Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Выявление инфицированных вирусом лейкоза крупног рогатого скота животных с помощью различных вариантов иммуноферментного анализа

Г'-.у

На правах рукописи

с.

САТАЕВА

ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЖИВОТНЫХ С ПОМОЩЬЮ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ИММУНО-ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Новосибирск 1998

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор В. М. Чекишев

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, профессор П. Н. Смирнов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник В.В. Хромцов кандидат биологических наук, доцент O.A. Колганова

Ведущее учреждение -

Алтайский государственный агроуниверситет

Защита диссертации состоится " " ¡¿Сй,Л,У~Й 1998 г. •

в_ часов на заседании диссертационного совета Д.020.23.01.

Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (633128, Новосибирская область, п. Красно-обск, ИЭВСиДВ)

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

Автореферат разослан" <L "^бзуу 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, „ ^

доктор ветеринарных наук А.А. Самоловов

/7 б <>

1. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы. Э Н зоотический лейкоз является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний крупного рогатого скота. Этиологический агент (вирус лейкоза крупного рогатого скота - ВЛКРС) выделен и идентифицирован сравнительно недавно (Miller J. et al.,1969). За прошедший период изучены физико-химические свойства возбудителя, его биохимические состав, инфекционность для различных видов животных, а также особенности патогенеза лейкоза крупного рогатого скота (Бурба Л.Г.,1977; Бусол В.А.Д982; Гулкжин М.И.,1993; Ко-ромыслов Г.Ф.,1988; Шишков В.Г.,1979; Нахмансон В.Н.,1986; Смирнов П.Н.,1987 и др.). К настоящему времени установлена стадийность заболевания, особенности динамики антителоносительства к ВЛКРС, изменения гематологических и биохимических показателей инфицированных и больных животных.

Одним из факторов, определяющих эффективность борьбы с лейкозом крупного рогатого скота, является наличие высокоспецифичных и чувствительных методов прижизненной диагностики. Из апробированных к настоящему времени методов серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота наиболее широкое распространение получила реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД). Этот простой в выполнении и оценке результатов метод, вполне удовлетворяет ветеринарную практику на первоначальном этапе оздоровления стад крупного рогатого скота от лейкоза. Однако на завершающей стадии оздоровления, когда остаются единицы слабореагирующих животных, желательно использование более чувствительных методов (Jacobson K.L. et al. , 1985: Арутюнян В.Г.,1992; Киселев A.B.,1992). Более чувствительные радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный (ИФА) анализ полностью отвечают требованиям практики, однако в нашей стране до настоящего времени не нашли широкого применения из-за отсутствия высоко-очшценных и специфичных реагентов. Из двух последних методов следует отдать предпочтение ИФА, т.к. он не требует особых условий при выполнении, обладает сравнительно высокой специфичностью и чувствительностью и может выполняться в автоматическом режиме (Monke D.R. et al.,1992: Beier D„ Siakkou H.,1994: Bricout F., 1987: Jacobello C. et al.,1988). В ИФА можно определить антивирусные антитела не только в индивидуальных, но и в сборных пробах сыворотки крови и молока (Jacobs R.M. et al.,1991). В настоящее время метод широко применяется в зарубежной практике и позволил практически завершить оздоровление ферм на территории Западной Европы (Schwarts I. and Levy D.,1994).

В лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ получены реагенты для выявления инфицированных ВЛКРС животных в ИФА (Файзулин Р.З. и др.,1993), однако они недостаточно апробированы - в условиях практики.

1.2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Апробировать различные варианты ИФА с реагентами ИЭВСиДВ и дать оценку их эффективности при выявлении инфицированных ВЛКРС животных. Для реализации указанной цели были определены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия выполнения ИФА с реагентами ИЭВСиДВ для выявления инфицированных ВЛКРС животных;

2. Оценить чувствительность и специфичность избранного варианта ИФА для выявления инфицированных ВЛКРС животных в сравнении с принятой в настоящее время для этих целей РИД в геле агара;

3. Апробировать тест-систему ИФА при исследовании молока, в т.ч. групповой пробы молока.

1.3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА На основе моноклональных антител к р24 антигену ВЛКРС разработан сэндвич-вариант ИФА лейкоза животных. Показана возможность использования молока, в т.ч. групповой пробы молока для оценки эпизоотической ситуации стад в рекомендуемом варианте ИФА. Проведен сравнительный анализ чувствительности и специфичности сэндвич-варианта ИФА и РИД в экспериментальных и производственных условиях, в т.ч. на различных стадиях оздоровления ферм от лейкоза.

1.4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Сэндвич-вариант ИФА внедрен в ряде хозяйств Алтайского края, республики Саха (Якутия) и других областей РФ. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ рекомендуемая нами система принята для широкой производственной проверки.

1.5. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения диссертационной работы доложены: ла научно-практической конференции "Актуальные вопросы ветеринарии" г. Новосибирск, 1997); II Межвузовской научно-практической конференции "День Земли" (г.Бийск, 1996); Ш Межвузовской научно-практической конференции "День Земли" (г.Бийск, 1997); на научной конференции, посвященной 50-летию Алтайской НИВС (г.Барнаул, 1997).

1.6. ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

По теме диссертационной работы опубликовано 5 научных

работ.

1.7. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, который иллюстрирован 24 таблицами состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы и практические предложения. Список цитированной литературы включает 145" источника, из них 105 - иностранных авторов.

1.8.0СН0ВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На защиту выносятся условия выполнения иммуноферментно-го анализа с реагентами ИЭВСиДВ при выявлении инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота и материалы о сравнительной эффективности

тест-систем ИФА и РИД в системе мер профилактики и ликвидации лейкоза.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ СО РАСХН с 1992 по 1997 год. Исследования по оптимизации параметров реакции для непрямого и сэндвич-вариантов ИФА проводили при использовании контрольных сывороток крови, тестированных в лаборатории по изучению лейкозов ИЭВСиДВ.

Материалом для исследований при отработке параметров выполнения ИФА служили положительные и отрицательные контрольные сыворотки крови из коммерческих наборов, а также сыворотка крови и молоко из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств Новосибирской области, любезно представленные лабораторией по изучению лейкозов ИЭВСиДВ.

Для изучения характера реагирования крупного рогатого скота в РИД с полисахаридным gp51 антигеном и в ИФА с полипептидным р24 антигеном ВЛКРС 3-х кратному серологическому исследованию были подвергнуты пробы сыворотки крови и молока от 2663 животных из нескольких хозяйств Бийского района Алтайского

края. Серологические исследования в хозяйствах проводили с интервалом в 7 месяцев.

Показатели динамики серологических исследований сыворотки крови и молока учитывали у 609 коров указанных выше хозяйств.

Параллельные пробы сыворотки крови и молока от 211 коров из 4 хозяйств Курганской области, представленные лабораторией по изучению лейкозов, исследовали в сэндвич-варианте ИФА и РИД для определения чувствительности и специфичности предлагаемого нами метода. Выявление специфических антител проводили в РИД в агаровом геле с gpSl антигеном BJIKPC.

Ашиген для непрямого варианта ИФА был наработан по методике Takahachi К., Kono Y. (1985) в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ на FLK-культуре клеток, предоставленной лабораторией лейкозов животных ИЭВСиДВ (проф. Смирнов П.Н.).

FLK-культуру заражали BJIKPC, инкубировали в среде, содержащей 10% триптозофосфатной среды и 2% фетальной телячьей сыворотки, свободной от гамма-глобулинов. Культуральную жидкость цешрифугировали при 4000 g 30 минут при 4°С и осевшую суспензию клеток отбрасывали. Супернатант смешивали с (NH 4)2 SO4 (0,318 г/мл), помещали в ледяную баню на 1 час при 4° С. Осадок растворяли в минимальном количестве буферного раствора TNE (0.01М трис-HCl pH 7,4; 0,1M NaCl; 0,001М EDTA).

В центрифужные пробирки с несмешанными слоями (по 6 мл) сахарозы60% - и 30% (W/v) наслаивали до 25 мл растворенный осадок культуральной жидкости и центрифугировали при 120000 g в течение 2 часов при 4СС (Ротор SW 27, центрифуга Bekman).

Белый осадок антигена между слоями сахарозы осторожно отсасывали из пробирки и смешивали с равным объемом TNE, добавляли к 20 объемам градиента сахарозы и центрифугировали при 120000 g 18 часов при 4°С. Вновь белую часть над градиентом отсасывали и обрабатывали 0,1% Triton хЮО 1 час в ледяной бане. Этот очищенный вирусный материал помещали в разовые полиэтиленовые пробирки и хранили в жидком азоте до использования в ИФА, как антигена, содержащего преимущественно gp51.

Специфическую активность антигена проверяли в РИД в геле агарозы с положительной к gp51 сывороткой крови крупного рогатого скота.

Непрямой вариант ИФА выполняли в соответствии с методикой в описании Takahachi К. and Kono Y,(1985). Полученный вышеописанным методом антиген gp51 титровали для определения ра-

бочего разведения и в лунки иммунологических планшет вносили по 200 мкл оттитрованной дозы антигена. Сорбцию антигена проводили в течении 18 часов при температуре 4° С. Затем планшет 3-х кратно отмывали ФСБТ и в каждую лунку вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки в разведении 1:100 в ФСБТ. Через 30 минут планшет Зх-кратно отмывали ФСБТ и вносили рабочее разведение конъюгата. Через 30 минут проводили 3-кратное отмывание ФСБТ и в каждую лунку вносили субстратную смесь*.

Реакцию останавливали при четком окрашивании в контрольной лунке 6М раствором Н^БО^. Учет реакции проводили визуально и спектрофотометрически при 490 нм с помощью ридера фирмы Е>упа1есЬ.

Конъюгат готовили из моноклональных антител (МКА) к Н-цепям .Т^! крупного рогатого скота.

Гибридома, синтезирующая МКА, была получена в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ (Файзулин Р.З.).

Сэндвич-вариант ИФА выполняли в соответствии с методикой, описанной РоййеИе е1 а1. (1983). Полученные моноклональные антитела разводили в карбонат-бикарбонатном буфере ** (рН 9,6) 1:1000 и по 100 мкл вносили в лунки планшета и инкубировали для неспецифической сорбции антител 20 часов при температуре 37°С. Затем планшет 3-х кратно отмывали ФСБ с добавлением 0,05% Т\уееп-20 и в каждую лунку вносили р24 антиген ВЛКРС (полученный Файзулиным Р.З. с помощью аффинной хроматографии) в ФСБТ в рабочем разведении по 100 мкл.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ ТИТРОВ КОНЪЮГАТА

Рабочее разведите конъюгата готовили после предварительного титрования нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота в прямом варианте ИФА.

* Субстратная смесь Ортофенилендиамин растворяли в Ыа-цитратном буфере рН 5,2 (5 мг ОФД на 10 мл буфера, содержащего 3 мкл Н2О2).

* * Карбонат-бикарбонатный буфер

5,28 г/л Ыа гСОг, 4,2 г/л ЫаНСО} вносили до полного растворения в небольшой объем дистиллированной воды и доводили до 1000 мл дистиллированной водой.

Иммунопероксидазный конъюгат был приготовлен из мо-ноклональных антител клона 7Ds2. Титр конъюгата определяли в реакции с антигеном (JgG).

В горизонтальные ряды планшета в течении 30 минут при комнатной температуре сорбировали разведения нормальной сыворотки крупного рогатого скота в КББ в разведениях 1:10, 1:50,1:100, 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1000. Последний ряд- контроль конъюгата. В вертикальные ряды вносили разведения конъюгата 1:100, 1:200, 1:400, 1:600, 1:800, 1:1000,1:1600, 1:3200.

В соответствии с показателями оптической плотности при раститровке нормальной сыворотки крови в прямом варианте ИФА оптимальным титром конъюгата является разведение 1:1000. Все последующие исследования с применением непрямого и сэндвич-варианта ИФА проводили с использованием конъюгата в разведении 1:1000. Хранили конъюгат в виде суспензии в полунасыщенном растворе сульфата аммония при 4°С или под 20%-ным раствором глицерина (10 мкл трис-HCl pH 7,4; 150 мкл NaCl) при -16°С (Angel Montoya and Jose V.Casstell, 1987).

2.2.2. НЕПРЯМОЙ ВАРИАНТ ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВЛКРС ЖИВОТНЫХ

Определение чувствительности и специфичности непрямого варианта ИФА изучали при исследовании сыворотки крови и молока из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств Новосибирской области, представленных лабораторией по изучению лейкозов ИЭВСиДВ (П.Н.Смирнов). Предварительно были определены оптимальные режимы выполнения анализа.

Титр антигена определяли в ИФА с контрольной положительной сывороткой. В вертикальные ряды планшета вносили разведения антигена в КББ pH 9,6 и сорбцию антигена проводили при 4°С в течении 18 часов.

В горизонтальные ряды планшета вносили разведения контрольной положительной сыворотки крупного рогатого скота в КББ pH 9,6 и инкубировали 15 минут при комнатной температуре.

Наилучшие показатели мы получили при разведении антигена 1:100. При разведении антигена меньше 1:100 наблюдается незначительное увеличение чувствительности реакции, а при повышении титра более 1:100 -снижение чувствительности реакции. При разведении антигена и положительной контрольной сыворотки 1:1000 наблюдается легкое желтоватое окрашивание лунки, сравнимое с окрашиванием в лунке с отрицательным контролем.

Установив титр антигена, мы установили оптимальное время связывания антигена с планшетом. Описанные в литературе значения рН для антигена соответствуют 9,6, который мы взяли за исходный.

Оптимальное разведение антигена 1:100 сорбировали в течение периода от 5 минут до 18 часов при 4°С в КББ с рН 9,6 и рН 12,0.

При длительности инкубации антигена (1 час и более) наблюдали снижение чувствительности реакции. Оптимальный результат получали при инкубации антигена до 30 минут при рН 12,0, после чего чувствительность реакции снижалась (Таблица 1).

После установления оптимальных титров конъюгата и антигена для получения стабильных результатов с заведомо известными положительно- и отрицательно реагирующими на лейкоз сыворотками отработали режим выполнения непрямого ИФА.

Таблица 1

Интенсивность окрашивания результатов реакции в зависимости от времени сорбции антигена на планшет

Время сорбции (мин.) БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ

рН 9,6 рН 12,0

5 - 0,932

10 0,348 1,113

15 0,370 1,248

30 0,541 1,238

45 0,634 0,832

60 0,877 0,655

18 час. 1,266 0,322

При постановке непрямого ИФА по описанной в материалах и методах схеме были получены неудовлетворяющие нас фоновые реакции с сыворотками крови из благополучных по лейкозу хозяйств.

Для понижения показателей фоновых реакций с контрольными сыворотками мы попытались увеличить титр исследуемой сыворотки 1:1000, ввели в схему обработку сорбированного на планшет антигена блокатором (10%-ная сыворотка крови лошадей в КББ рН 9,6 ), изменили состав субстратной смеси ( 10 мл 0,1 М лимонной кислоты, 10 мл 0,2М ЫаНР04,10 мг ортофенилендиамина, 3

мкл 33%-ной Н 2О2), увеличили кратность отмывания на всех этапах анализа до 4-х.

При этом мы достигли некоторого понижения уровня фоновых реакций, но значительно понизилась и чувствительность реакции с положительными контролями.

При исследовании 22 сывороток крови и параллельных проб молока из неблагополучного по лейкозу хозяйства, часть проб, положительно реагирующих при исследовании по схеме 2, оказались отрицательными.

При отработке окончательного варианта схемы выполнения непрямого ИФА в последующем были предприняты попытки варьирования каждого из компонентов реакции.

Наиболее удовлетворяющие нас результаты были получены при постановке анализа по следующей схеме: антиген, разведенный 1:100 в карбонатном буфере, рН 12,0 сорбировали при комнатной температуре в течении 15 минут. Затем планшет отмывали ФСБ с 0,05% Твин-20 и 2-кратно дистиллированной водой. После отмывания во все лунки планшета вносили по 90 мкл молочного блокирующего буфера рН 7,4 с казеином и по 10 мкл исследуемой сыворотки. При исследовании молока вносили 50 мкл блокатора и 50 мкл неразведенной пробы.

Планшет с внесенными пробами инкубировали при комнатной температуре в течения 30 минут и отмывали 3-кратно дистиллированной водой. После внесения рабочего разведения конъюгата и инкубации при комнатной температуре в течении 30 минут проводили отмывание ФСБТ и 3-кратное отмывание дистиллированной водой.

В лунки отмытых планшет вносили субстратную смесь и инкубировали при комнатной температуре в темном месте в течении 20-30 минут. Для остановки реакции в каждую лунку вносили 50 мкл 6М Н 2804.

Для определения специфичности отработанной схемы выполнения ИФА исследовали сыворотку крови из благополучного по лейкозу ОПХ "Элитное". При этом показатель оптической плотности при 490 им был во всех исследованных пробах в 3-5 раз ниже, чем с положительными контролями.

Отработанная схема выполнения непрямого варианта.ИФА была комиссионно апробирована в ИЭВСиДВ. Пробы сыворотки крови и молока из хозяйств Новосибирской области с различной эпизоотической ситуацией по лейкозу, бруцеллезу, туберкулезу, а также от коров, больных маститом были зашифрованы и подвергнуты исследованию в РИД и ИФА. Исследования проведены в дубле.

Результаты сравнительных исследований показали, что:

- представленная тест-система обладает высокой специфичностью и активностью, совпадение с данными РИД составляет 100%;

- из 14 проб сыворотки крови и молока из хозяйства, благополучного по лейкозу, положительных проб молока и сыворотки крови в ИФА не выявлено;

- по данным анализа образцов сыворотки крови и молока от животных из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу, туберкулезу и маститу, установлено совпадение результатов ИФА в материалах от одного и того же животного. Несовпадение отмечено в пробе 43 (шифр 69 и 113), где при положительном результате с сывороткой, отрицательный результат получен с молоком.

Результаты комиссионного испытания показали, что предлагаемый на ми вариант ИФА высокеспецифичен, обладает высокой чувствительностью и может быть использован для исследования молока.

Учитывая результаты комиссионной проверки специфичности непрямого варианта ИФА, нами проведено определение чувствительности метода по раститровке проб молока. Для этого пробы молока от животных положительно реагирующих в РИД были рас-титрованы молоком отрицательно реагировавших в ИФА.

Таблица 2

Чувствительность ИФА при исследовании групповой пробы молока

Номер животного ОЦЕНКА СЫВОРОТКИ Титр молока

в РИД в ИФА

112 - - -

113 - - -

117 - - -

89 ± + 1 16

111 ± + 1 32

90 + + 1 32

102 + + 1 32

72 + + 1 64

108 + + 1 128

106 + + 1 128

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

Молоко от сомнительно реагирующих в РИД животных дает положительную реакцию в непрямом варианте ИФА в минимальном разведении 1:16. Следовательно, если в стаде из 16 коров одно животное окажется слабореагирующим в РИД, то при исследовании групповой пробы будет получен положительный результат (Таблица 2).

К сожалению, активность §р51 антигена, сорбированного на полистароловые планшета резко понижалась через 2 недели, а через 1,5-2 месяца, даже при хранении в бытовом холодильнике, полностью терялась. Это явилось основной причиной поиска других вариантов ИФА, пригодных для использования в практических условиях.

2.2.3. СЭНДВИЧ-ВАРИАНТ

Специфичность ИФА определяется высокой степенью очистки основных реагентов, используемых в реакции. Сэндвич-вариант ИФА предусматривает использование высокоспецифичных антител, желательно к одному из эпитопов основного антигена вируса или бактериальной клетки. Оптимальный результат может быть получен при использовании моноклональных антител.

В лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ были получены моноклональные антитела к основному белку ВЛКРС- р24 (Р.З.Файзулин).

При отработке параметров проведения сэндвич-варианта ИФА за основу был взят метод в описании А.М.Егорова и др.(1991).

МКА в рабочем разведении в 0,1М ЫаНСОЗ, рН 9,6 сорбировали на полистироловый планшет в течении 18 часов при температуре 4°С. Несвязашиеся с планшетом антитела отмывали 3-кратно ФСБТ. Затем в лунки планшета вносили неочищенный р24 антиген в блокирующем буфере (ФСБТ, содержащий 10% сыворотки лошадей). После связывания антигена в течение 3-х часов при комнатной температуре планшет отмывали от избытка антигена 3-кратно ФСБТ. Исследуемые пробы вносили в разведении 1:100 в блокато-ре и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Исследуемое молоко разводили в ФСБТ, содержащем 10% сыворотки лошадей 1:10 и инкубировали также 1 час. Планшет после инкубации отмывали от несвязавшихся антител 3-кратно ФСБТ, после чего вносили выявляющий иммунопероксидазный конъюгат в бикарбонатом буфере с Твином 1:1000. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре планшет отмывали от несвязавшегося конъюгата 5-кратно ФСБТ. Субстратную смесь вносили по 100 мкл в каждую лунку и ставили планшет в темное место на 20 минут. Реакцию оста-

иавливали 6М раствором НгвО^ Учет результатов реакции проводили визуально и на спектрофотометре фирмы БутШесЬ (Ридер МЯ-250) при 490 нм.

Приведенный вариант выполнения ИФА показывал уровень оптической плотности в лунках положительных контрольных сывороток от 0,457 о.е. до 0,938, а отрицательных - от 0,238 до 0,284 о.е.

Высокий уровень фоновых реакций с отрицательными контрольными сыворотками не позволил нам рекомендовать апробированный режим выполнения анализа для дальнейшего использования. Без дополнительного контрольного ряда лунок мы не могли достоверно интерпретировать результат исследований.

Нами проведены дополнительные исследования по снижению фоновых реакций и оптимизации ряда других параметров выполнения сэндвич-варианта ИФА.

2.2.4. ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ИНКУБАЦИИ РЕАГЕНТОВ НА СПЕЦИФИЧЕСКИЙ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ СИГНАЛЫ

Время является одной из важнейших переменных, определяющих эффективность процессов связывания реагентов между собой и с планшетом.

На первом этапе ИФА мы определили роль времени инкубации МКА с планшетом, роль времени инкубации сенсибилизированных планшет с антигеном, влияние длительности инкубации иммунопе-роксидазного конъюгата с комплексом антиген-антитело, а также варьировали некоторые другие параметры в процессе выполнения ИФА.

При неспецифической сорбции МКА к р24 антигену ВЛКРС в течение различного промежутка времени при различных значениях рН было установлено, что при рН 9,5 показатель фоновых реакций резко возрастает через 15 минут и в последующем в течение 18 часов практически не изменяется.

При рН 12,0 показатели фоновых реакций значительно снизились, но оставался слабым сигнал с положительной контрольной сывороткой.

Для повышения чувствительности анализа мы попытались варьировать время специфической сорбции антигена при его различной концентрации.

Частично очищенный р24 антиген мы использовали в 3 разведениях и инкубировали с сенсибилизированными МКА планше-

там и в течение различного промежутка времени. Положительную контрольную сыворотау использовали в разведении 1:10.

Результаты анализа показали, что высокая концентрация антигена, не способствует лучшему специфическому связыванию его с МКА на планшете. За оптимальное разведение антигена мы приняли татр 1:100. Время сорбции антигена в течение 1 часа повышало интенсивность реакции, а затем понижало.

Учитывая, что различия в интенсивности реакции при инкубации в течение 30 - 60 минут были несущественными, последующие исследования выполняли при инкубации в течение 30 минут.

Подбор оптимального разведения антигена и времени его сорбции позволили несколько повысить интенсивность проявления реакции, но различия между положительными и отрицательными контролями визуально были трудно различимыми.

Значительных различий при исследовании контрольных сывороток мы достигли после введения в сорбирующий буфер с рН 12,0 ЫаС1 до ЗМ.

Высокая концентрация ЫаС1 в сорбирующем буфере при значительном повышении чувствительности не стимулировала появление фоновых реакций. Различия интенсивности окраски при исследовании положительных и отрицательных сывороток крови были настолько велики, что легко поддавались визуальной оценке (Таблица 3).

Таблица 3

Влияние продолжительности сорбции МКА на планшет на показатель фоновых реакций при рН 12,0 и введение в сорбирующий буфер №С1 до 3 М

Время КОНТРОЛЬ Положительные в РИД сыворот-

сорбции ки крови коров

(мин.) положительный страдательный 1 2 3 4 5

3 0,470 -0,004 0,546 0,877 0,608 0,706 0,848

5 0,874 0,002 0,821 0,976 0,803 0,827 0,936

8 0,890 0,007 1,216 1,112 0,882 0,963 0,992

10 0,978 0,008 1,123 1,114 0,879 0,966 0,983

15 0,976 0,100 1,105 0,914 0,853 0,877 0,942

18 час. 0,714 0,116 0,858 0,900 0,681 0,633 0,756

В процессе отработки режимов выполнения сэндвич-варианта ИФА с реагентами ИЭВСиДВ мы установили оптимальное время инкубации детектирующего конъюгата на завершающей стадии специфического связывания компонентов реакции.

Для получения воспроизводимых результатов ИФА в различных тест-системах важное значение имеет отработка режимов инкубации исследуемого материала ( сыворотка крови, молоко и др.) с сорбированным на планшете антигеном.

В большинстве коммерческих тест-систем рекомендуемое время инкубации составляет 30 минут. Мы определяли зависимость интенсивности изменения единиц оптической плотности при завершении реакции от времени инкубации и разведения исследуемой сыворотки.

Установлено, что наиболее .интенсивное взаимодействие антител исследуемых сывороток крови с антигеном осуществляется в первые 20 минут вне зависимости от степени их разведения.

Дальнейшее увеличение времени инкубации не повышает чувствительность реакции, а напротив, ведет к значительному повышению фоновой окраски, а следовательно, понижению чувствительности.

Для понижения интенсивности неспецифических фоновых реакций, особенно при использовании не достаточно очищенных компонентов, многие исследователи рекомендуют использовать блокаторы. При использовании в ИФА растворов с низкими концентрациями реагентов, остающиеся свободными центры на поверхности носителя необходимо блокировать для уменьшения фонового сигнала. В качестве блокаторов чаще всего используют различные сыворотки и детергенты, а также очищенные белковые препараты, которые не могут повлиять на специфическую реакцию антиген-антитело.

Нами к качестве блокаторов были апробированы ФСБТ с 10% сыворотки крови лошадей, ФСБТ с 10% сыворотки крови свиней, ФСБТ без добавления сывороток, казеин, яичный альбумин, бычий альбумин, альбумин человека и блокатор из молока, изготовленный в нашей лаборатории. Лучшие результаты были получены с блокатором из молока и с сывороткой крови лошадей.

Дальнейшие исследования, в том числе материалов для выявления инфицированных ВЖРС животных мы проводили с использованием блокатора из молока.

Для изготовления блокатора брали молоко из благополучного по лейкозу хозяйства (ОПХ "Элитное") и для удаления жира центрифугировали его при 4000 об/мин в течение 20 минут. К 500

мл обезжиренного молока добавляли 0,6 г трис-аминометана и 0,1% Тритон х100, рН молока доводили до 7,4 Ш-ным раствором ЫаОН под ко1пролем рН-метра. Для консервирования в блокирующий раствор добавляли 50 мг азида натрия. Блокирующий раствор использовали для разведения антигена, исследуемых проб сыворотки крови и молока.

Оптимизация условий выполнения сэндвич-варианта ИФА для выявления инфицированных ВЛКРС животных позволяла в большинстве случаев получать вполне воспроизводимые результаты, которые совпадали более чем на 90% с показателями РИД. Возникали трудности в интерпретации результатов при исследовании сыворотки крови и молока со слабым положительным сигналом. Чаще всего это были сыворотки крови, не реагирующие в РИД. Следует признать, что отдельные сыворотки крови давали фоновые неспецифические реакции. Для дифференциации неспецифических и слабо-реагирующих положительно исследуемых проб мы проводили их контрольное исследование на планшете с контрольной лункой без антигена для каждой пробы.

Таким образом, основную массу исследуемых проб мы анализировали по общепринятой схеме, а часть - с индивидуальным контролем.

Окончательный вариант сэндвич-варианта ИФА включал сорбцию МКА к р24 антигену ВЛКРС на планшет в 0,1М КББ, содержащем ЗМ ЫаС1, рН 12,0 в рабочем разведении 1:100, по 100 мкл

в лунку.

Через 8 минут инкубации при комнатной температуре проводили отмывание планшета от несвязавшихся МКА ФСБТ и 2-кратно дистиллированной водой. В верхние 4 ряда планшета вносили р24 антиген в разведении 1:10 в блокирующем буфере, состоящем из обезжиренного молока с добавлением 0,1% Тритон хЮО и подгит-рованного №ОН до 8,6. Такой же раствор вносили в лунки для контрольных сывороток. В нижние оставшиеся ряды планшета вносили по 0,1мл блокатора без антигена. После инкубации планшет

15 минут при комнатной температуре проводили 3-кратное отмывание дистиллированной водой.

, После отмывки в каждую лунку вносили по 100 мкл исследуемого материала в разведении 1:10 в молочном блокаторе. При исследовании молока исследуемые пробы разводили 1:2 в блокаторе. Инкубировали планшет 15 минут при комнатной температуре и отмывали дистиллированной водой 3-кратно. Вносили иммуноперок-сидазный конъюгат в его рабочем разведении на 15 минут и отмыва-

ли 5-кратно дистиллированной водой. После отмывки вносили субстратную смесь по 100 мкл в лунку на 20 минут.

При данной схеме ИФА остановка реакции серной кислотой не обязательна, т.к. изменений интенсивности окраски через 20 минут после проявления практически не наблюдается.

Учет реакции может быть проведен даже через несколько дней при условии хранения планшета в темном месте.

2.2.1. ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ АПРОБАЦИЯ СЭНДВИЧ-ВАРИАНТА ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВЛКРС ЖИВОТНЫХ

При сопоставлении результатов РИД и ИФА с сыворотками крови и молока 198 коров из совхоза "Семеновод" (3 отделение), исследованными с интервалом в 7 месяцев, получены несопоставимые результаты. Так, при первом исследовании в РИД положительно реагировали только 2 пробы сыворотки крови от 2 коров, а в ИФА -110. При повторных исследованиях РИД оказалась положительной у значительно большего количества проб, чем ИФА (Таблица 4).

Следует заметить, что если динамика результатов исследования в ИФА сыворотки крови и молока определенной закономерности, то результаты РИД, по данным районной лаборатории, можно объяснить недостаточным уровнем квалификации серолога, выполнявшего исследования.

Таблица 4

Результаты сравнительного исследования сыворотки

крови и молока коров из совхоза "Семеновод", 3 отделение

Дата нссле-довани я Исследовано животных РИД положительные ИФА положительные с сывороткой крови ИФА положительные с молоком

количе ство в %,% количе ство в %,% количе ство в %, %

24.03.9 6 198 2 1 110 55,5 40 20

25.10.9 6 198 175 88,3 116 58,5 92 46,5

25.05.9 7 198 152 76,7 118 59,5 93 50

Все последующие исследования в РИД проводили в лаборатории по изучению лейкозов животных ИЭВСиДВ под контролем высококвалифицированных специалистов.

При 3-кратном исследовании с тем же интервалом сыворотки крови и молока коров первого отделения этого же совхоза получены почти полностью совпадающие результаты в РИД и ИФА. В ИФА с молоком лишь при втором исследовании были недовыявле-ны 2 положительно реагирующие корозы. Аналогичные результаты получены при исследовании сыворотки крови и молока от коров из колхоза им. "Ленина".

Исследование проб сыворотки крови и молока от коров АО "Новиково" показали, что сэндвич-вариант ИФА при исследовании сыворотки крови выявляет несколько большее число инфицированных животных, а - молока - недовыявляет часть инфицированных животных. Наиболее четкие результаты по сравнительному определению чувствительности РИД и ИФА получены при низком уровне инфицированности животных на завершающих этапах оздоровления, проводимого в хозяйствах Курганской области лабораторией по изучению лейкозов животных ИЭВСиДВ (Таблица 5).

Таблица 5

Результаты сравнительного исследования сыворотки крови и

молока коров из хозяйств Курганской области

Наименование хозяйства Исследован о животных РИД положительные ИФА положительные с сывороткой крови ИФА положительные с молоком

колич ество в %,% колич ество в %,% количе ство в %, %

АО «Разлив» 48 4 8,31 6 12,5 4 8,3

АО «Чкалова » 53 4 7,5 5 9,4 3 5,6

АО «Глинки» 60 4 6,6 6 10,0 3 5,0

АО «Кетово» 50 2 4,0 5 10,0 2 4,0

Приведенные результаты свидетельствуют о несколько более высокой чувствительности ИФА в сравнении с РИД, что, по-

видимому, наиболее важно на завершающих стадиях оздоровления. Выявление не реагирующих в РИД инфицированных ВЛКРС животных сократит кратность исследований и сроки оздоровления. ИФА с молоком не имеет преимуществ по чувствительности, однако простота получения исследуемого материала не лимитирует кратность проведения исследований, что также следует учитывать при оценке эффективности диагностических тест-систем.

ВЫВОДЫ:

1. Непрямой вариант ИФА с высокоочищенным антигеном ВЛКРС и конъюгатом из моноклональиых антител к Н-цепям JgGl крупного рогатого скота представляет высокочувствительную и специфичную тест-систему для выявления инфицированных вирусом лейкоза животных.

2. Нестабильность очищенного препарата др51 при хранении явилась основной причиной поиска других вариантов ИФА, которые при равной специфичности, не могли конкурировать с первым по чувствительности.

3. Оптимизация условий выполнения сэндвич- варианта ИФА, основу которого составляют моноклональные антитела к р24 антигену ВЛКРС и высокоспецифичный конъюгат из моноклональных антител, использование высокоэффективного блокатора из обезжиренного молока по предлагаемой нами прописи изготовления, позволила решить проблему неспецифических фоновых реакций и рекомендовать тест-систему для практического применения.

4. При сорбции частично очищенного ВЛКРС антигена для РИД на планшеты, сенсибилизированными моноклональными антителами к р24 антигену, использование высокосолевого щелочного буфера с рН 12,0 и ЗМ 1^аС1 позволило повысить интенсивность специфической реакции в 2,0 - 2,5 раза и чувствительность реакции в 4 раза.

5. Рекомендуемый нами для практического применения сэндвич- вариант ИФА позволяет более чем в 90% случаев выявлять инфицированных животных с помощью основного набора тест-системы. Для дифференциации незначительного числа слабореаги-рующих проб от неспецифических фоновых реакций проводится исследование на планшетах с контрольной лункой без антигена для каждой пробы.

6. Сэндвич-вариант ИФА при исследовании сыворотки крови на наличие антител против ВЛКРС на 10-20% превосходит по чувствительности РИД, являющуюся в настоящее время основным диагностическим тестом в нашей стране. В то же время часть проб

2%), положительно реагирующих в РИД, оказывается отрицательной в ИФА, что объясняется тем, что в сравниваемых, реакциях выявляются антитела к различным антигенам. В РИД регистрируют антитела к др51 антигену, а в предлагаемом нами варианте ИФА - к р24 антигену ВЛКРС.

7. Для оценки эпизоотической ситуации по лейкозу при исследовании методом ИФА могут быть использованы пробы молока, в том числе групповой пробы молока. При инфицированности стада от 3% и выше, результаты ИФА с групповой пробой молока регистрируются как положительные.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Временные наставления по применению тест-системы имму-ноферментной для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Утверждено ГУВ МСХ РФ 02.06.93 г.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Сатаева А.Р., Чекишев В.М. Применение сэндвич-варианта иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза животных // Тез. докл. конф. науч. молодежи "Молодые ученые в решении проблем сибирской аграрной иауки".-Новосибирск, 30 мая 1997.-С.57-58.

2. Сатаева А.Р., Чекишев В.М. Применение сэндвич-варианта ИФА для диагностики лейкоза животных // Ассоциативные инфекции сельскохозяйственных животных и новые подходы к их ликвидации и профилактике / Тез. докл. науч. конф., посвященной 50-летию Алтайской НИВС.-Барнаул, 30-31 июля 1997,- С.

3. Сатаева А.Р. К вопросу диагностики лейкоза крупного рогатого скота // "День Земли: Проблемы науки и образования" / Материалы II Межвузовской науч.-пракг. конф. -Бийск, 1996.-С.186-187.

4. Сатаева А.Р. Возможности использования тест-системы ИФА при оздоровлении хозяйств от лейкоза // "День Земли: Экология и образование" / Материалы 111 Межвузовской науч.-пракг. конф. -Бийск, 1997.-С. 111-112.

5. Сатаева А.Р. Использование иммуноферментного анализа для выявления коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота //Тез. докл. III Международной науч. конф.- г.Ховд, Монголия.-С. 181-182.