Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение пустырника татарского LEONURUS TATARICUS L.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ Р[*6 ОД ИНСТИТУТ

* На правах рукописи

КРУПИНА Марина Алексеевна

УДК 615.322:582.949

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПУСТЫРНИКА ТАТАРСКОГО ЬЕ01^1Жи8 ТАТА^СиБ I.

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

/V/

диссертации на соискание ученом степени кандидата фармацевтических наук

Санкт-Петербург — 1994

Работа выполнена в Кемеровском государственном медицинском институте и Сибирском медицинском университете.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор С. Е. Дмитрук.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Н. С. Фурса, кандидат фармацевтических наук, профессор К. Ф. Блинова.

Ведущее учреждение: Ботанический институт им. В. Л. Комарова Академии наук Российской Федерации.

Защита состоится «, Ж.. .»............................... 1994 года

часов на заседании специализированного Совета Д 084.63.01 при Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института (Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 4/6).

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат фармацевтических наук

А. В. РУСАК.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В настоящее время одним из основных направлений деятельности фармацевтической науки является поиск новых источников биологически активных веществ с целью дальнейшего расширения производства лекарственных препаратов растительного происхождения и наиболее полного удовлетворения потребности населения и аптечной сети.

Б этом отношении особую актуальность приобретают работы по изучению и рациональному использованию местных сырьевых ресурсов, что на сегодняшний день имеет важное значение, поскольку народное хозяйство постепенно переходит к рыночной экономике и каждое предприятие стремится к удешевлению себестоимости выпускаемой продукции.

Как показала экспертная оценка рынка потребления препаратов растительного происхождения в условиях Сибири большим спросом пользуется группа успокаивающих средств, особенно на основе биологически активных веществ валерианы и пустырника. Данное заключение вполне обосновано, так как наш современный век отличает высокие темпы жизни, стрессы, психическая напряженность, что выражается в прогрессирующем росте числа сердечнососудистых и нервных заболеваний.

Как известно, на удовлетворение спроса на лекарственные средства существенное влияние оказывает наличие сырьевой базы. С этой точки зрения нельзя не обратить внимание на информацию НПО ВИЛАР, согласно которой в 1991 г дефицит сырья пустырника составил около 400 тонн. Нам представляется, что для условий Сибири, эта проблема может быть решена счет сырья близкого к официнальным видам - пустырника татарского. Ь его пользу говорит не только широкое применение в народной медицине и близость химического состава, но и обширная географическая распространенность, приближенная к перерабатывающей промышленности и потребителю.

Цель и задачи исследования. Исходя из выше изложенного целью данной работы являлось теоретическое и практическое обоснование возможности использования пустырника татарского в медицинской практике в качестве полноценного заменителя п.пя--тилопастного и п.сердечного.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- изучить по данным литературы современное состояние исследований и распространение растений рода пустырник;

- провести сравнительное изучение пустырника пятилопаст-ного и пустырника татарского на содержание фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот), терпеноидов, полисахаридов, алифатических кислот, эфирных масел, алкалоидов;

- выявить и выделить основные биологически активные вещества, провести их идентификацию на основании изучения их физико-химических свойств и спектральных характеристик;

- изучить специфическую активность и безвредность сумма] ных комплексов пустырника татарского;

- определить ресурсно-сырьевой потенциал пустырника татарского в Кемеровской области и Туве;

- обосновать показатели норм качества, разработать хара] теристики подлинности, составить нормативно-техническую документацию на траву пустырника татарского.

Научная новизна и теоретическая значимость. Проведено фармакогностическое изучение малоизученного вида из рода пус' тырник - пустырника татарского. На основании экспериментальных исследований дано теоретическое обоснование возможности использования нового сырьевого источника в качестве полноцен ного заменителя пустырника пятилопастного.

Б исследуемом виде выделено 8 биологически активных веществ, 3 из которых идентифицированы как флавоноидные гликоз ды (рутин, космоссиин, цинарозид), 3 из них - фенолкарбоновы кислоты (кофейная, хлорогеновая, неохлорогеновая), 2 - иридо (гарпагид, гарпагид-ацетат).

Для растений указанного рода впервые доказано присутств (в траве пустырника татарского) кофейной, хлорогеновой, неох геновой кислот, иридоидов - гарпагида и гарпагида-ацетата, а также 21 химического элемента, из которых в наибольшем колич накапливаются фосфор, цинк, марганец, медь, титан и стронций По содержания отдельных химических элементов, полисахаридов, рутина, космэссиина и цинарозида официнальный и исследуемый вид проявляют выраженное сходство.

Доказана безвредность и аналогичное седативное, гипотензивное и противосудорожное действие суммарных комплексов пустырника пятилопастного и предлагаемого для его замены вида. Впервые для п.татарского установлена высокая антигрибковая активность водных экстрактов и показана возможность использования его сырья в составе противогрибковых растительных сборов.

Впервые установлены морфолого-анатомические диагностические Признаки сырья для растений рода пустырник, распространенных в регионе Сибири, что необходимо для составления нормативно-технической документации. Обоснованы показатели норм качества сырья пустырника татарского, обеспечивающие объективную оценку его доброкачественности. Разработана и включена в соответствующий раздел проекта Временной Фармакопейной статьи "Трава пустырника татарского" методика стандартизации сырья по содержанию действующих веществ - флавоноидов.

Практическая значимость работы. В результате установления сходства химического состава и фармакологических свойств суммарных комплексов п.пятилопастного и п.татарского появилась возможность рекомендовать последний в качестве полноценного заменителя официнального вида, что в конечном итоге позволит расширить сырьевую базу, приблизить ее, в условиях Сибири, к фармацевтическим предприятиям и лучше удовлетворить спрос на растительные средства успокаивающего и гипотензивного действия.

Для внедрения в аптечные учреждения и заготовительные организации России разработаны и предложены методические рекомендации по диагностическим признакам сырья п.пятилопастного и сопутствующих ему видов.

В результате экспедиционных обследований основных районов Кемеровской области и Тувы определен ресурсно-сырьевой потенциал п.татарского, что показывает на возможность насыщения рынка указанных регионов сырьем успокаивающего действия.

Наличие сырьевой базы и высокая антифунгальная активность водного экстракта п.татарского в отношении возбудителей дерма-тофитий, позволяет рекомендовать данный вид сырья для получения противогрибкового средства на основе природных биологически активных веществ.

Внедрение результатов исследования. Разработана и прошла предварительную экспертизу в лаборатории фармакогнозии НПО

"ВИЛАР" (декабрь, 1993 г) нормативно-техническая документаци, (проект ВфС) на траву пустырника татарского.

Разработанная пропись противогрибкового растительного сбора апробирована на кафедре дерматовенерологии Сибирского медицинского университета и внедрена в лечебно-профилактические учреждения г.г. Томска, Кемерово и Прокопьевска (Кемеров! кой обл.).

В заготовительные организации Российского АПК "Эфирлек-распром", в контрольно-аналитические лаборатории Томского и Кемеровского аптечных управлений внедрены разработанные методические указания "Диагностические признаки сырья и растений рода пустырник".

Результаты исследований пустырника татарского использую1 ся в научных исследованиях и учебном процессе кафедр фармакогнозии и технологии лекарств Сибирского медицинского университета и Кемеровского медицинского института.

Положения, выдвигаемые на защиту. На защиту выносятся:

- теоретическое обоснование возможности использования w вого сырьевого источника, содержащего биологически активные : щества успокаивающего и гипотензивного действия;

- результаты изучения фармакологических свойств и безвр' ности предлагаемого вида сырья;

- обоснование показателей норм качества на новый вид лекарственного сырья с целью включения их в проект ВФС.

Связь задач исследования с проблемными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Кемеровского медицинского института, тематикой научных исследований по проблеме "Фармация" секции "Изучение лекарственной флоры России" Научного совета № 10 "Фармакология и фармация" АМН Российской Федерации (№ госуда] венной регистрации 01.90.0016745).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на III съезде фармацевтов Туркменистана (Ашха< 1989); 12 областной научной конференции фармацевтов, посвяще! ной 10-летию фармацевтического факультета Кемеровского медицинского института (Кемерово, 1989); областной научно-практической конференции: "Молодые ученые Кузбасса - народному хозяйству" (Кемерово, 1990); X и XI научно-практических конфер!

циях фармацевтов Кузбасса (Кемерово, 1990; 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, подана I заявка на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена ?1а 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, общих выводов, библиографии и приложения. Работа иллюстрировала 15 таблицами, 33 рисунками и 2 схемами. В списке цитируемой литературы приведено 256 источников, из них 191 отечественых и 65 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во "Введении" обоснована актуальность диссертационной работы, определены цель и задачи исследований, показана научная новизна и практическая значимость.

Обзор литературы представлен в первой главе и включает вопросы, касающиеся морфолого-анатомической характеристики и распространения растений рода пустырник, сведения об их химическом составе во взаимосвязи с фармакологической активностью и применением в медицине. В главе представлен анализ этих данных и сделаны необходимые для дальнейшей работы выводы.

Пять следующих глав диссертации состоят из собственных экспериментальных исследований и далее разбираются подробно.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служила надземная часть пустырника татарского, заготовленная в фазу цветения в Кемеровской области. В ряде случаев для получения и исследования суммарных комплексов привлекали образцы сырья п.татарского, собранные в Алтайском крае и ТУве. Для сравнения использовали стандартное сырье пустырника пятилопастного Кемеровской фармацевтической фабрики. Ботаническую идентификацию видов проводили на кафедрах фармакогнозии Сибирского медицинского университета и Кемеровского медицинского института под руководством доктора биологических наук, профессора Т.П.Березовской и канд. биологических наук, доцента Н.Ф.Славиной.

Выделение и химическое изучение биологичесш активных веществ проводили методами адсорбционной, бумажной и тонкослойной

хроматографии.

При установлении структуры веществ использовали химические методы: кислотный, щелочной гидролиз, щелочную деструкцию ацетилировакие, щелочное плавление; физико-инструментальные: УФ-, ИК-спектроскопию, биохимические - ферментативный гидроли:

Сравнительная оценка пустырника татарского и пустырника пятилопастного на содержание биологически активных соединений

Для обнаружения биологически активных веществ готовили водные, водно-спиртовые и хлороформные вытяжки. Разделение различных классов соединений проводили с учетом их полярности

С помощью качественных реакций и хроматографии на бумаге в надземной части обоих видов пустырников обнаружены флавонои-ды, фенолкарбоновые кислоты, иридоиды, азотистые соединения, I лисахариды, алифатические кислоты. Как показали результаты ко. чественного определения, в наибольшем количестве пустырник татарский накапливает фенольные соединения (3,78±0,18 %), в их числе флавонэиды (1,51+0,07 %), фенолкарбоновые кислоты (0,98; 0,05 %), среди других групп Е4.В - полисахариды (4,01+0,19 %). По содержания флавоноидов и фенолкарбоновых кислот п.татарски! несколько уступает официнальному виду. Эфирные масла, азотисть основания, сапонины присутствуют в сравниваемых видах пустырников в следовом количестве. Таким образом, на основаниии проведенных исследований, а также учитывая сведения литературы, установлено, что наибольший интерес для детального химимескогс и фармакологического изучения представляют фенольные соединения (флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты), иридоиды, наиболе< характерные для данного рода и обладающие широким спектром фа{ макологической активности.

Выделение и идентификация биологически активнь;; веществ пустырника татарского

Используя избирательную экстракцию, фракционирование не-смешивающимися растворителями разной полярности, кристаллизацию, колоночную хроматографию на полиамидном сорбенте, препаративную хроматографию на бумаге нами выделено 8 биологически активных веществ, 3 из которых представлены флавоноидными гли-

козидами, 3 из них - фенолкарбоновыми кислотами, 2 - иридод-ными соединениями.

Строение выделенных веществ установлено с помощью химических и биохимических методов, УФ-, ИК-слектроскогши; физико-химические константы исследованных соединений приведены в таблице I.

Флавоноиды. На основании качественных реакций с солями циркония и кислоты лимонной, с диазореактивом, а также окраски веществ на хроматограммах в УФ-свете установили принадлежность выделенных флавоноидов к. классу флавонов: Еещества В-5, В-7 и флавонолов - В-6. Схема химических превращений данных соединений представлена на рис. I.

Спектральные исследования в УФ-области с применением диагностических добавок показали, что соединение В-5 имеет свободные оксигрулпы при С-5, С-З', С-4'. Кислотный гидролиз в мягких условиях (0,2 % кислота серная, 30 мин) не давал расщепления гликозида В-5 на агликон и углеводную часть, что подтверждает замещение гидроксила при С-7. При кислотном гидролизе 10 %-ной кислотой серной в течение б ч получили агликон и сахарный компонент, которые идентифицировали хроматографически с достоверными образцами свидетелей как лютеолин и Б- глюкоза. В продуктах щелочной деструкции данного вещества найдены флороглюцин и протокатеховая кислота. В ИК-области спектра наряду с характерными полосами отмечены полосы в области 1010-1100 см-*, характеризующие пиранозную форму сахара.

Полученные данные, сравнение хроматографических и физико-химических свойств с достоверным образцом свидетеля позволили идентифицировать вещество В-5 как апигенин-7-0-^-И-глюкопирано-зид (цинарозид).

Аналогично исследовали вещество В-6. Темно-коричневая флуоресценция вещества В-6 на хроматограммах в У&-свете до гидролиза и ярко-желтая после гидролиза, отрицательная реакция с хлорокисью циркония в присутствии кислоты лимонной свидетельствуют в пользу нахождения углеводного компонента в позиции С-З. Оранжево-красное окрашивание вещества В-6 с диазореактивом выявляет свободный гидроксил при С-7. Данные У4-спектроскопии с комплексообразующими и ионизирующими добавками указывают на наличие свободных гидроксильных групп при С-5, С-7, С-З, С-4'.

• Таблица I

Физико-химические свойства соединения, выделенных из п.татарского

Вещество Формула Т^ ц0_ _УФ- спектроскопия_

ло- исход- +алюми- +алюминия +натрия +кислота +цирконил +цирконил

сы ное ния хлорид* ацетат борная и азотно- азотно-пог- ветцест- хлорид к-та хло- натрия кислый кислый и

ло- во в ристово- ацетат кислота

ще- мета- дородная лимонная

Oq ния ноле_

Лютеолин-7- С9ТН9П0ТТ О- ß -Д-глю-копиранозид

о:]ь-д-глг): w iD копиранозил-6-1 -L -рам-нопиранозид

Апигенин-7-0-$-Д-глю-

копиранозид

Неохлороге- СтеНгоОо новая

кислота (С—3)

Хлорогеновая, CTAHToOq кислота (С-4) 16 10 у

Кофейная____ С^Од 195

255257 I П пл. 348 254 266 404 270 +56 +16 382 270 +34 +16 348 255 - 360 - 258 +12 +4 408 +60 348

188190 I .П пл. 358 258 266 299 435 275 +77 +17 400 270 +42 +12 368 268 +10 381 +10 268 +23 +10 425 273 +67 +15 358 258

178 I П пл. 335 268 296 348 399 275 +13 +64 +7 338 379 273 + 3 +44 +5 335 268 - 339 - 268 +4 404 310 +69 +42 335 310

198200 I П 328 300 245 360 315 240 +32 330 280 +2 350 +45 255 +22 +10

оо I П 328 298 240 360 315 240 +32 335 +7 350 255 +22 +15

195- I 325 360 +35 310 -15 320 -5

I

00

I

Рис. I. Схема химических преврвщений флавоноидов, выделенных из пустырника татарского.

-10В продуктах кислотного гидролиза с 2 % кислотой серной хроматографией на бумаге с достоверными образцами свидетелей идентифицировали: кверцетин, Б-глюкозу иь-рамнозу. Ферментативно расщепление рамнодиастазой приводит к образованию кверцетина -биозы, соответствующей на хроматограмме рутинозе, полученной аналогичным путем из аутентичного образца рутина.

Результаты исследований характеризуют вещество В-6 как кверцетин-3-0-]Ь-Б-глюкопиранозил-6-0-Х-1.-рамкопиранозид или рутин.

В числе других фенольных соединений из надземной части п.татарского выделен флавоновый гликозид В-7. Отсутствие сдви максимумов поглощения под воздействием натрия ацетата указыва на замещение гидроксигруппы при С-7; добавление кислоты борно к спиртовому раствору вещества В-7 с натрия ацетатом не приво дило к батохромии I полосы поглощения, что свидетельствует об отсутствии ортодиоксигруппировки в кольце В исследуемого фла-воноида. В результате кислотного гидролиза вещества В-7 с 8 % кислотой серной был получен ьгликон с температурой плавления 345-348°С, ацетильное производное которого плавилось при 180-182°С. При щелочном расщеплении вещества В-7 с последующе: хроматографией полученных продуктов установлено наличие флоро-глюцина и п-оксибензойной кислоты, что дало возможность предположить идентичность агликона вещества В-7 с апигенином. Для подтверждения полученных результатов проводилось хроматографи-ческое исследование и смешанная проба плавления. Углеводный компонент идентифицировали с в-глюкозой.

Таким образом вещество В-7 охарактеризовано как апигенин-7-0-^5-Б-глюкопиранозид или космоссиин.

Фенолкарбоновые кислоты. Одновреме! но с флавоноидами, многократной хроматографией на колонках полиамида и последующей препаративной хроматографией на бумаге I делены 3 производных коричной кислоты (С-3, С-4, С-5).

Вещества С-3 и С-4 имеют одинаковые максимумы поглощения в УФ-области спектра. Батохромный сдвиг максимумов в длинново; новой и коротковолновой областях спектра в присутствии кислоть борной и натрия ацетата свидетельствует о наличии в данных сое динениях слокноэфирной связи. Щелочной гидролиз веществ С-3 и С-4 приводит к образованию кофейной и Б-хинной кислот. Однако различие в температуре плавления, оптической активности, подвижности при хроматографировании на бумаге свидетельствуют о

/

-п-

том, что исследуемые вещества (С-3, С-4) являются изомерными соединениями, отличающимися лишь порядком замещения гидрокси-лов в хинной кислоте. При нагревании этих веществ с ледяной уксусной кислотой из вещества С-4 образуется лактон хинидин, а соединение С-3 остается без изменений, что указывает на замещение гидроксигруппы в позиции (3) Б-хинной кислоты вещества С-4 и в позиции (5) - вещества С-3.

На основании проведенных исследований анализируемые вещества охарактеризованы: С-3 как б-О-кофеил-Е-хинная (хлороге-новая) кислота, С-4 как З-О-кофеил-Б-хинная (неохлорогеновая кислота).

Вещество С-5. Качественные реакции и спектральные исследования в УФ-области позволили отнести изучаемое соединение (С-5) к оксикоричной кислоте. Характерный гипсохромный сдвиг максимума I полосы поглощения (5 нм)-при добавлении кислоты борной в присутствии натрия ацетата выявляет свободную карбоксильную группу. Щелочная деструкция вещества С-5 проходит с образованием протокатеховой кислоты, что подтверждает спектральные исследования о наличии в структуре вещества С-5 3,4-диоксигруппы.

Таким образом результаты исследований характеризуют вещество С-5 как 3,4-диоксикоричную или кофейную кислоту.

Иридоиды. На основании качественных реакций со специфическими'реактивами (Шталя, Бекон-Эдельмана), данных УФ-, ИК-спектроскопии, химических превращений вещества Д-1, Д-2 отнесены к иридоидным гликозидам.

В УФ-спектре исследуемых соединений отмечен максимум поглощения при Л 207-210 нм, что подтверждает наличие эфирно-енольной группировки пиранового цикла. Максимум поглощения при Л 242-245 нм свидетельствует о наличии X,^-ненасыщенного лак-тона. В ИК-спектре веществ Д-1 и Д-2 имеются максимумы полос при 3500-3100 (спиртовые группы агликона и углеводной

части), 3000-2800 см~*(СН-группы изолированных двойных связей), 1755, 1735 (карбоксильная группа, принимающая участие в образовании ненасыщенного лактона), 1640-1560 (валентные колебания

-0-С=С-), 1470-1340 (алифатические СНо- и СН? - .группы), 813 см"1 (пирановое кольцо).

При энзиматическом расщеплении ферментом эмульсином вещество Д-1 дает неустойчивый агликон и углеводный компонент -р-глюкозу.

Омыление иридоида Д-1 0,5 % раствором натрия гидроксид; течение 2 ч приводит к образованию кислоты уксусной и вещест] которое при хроматографическом иссЛёдОВании а диитивврным и< разцом свидетеля оказалось идентичным гарпагиду.

При ацетилировании в обычных условиях вещество Д-1 прев] щается в ацетильное производное с Тш 185-190°С (гептаацетат гарпагида), что указывает на присутствие в исходном веществе ацетильного остатка.

При кислотном гидролизе вещества Д-2 5 % кислотой сержн в течение I ч образуется темно-синий пигмент, В фильтрате пос ле обычной обработки обнаруживается С-глюкоза.

Таким образом на основании проведенных исследований и данных сравнения с достоверными образцами свидетелей иридоидс анализируемые вещества охарактеризованы как: Д-1 - гарпагид-ацетат, Д-2 - гарпагид.

Макро- и микроэлементы. Учитывая важную роль макро- и микроэлементов в структурировании полисахаридов, ферментов и других БАБ, представляло интерес их исследование и в надземной части п.татарского. В результате спе рального анализа установлено, что минеральный состав исследуе мого растения представлен 21 химическим элементом. Среди них заметном количестве присутствуют жизненно важные, принимающие активное участие в обменных прцессах ( Ъп, Си, Мп, Мо, 7 , Са Р ); Содержание примесных тяжелых металлов, токсичных для ор ганизма человека (А-е , В1 э С<1 , ЭЪ ) в объекте исследования не обнаружено.

Изучение специфической активности и безвредности препаратов пустырника татарского

Фармакологические исследования п.татарского в сравнении I официнальным видом - п.пятилопастным выполнены на кафедре фармакологии Кемеровского медицинского института, кафедре фармакогнозии Сибирского медицинского университета, в Лаборатории скрининга лекарственных веществ НИК фармакологии Томского нау ного центра Рос. АМН.

Для изучения фармакологических свойств п.татарского из ' надземной части были получены настойка (1:5) на 70 % этаноле и жидкий экстракт (1:2) на 25 % этаноле.

Исследования острой токсичности настойки и жидкого экстракта п.татарского, выполненные по общепринятой методике на

белых беспородных половозрелых мышах-самцах, показали, что дозы препаратов от 500 до 5000 мг/кг включительно гибели животных, изменений в поведенческих реакциях, нарушения основных рефлексов не вызывают. Согласно классификации токсических веществ они могут быть отнесены к группе практически нетоксичных соединений.

Исследование хронической токсичности препаратов в опытах на кроликах позволило установить, что настойка и жидкий экстракт п.татарского при 30-дневном курсовом пероральном введении в дозах 500 мг/кг существенного токсического действия не оказывают.

Седативные свойства. Изучение влияния водно-спиртовых вытяжек п.татарского на центральную нервную систему проводили общепринятыми методиками оценки различных проявлений действия психотропных веществ. При этом использовали методики "открытого поля", "конфликтной ситуации", "условного рефлекса пассивного избегания" (УРПИ).

Опыты выполнены на 276 белых нелинейных половозрелых крысах обоего пола массой 90-150 г. Препараты вводили внутрибрю-шинно в дозах 500 мг/кг (настойка), 1000 мг/кг (экстракт). Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статастики с учетом критерия Стъодента при Р=0,05.

В условиях методики "открытого поля" изучали общую двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение животных. Наблюдения вели через 60 мин после однократного, а затем курсового (б-дневного) введения препаратов. В результате исследований отмечено, что вытяжки п.татарского после однократного введения заметно снижают подвижность животных в сравнении с исходным уровнем. В тоже время под влиянием этих же препаратов увеличивается время пребывания крыс-самцов в центре поля и сокращается число посещаемых секторов по периферии. Се-датиЕный эффект исследуемых препаратов сочетается с достоверным снижением вертикального компонента ориентировочной реакции, ухудшением исследовательского поведения, последнее проявляется в снижении числа заглядываний в "выходные" отверстия поля. После курсового назначения данных вытяжек поведение животных приближается к исходному уровню. Как показали результаты эксперимента существуют незначительные различия в степени проявления эффекта настоек на 70 % этаноле сравниваемых видов пустырников, действие экстрактов аналогично.

"Конфликтную ситуацию"создавали столкновением двух безу' ловных рефлексов: питьевого и оборонительного. В результате исследований установлено, что вытяжки из п.татарского оказыв

"||1 M'I'UUII'IIUUIIH .. ...........inn nnttimnnn п уттпрмс^у конфликта. ДОСТ'

верный эффект проявляется после 5-дневного введения препаратов, что находит отражение в эмоциональном поведении животны: исчезает невротичность, что характеризуется увеличением числ подходов к поилке со взятием воды, несмотря на получение при этом электроболевых раздражений (снижение условно-оборонител ного рефлекса). Препараты п.татарского не уступают по своей активности таковым п.пятилопастного.

УРПИ вырабатывали в камере с электродным полом путем од нократного электрокожного подкрепления. После 6-дневного вве дения исследуемых вытяжек животных тестировали на воспроизве дение УРПИ. Как показали результаты эксперимента, настойка и жидкий экстракт п.татарского способствуют обучению и закрепл нию памяти животных, что подтверждается удлинением общей про должительности латентного периода незахождения в темную каме ру животных. По данному тесту настойка и жидкий экстракт п.т тарского незначительно уступает препаратам п.пятилопастного.

Гипотензивные свойства. При изучен влияния водно-спиртовых вытяжек на кровяное давление установ лено, что в дозах 250-500 мг/кг наблюдается снижение кровяно го давления на 20,5-28,1 %.

Противосудорожные свойства. Изу чение антиконвульсивных свойств вытяжек пустырника татарског и п. пятилопастного проводили на 240 белых беспородных мышах самцах. Исследуемые препараты вводили I раз в сутки в одно и тоже время в постоянной дозировке в течение 5 дней. В качест экспериментальных методик для оценки противосудорожных свойс препаратов использовали: метод максимального электрошока (МЭ экспериментальные модели коразоловых и стрихниновых судорог.

Исследования показали, что нативные вытяжки, полученные из надземной части обоих видов пустырников, обладают проти-восудорожной активностью по тестам МЭШ и коразолового титров ния. Наиболее эффективны в отношении коразоловых судорог нас тойки на 70 % этаноле, которые в наименьшей по сравнению с другими препаратами дозе (1000 мг/кг) заметно повышают судорожный порог коразола; причем действие их выражено в равной степени для п.татарского и п.пятилопастного (АКИ 1,29 и 1,33

соответственно). Жидкие экстракты и водные настои обнаруживают достоверный антикоразоловый эффект при более высоких дозах: 1500 мг/кг для п.татарского и 2000 мг/кг - для п.пятилопастного.

Как показали наблюдения по тесту Möiü, изученные нами препараты обоих видов пустырников проявляют разный уровень проти-восудорожной активности в диапозоне ЭД^д от 750 до 3820 мг/кг. При этом настойка п.татарского выгодно отличается по своей активности от настойки официнального вида (ЭД^д 750 и 1560 мг/кг соответственно). Обратные результаты получены для экстракта и настоя п.татарского.

С целью оценки влияния препаратов изучаемых пустырников на спинной мозг использована экспериментальная модель стрихни-новых судорог. В ходе эксперимента достоверных результатов получено не было; в дозах, эффективных в отношении коразола, исследуемые вытяжки на судорожное и летальное действие стрихнина существенного влияния не оказывают.

Антигрибковая активность. Исследованию на антигрибковую активность подвергались: экстракты (хлороформный, эфирный, этанольный, водный), сумма флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, а также ряд индивидуальных биологически активных веществ, выделенных из пустырника татарского: флавоноиды (гиперозид, рутин, цинарозид, изокверцитрин), окси-коричные кислоты (кофейная, хлорогеновая, неохлорогеновая).

Проведенные исследования позволили выяеить различную степень фунгистатической актизности в отношении возбудителей дерматофитий ( Microsporum canis, Trichophyton rubrum, Trichophytc mentagrophytes ). Все условные препараты оказывают умеренную ингибирующую активность на рост возбудителей дерматофитий в достаточно широких пределах (0,96-500 мкг/мл). И только извлечения, полученные с помощью горячей воды (Ю0°С) отмечаются более низкими ингибирующими концентрациями (0,95-3,84 мкг/мл), что позволяет рекомендовать этот вид экстракта для углубленных фармакологических исследований с целью создания на его основе противогрибкового средства.

Данные, полученные в результате выполненных исследований, послужили основанием для разработки оригинального способа получения противогрибкового средства, представленного в ИЖ Государственной Патентной экспертизы для патентования.

Разработка НТД и ресурсные исследования __пустырника татарского

В данной главе приведены результаты изучения признаков, характеризующих подлинность и доброкачественность сырья.

Макро- и микроскопические исследования надземной части п.татарского проводили в сравнении с такими видами пустырник как п.лятилопастной и п.сизый, поскольку они имеют общий аре и возможны как примеси при заготовке сырья. При этом выявлен отличительные макро- и микропризнаки сырья п.татарского, по: воляющие точно установить его подлинность.

Среди микроскопических особенностей данного растения следует выделить: устьица аномоцитного типа с 2-6 сопровожде щими клетками на нижней стороне листа; простые волоски 1-2-> реже 3-4-клеточные, грубобородавчатые, коленчато-изогнутые; чешуйчатые волоски 2 типов: крупные с 6-8 выделительными кле ками (эфирно-масличные железки) и 4-клеточные с округлой гоI. кой (железистые волоски); головчатые еолоски с одноклеточной головкой на 1-2-клеточной короткой ножке; стебель и чашечка с наружней поверхности обильно опушены простыми многоклеточными оттопыренными волосками; эпидерма венчика с обилием головчатых волосков на коротких ножках, простых тонкостенных многоклеточных и железистых волосков.

С целью установления доброкачественности сырья были ощ делены числовые показатели, включенные в проект НТД: влажнс не более 10 содержание золы общей не более 10 %\ золы не растворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной не бс лее I %; экстрактивных веществ, извлекаемых 70 % этанолом, I-менее 15 %\ количественное содержание флавоноидов не менее I Срок годности сырья рекомендуется установить до 3 лет.

Изучено распространение пустырника татарского на террит рии Кемеровской области. Определена урожайность указанного е да на конкретных зарослях методом закладки учетных площадок. При этом установлено, что выход воздушно-сухого сырья с едиь цы площади в указанных районах составляет 10,23-54,0 г/м^.

На основании проведенных исследований разработан проект Временной Фармакопейной статьи на траву пустырника татарскох

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено комплексное исследование одного из малоизученных представителей рода пустырник - п.татарского

( Ьеопигиэ tataricus Ь.) и установлено, что в надземной части данного растения в сравнении с официнальным видом - п.пятило-пастным содержатся теже группы биологически активных веществ: флавоноиды, фенолкарбоновые и алифатические кислоты, иридоиды, эфирные масла, азотистые основания, полисахариды, макро- и микроэлементы.

2. Из надземной части п.татарского выделены и установлена структура 8 биологически активных соединений, 3 из которых представлены флавоноидами (рутин, космоссиин, цинарозид), 3 -фенолкарбоновыми кислотами (кофейная, хлорогеновая, неохлоро-.геновая) и 2-иридоидами (гарпагид, гарпагид-8-ацетат).

3. Для оценки качества сырья по содержанию действующих веществ разработана и включена в соответствующий раздел проекта Бременной Фармакопейной статьи "Трава пустырника татарского" методика количественного определения флавоноидов.

4. В надземной части исследуемого вида определено содержание полисахаридного комплекса - 4,01+0,19 %; качественный моно-сахаридный состав которого представлен о -глюкозой, и-галактозой, с -ксилозой, ь-рамнозой.

5. Учитывая важную роль макро- и микроэлементов в структурировании полисахаридов, ферментов и других биологически активных веществ, изучен минеральный состав п.татарского. Установлено, что в сырье в заметных количествах накапливаются .такие незаменимые для организма элементы как Яп, Си, Нп, Мо, V.

6.Фармакологическими испытаниями установлено, что настойка на 70 % этаноле и жидкий экстракт на 25 % этаноле малотоксичны для лабораторных животных, обладают седативным, противо-судорожным и гипотензивным действием. По своей специфической активности исследуемые экстракты не уступают официнальным препаратам п.пятилопастного,' что позволяет рекомендовать их в качестве дополнительных лекарственных средств седативного и гипотензивного действия.

7. Исследованы антигрибковые свойства индивидуальных БАЗ, суммарных комплексов, выделенных из травы п.татарского и п.пятилопастного. Установлено, что все исследуемые препараты в широком диапозоне концентраций (0,96-500 мкг/мл) проявляют имги-

бирующее воздействие на рост дерматофитий ( Microscorum cani Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytee ) . Наиболс ЦффЫКТИЦНЫМИ UKUJcUlHm Водили ИДИЛСЧ0Н1Ш, получопшо о по май горячей воды (Ю0°С), в связи с чем является перспективным \ дальнейшее фармакологическое исследование с целью создания I-вого противогрибкового средства.

8. Изучено морфолого-апатомическое строение надземной t ти п.татарского. Установлены диагностические признаки сырья.

9. На основании проведенных исследований разработана не мативно-техничьская документация на лекарственное растительь: сырье: проект Б-..С "Трава пустырника татарского". Документаци по результата]/, доклинических испытаний п.татарского находите на рассмотрении Фармакологического комитета МЗ Rfc.

По Т' ме диссертации опубликованы следующие работы

1. Губко М.А., Славина Н.Ф. Анатомо-морфологические осо бенности вида Loonurus tatariouab- Кемерово, 1990. - 21 с. (^копись деп. в ВИНИТИ № 5815-90).

2. Крупина М.А., Горшкова В.К., Дмитрук С.Е. Исследован противосудорожных свойств некоторых видов рода пустырник //$ терапия. - Кемерово: Народная медицина, 1993. - № 2. - С.7-1

3. Попов А.И., Губко М.А. Фитохимическое изучение запад сибирских видов пустырников /Материалы III съезда фармацевто Туркменской ССР: Тез. докл. - Ашхабад, 1989. - С. 261.

4. Губко М.А. 0 флавоноидах пустырника татарского /Мате риалы областной научно-практической конф. Молодые ученые Куз басса - народному хозяйству: Тез. докл. - Кемерово, 1990. -

5. Губко М.А., Толочко Т.А. Изучение пустырника татарск в геохимическом аспекте /Материалы областной научно-практич. Молодые ученые Кузбасса - народному хозяйству: Тез. докл. -Кемерово, 1990. - С. 30.

6. Губко М.Л., Славина Н.Ф. Получение и химическое иссл дование полисахаридов пустырника татарского /Материалы научн практич. конф., поев. 50-летию фармац. ф-та ТМИ. Состояние и перспективы раз; ;:тия фармации в Сибири и на Дальнем Еостоке: Тез. докл. - Том.лс, 1991. - С. 127-128.

7. Крупина М.А., Коновалова Е.И. Распространение, морфо. гические особенности и .перспективы использования сибирских в: дов пустырников /Материалы 12 областной науч. конф. фармацев1 поев. 10-летию фармац. ф-та КГМИ. Актуальные проблемы фармац: Кузбасса. - Кемерово, 1989. - С.84-88.