Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Реакция иммунофлуоресценции для выявления антигенов и антител пастерелла мультоцида

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ имени К.И. СКРЯБИНА

На права* рукописи

ТАРИГ ЭЛЬ МАХАДИ ЭЛЬ АВАД

РЕАКЦИЯ ЩЦУНОМУОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ШЯВЛЕНИЯ АНТИГШОВ И АНТИТЕЛ ПАСТЕРЕЛЛА НУЛЬТОЦИДА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология, иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени квндидгтп ветеринарных наук

Москва - 1992

Ррботя выполнена в Московской ордена Трудового Красного Знгмени ветеринарной академии имени К.И. Скрябине

Нручный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Бурлаков В.А.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор Сидоров М.А.

кандидат ветеринарных наук, доцент Масимов H.A.

Ведущая организация: Всероссийский ордена Ленина няучно--исследовптельский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко

Защита диссертации состоится " ^^ " /г '1993г. в /Ж часов на заседании специализированного Совете К 120.36.05 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К.И. Скрябина по адресу: 109472 Москва, ул. Академике Скрябина, 23, тел. 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан " ^ " декабря 1992г.

Ученый секретарь специализированного Совета Федосеева Т.Н.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТН

Актуальность_тему. [Микроорганизмы рода Paateurella широко распространены в природе и вызывают заболевания у многих видов яивотных, нанося большой экономический ущерб. P.multocida - является причиной пастереллеэа крупного рогатого скота, овец, свиней, буйволов, птиц и других животных. Заболевание наблюдается почти во всех странах мира.

Трудность диагностики и специфической профилактики обусловлена тем, что среди пастерелл встречается несколько типов, которые отличаются своими иммунобиологическими свойствами (типы А, В, Д, Е и неидентифицированные штаммы). Однако, широта распростране- • ния серологических типов P.aultoclda у разных видов животных при остром и хроническом течении болезни изучены недостаточно (П.Субраато, 1974; Б.Гунто и С.Кунмор, 197-9; Н.А.Чистов, 1969; Г.Ф.Бовкун, 1976 и др.).

Важнейшей задачей в борьбе с пастереллезом является разработка аффективных методов лабораторной диагностики, доступных для применения в практических лабораториях.

В настоящее время с этой целью многие авторы (А.Н.Борисенко-ва, И.А.Болотников, 1966; Г.Ф.Бовкун, 1976, 1977; В.В.Кольчак, 1979; М.А.Сидоров, Э.М.Агаева, 1982; М.Я.Ярцев и др., 1989; (J.Carter, 1955, 1972; I.Brogden, 1979) считают целесообразным применение серологических методов в сочетании с бактериологи .ес-кими исследованиями патматериала. Для серологической диагностики и типирования штаммов возбудителя пастереллеэа были предложены реакции агглютинации, непрямой гемагглютинации и преципитации. Из указанных методов на практике лишь в отдельных случаях применяются реакции диффузионной преципитации, а также непрямой гемагглютинации. Эти основные серологические методы имеют ряд недостатков. Реакция преципитации в силу своей низкой чувствительности уже мало приемлема для серотипизации, а реакция непрямой гемагглютинации, хотя считается основным серологическим тестом, довольно капризна относительно сенсибилизация эритроцитов,и коцпонентов для ее постановки биопромышленность не выпускает. То же самое следует отметить и относительно реакции латексагглютинации.

- г -

Исходя из этого необходимо изучить возможность более простых, доступных и чувствительных методов диагностики заболевания и типирования возбудителя. Кроме того необходимо изыскать серологические методы контроля вакцины. Таким требованиям в большей мере отвечает реакция иммунофлуоресценции (В1Ф). ГШ, как метод диагностики, широко применяется для диагностики многих бактериальных и вирусных заболеваний. Многие авторы находят, что РИФ вполне заслуживает внедрения в практику как надежный и самый быстрый метод индикации бактерий в патологическом материале, по эффективности, как минимум, не уступающий вццелению чистых культур на питательных средах. Но он еще не отработан при пастерел-лезе, хотя имеются отдельные сообщения о положительных результатах при выявлении антигенов из культур.

Ц§2Ь_и_эадачи_исследований.

Целью исследований являлась отработка методики постановки прямого и непрямого вариантов реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и определить ее перспективы для выявления антител и антигенов при пастерелла мультоцида.

В задачи исследований входило:

- приготовить цельномикробные и капсульные антигены, получить соответствующие антисыворотки и меченые коньюгаты из них на серотипы А, В и Д пастерелл;

- отработать оптимальные режимы постановки прямого и непрямого вариантов РИФ;

- изучить чувствительность и специфичность РМФ при выявлении антител и антигенов пастерелла мультоцида.

На^чная_новизн§. Отработаны методики постановки прямого и непрямого вариантов реакции иммунофлуоресценции (РИФ) при пасте-реллезе с использованием полученных калсульных и цельномикробных антигенов и соответствующих кроличьих антисывороток.

В сравнительном аспекте реакции иммунофлуоресценции и диффу зионной преципитации в агаре (РДП) изучено распределение антиге^ Нов пастерелл типов А, В и Д в органах экспериментально заражен-1 ных мышей и кроликов. Изучена динамика антителообразования (РИФ_ и РДП) при вакцинации кроликов стандартной гидроокисьалюминиевоЙ формолвакциной и экспериментальной политиповой пастереллезными ва динами. Выделены из патматериалов 15 культур пастерелл, изучг

и культурально-биохимические свойства и на основе комплекса соименных методик проведена их серотипизация. Получены данные о осокой чувствительности и специфичности отработанных методов постановки РИФ.

Практическая_значиыость. На основании проведенных исследова-[ий предложены методы постановки прямого и непрямого вариантов №6, простые, доступные для практической работы с целью выявления нтигенов и антител типов А, В и Д пастерелла цультоцида. В том :исле юказана возможность контроля вакцинных препаратов с исполь-ованием И1Ф и РДП.

Выделены из патматериалов от больных животных 15 культур и ипированы II этих изолятов.

Апообация_работы_и_гщбликация. Материалы диссертации ^оложе-:ы и одобрены на отчетной научной конференции Московской ветери-арной академии в 1990 и 1991 гг.

По теме диссертации сданы в печать для публикации в трудах [осковской ветеринарной академии им.К.И.Скрябина две статьи.

Диссертационная работа изло-:ена на НО страницах машинописного текста и состоит из введения, бзора литературы, собственных исследований, обсуждения и выводов, писок использованной литературы включает 154 публикации по тема-ике исследований, из них 55 русских и 99 зарубежных. Материалы ллюстрированы 19 таблицами и 7 фотографиями.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работу проводили по плановой исследовательской тематике на афедн вирусологии, микробиологии и биотехнологии ордена Трудо-ого Красного Знамени Московской ветеринарной академии имени .И.Скрябина в 1989-1992 гг.

В опытах для получения сывороток, выделения чистой культуры, пределения патогенности выделенных штаммов пастерелл и изучения ипамики выявления антиген л в тканях и накопления антител в сы-оротках, были использованы 50 взрослых кроликов породы пиншилла ассой 3-3,5 кг и 4С0 взрослых белых мышей.

Для проведения культуральных работ использовались следующие питательные среды: МПБ, МПА, перевар Хоттингера, гидролизат лак-тальбумина, кровяной агар и обогащенные среды Хоттингера.

В опытах были использованы штаммы пастерелл типов А, В и Д.

Для выделения и идентификации возбудителей пастереллеза применяли общепринятые методы.

Для выявления капсулы применяли метод Михина - фиксированный мазок или препарат-отпечаток из органов окрашивали метиленовой синькой с подогреванием до отхождения napoD, выдерживали 7 мин, краски смывали, промывали водой, просушивали и микроскопировали в иммерсионной системе.

Изучение ферментативных свойств культуры проводили обычно с применением укороченного "пестрого" ряда, состоящего из некоторых наиболее используемых Сахаров и спиртов.

Патогенность выделенных микроорганизмов испытывали на белых мышах.

В основу серотипизации штаммов пастерелл взяли предложенную Картером (1955) классификацию по капсульному антигену. Для получения типоспецифических сывороток использовали методику, предложенную М.А.Сидоровым (1979).

Селекционированные культуры каждого штамма пастерелл хранили в мясо-пептонном бульоне в запаянных ампулах при температуре -Ю-14°С до 3-х месяцев.

Серогрупповую принадлежность эталонных штаммов пастерелл, используемых в качестве антигенов, определяли по перекрестной РДП не реже двух раз в год с гомологичными антисыворотками. Для подтверждения результатов, полученных с помощью серологических методов, были использованы несерологические тесты: акрифлавино-вый, трилафлавиновый тесты и гиалуронидазная проба (carter, Subranto, 1973; Carter, Jtondle, 1975; Э.А.Шегидевич, В.Б.Федотов, И.В.Чернутпкина, 1985).

Реакцию диффузионной преципитации в агаровом геле ставили по Ouchterlony (1948) в чашках Петри. Для приготовления геля использовали 1% агар фирмы Difco в мединал-вероналовом буфере, консервированном азидом натрия.

Статистическую обработку результатов исследований проводил»' согли^но методике Ю.К.Паюна (1989).

2.2. Результаты исследования

2.2.1. Получение антигенов, антисывороток и постановки Н1Ф

Для приготовления антигенов итаммы А, В и Д серотипов пасте->елл предварительно били проверены по морфологическим, культу-шьно-биохимическим свойствам и патогенности.

Для получения растворимого антигена, используемого в реак-;ии д'-Цфузионной преципитации, пастереллы осаждались центрифуги-юванием при 6000 об.' шн в течение 20-30 мин, затем дважды отш-али стерильным физиологическим раствором. Полученный осадок ре-успендировали в физиологическом растворе из расчета 1/10 от ис-одного объема и к суспензии добавляли 0,3% формалина.

Для получения цельномикробного антигена для иммунизации кро-иков с целью приготовления антисывороток пастереллы осаждали с омощью полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с одновременной инактиваций их формалином (по методике Н.А.Смирновой).

Капсульный антиген получали по методике М.А.Сидорова и .М.Агаевой (1979).

Преципитируюцая активность получаемых нами антигенов колеба-ась от 1:2 до 1:32.

Изготовление качественных иммунных сывороток является одним з' основных условий успешного применения реакции иммунофлуорес-енции.

Прежде чем проводить иммунизацию кроликов мы проверяли их аворотки в РДП на отсутствие нормальных антител к пастерелла |Гльтоцида серотипов А, В и Д и выбраковывали пастереллоносителей.

Иммунизацию вели по следующей схеме: антиген вводили по ,5 мл подкожно, далее дважды с интервалом 10 дней комплексно по ,5 мл подкожно и по 2,С мл внутримышечно.

В ходе опыта через каждые 7-10 дней после очередной имитации брали кровь из ушных век кроликов для проверки преципити-тцей активности сывороток в РДП методом двойной диффузии (двух-фной) по Оухтерлони. Сын ротки отделяли бесцентрифужным мето-)м путем отстоя при температуре +4°С.

Сыворотки,полученные на цельномикробные и кипсульние антиге-

проверяли на активность в РДП.

- б -

Иммунные глобулиновые фракции сывороток крови получали высаливанием сульфатом аммония при 50% насыщении (Ю.Н.Зубжицкий, 1964). Переосаждение и центрифугирование проводили трижды, в конечном итоге осадок растворяли в небольшом количестве физиологического раствора, переносили в целлофановый мешочек и, для освобождения от солей аммония, диализировали против 0,15 М раствора хлорида натрия на фосфатном буфере рН-7,4.

Метку белков изотиоцианатом На (флуоресцеина) проводили по методике Соопв и Kaplan в модификации Hegge и Mareholl.

Коныогаты очищали от свободного флуорохрома гельфильтраци-ей через сефадекс G-25 и методом исчерпывающего диализа (Л.А.Зиль-бер, 1968).

Приготовленные люминесцирующие сыворотки консервировали мер-тиолатом из расчета 1:10000 и хранили в рефрижераторе при 4°С.

Для контрастирования неспецифического свечения мы использовали бычий альбумин меченый родамином. Сыворотки и антигены, полученные нами контролировали на активность в РДП и наиболее активные использовали для отработки прямого и непрямого вариантов F®. Были отработаны следующие параметры постановки реакции: оптимальное время инкубации препаратов в термостате - 25-30 мин при первоначальной фиксации их ацетоном в течение 15 мин (тканевые препараты) или метанолом - 5-10 мин; после инкубации препараты тщательно промывали дважды в 0,15 хлориде натрия pH - 7,27,4 по 10 мин.

Реакцию считали:

- положительной при оценке ее на ++++ и +++ креста;

- сомнительной - ++ и + крест. В этом случае проводили повторное исследование, при получении повторного сомнительного результате пробу считали отрицательной;

- отрицательной - свечение не наблюдали.

С целью определения активности галцунных сывороток, полученных на цельнобактериальные и капсульные антигены серотипов А, В и Д, мы проводили их титрование в непрямом варианте РИФ и РДП.

В сыворотках большинство кроликов преципитиругащие антитела выявляли в значительных титрах с гомологичными антигенами (1:81:32), с гетерологичными антигенами их активность была ниже на 1-2 ра эедения.

Результаты титрования сывороток в ШФ были, выше, чем в РДП, с гомологичными антигенами титры антител в сыворотках на цельно-микробные антигены были 1:512.

Титры антисывороток на капсульные антигены с гомологичными антигенами также были высокими: 1:16-1:32 в РДП и 1:512-1024 в РИФ.

Титры антител с гетерологичными антигенами в обеих реакциях были значительно меньше. Так™ образом, с полученными антигенами и гипериммунными сыворотками кроликов (и коныогатами) нам удалось отработать реакцию иммунофлуоресценции, которая при относительной простоте постановки, возможности ускоренного получения результатов позволяла надеяться на перспективность применения ее для изучения распределения антигенов в тканях и контроля выработанных антител у иммунизированных животных.

2.2.2. Выявление антйгенов и антител

Для выявления антигенов в культурах мы использовали в качестве испытуемых цельномикробные антигены музейных штаммов № 8683, № 682 и № Т-80 серотипов А, В и Д соответственно. В прямом варианте РИФ культуры исследовали без разведения.

В непрямом варианте РИФ использовали иммунные сыворотки, полученные наш и антивидовую люминесцирующуг сыворотку против глобулинов кролика.

Антигены раститровывали с коэффициентом 2 от 1:2 до 1:4096; иммунную сыворотку и коньюгаты использовали в рабочем разведении 1:16 и 1:32 соответственно.

В качестве контроля использовали отрицательный антиген и нормальную кроличью сыворотку.

Цельномикробные антигены на серотипы А, В и Д реагировали с гомологичными сыворотками в титрах 1:1024, 1:2048 и 1:512 соответственно.

Перекрестные реакции выявлялись в титрах намного ниже по сравнению с таковыми на гомологичные комплексы антиген-антитело -контрольные антигены давали отрицательную реакцию.

С целью изучения динамики накопления и распределения возбудителя в паренхиматозных органах мышей заражали культурами и убивали через 6, 12, 18 и 24 ч после заражения, брали кусочки орга-

нов (сердце, легкие, печень, селезенка, почки) и готовили мазки-отпечатки. Кроме того, из всех органов (в том числе и убитых в соответствующие сроки интактных (контрольных) мышей стерильно готовили концентрированные экстракты и нарезали мелкие куски для использования их в качестве испытуемых антигенов в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле.

Динамика накопления и распределение возбудителя в- органах и тк,.нях мышей были прямо пропорциональны срокам после заражения; так через 6 ч преципитирующий антиген не выявлен, а через 18 и 24 ч после заражения его выявляли в экстрактах и кусочках сердца и легких (тип А). Антиген серотипа В регистрировали уже через 12 ч после заражения в печени, селезенке и почках, типа Д через 18 ч обнаруживали в легких и сердце, но линии преципитации были слабыйи.

В реакции диффузионной преципитации встречали перекрестные реакции с гетерологичными сыворотками (титры сывороток 1:2-1:4).

Им-мунофлуоресцентное свечение было видно в препаратах, приготовленных из легких мышей, убитых через 6 ч после заражения (тип А), а через 12, 18 и 24 ч антигены обнаруживали во всех исследуемых органах.

Сроки выявления и распределения антигенов серотипов В и Д были довольно сходными с данными, полученными для типа А. Антиген типа В в печени и селезенке выявляли раньше, чем в легких и сердце. Накопление Р.ти:Нос1<1а серотипа Д регистрировали больше всего в легких и печени через 18 и 24 ч после заражения; причем свечение клеток микроорганизмов было слабее, чем у других серотипов.

В целом в Ш1> антигены Г.ти1Лоо1да в органах и тканях мышей удавалось выявлять раньше и в больших титрах, чем в РДП, следовательно, реакция иммунофлуоресценции по чувствительности превышала РДП. В прямом варианте Р11Ф вообще не встречали перекрестных реакций.

С целью изучения накопления и распределения антигенов в паренхиматозных органах у кроликов после экспериментального заражения готовили мазки-отпечатки из органов павших кроликов.

Для контрастирования неспецифического свечения мы использовали бычий альбумин ц^чеиый. родамином.

Реакция ставили многократно с целью достичь наилучшего свечения в препаратах и избежать ошибок. От каждого павшего кролика было приготовлено по 100 мазков-отпечатков. Реакцию ставили как с гомологичными сыворотками, так и с гетерологичными в разведении 1:5 и в разведении, в 4 раза превышающем предельный титр с гомологичным антигеном (рабочий титр).

Наиболее интенсивная окрашенность отмечалась в мазках-отпечатках из селезенки, печени, легких и почек (тип А и В), легких, селезенки и почек.

В препаратах с гетерологичными антисыворотками также выявляли антигены различных типов, включая тип Д, лишь интенсивность свечения чаще всего была менее интенсивной.

Все контрольные препараты показали четкую отрицательную реакцию. Свечение*препаратов, обработанных иммунной сывороткой, полученной на капсульный антиген, отличалось от свечения препаратов, обработанных антисывороткой на цельномикробный антиген тем, что в первом случае свечение наблюдалось во внутреннем слое капсулы, а с сыворотками на цельномикробные антигены, свечение было по всей клеточной стенке бактериальной клетки.

В последующем проводились испытания непрямого варианта И1Ф для выявления антител в•гипериммунных сыворотках и сывороток кроликов, привитых вакцинами против пастереллеза.

Гипериммунные сыворотки, полученные на цельномикробные антигены серотипов А, В и Д, реагировали с гомологичными антигенами в титрах 1:1280, 1:2560 и 1:1280 соответственно, в то же время отмечали и перекрестные реакции, но в меньших разведениях (1:401:80) с гетерологичными антигена?™. Сыворотки, полученные на кап-сульные антигены тех же штаммов пастерелл, реагировали с гомологичными антигенами в наиболее высоких титрах - 1:5120, 1:2560, 1:2560; перекрестные реакции между гетерологичными системами в незначительных титрах также имели место. Все контроли были отрицательными.

Чтобы составить общее представление о показаниях реакции иммунофлуоресценции в процессе иммунологической перестройки организма животных, мы изучали динамику выявления антител в РИФ и РДП у кроликов, привитых экспериментальной политиповой ГОА-вакци-

ной и стандартной форыогчакциной против пастереллеза.

Установлено, что кролики в ответ на введение вакцин ответили выраженной иммунологической перестройкой организма. Титр пре-ципитируюцих антител, а также показания реакции иммунофлуоресцен-ции достигали своих максимальных величин на 21-28-35 сутки. Однако, динамика нарастания титров антител в РДП и РИФ имели свои особенности.

К периоду максимальных серологических сдвигов, определяемых в РИФ и РДП,.титры антител в иммунофлуоресценции, как правило, бы ли выше, но довольно близки к показаниям уровней антител в РДП. На заключительном этапе исследований (49-56 сутки) обнаруживали резкое снижение уровня антител, в первую очередь преципитируицих и разница в показаниях этих реакций становилась значительной.

Было показано, что в носовых смывах от кроликов через 1428 дней после прививки стандартной формолвакциной в РИФ выявляли антитела регулярно с антигеном серотипа В, а с антигенами сероти-пов А и Д положительные результаты регистрировали лишь с носовыми смывами от отдельных кроликов.

Все препараты-смывы от кроликов, привитых политиповой ГОА-вак-циной, давали положительный результат с антигенами серотипов А, В и Д в сроки от 14 до 28 дней после прививки..

На заключительном этапе исследований (1,5-2 мес) со смывами от кроликов, привитых обоими типами вакцин, были получены отрицательные результаты (отсутствие антител).

Таким образом была продемонстрирована перспективность реакции иммунофлуоресценции сравнительно с РДП для выявления всех типов антигенов и антител при пастереллезе. Необходимо было убедиться в специфичности'такой реакции.

2.2.3. Специфичность реакции иммунофлуоресценции при пастереллезе

При проверке специфичности РИФ изучали возможность выявления перекрестных связей со стандартными сыворотками и антигенами различных возбудителей заболеваний сельскохозяйственных животных: бруцеллеза, респираторного микоплазмоза, сальмонеллеза, сибирской язвы, колибактериоза, стрептококкоза, стафилококкоза и др.

При использовании противопастереллезных сывороток на калсуль-ше антигены не выявлено каких-либо перекрестных реакций- с анти-'енами возбудителей других бактериальных инфекций.

При использовании цельномикробных антигенов пастерелла муль-•оцида не было получено каких-либо перекрестных реакций с антиге-1ами возбудителей других инфекций, но в сборной нативной сыворот-;е крупного рогатого скота удавалось выявить противопастереллез-ие антитела в низких титрах (1:5-1:10). Вероятно, это связано с 'ем, что отдельные животные-доноры были привиты или переболели 1анее пастереллезом.

В целом результаты проведенных опытов позволяли сделать за-лючение о специфичности И0 и пригодности ее для выявления анти-енов и антител пастерелла мультоцида и, возможно для серотипиро-ания выделяемых.культур пастерелл.

2.2.4. Выделение культур пастерелл из патматериалов и изучение их свойств, сёротипиза^ия

Для вццеления пастерелл были использованы 25 проб из орга-ов павших животных (8 от кроликов, б от свиней, I от норки и

0 от телят). Всего было выделено 15 изолятов, которые по морфо-огии, культуральным, биохимическим свойствам и патогенности были арактеризованы как Р.тиЗЛос1<1а. Почти все выделенные штаммы не ерментировали арабинозу, ксилозу, мальтозу и лактозу,, ферментиро-эли галактозу, глюкозу, сахарозу, сорбит, маннозу.

Все культуры не изменяли цвет лакмусового молока, не разжи-али желатину и почти больше половины штаммов образовывали индол сероводород.

Выделенные культуры при постановке биопробы были патогенны-

1 для белых мышей. При введении их белым мышам внутрибршинно в эзе 0,5 мл последние погибали в течение 18-24 ч.

Из 15 штаммов при типизации их в 3 были отнесены к серо-ту А, 2 - к серотипу В и 6 - к серотипу Д. Серотиповую принад-гжность 4 штаммов установить не удалось.

С целью сравнения и подтверждения результатов типизации, поденных # В1$, мы исследовали выделенные культуры в реакции диф-■зионноЯ преципитации по Оухтерлони, акрифлавиновым, трипафлави-1вым и стафилококковым тестам.

С помощью акрифлави-'овой пробы из 15 штаммов 4 отнесены к серотипу Д, а в трипафлавиновой пробе к этому типу отнесены б штаммов. При типизации с помощью стафилококкового теста к серотипу А отнесены 2 штамма, принадлежность, к типу А этих штаммов подтверждена и результатами РИФ и РДП. К серотипу А отнесены 3 штамма из 15 по данным РИФ и РДП.

Результаты идентификации культур по отношению к типу Д в ГОФ и РД". были также аналогичны - б культур из 15.

Для типирования штаммов типа В несерологические тесты не рекомендованы. К этому типу в РИФ были отнесены два штамма из 15 вццеленных, в РДП определить культуры серотипа В не удалось.

Как показали наши исследования, для выявления антигенов, контроля распределения возбудителя в тканях и уровня антител у привитых лабораторных животных, а также для типизации вццеляемых культур, отработанные нами варианты реакции иммунофдуоресценции оказались достаточно чувствительными, специфичными, а также лишенными ряда недостатков, присущих двухфазным серологическим реакциям. Реакция имцунофлуоресценции безусловно заслуживает большого внимания и дальнейшего изучения как метод серодиагностики пастерел-леза сельскохозяйственных животных.

3. В Ы В О Д Ы

1. Получены активные концентрированные антигены и антисыворотки на цельномикробные антигены с активностью в РДП 1:8—1:16

и на капсульные антигены с активностью 1:16-1:32, а также меченые люминесцируюцие противопастереллезные коныогаты (1:512-2048).

2. Отработаны методики постановки прямого и непрямого вариантов реакции имцунофлуоресценции (ГИФ) с использованием капсульных и цельномикробных антигенов и соответствующих антисывороток или меченых коныогатов серотипов А, В и Д Р.тииос1аа.

Режимы постановки реакции предусматривали: оптимальное время инкубации препаратов в термостате 25-60 мин, при первоначальной фиксации их ацетоном 15 мин (тканевые препараты) или метанолом 5-10 мин (культуральные препараты); после инкубации препараты тщательно промываются дважды в 0,15 М хлориде натрия рН - 7,2-7,4 по 10 мин.

3. Реакция иммунофлуоресценции позволяла выявлять антигены непосредственно в мазках-отпечатках органов убитых или павших экспериментально зараженных мышей и кроликов (прямой вариант): максимальные титры антител в гипериммунных сыворотках или сыворотках вакцинированных кроликов достигали титров 1:1280-1:5120 (непрямой вариант).

4. Изучена динамика антителообразования (РИФ и РДП) при вакцинации кроликов стандартной гидроокисьалшиниевой формолвакциной и экспериментальной политиповой пастереллеэной вакцинами.

5. Из патматериалов павших телят, свиней, кроликов и норки выделено 15 штаммов, из которых по данным РИФ, подтвержденным принятыми тестами, 3 отнесены к серотипу А, 2 - к серотипу В и 6 - к серотипу Д и 4 штамма не типированн.

6. Реакция иммунофлуоресценции более чувствительна, чем РДП, специфична, проще по технике постановки, и результаты опытов свидетельствуют о ее перспективности как метода для серодиагностики заболевания и идентификации возбудителя при пастереллезе.

4. РЕК01ЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИИ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Целесообразно внедрение отработанных методов постановки прямого и непрямого вариантов FH$ в практику работы ветеринарных лабораторий с целью выявления антител у вакцинированных или переболевших животных и для ускоренной диагностики заболевания путем непосредственного выявления в тканях антигенов различных патогенных типов пастерелла мультоцида.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тариг Эль Махади Эль Авад. Уровень бактерионосительства крупного рогатого скота при вспышке геморрагической септицемии в Судане.

Сб.науч.трудов МВА "Опыт подготовки специалистов для сель-зкого хозяйства зарубежных стран". 1992, стр.63.

2. Бурлаков В.А., Тариг Эль Махади Эль Авад. Реакция имму--юфлуоресценции для выявления антигенов пастерелла мультоцида

в оргяняг белыг мышей.Сборник няучныг трудов(межведомственный), 1992, стр.63.