 20 мг

3 Результаты определения частоты появления полиморфизма С3435Т гена МИШ, кодирующего выработку Р-гликопротеина у 103 человек московской популяции из этнической группы русских, проведенного методом ПЦР-ПДРФ, и результаты сопоставления с распределением генотипов у группы из 36 индивидуумов, участвующих в фармакокинетическом исследовании домперидона.

4 Сопоставление результатов фармакокинетического и фармакоге-нетического исследований Р-гликопротеина у лиц московской популяции из этнической группы русских.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, из 124 названий (113 из которых зарубежные) и приложения Работа иллюстрирована 19 рисунками и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Оборудование и реактивы

Для анализа домперидона в плазме крови использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф фирмы SHIMADZU с насосом модели LC-6А, инжектором Rheodyne с петлей 50 мкл, с различными хроматографиче-скими колонками (Supelcosil LC-8 150x4,6 мм 5 цт, YMC 5 цт 250><б мм, LUNA С18 150><2,1мм 3 цт, Zorbax ODS 150><4,6 мм) и флуориметриче-ским детектором Е-530 Регистрацию хроматограмм осуществляли с помощью самописца METROHM (Е586 LABOGRAPH) Кроме того, использовали необходимое лабораторное оборудование и материалы Все реактивы, использованные для анализа были марок «ХЧ», «ЧДА», «Для ВЭЖХ» Все реактивы были отечественного производства Для разработки количественного определения домперидона в плазме крови использовали образец субстанции домперидона малеата с содержанием вещества 99,4%

Для генотипирования полиморфизма С3435Т гена MDR1, кодирующего выработку Р-гликопротеина у индивидуумов московской популяции использовали амплификатор МС2 («ДНК Технология») Тактика исследования

Для изучения фармакокинетики домперидона сначала была разработана методика количественного определения домперидона в плазме крови с помощью ВЭЖХ.

Изучение фармакокинетики домперидона у лиц с различным генотипом Р-гликопротеина проводили у 36 человек после однократного перорального приема домперидона (Мотилиум, «Янссен», Бельгия, таблетки 10 мг) в дозе 20 мг (2 таблетки) Исследование проводили в рамках изучения биоэквивалентности JIC (протокол утвержден Комиссией по клинической фармакологии, одобрен Комитетом по Этике при Федеральном органе контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств) В качестве испытуемых привлекались мужчины и женщины, добровольно изъявившие желание участвовать в исследовании, прошедшие клинико-физиологическое об-

следование и отвечающие критериям включения и исключения Прием препарата осуществлялся per os в 8 часов утра в дозе 20 мг Отбор крови осуществлялся из кубитальной вены в количестве 5 мл в стеклянные гепаринизиро-ванные пробирки до приема препарата и спустя 0 33, 0 66, 1, 1 5, 2, 3, 4, 6, 10, 12 и 24 часа после приема препарата Пробы крови центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, плазму крови переносили в чистые пробирки и хранили при -35°С до анализа

Частоту появления полиморфизма С3435Т гена MDR1, кодирующего выработку Р-гликопротеина, определяли у 103 человек московской популяции из этнической группы русских Для чего отбирали 1 -2 мл крови из кубитальной вены в пробирку «Эппендорф» с 1 мл 0,5 М этилендиаминтетраацетата двунатриевой соль (ЭДТА*На2) (pH 8,5), помещали в пробирку марлевый тампон и хранили при температуре 4°С до анализа Определение наличия данного полиморфизма определяли методом ПЦР-ПДРФ

ДНК из крови выделяли стандартным фенольным методом с модификациями к 600 мкл крови добавляли 600 мкл буфера PBS, калия фосфат, натрия фосфат для отделения форменных элементов, центрифугировали 5 мин, выливали супернатант, а к остатку добавляли буфер для лизиса (трис, ЭДТА, SDS) и протеиназу К. Затем очищали с помощью фенола и хлороформа на Vortex

Раствор выделенной ДНК в количестве 2 мкл использовали для ПЦР в реакционной смеси объемом 25 мкл ПЦР проводили с использованием стандартной Taq-полимерэзы в KCl, буфере производителя и пары праймеров (MDRlfor 5' - GAT GGC AAA GAA ATA AAG CGA CTG - 3' и MDRlrev 5' - ACC AGC CCC TTA TAA АТС AAA СТА - 3'), добавляли 2мМ магния хлорида Температура отжига составляла 65°С В результате ПЦР синтезировался фрагмент длиной 280 пар нуклеотидов (п н.), который затем подвергался рестрикции рестриктазой Mbol («Fermentas», Литва) при температуре 37°С в буфере производителя Разрезался фрагмент, содержащий вариант «С», в то время как фрагмент, содержащий вариант «Т», оставался нерасщепленным В

случае расщепления образовывались фрагменты длиной 133 и 147 пн соответственно. Результаты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) на стандартном трис-боратном буфере Визуализацию результатов проводили в ультрафиолетовом свете (312 нм) после окрашивания раствором бромистого этидия.

Расчет фармакокинетнческих параметров и статистическая обработка результатов

Фармакокинетические параметры домперидона рассчитывали с помощью программы Kinetica™2000 модельно-независимым методом Рассчитывались следующие параметры, максимальная концентрация Стах - максимальное значение из измеренных, нг/мл, время ее достижения Ттах - время, при котором измерялась максимальная концентрация, час, площадь под фар-макокинетической кривой - в пределах длительности наблюдений (AUCo-t) рассчитывали методом трапеций, нг*ч/мл, относительная величина Сшах /AUCo-t - характеристика скорости всасывания

Полученные экспериментальные данные были подвержены статистической обработке с помощью пакета Systat w5 для персонального компьютера. Рассчитывались следующие статистические параметры среднее арифметическое значение (Mean), среднее геометрическое значение (Geom Mean), стандартное отклонение среднего результата (SD), медиана (Median). Достоверность различий изученных параметров оценивали при р < 0,05 Для оценки различий динамики концентрации домперидона в плазме крови лиц с различным генотипом использовали дисперсионный анализ (ANOVA) Для метрологической характеристики методики определения домперидона методом ВЭЖХ определяли следующие параметры: /х - истинное значение измеряемой величины, f- число степеней свободы, х- средняя выборки, s2- дисперсия, s- стандартное отклонение, Р- доверительная вероятность, t(P,f)- критерий

Стьюдента, Дх- полуширина доверительного интервала величины, е, %- относительная ошибка отдельного результата (по ГФ XI)

Разработка методики количественного определения домперидона методом ВЭЖХ

В результате серии экспериментов нами была выбрана колонка Zorbax ODS 150X4,6 мм

При подборе состава элюента применялись подвижные фазы с различным соотношением водной и органической фаз метанол - вода - триэтила-мин - уксусная кислота в соотношении (60 40 0,02 0,3), 0,02М фосфатный буфер (рН 3,5) - метанол (45 55), 5 M аммония ацетат - ацетонитрил в соотношении (82,5 17,5), ацетонитрил 0,01 M калия дигидрофосфат (с добавлением о-фосфорной кислоты до рН 3,2) в соотношении (25 75) и другие Результаты исследования показали, что при использовании колонки Zorbax ODS 150x4,6 мм оптимальное разделение домперидона наблюдается при использовании подвижной фазы ацетонитрил 0,01 M калия дигидрофосфат (с добавлением о-фосфорной кислоты до рН 3,2) в соотношении (25 75)

Скорость потока подвижной фазы выбирали исходя из времени анализа и давления на хроматографической колонке, которое не должно превышать 3000 psi Оптимальной по указанным параметрам была скорость потока элюента 1 мл/мин

В этих условиях время удерживания составляло 4,2 ± 0,2 мин, а предел обнаружения 1 нг/мл На рисунке 1 представлена хроматограмма стандартного раствора домперидона (3 мкг/мл)

Рассчитывали параметры характеризующие удерживание определяемого вещества в колонке (BP, Ph Eur ) В описанных условиях достигается хорошая эффективность колонки (N=2443 >2000), хорошая разделяющая способность хроматографической системы (Rs= 13,5 > 1), количественное определение достаточно точно (сигнал в 26,7 раз превышает шум) с высокой воспроизводимостью результатов измерений (RSD%=1,22< 2)

домперидон

Рисунок 1, Хроматограмма стандартного раствора домперидона

Методика определения домперидона в плазме крови методом ВЭЖХ

Экспериментальным путем были предложены следующие условия определения домперидона в плазме крови

Экстракция К 1 мл плазмы крови добавляли 100 мкл 2М NaOH, встряхивали на vortex 5 сек, затем добавляли 5 мл хлороформа, смесь перемешивали и экстрагировали 10 минут на шейкере Затем пробы центрифугировали при 4500 об/мин - 10 минут. Органический слой переносили в колбы для упаривания и упаривали под вакуумом при 37 °С Сухой остаток растворяли в 100 мкл подвижной фазы и аликвоту (50 мкл) вводили в хроматограф

Хроматографический анализ Флуориметрический детектор, }.„ = 282 нм, Хет = 328 нм Хроматографическая колонка Zorbax ODS (4,6*150 мм) Подвижная фаза - ацетонитрил 0,01 М дигидрофосфат калия (с добавлением о-фосфорной кислоты до рН 3,2) в соотношении 25 • 75 Подвижную фазу перед использованием дегазировали под вакуумом Скорость элюирования 1 мл/мин

Образцы хроматограмм представлены на рисунке 2

Рисунок 2 Хроматограмма домперидона изолированного из плазмы крови испытуемого

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по высоте пиков Для этого к 1 мл плазмы, не содержащей домперидон, добавляли стандартный раствор домперидона (1 мкг/мл) в количестве 2 мкл, 10 мкл, 20 мкл, 30 мкл, 40 мкл так чтобы концентрация домперидона составила 2, 10,20,30 и 40 нг/мл Затем пробы обрабатывали как указано выше Калибровочная зависимость в диапазоне концентраций 2-40 нг/мл носила линейный характер (рисунок 3)

Концентрация домперидона (С, нг/мл)

Рисунок 3. Калибровочный график зависимости между концентрацией домперидона в плазме крови и высотой пика на хроматограммах

Метрологические характеристики метода анализа представлены в таблице 4

Таблица 4

Метрологические характеристики метода анализа (п=5)

и 7 Т * в Р НР.О Дх е, %

Юнг/мл 4 9,94 0,11 0,34 95 2,78 0,42 4,3

20нг/мл 4 19,82 0,31 0,55 95 2,78 0,69 3,4

30 нг/мл 4 29,88 0,56 0,75 95 2,78 0,93 3,1

Примечание 11= |д-х|* у/т / 0,39 < 2,78,12=|д-х|* л/т / в= 0,73 < 2,78, 13= |ц-х|* </т / 0,36 <2,78

Данные метрологические характеристики доказывают, что результаты выборок концентрации домперидона в плазме крови свободны от систематической ошибки

Результаты фармакокинетического исследования домперидона

Фармакокинетическое исследование домперидона на 36-и индивидуумах московской популяции показало значительный разброс в динамике содержания домперидона в плазме крови испытуемых (СУ=43-63 %) и в значениях фармакокинетических показателей этого препарата (СУ=32-47 %) Этот разброс можно объяснить наблюдаемой частотой полиморфизма С3435Т гена МИШ (30,6 % - ТТ, 50,0 % - СТ), кодирующего Р-гликопротеин у индивидуумов московской популяции Динамика концентрации домперидона в плазме крови 36-и здоровых добровольцев после однократного перорального приема 20 мг препарата представлена в таблице 5 Значения фармакокинетических показателей домперидона у 36-и здоровых добровольцев после однократного перорального приема 20 мг составили Стах 24,5±11,5 нг/мл, Ттах 0,98±0,31ч, АиС0-1 118,9±46,9 нг*ч/мл, Стах /АиС<м 0,21±0,07 (таблица 6) Профили индивидуальных фармакокинетических кривых представлены на рисунке 4. Усредненная фармакокинетическая кривая представлена на рисунке 5

Рисунок 4 Динамика содержания домперидона в плазме крови испытуемых (п=36)

30,0

о 33 0.66 1

15 г з 4 Время (Т, час)

Рисунок 5 Средняя динамика содержания домперидона в плазме крови испытуемых (п=36).

Таблица 5

Динамика содержания домперидона в плазме крови испытуемых, после _^_однократного перорального приема (нг/мл)_

№ Время после приема домперидона, час

0 33 0 66 1 1 5 2 3 4 6 10 12 24

Меап 13,3 17,7 21,4 19,8 16,7 14,1 11,0 8,7 6,2 4,4 -

ОМеап 10,9 16,2 19,8 17,5 15,1 12,8 10,1 8,0 5,9 4,1 -

ЭЭ 8,4 7,5 8,9 11,3 8,7 7,1 5,2 3,8 2,7 2,1 -

СУ 63 42 41 57 52 50 46 43 44 - -

МесЬап 11,4 15,4 20,4 17,3 15,3 12,7 10,4 8,9 6,2 4,0 -

мпо - менее предела обнаружения

Таблица 6

Фармакокинетические параметры домперидона_

№ С„и, нг/мл Тт„, час ЛиСоЛ, нг*ч/мл Сщах /АиСо-1

Меап 24,5 0,98 118,9 0,21

ОМеап 22,5 0,92 110,5 0,20

ЭО 11,5 0,31 46,9 0,07

СУ 47 31 39 33

МеАап 21,55 1,00 114,0 0,19

Генотипирование Р-гликопротеина у добровольцев из московской популяции

Изучение гена МОЮ, кодирующего выработку Р-гликопротеина у индивидуумов московской популяции необходимо для определения активности этого белка Известны четыре аллельных варианта (полиморфных маркеров) гена МЕШ, которые представляют собой замены в последовательности ДНК одного нуклеотида на другой - т н полиморфизмы одного нуклеотида, однако наиболее значимым является С3435Т в 26 экзоне Этот полиморфизм ведет к изменению фармакокинетики лекарственных средств, являющихся субстратами Р-гликопротеина Генотипирование проводили с помощью поли-меразной цепной реакции - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)

Исследование генотипа гена МЛК1 у 103 индивидуумов московской популяции из этнической группы русских методом ПЦР-ПДРФ показало

значительное количество полиморфного маркёра С3435Т гена ¡\4DR1, кодирующего Р-гликопротеин. Из 103 индивидуумов число человек с ТТ генотипом составило 30,1 % (п=31) испытуемых, с СТ генотипом - 50,5 % (п=52) испытуемых и с СС генотипом - 19,4 % (п=20) испытуемых. Распределение генотипов представлено на рисунке 6,

19,4« сс

Рисунок 6. Соотношение полиморфных и нормальных генотипов у индивидуумов московской популяции гена МОЕ I, кодирующего Р-гликопротеин (п=103).

Также определяли наличие полиморфизма С3435Т гена МОЯ! у 36 индивидуумов московской популяции из этнической группы русских, участвующих в фармакокинетическом исследование домперидона. При этом распределение генотипов в этой группе лиц совпадало с распределением генотипов 103 индивидуумов московской популяции из этнической группы русских (рисунок 7).

11,+% сс

Рисунок 7. Соотношение полиморфных и нормальных генотипов у индивидуумов московской популяции гена МОЯ 1, кодирующего Р-гликолротеин (п=3б).

Следовательно, распределение генотипов у индивидуумов, отобранных нами для фармак о кинетического исследования домперидона соответствует общей картине распределения генотипов у лиц московской популяции из этнической группы русских.

Сопоставление результатов фармакокинетического исследования и

генотнпнрованнн

Нами была изучена фармако кинетика субстрата Р-гликопротеина домперидона в зависимости от носительства генотипов СС, С.Т и ТТ по полимофному маркеру С3435Т тет МОЯ1. Предполагаемую связь изменений в фармакокинетике домперидона с полиморфизмом С3435Т гена МОЯ!, кодирующего Р-гликопротеин у индивидуумов московской популяции исследовали сопоставлением данных феногипнроаания и генотип ирования Р-глнко протеина.

Для наглядности зависимости генотипа индивидуумов от фармакокине-тики домперидона и его фармакокинетических показателей результаты исследования разделили на 3 группы: для индивидуумов с СС генотипом, СТ генотипом и 7Тгенотипом.

Из данных представленных в таблице 7 и на рисунке 8 видно, что концентрация домперидона в плазме крови у лиц с генотипом ТТ статистически достоверно выше (р<0,05), чем у лиц с генотипами СТ и СС При этом следует отметить, что у лиц с генотипом СС концентрация домперидона в плазме крови через 12 часов после приема препарата была ниже предела обнаружения В то время, как у лиц с генотипами 7Ти СТ через 12 часов после приема препарата домперидон еще определялся в плазме крови

Таблица 7

Содержание домперидона в плазме крови у лиц московской популяции с различным генотипом МОЮ гена, после однократного __перорального приема, (нг/мл)_

генотип Время после приёма, час

0 33 0 66 1 1 5 2 3 4 6 10 12 24

СС 11,3 15,9 17,8 13,9 11,8 9,6 8,5 6,5 4,0 .

СТ 10,9 16,4 17,7 15,5 14,4 12,3 9,9 8,2 6,2 4,4

ТТ 18,0 21,1 29,6 30,5 23,7 20,0 14,5 11,0 7,2 4,6 -

Время (Т,ч)

—» генотип СС <п=7)

генотип СТ (п=18)

■ генотип ТТ (п-11)

и Средняя динамика домперидона (п=36)

Рисунок 8 Усредненная динамика концентрации домперидона в плазме крови после однократного приема 20 мг у лиц московской популяции с различным генотипом МЛШ гена

У испытуемых с генотипом ТТ максимальная концентрация домпери-дона была статистически достоверно выше (р=0,0032), по сравнению с лицами с генотипом СС Значение площади под кривой также было статистически достоверно выше у испытуемых с ТТ генотипом по сравнению с СС (р=0,0002) Однако время наступления максимальной концентрации и отношение Стах/АиСсн статистически достоверно не различались у лиц с генотипом ТТ и СС (р>0,05) (для СС генотипа: Стах 18,0±2,5 нг/мл, Ттах 0,90±0,25 ч, АиСо-1 80,9±24,3 нг*ч/мл, Стах /АиС0., 0,23±0,04, для ТТ генотипа Сшах 35,1±14,8нг/мл, Тшах 1,09±0,38ч, АиС0-( 160,5±4б,9 нг*ч/мл, Стах /АиСо-1 0,23±0,09) Подобные особенности фармакокинетики домпери-дона у лиц с генотипом ТТ могут быть связаны с полученным снижением экспрессии гена МОШ у лиц с данным генотипом, следствием чего является низкое количество и функциональная активность Р-гликопротеина прежде всего в кишечнике, печени, почках.

У добровольцев с генотипом СТ по сравнению с генотипом СС отмечалась тенденция к повышению значений всех фармакокинетических показателей, но статистически достоверно выше (незначительно, р=0,0407) было только значение площади под фармакокинетической кривой (для СС генотипа Стах 18,0±2,5 нг/мл, Ттах 0,90±0,25 ч, АиС0! 80,9±24,3 нг*ч/мл, Стах /АиСсм 0,23±0,04; для СТ генотипа. Стах 20,6±6,0 нг/мл, Ттах 0,94±0,28 ч, АиС0., 108,1±34,5 нг*ч/мл, Стах/АиС0_, 0,20±0,07) У испытуемых с генотипом ТТ максимальная концентрация домперидона была статистически достоверно выше (р=0,0089), по сравнению с лицами с генотипом СТ Значение площади под кривой также было статистически достоверно выше у испытуемых с ТТ генотипом по сравнению с СТ (р=0,0052) Однако время наступления максимальной концентрации и отношение Сшах/АиСо-; статистически достоверно не различались у лиц с генотипом ТТ и СТ (р>0,05) То есть индивиды с СТ генотипом имели Р-гликопротеин с промежуточной активностью, большей, чем у индивидов с ТТ полиморфным генотипом, но меньшей

по сравнению с активностью Р-гликопротеина у индивидуумов с нормальным СС генотипом (таблицы 8-10, рисунок 9), то есть ТТ<СТ<СС

Таблица 8

Фармакокинетические показатели у индивидуумов московской популяции с __различным генотипом МРШ гена _

генотип Стах, нг/мл Ттах, час АиОы, нг*ч/мл Стах /АиСо-1

СС 18,0** 0 90 80 9*** 0,23

СТ 20 6 0 94 108,1* 0 20

ТТ 35 1 1,09 160 5 0 23

Примечание *-р<0,05, **-р<0,01, *** -р<0,001

Таблица 9

Изменение фармакокинетических показателей в зависимости от генотипа

М1Ж1 гена

генотип Стах. НГ/МЛ Ттах» час АиСоЧ, нг*ч/мл Сти /АиСо-1

СС 1 ^ т

СТ и М

ТТ т Ш 1

Примечание ^наименьший ^ Г-увеличивается I ♦ ^наибольший

Таблица 10

Статистическая достоверность различий фармакокинетических показателей у __индивидуумов с СС, СТ и ТТ генотипом__

Показатель Генотип ТТ п=11 Генотип СТ п=18 Генотип СС п=7 Ргг-сс рст-сс Ртт-ст

Стах, нг/мл 35,1±14,8 20,6± 6,0 18,0±2,5 0,0032 0,1457 0,0089

Ттах, час 1,09±0,38 0,94±0,28 0,90±0,25 0,2343 0,7467 0,2859

АиСм, нг*ч/мл 160,5±46,9 108,1±34,5 80,9±24,3 0,0002 0,0407 0,0052

Стах /АиСо, 0,23±0,09 0,20±0,07 0,23±0,04 0,7776 0,1777 0,4486

Рисунок 9. Изменение фармакокинетических показателей б зависимости от генотипа МОЯ! гена.

ВЫВОДЫ

1. Изучено хроматографическое поведение домперидона и предложены условия его определения в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектором.

2. Подобраны условия экстракции домперидона из плазмы крови хлороформом б среде 2М ЫаОН. В разработанных условиях изолирования эффективность экстракции домперидона составила 85%.

3. Разработанная методика анализа домперидона характеризуется быстротой анализа (время удерживания домперидона 4,2 мин), точностью и воспроизводимостью (относительная ошибка 3,6 %), чувствительностью (предел обнаружения 1 нг/мл, предел количественного определения 2 нг/мл) и может быть предложена для фармацевтического анализа и фармакокинетических исследований домперидона.

4 Изучена фармакокинетика домперидона после его однократного перо-рального приема Показан значительный межиндивидуальный разброс в динамике содержания домперидона в плазме крови испытуемых (СУ=43-63 %) и в значениях основных фармакокинетических параметров (СУ=32-47 %)

5 Проведено генотипирование гена МОЯ1, кодирующего синтез Р-гликопротеина, методом ПЦР у лиц московской популяции из этнической группы русских Показано, что в московской популяции из этнической группы русских число лиц с ТТ генотипом - 30,1 %, лиц с СТ генотипом — 50,5 %, лиц с СС генотипом - 19,4%

6. Выявлены статистически достоверные отличия в фармакокинетике домперидона у лиц с различным генотипом гена МИШ (Стах= 35 1 нг/мл, АиС0ч= 160,5 нг*ч/мл для лиц с ТТ генотипом, Стах= 20 6 нг/мл, АиСо-1=108,1 нг*ч/мл для лиц с СТ генотипом, Стах= 18,0 нг/мл, АиС<м= 80,9 нг*ч/мл для лиц с СС генотипом)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Файнштейн С Л. Влияние функционального состояния Р-гликопротеина на фармакокинетику домперидона // Мат XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» -200бг - С 468

2 Файнштейн С Л., Сычев Д А., Игнатьев И В Определение полиморфного маркера С3435Т гена МОЯ!, кодирующего Р-гликопротеин у лиц московской популяции // Мат XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - 2006г -С 468

3 Раменская Г В , Файнштейн С Л , Сычев Д А Значение изменения функциональной активности и количества экспрессируемого Р-гликопротеина в фармакокинетике лекарственных средств // Экспериментальная и клиническая фармакология - 2007г - Том 70, №1. -С. 73-80

Подписано в печать 040*17 Формат 60 х 90 1/16

Объем /е6г л Тираж 100 экз

Заказ №

Отпечатано в ООО КПСФ «Спецстройсервис-92» Отдел оперативной полиграфии 101000, Москва, Мясницкая, 35, стр 2

Актуальность. Домперидон, являясь антидопаминергическим препаратом периферического действия, в настоящее время широко используется в РФ при нарушениях моторики желудочно-кишечного тракта. Являясь производным бензимидазола, молекула домперидона липофильна, обладает большой конформационной вариабельностью и имеет большое сродство к транспортному белку Р-гликопротеину [1, 10, 58].

Р-гликопротеин играет важнейшую роль в фармакокинетике JIC. Он препятствует проникновению, распределению JIC и способствует их выведению из клетки. Если активность Р-гликопротеина в тканях снижена, то концентрация JIC в организме может увеличиться, что приведет к развитию побочных эффектов. Известно, что активность Р-гликопротеина зависит от генетических особенностей, влияя тем самым на фармакокинетику JIC, в том числе домперидона [42,43, 45, 58, 76, 79, 92, 116, 119].

Одним из самых распространенных и перспективных методов для изучения фармакокинетики JIC является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод ВЭЖХ имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с другими: отсутствие ограничений по термоустойчивости и летучести анализируемого препарата, возможность работы с водными растворами, возможность собирать разделённые фракции для их последующей идентификации, анализировать большое количество проб, а также высокая чувствительность, точность, скорость, и экономичность анализа [7, 18, 58,67, 122, 124, 96, 121].

Таким образом, исследование применения метода ВЭЖХ в изучении фармакокинетики домперидона у лиц с различным генотипом Р-гликопротеина представляется актуальным.

Цель и задачи планируемого исследования:

Целью исследования является исследование применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в изучении фармакокинетики домпе-ридона у лиц с различным генотипом.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить хроматографическое поведение домперидона и обосновать условия его определения в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

• Разработать методику экстракции домперидона из плазмы крови.

• Изучить фармакокинетику домперидона после его однократного перо-рального приёма.

• Провести генотипирование гена MDR1, кодирующего Р-гликопротеин, методом ПЦР у лиц московской популяции из этнической группы русских.

• Сопоставить результаты фармакокинетического исследования домперидона после его однократного приёма у лиц с различным генотипом гена MDR1.

Научная новизна

Изучены хроматографические свойства домперидона методом ВЭЖХ.

Определены фармакокинетические параметры домперидона в плазме крови после однократного перорального приёма.

Изучено распределение ТТ, СТ и СС генотипов по полимофному маркеру С3435Т гена MDR1, кодирующего Р-гликопротеин, у лиц московской популяции из этнической группы русских.

Впервые проведено сопоставление результатов фенотипирования и гено-типирования Р-гликопротеина у лиц московской популяции из этнической группы русских.

Практическая значимость

Разработана оригинальная доступная методика определения домперидо-на в плазме крови методом ВЭЖХ, характеризующаяся быстротой анализа, чувствительностью, высокой точностью и воспроизводимостью результатов измерений.

Определены фармакокинетические параметры домперидона в плазме крови после однократного перорального приёма.

Показана необходимость оценки активности Р-гликопротеина у лиц с различным генотипом гена MDR1 путем генотипирования (методом полиме-разной цепной реакции) или определения концентрации домперидона в плазме крови (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии) при назначении лекарственных средств-субстратов Р-гликопротеина.

Внедрение в практику

Методика количественного определения домперидона методом ВЭЖХ в плазме крови используется при проведении фармакокинетических исследований в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН.

Личный вклад соискателя

Автором лично подобраны условия обнаружения и количественного определения домперидона в растворах и плазме крови методом ВЭЖХ, проведено определение концентрации домперидона в плазме крови у групп испытуемых с различными генотипами, проведено генотипирование Р-гликопротеина, рассчитаны фармакокинетические параметры домперидона. Автором самостоятельно проведены статистическая обработка и анализ полученных результатов, оформлен иллюстративный материал.

Апробация работы

Результаты работы доложены на XIII конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006); на Всероссийской конференции Государственного регулирования в сфере обращения лекарственных средств и медицинских изделий-«ФармМедОбращение - 2006» (Москва, 2006); на эллективах кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2006).

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М.Сеченова «Совершенствования контроля качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.200.110545).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучено хроматографическое поведение домперидона и предложены условия его определения в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектором.

2. Подобраны условия экстракции домперидона из плазмы крови хлороформом в среде 2М NaOH. В разработанных условиях изолирования эффективность экстракции домперидона составила 85%.

3. Разработанная методика анализа домперидона характеризуется быстротой анализа (время удерживания домперидона 4,2 мин), точностью и воспроизводимостью (относительная ошибка 3,6 %), чувствительностью (предел обнаружения 1 нг/мл, предел количественного определения 2 нг/мл) и может быть предложена для фармацевтического анализа и фармакокинетических исследований домперидона.

4. Изучена фармакокинетика домперидона после его однократного перо-рального приёма. Показан значительный межиндивидуальный разброс в динамике содержания домперидона в плазме крови испытуемых (CV=43-63 %) и в значениях основных фармакокинетических параметров (CV=32-47 %).

Проведено генотипирование гена MDR1, кодирующего синтез Р-гликопротеина, методом ПЦР у лиц московской популяции из этнической группы русских. Показано, что в московской популяции из этнической группы русских число лиц с ТТ генотипом - 30,1 %, лиц с СТ генотипом - 50,5 %, лиц с СС генотипом - 19,4%.

6. Выявлены статистически достоверные отличия в фармакокинетике домперидона у лиц с различным генотипом гена MDR1 (Сшах= 35.1 нг/мл, AUCo-t =160,5 нг*ч/мл для лиц с ТТ генотипом; Сшах= 20.6 нг/мл, AUCo-t =108,1 нг*ч/мл для лиц с СТ генотипом; Сшах= 18,0 нг/мл, AUCo-t = 80,9 нг*ч/мл для лиц с СС генотипом).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При изучении фармакокинетики домперидона целесообразно использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуо-риметрическим детектором (кех = 282 нм, Хет = 328 нм, ПФ - ацетонит-рил: 0,01 М КН2РО4 (с добавлением о-фосфорной кислоты до рН 3,2) (25:75), скорость потока ПФ - 1 мл/мин, экстракция хлороформом в среде 2М NaOH).

2. Для определения активности Р-гликопротеина у лиц с различным генотипом гена MDR1 рекомендуется проводить генотипирование (методом полимеразной цепной реакции) или определение концентрации домперидона в плазме крови (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии).