Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение строения и фармакологических свойств новых конденсированных производных 1,2-диазола

Г- Г Б ОД

г з 1;:о;) ¿з-С

На правах рукописи

Фатма Али Омар Аль-Ассар

v

ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 1,2-ДИАЗОЛА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Санкт-Петербург 2002

Диссертационная работа выполнена на кафедре аналитической химии и кафедре фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Министерства здравоохранения РФ и на кафедре химии Российской военно-медицинской академии Министерства обороны РФ.

Научные руководители:

Доктор фармацевтических наук, профессор Б.А. Чакчир; Заслуженный деятель науки РФ, доктор химических наук, профессор К.Н. Зеленин

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор В.Н. Куклин; Доктор фармацевтических наук, профессор Ю.В. Мирошниченко

Защита диссертации состоится 28 мая 2002 г. в 12.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.088.01 в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 4/6).

Автореферат разослан « 27 » апреля 2002 г.

Ученый секретарь Диссертационного о

канд. фарм. наук, доцент Рыжкова М.В.

Ведущая организация:

Институт экспериментальной медицины РАМН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Спрос на нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), сочетающие терапевтическую эффективность и максимальную безопасность при продолжительном применении, постоянно растет (в настоящее время их принимает до 20% населения мира). НПВС - основная группа лекарств, используемых для лечения хронических воспалительных заболеваний. Обычно практикуемое применение НПВС продолжительными курсами способствует проявлению их побочных эффектов (ульцерогенное действие, осложнения со стороны органов кроветворения и др.). Поэтому поиск новых безвредных НПВС остается актуальным.

Одной из широко используемых в медицине групп НПВС являются производные пиразола, обладающие высокой противовоспалительной, болеутоляющей и жаропонижающей активностью (Видеть, 2000-2002).

Многообещающими выглядят ограниченные данные о противовоспалительной активности отдельных производных индазола -конденсированных аналогов пиразола, среди которых найдены отдельные представители, сопоставимые по активности с индометацином или с ацетилсалициловой кислотой. Отсутствовали сведения о противовоспалительной активности продуктов конденсации циклических гидразидов дикарбоновых кислот с алкеналями, легко доступных изомеров индазолов.

Поэтому цель настоящего исследования состояла в направленном синтезе функционально замещенных конденсированных производных пиразолидина на основе реакции алкеналей с циклическими гидразидами малеиновой и фталевой кислот, в установлении особенностей тонкого строения продуктов и в изучении их фармакологических свойств для обнаружения среди них высокоэффективных и малотоксичных противовоспалительных соединений.

Для реализации цели требовалось решить следующие задачи:

1. Взаимодействием акролеина и кротонового альдегида с малеин- и фталгидр аз идами синтезировать 1-гидрокси-2,3-дигидро-1//-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-¿>]фталазин-5,10-дионы и установить особенности их строения в зависимости от структурных факторов и среды.

2. Действием на них аминами и ацилгидразинами получить соответствующие 1-амино- и ацилгидразино-2,3-дигидро-1//-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1#-пиразоло-[1,2-¿]фталазин-5,10-дионы и исследовать их тонкое строение.

3. Оценить острую токсичность синтезированных веществ.

4. Осуществить фармакологическое исследование полученных соединений (противоспапительная, аналитическая,

нротивогипоксическая активность).

Научная новизна. Впервые достоверно установлено, что продукты конденсации малеин- и фталгидразидов с алкеналями имеют циклическое строение 1-гидрокси-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-<з]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-6]-фталазин-5,10-дионов, причем производные кротонового альдегида вследствие их латентной способности к кольчато-цепной таутомерии представлены смесями цис- и транс-тошров. Кольчато-цепная таутомерия характерна для 1-метил-1-гидрокси-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-диона - продукта взаимодействия малеингидразида с метилвинилкетоном.

Действием соответствующих аминов и ацилгидразинов на конденсированные гидроксипиразолидины впервые синтезированы 1-амино- и 1-ацилгидразино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-Ш-пиразоло[1,2-Ь]фталазин-5,10-дионы.

Установлено, что соответствующие 1-аминопроизводные с заместителем в положении 3 в результате их способности к кольчато-цепному равновесию представляют собой смеси цис,транс-изомеров.

Для 1-ацилгидразинопроизводных характерно явление кольчато-цепной таутомерии, причем в зависимости от строения эти вещества могут существовать как в виде линейных форм, так и представлять собой смеси линейного и циклического таутомеров в различных соотношениях. В отдельных случаях для таутомеров наблюдается появление разных стереоизомерных форм, и таким образом имеют место равновесные мультитаутомерные системы с участием до 6 компонентов.

В ряду конденсированных 1-гидрокси-, 1-амино- и 1-гидразинопиразолидинов циклического строения выявлены соединения, обладающие умеренной токсичностью, высокой противовоспалительной активностью, сопоставимой с действием препарата сравнения диклофенака, выраженным анальгегическим эффектом, сравнимым с действием эталонного препарата метамизола, и антигипоксическим действием, приближающимся к действию препарата сравнения гутимина.

Наиболее активные из указанных веществ, а именно 1-гидрокси- и 1-[(4-метил-, 4-метокси- и 4-хлорфенил)амино]-3-метил-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-6]фталазин-5,10-дионы, более эффективны и менее токсичны, чем метамизол и фенилбутазон, и обладают к тому же выраженным жаропонижающим действием.

Практическая значимость работы. Предложенные схемы

получения конденсированных производных пиразолидина являются методической основой для направленного синтеза в данном ряду.

Сведения об особенностях тонкого строения изученных веществ необходимы для последующих обобщений в области кольчато-цепной таутомерии, вопросов стереоизомерии гетероциклических производных и проблемы заторможенного вращения в амидном фрагменте.

Частные наблюдения о связи активности полученных веществ с их строением полезны для дальнейшего поиска противовоспалительных соединений среди производных пиразола.

В данной работе найдена новая группа легко доступных конденсированных производных пиразолидина, обладающих выраженным противоспалительным действием и низкой токсичностью.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 1-ой Всероссийской конференции по химии гетероциклов памяти А.Н. Коста, Суздаль (2000), Международной конференции по органической химии «Reaction Mechanism and Organic Intermediates)), Санкт-Петербург (2001) и III Всероссийской конференции молодых ученых, Саратов (2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 тезиса докладов, 3 статьи и 1 тезис приняты к печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», двух глав экспериментальных исследований, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы, 14 рисунков. Библиографический указатель включает 91 литературный источник, из них 40 на иностранных языках.

На защиту выносятся следующие положения:

- синтез и установление структуры в растворах и в газовой фазе 1-гидрокси-, 1-амино- и 1-ацилгидразино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-а]-пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1#-пиразоло-[1,2-6]фталазин-5,10-дионов;

-явление цис,транс-изомерии для 1-гидрокси- и 1-амино-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-Ь]фталазин-5,10-дионов с метпльной группой в положении 3;

-явление кольчато-цепной таутомерии для 1-метил-1-гидрокси-2,3 -дигидро-1 #-пиразоло[ 1,2-а] пиридазин-5,8-диона, 1 -ацилгидразино-2,3-дигидро-Ш-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-Ь]фталазин-5,10-дионов, приводящее за счет дополнительного существования стереоизомерии (Z,E-конфигурационное равновесие в амидном фрагменте; цис,транс-

изомерия цикла) к появлению мультитаугомерных систем;

-установление для серии конденсированных производных 1-гидрокси-, 1-амино- и 1-ацилгидразинопиразолидинов противовоспалительной, анальгетической и противогипоксической активности и определение их острой токсичности;

- нахождение в данном ряду 4-х высоко активных и мало токсичных соединений, которые более эффективны и менее токичны, чем метамизол и фенилбутазон и обладают к тому же выраженным жаропонижающим действием.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы (Глава 1)

В главе 1 представлен обзор литературы, в котором обсуждаются сведения о применяемых в настоящее время НПВС и механизме их действия. Здесь же приведены данные о ранее исследованных производных пиразолидина и конденсированных производных 1,2-диазола с противовоспалительной активностью.

Материалы и методы экспериментальных исследований (Глава 2)

В ходе выполнения диссертации было синтезировано 20 1-гидрокси-, 1-амино- и 1-гидразино-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-а]-пиридазин-5,8-дионов и -2,3 -дигидро-1 //-пиразоло[ 1,2-Ь]фталазин-5,10-дионов (15 описаны впервые); из них объектами исследования на наличие противовоспалительного эффекта явились 19 соединений*.

1-Гидрокси-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-д]пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[ 1,2-6]фталазин-5,10-дионы синтезировали реакцией малеин- и фталгидразида с а,Р-непредельными карбонильными соединениями с выходами 70-85%. 1-Амино- и 1-гидразино-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-6]фталазин-5,10-дионы получали действием соответствующих аминов и гидразидов на конденсированные 1-гидроксипиразолидины с выходами 30-97%. Чистоту полученных соединений определяли методом ТСХ, особенности строения - с помощью спектроскопии ЯМР 'н и 13С, а также масс-спектрометрии".

Количество 1 -метил-¡-гидрокси-2,3-дигидро-1 Н~пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-диона было недостаточным для испытаний.

Выражаем благодарность проф. К. Пихлайа (Университет г. Турку, Финляндия) и его сотрудникам Я. Синкконену и В. Овчаренко за съемку и интерпретацию масс- и ЯМР-спектров.

Спектры ЯМР были получены на спектрометрах JEOL JNM-A-500 при 500.16 МГц для 'Н и 125.78 МГц для 13С или JEOL JNM-L-400 при 399.78 МГц для *Н и 100.54 МГц для ,3С при 30 °С в ДМСО-с16. Химические сдвиги в спектрах ЯМР соединений, изученных в данной работе, были определены в основном методом DEPT при угле 135°, фазово-чувствительным DQF-COSY методом и корреляционными спектрами СН-сдвигов (fl-подавление). При необходимости применялись спектры дальних корреляций (дальние DQF-COSY и НМВС, или COLOC методы). Стереохимические заключения базировались на значениях химических сдвигов, 'и/Н-константах спин-спинового взаимодействия (КССВ) и на спектрах с применением ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО).

Масс-спектры (электронный удар, 70 eV, прямой ввод) записаны на спектрометре VG ZabSpec (VG Analytical, Manchester, UK). Схемы фрагментации подтверждены метастабильными ионами и данными высокого разрешения.

В качестве экспериментатьных животных использовали 1200 белых беспородных мышей-самцов массой тела 15-25 г и 400 белых беспородных крыс-самцов массой тела 120-200 г.

Острую токсичность оценивали при внутрибрюшинном введении соединений по методу Миллера-Тейнтера (Беленький МЛ., 1963).

Оценку влияния препаратов на процесс воспаления оценивали на моделях: острого отека легких, вызванного введением адреналина, каррагенинового отека лапы крысы, «ватной гранулемы»; на модели «уксуснокислых корчей» и в тесте «tail-flick» оценивали обезболивающую активность соединений. [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000].

Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно в дозах 1/10 от LD5o в виде водных суспензий.

Жаропонижающие свойства оценивали по способности соединений оказывать гипотермический эффект у крыс с дрожжевой лихорадкой (Loux J., Palma P., Yankscll S., 1972). Лихорадочную реакцию вызывали подкожным введением 20 % суспензии пекарских дрожжей (1 мл на 100 г веса крысы). Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно через 18 ч после введения пирогена на фоне максимального повышения температуры.

Оценку антигипоксического действия препаратов проводили на модели острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) (Пастушенков JI.B. и др., 1990).

Способность вызывать язвообразование изучали на модели деструкции слизистой желудка (Corell Т., Moller Y.K., Splawinski Y., 1979). Оценивали влияние веществ на систему кроветворения.

Статистическую обработку результатов выполняли по общепринятым методам с применением t-критерия Стьюдента, а также с использованием критерия Доннета (.Гланц С. Медико-биологическая статистика, 1998).

Синтез н строение конденсированных производных пиразолидина

(Глава 3)

Известная из литературы (Зеленин К.Н., Бежан И.П., Мельникова Л.Ф., 1984-2000) противовоспалительная активность некоторых производных гидрокси- и аминопиразолидина побудила нас осуществить синтез новых конденсированных производных этого гетероцикла с целью получения веществ, обладающих фармакологическим действием.

Синтетический поиск соединений вели в двух направлениях:

1. Получение соответствующих известных конденсированных производных гидроксипиразолидина взаимодействием малеин- и фталгидразидов с а,Р-непредельными карбонильными соединениями, опираясь на данные о противовоспалительном действии неконденсированных производных гидроксипиразолидина;

2. Синтез из них неизвестных 1-амино- и 1-ацилгидра-зинопродаводных действием соответствующих аминов и гидразидов, руководствуясь известным фактом о противовоспалительной активности простейших представителей аминопиразолидина.

1-Гидрокси-2,3-дигидро-1Д-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионы и -3-метил-2,3-дигидро-Ш-пиразоло[1,2-й]фталазин-5,10-дионы (1а-д)

Мы осуществили синтез типичных представителей конденсированных гидроксипиразолидинов (соединения 1а-д, соответственно; схема 1) реакцией малеин- и фталгидразида с акролеином, кротоновым альдегидом и метилвинилкетоном и исследовали их строение методами спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии.

Сведения о строении этих веществ противоречивы. По мнению одних авторов (Le Berre Н., Godin J., 1966) они находятся в линейной форме А, другие авторы (Kamiya S., Nakamura А., 1967) принимают циклическую структуру В.

По нашим данным в спектрах ЯМР (ДМСО-ё6) соединений 1а-г наблюдались сигналы атома углерода С-1, отвечающие только циклическому изомеру В в интервале 79-81 м.д. В случае производных 16,г имеется два набора однотипных сигналов, что обусловлено

явлением цис, транс-изомерии из-за присутствия двух заместителей в пятичленном цикле.

Лш

X I

V™

о

Я к ^ -М 3

XI) ччс- в

8 л'Лн

<

и к X 1^0

У™ л

о

V

М

1 )

гл.

транс- В

о 1*2 он

1а: X = -СН=СН~, Я = = Н; 16: X = -СНСН-, Я = СН3, К2 - Н; 1в: X = о-С6Н4<, К = Я2 = Н; 1г: X = о-С6Н4<, Я = СН3, Я2 = Н; 1д: X = -СН=СН- Я = Н, Я2 = СН3 Схема 1

Цис-изомеры были отождествлен по величине константы спин-спинового взаимодействия протонов в положении 2 цикла. Для одного из протонов (и только для него) величины вицинальных КССВ оказались близки к нулю. Для этой формы двугранный угол между ним и протонами в положениях 1 и 3 близок к 90°, а следовательно в таком изомере оба заместителя находятся по одну сторону цикла (цис-изомер).

Для сигналов протонов в положении 2 имеется четкое различие между цис- и тр да с-из о м ер а м и. Химсдвиги протонов г/ыс-формы составляют приблизительно 2.0 и 2.7 м.д., в то время как разница в химсдвигах таких же протонов для от^аис-формы намного меньше; они находятся в интервалах ~2.3 и 2.45 м.д.

Соотношение стереоизомеров для производных 16,г близко и составляет цис : транс «3:1.

Соединение 1д существует в растворе ДМСО-с16 в линейной форме А (ей среди прочих отвечает сигнал атома углерода связи С=0 при 206.6 м.д.), однако в растворе СБС13 имеется и полный набор сигналов циклического изомера В, что свидетельствует о существовании кольчато-цепной таутомерии А - В (А : В и 4 : 1).

1-Амино- и гидразино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1//-пиразоло[1,2-6]фталазин-5,10-дионы

(Па-д и Ша-к)

Известно (Зеленин К.Н., Бежан И.П. и др., 1986), что полуаминальная гидроксильная группа простейших гидрокси-пиразолидинов может замещаться под действием азотистых нуклеофилов. Мы распространили данное свойство на полученные нами конденсированные 1 -гидроксипиразолидины.

Реакцией 1-гидрокси-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионов 1а,б и 1-гидрокси-3-метил-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-й]-фталазин-5,10-диона 1г с аминами и ацилгидразинами мы получили неизвестные 1-амино- и 1-гидразино-2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-а]-пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1#-пиразоло[1,2-£]фталазин-5,10-дионы Па-д и Ша-к (схемы 2 и 3) с выходами 30-90% и изучили их строение в растворах и в газовой фазе методами ЯМР и масс-спектрометрии, соответственно.

Строение I -амто-3-метил-2,3-дигидро-1 Н-пиразоло[1,2-Ь]фта-лазин-5,10-дионов (На-д). Для этих соединений в спектрах ЯМР наблюдались два набора сигналов, отвечающих циклическому изомеру В (2 сигнала атомов углерода С-1 в интервале 67-73 м.д.) в результате существования цис,транс- изомерии. Отнесения стероеоизомеров выполнены на основании тех же критериев, что и для соединений 16,г. Кроме того, химсдвиг сигнала атома углерода метальной группы для цис-изомеров во всех случаях по крайней на 1 м.д. больше по сравнению с отралс-изомером. Та же особенность характерна и для протонов метальной группы.

Для соединений Иа-г не наблюдалось изменения соотношения во времени, однако в случае производного Ид содержание форм сразу после растворения составляло цис : транс = 83 : 17. Это позволяет допускать, что соединения И в кристаллическом состоянии существует в виде г^ис-изомеров.

Цис,транс-взаимопереход в случае соединений 16,г и Па-д должен реализоваться через линейный интермедиат А (схемы 1 и 2), то есть

вследствие кольчато-линейно-кольчатой изомерии, в которой линейный таутомер А мало стабилен и потому спектрально не обнаруживается.

ы

/Т > цис-в

W

о он

(--'I

Я R

О я

- ^^х ? > транс-В

— XVNH л ° W

О

ó он

H,NR'

м

х I > ЦИС-В

W

о NHR'

О R

о r

X ' ^ N —-X i > транс-В

v-nh v-n—/

п а

О

V-v-'

V1

О NHR'

II

Х = о-С6Н4<, R=CH3; На: R' = С6Н5СН2; 116: R' = С6Н5; Ив: R' = С6Н4СН3-р; Пг: R' = С6Н4ОСН3-р; Пд: R' = С6Н4С1 -р. Схема 2

Соотношение стереоизомеров для производных IIa-д близко к 1:1.

Строение 1~гидразино-2,3-дигидро-Ш-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионов (Ша-г). В этих производных цис,транс- изомерия исключается (метильной группы в положении 3 нет), но появляется E,Z-изомерия относительно связи C-N (N-C=0), имеющей частично двоесвязанный характер (схема 3).

Для них характерно сильное преобладание линейных форм А, и только в случае производного Шг количество циклического изомера В достаточно (табл. 1) для его достоверных спектральных отнесений. Следовые количества циклической формы В видны и в случае других производных, однако ее содержание слишком мало (менее 1-2 %), чтобы ее можно было интерпретировать.

Химсдвиги атома углерода карбонильной группы £-конформера на 6-7 м.д. больше, чем в случае Z-стереоизомера, a C=N атома углерода Z-формы на ~3 м.д. больше, чем у £-изомера. £-конформер производного Illa отличается большей (-10 Гц) вициналыгой КССВ между

формильным и //Ы-С=0 протонами. В производном Шг идентификация 2-формы осуществлена с помощью ЯЭО, который наблюдался для протонов фенильной группы при облучении #N-0=0 протона.

и я

М 1 /

ы-с

2- цис

К

X I

Г"

7-линейный

\\

М

К I >

У"-7

тм.

к-с;

н

Ъ-транс

Я"

м

X I >

о

г

/

Ш Я"

N ✓

ы-сч

' V

н о

Е-цис

\\

О

I м р»

V

х I

¿■-линейный

х I >

У"-7

о

*

н

Е-транс

Я"

Х = -СН=СН-11 = Н: Ша:Я" = Н; Шб: II" -СН3; Шв: Я" = СН2СЯ; Шг: Я" = С6Н5. Х = -СН=СН- Я=СН3: Шд: Я" =Н; Ше:И" = СН3; Шж: Я" = С6Н5.

X = о-С6Н4< Я = СН3: Шз: Я" = Н; Ши: Я" = СН2СИ; Шк: Я" = СбН5.

Схема 3

о

н

n

О

О

о

В соединении lila £-форма сильно преобладает, у производных Шб и Шв все еще доминирует, а линейный таутомер А соединения Шг представляет собой чистый Z-конформер, то есть EJZ соотношение контролируется стерическими эффектами заместителей (табл. 1). По той же причине и циклический изомер В вещества Шг - Z-форма.

Строение 1-гидразино-3-метил-2,3-дигидро-1 Н-пиразоло[1,2-а]-пиридазип-5,8-дионов (Шд-ж). Их свойства комбинируются с найденными для производных IIa-д и Ша-г.

Линейные формы А похожи на те, что были обсуждены выше (для соединений без метильной группы, табл. 1): соотношешю между линейными А и циклическими В таутомерами лежит примерно в тех же интервалах; количества цис- и ш^онс-изомеров циклической формы В близки; содержание Z-формы растет с ростом размера заместителя при карбонильном атоме.

Единственное соединение, где доля циклической формы В сопоставима с содержанием линейных форм А, - производное ИЬк с фенильной группой при карбонильном атоме. Циклические формы А идентифицированы как Z-ротамеры сопоставлением химсдвигов карбонильного атома углерода с данными для атомов углерода этой формы соединений Шз-к (см. ниже).

Строение 1-гидразино-3-метил-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[1,2-Ь]-фталазин-5,10-дионов (Шз-к). По сравнению с производными Ша-ж в случае соединений Шз-к доля циклической формы В существенно выше (табл. 1), что дает возможность рассмотреть спектральные характеристики и особенности строения циклических изомеров. В частности, обращает на себя внимание существование для них £,Z-poTaMepoB. В совокупности следует считаться с 6 возможными изомерами: Z-линейным, ¿'-линейным, Z-цис, Е-цис, Z-транс и E-транс (схема 3), что и наблюдалось для соединений Шз и Ши (табл. 1).

Так как не все сигналы 6 форм перекрываются, возможно их полное отнесение для каждого из изомеров. Для этого применялся широкий набор ЯМР-методик, в том числе - гетероядерные корреляционные спектры дальнего порядка с их оптимизацией для различных дальних Н,С-КССВ.

Во-первых, просто отделить сигналы линейных форм А - атома углерода C=N (145-150 м.д.) и связанного с ним протона (7.2-7.6 м.д.).

Во-вторых, Е- и Z-линейные формы А различались по химсдвигам сигналов атомов углерода C=N и N-C=0. В производном Шз различия между Е- и Z-ротамерами установлены с помощью вицинальной 'Н,'Н-КССВ между азометиновым и Ntf протонами.

Таблица 1

Таутомерный и стереоизомерный равновесный состав соединений III

Соединение Форма, % (flMCO-d6, 30 °С)

А В

Z Е Z-цис Е-цис Z-транс Е-транс

Illa 17 83 следы

III6 38 62 следы

Шв 28 71 следы

Шг 90 - 10

Шд 20 80 следы

Ше 35 59 3

Шж 80 - 10 10

Шз 5 25 21 19 16 14

Пи 8 21 29 7 24 11

Шк 12 - 42 - 46 -

В-третьих, четыре циклических таугомера В были разделены на две пары Е- и 2-форм на основании химсдвигов их карбонильного атома углерода (в случае производного Шз - и по величинам КССВ).

В-четвертых, г/ис-изомеры В различалась по химсдвигам и КССВ протонов в положении 2, а пара транс-форм В дифференциировалась по значениям химсдвигов сигналов атомов углерода карбонильных групп.

После этого проводилась корреляция с опорой на указанные реперные сигналы внутри всего набора сигналов, отвечающих отдельным формам. С помощью корреляционных спектров легко перейти от таких сигналов, к связанным с ними, а от последних к следующим, и так распространить процедуру на все сигналы.

При переходе к соединению Шк ситуация упрощается. Наличие фенильного кольца стабилизирует его 2-линейный конформер А; поэтому у этого соединения присутствуют только 3 формы - 2-цис, 2-транс и 7-линейная.

Рост доли циклических форм В по сравнению с предыдущими производными можно объяснить увеличением объема соединяющего звена при переходе от пиридазиновых к фталазиновым производным.

В линейных формах А соотношение между Е- и 2-формами согласуется с таковым для пиридазиновых производных: в случае соединений Шз и Шн £-конформеры более стабильны, а в соединении Шк 2-форма является единственной.

У циклических изомеров В ситуация иная: у производных Шз и Ши ^-изомер стал предпочтительным.

Стерический эффект заместителя стабилизирует Z-форму, а эффект делокализации в фрагменте C=N-N-C=0 смещает равновесие в сторону ¿-изомера. Это объясняет £/7-соотношепие линейных форм А.

Спектры соединений Шз-к были сняты также в CDC13, где присутствовали только циклические формы В. Это является результатом их стабилизиции в мало полярной среде из-за их меньшей полярности, что типично для многих кольчато-цепных таутомерных систем.

Масс-спектры соединений I-III указывают на открыто-цепную форму молекулярных ионов соединений I и на циклическое строение М+* ионов амино- и гидразинопроизводных II-III в газовой фазе.

•ftie-k

Таким образом, действием акролеина и кротонового альдегида на фтал- и малеингидгазиды были получены соответствующие конденсированные производные гидроксипиразолидина, а последующим замещением их полуаминальной гидроксильной группы приготовлена серия ядерно замещенных конденсированных ариламинопиразолидинов (под действием аминов) и ацилгидразинопиразолидинов (в результате взаимодействия с соответствующими гидразидами).

1-Гидрокси- и 1-аминопиразолидины данного ряда существуют в виде смесей стереоизомеров при наличии метального заместителя в положении 3 (исключение составил 1-метилзамещенный гидрокси-пиразолидин 1д, для которого имела место кольчато-цепная таутомерия).

1-Ацилгидразйнопиразолидины проявляют склонны к кольчато-цешюй таутомерии, и по стабильности циклического таутомера располагаются в ряд: пиразолидины < пиразолидины, конденсированные с пиридазиновым кольцом < пиразолидины, конденсированные с фталазиновым циклом.

В свою очередь, для таутомеров имеет место явление стереоизомерии (цис,транс для циклической формы и Z,E в амидном фрагменте для обеих). Это вызывает появление мультитаутомерных равновесий с участием в отдельных случаях до 6 изомерных форм.

Фармакологическое исследование соединений (Глава 4)

Данные по острой токсичности изученных соединений (рис. 1) позволяют отнести их к числу мало или умеренно токсичных веществ.

Ш малотоксично О умеренно токсично Рис. 1. Острая токсичность исследуемых соединений и НПВС.

Сравнивая показатели острой токсичности исследуемых соединений и наиболее часто используемых НПВС из числа производных пиразола, можно заключить, что все изученные производные менее токсичны, чем аминофеназон и фенилбутазон. Многие из производных 1-Ш обладают меньшей токсичностью, чем метамизол.

В неактивно [3 активно □ эффект близок к диклофенаку

Рис. 2. Влияние соединений на экссудативную фазу воспаления (модель каррагенинового отека лапки крысы, в каждой группе по 10 животных).

При изучении антиэкссудативной активности на моделях каррагенинового отека лапы животных было установлено, что соединения 1г, Пп-д, Шг,д обладают выраженной антиэкссудативной активностью. Остальные вещества не оказывали заметного положительного воздействия на экссудативную фазу воспаления.

Полученные данные по высокой антиэкссудативной активности отдельных представителей соединений 1-И побудили нас изучить влияние этих веществ на экссудативную фазу воспаления на модели адреналинового отека легких.

Установлено, что и по этому параметру соединения 1г, Пв-д (рис. 3) сравнимы с препаратом сравнения (фенилбутазон).

Рис. 3. Влияние соединений 1-И на экссудативную фазу воспаления (адреналиновый отек легких).

Результаты экспериментального изучения влияния соединений на пролиферативный компонент воспаления на модели «ватной гранулемы» показали (см. рис. 4), что вещества 1г, Ив-д, эффективные по отношению к экссудативной фазе воспаления, по угнетающему действию на пролиферативный процесс сопоставимы с препаратом сравнения - диклофенаком.

Изучение анальгетической активности соединений I-III на модели «уксуснокислых корчей» (рис. 5) показало, что по обезболивающей активности производные 1г, Ив-д приближались к действию использованного в качестве препарата сравнения мегамизола.

Поэтому эти же соединения были испытаны в тесте «tail-flick». Было установлено, что их способность уменьшать ответную реакцию на болевой раздражитель также сопоставима с эффектом препарата сравнения (рис. 6).

150

2 140

9 130

ь о 120

110

2 100

ЕЕ 90

1 80

о X 70

н о 60

с 50

X 40

X 30

i с 20

о 10

0

X g

X

£

89,4 88,9 89,9 88,1 90,1 90,2 88,8 89,9 gs,5

- а и п

в а

I б в з

Щ неактивно д эффект блшок к диклофенаку

Рис. 4. Влияние соединений на пролиферативную фазу воспаления (модель «ватной гранулемы», в каждой группе по 10 животных).

Ц неактивно эффект близок к метамизолу

Рис. 5. Анальгетическая активность соединений на модели уксуснокислых корчей (в каждой группе по 10 животных).

Поэтому эти же соединения были испытаны в тесте «1аП-П1ск». Было установлено, что их способность уменьшать ответную реакцию на болевой раздражитель также сопоставима с эффектом препарата

сравнения (рис. 6).

1г Нв Иг Ид Контроль Метамизол

Рис. 6. Анальгетическая активность соединений 1г, Пв-д на модели «tail-flick» (в каждой группе по 10 животных).

Поскольку в патогенезе процесса воспаления важное место принадлежит гипоксии, было целесообразно исследовать защитные свойства соединений в условиях кислородного голодания.

Антигипоксическую активность соединений оценивали на модели острой гипобарической гипоксии (ОГБГ). Было установлено, что только четыре из числа исследуемых соединений (1б-в, IIa-б) слабо способствовали увеличению продолжительности жизни мышей; введение остальных веществ приводило к заметному увеличению времени жизни животных, причем действие соединения Ши было сравнимо (рис. 7) с эффектом препарата сравнения гутимином, рекомендованным Фармакологическим комитетом в качестве эталонного вещества, при изучении антигипоксической активности соединений.

Для наиболее активных и обладающих наиболее широким спектром действия соединений 1г, Пв-д были проведены дополнительные исследования.

Так как практически у всех нестероидных противовоспалительных средств проявляются в качестве побочного эффекта раздражающее действие на желудочно-кишечный тракт и угнетающее действие на кроветворение, было исследовано действие наиболее эффективных соединений Нв-д на кроветворение и слизистую желудка. Испытанные соединения вызывали появление эрозий на слизистой желудка у крыс. Действие препаратов было близко к эффекту диклофенака.

В неактивно □ активно О эффект близок к гугимину

Рис. 7. Влияние соединений на длительность жизни животных в условиях ОГБГ (в каждой группе по 10 животных).

Исследуемые соединения оказывали токсическое действие на кроветворение, содержание эритроцитов, лейкоцитов и на изменение лейкоцитарной формулы крови примерно в той же мере, что и диклофенак.

Таким образом, в результате фармакологических исследований были выявлены 4 вещества - 1-гидрокси- и 1-[(4-метил-, 4-метокси-, и 4-хлорфенил)амино]-3-метил-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[ 1,2-6]фталазин-5, 10-дионы, которые сочетают фармакологические эффекты, необходимые для адекватной коррекции патологических состояний при воспалении: анальгезирующий, жаропонижающий, противо-гипоксический. Эти соединения, кроме того, обладает низкой токсичностью. Их преимуществом является легкая доступность: соединение 1г получается в одну стадию с выходом 75%, а для синтеза из него производных Пв-г требуется еще одна стадия с использованием из имеющихся в России реактивов (выходы составляют 90-97%).

ВЫВОДЫ:

1. НуклеофилЬное замещение гидроксильной группы 1-гидрокси-2,3-дигидро- 1Я-пиразоло[1,2-я]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-й]фталазин-5,10-дионов аминами и гидразидами - удобный метод синтеза фармакологически активных конденсированных 1 -амино- и 1-ацилгидразинопиразолидинов.

2. 1-Гидрокси- и 1-амино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-а]-пиридазин-5,8-дионы и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-Ь]фталазин-5,10-дионы с метальной группой в положении 3 представлены смесями цис-и транс- изомеров.

3. Кольчато-цепная таутомерия - характерное свойство 1-ацилгидразино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-я]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-Ь]фталазин-5,10-дионов, в ряде случаев осложненное явлениями цис, транс-изомерии и заторможенного вращения в амидном фрагменте.

4. Отдельные представители 1-гидрокси-, 1-амино- и 1-ацилгидразино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-а]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-Ь]фталазин-5,10-дионов мало токсичны и обладают противовоспалительным, анальгезирующим и антигипоксическим эффектом.

5. 1-Гидрокси- и 1-[(4-метил-, 4-метокси- и 4-хлорфенил)-амино]-3-метил-2,3-дигидро-1Я-ииразоло[1,2-й]фталазин-5,10-дионы более эффективны и менее токсичны, чем метамизол и фенилбутазон, и обладают к тому же выраженным жаропонижающим действием.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ:

1. Зеленин К.Н., Бежан И.П., Мельникова Л.Ф., Аль-Ассар Ф., Лесиовская Е.Е., Чакчир Б.А. 5-Гидрокси- и 5-аминопиразолидины и их противовоспалительная активность // Тезисы 1-ой Всероссийской конференции по химии гетероциклов памяти А.Н. Коста, 2000. -Суздаль, с. 183.

2. Зеленин К.Н., Бежан И.П., Алексеев В.В., Якимович С.И., Зерова И.В., Тугушева А.Р., Аль-Ассар Ф. Reactions of 1,3-di- and a,P-unsaturated carbonyl compounds with hydrazines: from observation of intermediates to their stabilization // Book of Abstracts "Reaction Mechanism and Organic Intermediates", 2001. - St.-Petersburg, p. 40.

3. Зеленин K.H., Бежан И.П., Аль-Ассар Ф. 1-Amino- and 1-hydrazino-2,3,5,10-tetrahydro-1 Я-pyrazolo[ 1,2-&]phtaIazine-5,10-diones and 2,3,5,8-tetrahydro-l#-pyrazolo[l,2-a]pyridazine-5,8-diones and their ring-

chain tautomerism // Book of Abstracts "Reaction Mechanism and Organic Intermediates", 2001. - St.-Petersburg, p. 239.

4. Аль-Ассар Ф., Лесиовская E.E., Чакчир Б.А., Бежан И.П., Зеленин К.Н. Синтез и биологическая активность 1-амино-З-метил- -2,3,5,10-тетрагидро-1 #-пиразоло[1,2-6]фталазин-5,10-дионов // Тезисы докл. III Всерос. конф. молодых ученых, 2001. — Саратов, с. 78.

5. Sinkkonen J., Ovcharenko V., Zelenin K.N., Bezhan I.P., Chakchir B.A., Al-Assar F. and Pihlaja K. Stereoisomerism and Ring-chain Tautomerism in 1 -Hydroxy-2,3-dihydro-1H-pyrazolo[ 1,2-a]pyridazine-5,8-diones and 1-Hydroxy- and l-Amino-2,3-dihydro-№pyrazolo[ 1,2-6]-phthalazine-5,10-diones // European Journal of Organic Chemistry, in press.

6. Sinkkonen J., Ovcharenko V., Zelenin K.N., Bezhan I.P., Chakchir B.A., Al-Assar F. and Pihlaja К. 'H and 13C NMR study of l-hydrazino-2,3-dihydro-l#-pyrazolo[l,2-<3]pyridazine-5,8-diones and -l#-pyrazolo[l,2-6]phthalazme-5,!0-diones and their ring-chain tautomerism // European Journal of Organic Chemistry, in press.

7. Аль-Ассар Ф., Зеленин K.H., Лесиовская E.E., Бежан И.П., Чакчир Б. А. Синтез и биологическая активность 1-гидрокси-, 1-амино-и 1-гидразино-2,3-дигидро-1Я-пиразоло[1,2-д]пиридазин-5,8-дионов и -2,3-дигидро-1//-пиразоло[1,2-й]фталазин-5,10-дионов // Химико-Фармацевтический Журнал, в печати.

8. Al-Assar F., Sinkkonen J., Ovcharenko V., Zelenin K.N., Bezhan I.P., Chakchir B.A. and Pihlaja K. Synthesis, Structure and Pharmacological Properties of 1-Hydroxy-, 1-Amino- and 1 -Hydra7jno-2,3-dihydro-1//-pyrazo!o[l,2-a]-pyridazine-5,8-diones and -2,3 -dihydro-1 Я-pyrazo 1 о [ 1,2 -¿]phthalazme-5,l 0-diones. Third Youth School-Conference of Organic Synthesis (YSCOS-3), June 24-27, 2002, Saint Petersburg, in press.