Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Разработка тест-систем ускоренной индикации и идентификации сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного экологического контроля на основе генных зондов

РГ'Б ОД На права* рукоти-.и

п 6 ЯНВ 1388

ДОЛЯ ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ САЛЬМОНЕЛЛ В ОБЪЕКТАХ ВЕТЕРИИАРЖ)■ САНИ ГАРНОЮ И ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ НА ОСНОИН ГЕННЫХ ЗОНДОВ

16 00 06 - Ветеринарная санитарии и жолшш 16.00.08 - Гигиена животных, продуктов животноводства и ветсринкрно санитарная жеиержш

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москпа- 1947

Набша выполнена во Всероссийском иаучно-исследовгисльском инсттугс ветеринарной санитарии, гигиены и экологии

Научные руководители доктор ветеринарных паук

В А ДОЛГОВ кандидат биологических наук В.В.СВЕТЛИЧКИН

Официальные оппоненты: доктор биологических нау^

Ю А. СГМИЛЕТОВ (НИИ вирусологии им. Д.Н Ивановского РАМИ) кандидат бис логических наук А.Б. КОИОНЕНКО (ВНИИ ветеринарной .санитарии.

гигиены и экологии)

Ведущая организация Московский Государственный уннвсрситсг

прикладной биотехнология

Защита состокгся "Я! " 1993г. в Л& ""час. на заседании

диссертационного совета Д.020.30.01 - при Всероссийском научись, исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийски о научно исследовательского тмсгитута ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022. Москва. Звенигородское шоссе. 5)

Автореферат ( плотин "

Учений ссм*-'<арь ■и<ссср> .1ИИОННО! п Сонета, Кашшлят биологических на) к

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

Актуальность темы. Сальмонелле! - инфекционное заболевание поражающее многие виды животных, птиц и человека.

Возбудители этого заболевания существуют в природе во »со органических и неорганических субстанциях, чаще они локализуют» а печени, кишечнике, лимфатических узлах и других органах животных и человека, а также в окружающей среде.

Практически все объекты ветеринарно-санитарного и эколошчесмло контроля могут быть поражены возбудителями сапьмонеллеза.

Возрастающая индустрия производства и потребления пищении продукции, кормов, а также экологические аспекты охраны окружаюшс-и среды требуют быстрого и эффективного конгроля зараженное ш возбудителями сапьмонеллеза.

Существующие методы обнаружения и идентификации сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля, основанные на использовании дифференциально-питательных сред, длительны и трудоемки. Кроме того, значительно меняющиеся фенотипические признаки семейства Enterobacteriaceae делают культурапьно-биохимические тесты не всегда корректными при идентификации сальмонелл.

Относительно быстрые серологические тесты могут давай ложноположительные результаты из-за фона сопутствующей микрофлоры и биохимических компонентов, входящих в сосгав объекгов исследования Дли получения достоверных результатов указанными меюдами гребке* предварительное обогащение микробных клеток, что приводит к снижению экспрессности.

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот и полимеразнал 'цепная реакция являются высокоспецифичными и чувствительными методами в обнаружении и идентификации микроорганизмов (Антонов АС 1980; Шагинян И.А и др. 1992, Sklar J 1985, Brenner L). 1986; Thomas Elizabeth J. et all 1991; Kruger G. et all 1992; Kupperveld F J.M. et all 1992)

Метод гибридизации нуклеиновых кислот, основанный на специфическом связывании известной »талонной нуклеошдний последовательности (генного зонда) с комплементарными нуклеошдиымм последовательностями ДНК или РНК исследуемых MtiKpoopi анизмон, применяется для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии. (Дерюшева СЕ. 1993; Асеев II В и др 1994, Орешкова И др 1995; Горбовнцкая М. 1996; Донской Д И 1996, I alkovv S el all 1982; Bryau R.N. et all 1984, Wachsmuth K. 1986, Cuiiale M S et alt 1990,)

В настоящее время известны высокоснеиифичние иуклеоииные иоследова^льносш, используемые в качестве генных зондов, позволяющие

iie только определять видовую принадлежность микроорганизмов в смеси культур без предварительного обогащения, но дифференцировать гокснгенные и нетоксигенные штаммы. (Hill W. et all 1983; Hill W. et all 1983; MoseleyS.L. 1985; Wolf-WatrH. 1987).

Несмотря на определенные достижения применения генных зондов в областях геносистематикн, медицины, ветеринарии, методы генного зондирования недостаточно используются в практике ветеринарно-санитарного и экологического контроля.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка ускоренных методов обнаружения и идентификации сальмонелл в продуктах, кормах и других объектах е етерин^рно-cai гитарного и экологического контроля с использованием меченых ДНК зондов.

Были поставлены следующие задачи:

1. Модифицировать способы предварительной обработки проб и выделения ДНК сальмонелл применительно к различным объектам ветеринарно-санитарного п экологического контроля и провести их сравнительный анализ. ,

2. Разработать методики ускоренной индикации сальмонелл в мясе, мясопродуктах, кормах, воде и воздухе на основе биотгапшированных п меченых тритием ДНК зондов.

3 Разработать методики ускоренной идентификации сальмонелл на основе тотальных ДНК илпг, высокоспецифичных цуклеотидных последовательностей. " ,

4. Создать тест-наборы диагностикумов и показать возможность приборной реализации методов для анализа в стационарных и нестационарных условиях.

Научная новизна. Разработаны методики ускоренной индикации сальмонелл на основе меченых тритием и биотиннлированных генных зондов для конкретных объектов ветеринарно-сатггарного и экологическою контроля ( мясо, мясопродукты, корма, вода и воздух).

Показана возможность высокоспецифичной индикации сальмонелл с использованием амплификациогаюго генного зонда в смеси микроорганизмов без предварительного обогащения.

Разработана схема ускоренной ' индикации сальмонелл на основе тотальных хромосомных ДНК бактерий.

Созданы тест-наборы на основе биотинилированного и тритиевого ДНК зондов, пригодные для проведения анализов в различных объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля.

Показана возможность приборной реализации методов индикации и идентификации сальмонелл генными зондами в полевых и стаичонлрннх условиях.

í

Практически ценность и реализация результатов На осноианм! проведенных исследований разработаны "Методические рекомендации >н, определению Sal. typhiniurium в продуктах н кормах с использованием ДИК зондов" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РЛСХН, 1997 г )

Созданы тест-наборы ддя коммерческого тиражирования, показа! <i возможность приборной реализации методов в полевых и стационарньч условиях.

Апробация работы Материалы диссертационной рабогы доложены «м Международной конференции "Актуальные проблемы ветеринарии; медицины и ветерннарно-санитарного контроля сельскохозяйственных продуктов" (Москва 1997г.), на межлабораторном совещании наупшч сотрудников ВНИИ вегеринарной санитарии, гигиены и экологии (1997г )

Публикации. По теме диссертации опубликовано три научных статьи

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, об юра литературы, собственных исследований, обсуждения получешшч результатов, выводов, списка литературы и приложения

Работа изложена на и О страницах машинописною текст, иллюстрирована И га блицам н и 10 рисунками. Список ншеригури включает ¿00 источников отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. методы и место проведения исследовании Экспериментальные исследования проводились в периоде 1994 но 1997 год л лаборатории ветерннарно-санитарной экспертизы мяса, рыбы и друтш» пищевых продуктов ВНИИВСГЭ, а также в МГ У и Институте микробиолш нн РАН. *

В опытах использовали различные штаммы микроорганизма S.typhimurium, S.dublin, E.Coli, Bac.subtilis, Bac.caeu» Ps. ssrugeñosa:

Материалом для разработки тест-систем служили модельные системы-кшпаминировашше микроорганизмами объекты ветеринарно-санигарного и экологического контроля, а также различные опытные пробы, поступавшие на исследование в лабораторию ветеринарнр-санитарной экспертизы института. ,

, При разработке методов использовали ДНК зонды на основе тотальных ДНК соответствующих.микроорганизмов,' меченых тритием по методу ¡¡ик трансляций (Маннатнс Т. и др. 1984 г.), или биотипом в процессе фотобиотанилирования (Синапп^лнна Э Н/ 1992 г.), а также ДНК зонды, полученные в процессе полимеразноа цепной реакции (ПЦ1>) с

использованием меченых тритием (3Н) или биотаном (ооксинуклеозидтрифосфатов ("Amercham" Англия) на - основе '.мплификационного диагностического набора для выделения возбудителя сальмонеллеза (Salmonella typhimurium) (НИИ экспериментальной микробиологии им. Н.ф. Гамалеи).

Микробиологический ко!ггроль исследуемых проб проводили с использованием общепринятых методов анализа согласно действующей нормативной документации.

В работе применяли укладку для полевой индикации микроорганизмов на основе генных зондов, а также переносной портативный жидкостной ецинтилляционный бета-счетчик производства ГосНИИБП.

Специфичность и чувствительность разработанных тест-систем определяли в сравнении с классическими микробиологическими методами

Результаты исследований обрабатывали статистически с определением средней арифметической, среднего квадратичного отклонения, критерия достоверности и коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Разработка методик ускоренной индикации сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля на основе 3Н ДНК

зоцдов.

.>.■'.

При разработке ускоренных методик индикации сальмонелл в конкретных объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля важным является получение доступных для гибридизации ДНК определяемых микроорганизмов. Структура объектов и их биохимические особенности могут накладывать определенные отпечатки на проведение анализа.

Нами исследованно несколько вариантов схем предварительной обработки проб и получения ДНК сальмонелл.

Пробы твердой консистенции контаминировали различными титрами Sal. typhimurium в физрастворе, дезинтегрировали в механическом дезинтеграторе или в фарфоровой ступке. От дебриса освобождались центрифугированием при 500xg или фильтрацией. Дальнейшие операции проводили по различным вариантам, представленным на рис 1.

В первом варианте использовали одну из классических схем выделения ДНК из бактериальных клеток.

Клетки осаждали центрифугированием, лнзировалн в лизируюшем буфере, содержащем лизоцим и сахарозу. Депротеинизацню ДНК осуществляли обработкой раствором лодецилсульфлп! нтгрия п хлороформом и после разделения фаз осаждал» ДНК иэопроиачо.чом. wrev

ресуспендировали, проводили обработку РНКазой, проназой , хлороформ им >, переосаждали спиртом.

Второй вариант предварительной обработки, проб проводили и значительным сокращением операций (без переосаждения ДНК спиргом. обработкой РНКазой и проназой ).

В третьем варианте была поставлена задача исключения операции выделения ДНК, связанных с обработкой хлороформом.

С этой целью осадок клеток последовательно обрабатывали лизнрущнч буфером, проводили депротеинизацию проназой и осаждение ДНК изопропанолом. •

ДНК, полученную по первому, второму и третьему вариантам, денатурировали и иммобилизовали на фильтры.

В четвертом варианте мы исключили все операции, связанные как l депротеинизацией хлороформом, так и с центрифугированием при выделении ДНК.

С этой целью после разрушения клеток в лизоцим-сахарозном буфере >< депротеинизацин проназой проводили тепловую денатурацию полуочищенной ДНК в течение 20 минут, добавляли стандартно-солевой раствор (1ССР: 0.15М NaCl, 0,015 ацетат Na, рН-7,0) до конечной концентрации бхССР и иммобилизовали ДНК на мембранные шпроцеллюлозные фильтры.

В основе схемы выделения ДНК по пятому варианту лежал способ. выявления рекомбинантных плазмйдных ДНК путем гибридизации с последующей радиоавтографией (GrUnstein М., Hogness D.S. 1978 г) Ресуспендированный осадок клеток наносили на нитроцеллюлозные фнлыры 0,45мкм и лизис клеток, депротеинизацНю, денатурацию и иммобилизацию ДНК осуществляли путем последовательного переноса фильтров на стопки фильтровальной бумаги, смоченной соответствующими растворами'

1. раствор лизоцима ( 2 мг/мл в 50 • мМ трис-HCl, содержащем сахарозы, рН=8,0,10 мин); '

2. 0,25% раствор додецилсульфата натрия, (5 мин);

3. раствор проназы ( 500 мкг/мл) в бхССР, (20 мйн);

4. 0,5 М NaOH, (10 мин);

5. 1Мтрис-НС1 буферный раствор, рН=7,8, (10 мин);

6. бхССР, (5 мин).

Иммобилизованную . ДНК всех вариантов фиксировали на нитроцеллюлозных фильтрах при 80UC в течение 60 мин.

Фильтры с иммобилизованными ДНК всех вариантов использовали в гибридизации с 3Н ДНК Sal. typhiinurium.

Установлено, что J1I ДНК зонд Sal typhimurium гибридиювалсн со всеми ДНК, выделенными из контамннированных Sal. typhimurium проб Пракшчески отсутствовала гибридизация с ДНК Вас. subtílis.

12 3 4 5

Дезинтеграция проб и элюция микроорганизмов физраствором (20 мин)

__1_1____I I. ____1_

Очистка от дебриса (центрифугирование 5 мин или фильтрация)

! Г I ' 1 I '

Концетрирование клеток микроорганизмов (цапрнфугирование 15 мин)

____I 1 Г I

Лизис клеток в растворе (лизоцим-сахарозный буфер, 10 мин)_____]

Заморажива-

ние-оттаивание

(20 мин)

т __

Депротеннизання додецил-

сульфатом 37°С.. (20мии)

I 1

Депротеииизация нроназой (30 мин)

1

7Хснрогеиннзацня хлороформом (20 мин)___

"Разделение фаз (центрифу-п гировлнис 5 мин)

Осаждение ДНК изопропанолом

ПЕ £ с V £ п_е.н ¿QUiCL5.IL11

ЖЮ

Концетрирование клеток на нитро-целлюлозные фильтры 0,45мкм

Последовательная инкубация фильтров на смоченной фильтровальной бумаге соответствующими растворами:

1. Расттюр лизо-цима 2 ■ мг/мл в 50мМ три-НС1.., 25% сахарозы рН Х,<>,

1. 0.2о додепил-ольф.та (5 мни);

| Ресуспендирование ДНК |

[тепловая денатурация ДНК (15 мин)

3 Проката 500 мкг/мл, 6хССР(20мии)

4 0,5м №(>11 (10 ми»)

5. 1М фис-НП рН- 7,8, И) мич 6 бхССР (5 мин

Иммобилизация ДНК на нитроцелдюлозных фильтрах

0,45 мкм (6 х ССР)

-1

Фиксация ДНК на нитроцелдюлозных филырах (80°С, 60 мни)

Рис. 1. Вариант предварительной обработки проб, выделения и иммобилизации ДИК сальмонелл из объектов ветеринарио-сашп арного контроля твердой консистенции

Анализ воды на содержание сальмонелл проводили по тем же вариантам с незначительными модификациями для некоторых из них. Исключали чсшнтеграцию проб во всех вариантах.

В четвертом варианте лизис, депротеинизацию и тепловую денатурацию проводили непосредственно в пробе с последующей иммобилизацией на нитроцеллюпозные фильтры.

Степень гибридизации ДНК проб воды была несколько выше, чем степень гибридизации ДНК проб, выделенных из объектов твердой консистенции. Это обусловлено меньшими потерями клеток и ДНК в процессе их выделения.

Степень гибридизации ДНК в гомологичных системах для всех вариантов предварительной обработай проб была одного порядка, что давало основания использовать эти варианты для разработки ускоренных методов идентификации сальмонелл.

Для разработки схем индикации сальмонелл в воздушной среде создавали модельную систему в стационарной биоаэрозольной камере и осуществляли отбор проб с помощью пробоотборников в жидкую среду или непосредственно на мембранные нитроцеллюлозные фильтры.

Анализ проб, концентрированны* в жидкую среду, проводили по всем тигги вариантам. Пробы, концентрированные непосредственно на нитроцеллюлозные фильтры, анализировали по пятому варианту.

Данные о степени гибридизации ДНК проб воздуха во всех вариантах коррелировали с аналогичными данными проб твердой консистенции и воды.

Таким образом, несмотря на незначительные модификации .аля различных объектов исследований, варианты 2-5 обладали определенной универсальностью и явились основой для разработки методов ускоренной индикации сальмонелл с 3Н ДНК зондом.

Схемы методов ускоренной индикации сальмонелл в различных объектах ветеринарно-сашгтарного н экологического контроля с использованием 'Н ДНК зондов представлены на рис. 2

Реакцию гибридизации ДНК проводили в течение 3-х часов в присутствии декстрансульфата.

Общее время анализа составляло 6-8 часов

На основании данных зависимости степени гибридизации 'Н ДНК юнда от концентрации микроорганизмов в пробах чувствительность индикации составляла I (Г-10" клеток.

Объекты твердой консистенции

Объекты жилкой консистенции

Дезинтеграция проб и элюция микроорганизмов физраствором (20 мин)

Очистка от дебриса или

крупных примесей (5 мин)

Вшлух

и:....

Конценгрирова ние микроорт ч-

ни)мпр гцн'Гнч" борннкл ми

"в жидкую срелу (10 мин)

на нитро-"

нелтюкпш ¡с фильтрм (10 мин)

Концентрирование клеток центрифугированием (15мнн)

[лизис клеток в растворе^ (10 мин)]

!

Концентрирование клеток на нитроцеллю-лозкые фильтры (10 мин)

2 вариант

3 вариант 4 вариант

Депротеишпания пронятой (30 мин)

Депротёинизання доаецилсульфнтом и

хлороформом

(40 мни)

1_ 5 вариант

.....Т~

Лизис клеток, депротеини-зания, денатурация, иммобилизация ЛПК на филмры (60 мыт)

(продолжение на стр.10)

Осшвддаие ДНК изопропамолом (10 мин)

итг:

1 енловая денатурация ДНК (20 ими)

Иммобилизация ДНК на ннгроцеллюлозные фнлыри (5 мин)

Фиксация ДНК на фильтрах (60 мин)

1

1 Предгибридизация н гибридизация ДНК (3,5 часа) в присутствии декстрансульфата

1

Отмывка неспецифической сорбции

(30 мин)

Оценка результатов на жидкостном сцтпшишшошюы счетчике (5ыии)

Рис. 2 Ускоренна» индикация сальмонелл в объект вегсринарно-сатш гарного и экологического контроля с использованием 5Н ДНК зондов

_РафАбРЖЧ Мпмик_!П!лнка1у1,( сальмрие/шцл^к).'?«

бШДШ^ШЩЖ^Пт

Для разработки ускоренных методов инликашш сальмонелл с биотинилированными ДНК зоилами использовали аналогичные схемы предварительно« обработки проб, описанные в предыдущем разделе.

Иммобилизацию ДНК или клеток на нитропеллюлозные фильфн осуществляли в виде точек, пе допуска* взаимного перекрывания.

Фильтры инкубировали с биотннилированными ДИК зондами в присутствия декстрансульфата в течение 3-х часов, отмывали от песпецнфического связывают* и проподрлн реакцию с конъюгатом (стрептавидин-фосфатаза), а затем с субстратом в присутствии крастггеля

Результаты гибридизации оценивали визуально или с помощью фотометра я проходящем свете после осветления фильтров.

Как показали исследования, варианты предварительной обработки проб без стадии очистки ДНК хлороформом или осаждения ДНК спиртом были пелригодны для индикация сальмонелл вследствие неспецифической реакции в гетеролоптых системах (меченая и иммобилизованная ДНК из разных микроорганизмов).

Для всех объектов вегеринарно-санитарного и экологического контроля взртапты 2 я 3 предварительной обработки проб лапали положительные результаты н явились основой для методов ускоренной индикации сальмонелл с биогинилированнымн ДНК зондами.

Схемы методов ускоренной индикации сальмонелл с биогинилированнымн ДНК зондамн предстежлены на рис 3.

Время анализа -8 часов.

Чувствительность этих методов составляла 102-10! клеток в пробе.

I йы.пи шерлом

ки|К >11.1 с (ИЩИ

с:

проб и элюцня микроорганизмов фн »раем вором (20 мин)

()чийкг*оГ_дабрйсГ или

крупных примесей 0 пин)

Объекты жидкой

консистенции

Во адух

Концентрирова ние микроорганизмов пробоотборниками в жидкую среду (10 мин)

Иммобилизация ЛИК на ншроцеллтопозные фильтры (10 мин)

Фиксация ДНК на фильтрах (60 мин)

Предтбриднзацня и гибридизация ДНК ' (3.5 часа) в присутствии декстрансульфзта

| Отмывка от («специфической сорбции (30 мин)

Блокирование «специфического (50 мин) связывания коньюгата

Г

Реакция с конькматом (20 мин) |

Обработка проявляющим раствором и оценка результатов (1 час)

Рис. 3. Ускоренная индикация сальмонелл в объектах ветерниарно сантпарпон) и экологического контроля с использованием биотиншшронанных Д1ПС зондов.

Рац)з(кг1цй трст-систем ускоренной индикации сальмонелл и их рри&орная реализация

На основании разрабошшых методик ускоренной индикации ц идентификации сальмонелл нами были созданы соответствующие тест-наборы с биопшилироваинымм и тритиевыми ДНК зондами.

В процессе разработки учитывались оптимальные условия концентрации отделоных реагешов для длительного хранения в стационарных и нестационарных условиях.

Комплекты рассчитаны на проведение 80-100 анализов, включая ксшрольные образцы

Комплект с бмотншишровашшми ДНК зондами хранится при температуре 2-10иС и относительной влажности воздуха 80%.не более 6 месяцев, а при температуре выше 25°С не более 2-х суток.

Гест-набор с трит иевыми ДНК зондами хранится при 25°С не более 14 дней, а при 2- 10°С и относительной влажности воздуха 80% в течение 1 года

'>|и наборы мо1>т быть использованы для высокоспецифичной индикации и идентификации сальмонелл в стационарных и полевых условиях.

Дня проведения анализа в полевых условиях нами была апробирована в адаптирована укладка полевой индикации микроорганизмов (разработана в ГосНИИБП)

Укладка состоит из грех блоков, соединенных в одну систему. Общий вес укладки 12 кг.

В состав первого блока входят автоматический дозатор, система для иммобилизации ДНК на фильтры, комплект фильтров для исследуемой ДНК, комплект стандартных фильтров с эталонной ДНК, пробирки с ДНК зондами, наконечники для автоматических дозаторов, флаконы дня соответствующих 1>ешешов, чашки Петри, плата для проведения анализа, пинцет.

Второй блок представляет собой термостат, работающий от автономного источника питания 12В с температурными режимами реакции гибридизации, денатурации и фиксации ДНК на фильтры.

Третий блок включает в себя комплект запасных частей с емкостями для хранения реагентов , слива отработанных жидкостей , а также два пассивных холодильника для хранения реагентов и зондов.

Данная укладка позволяет проводить анализ и учет результатов 9 гртиевыми и бжтшнлироваиными ДНК зондами при включении 9 комплект микроцентрифуги с автономным источником питания 12В.

Для учета результатов с *Н ДНК зондами использовался портативный жидкостной сцннтнлляцнонный бета-счетчик, работающий от автономного источника питания 12В.

Как показали исследования, укладкэ дает возможность проводить ускоренную индикацию и идентификацию сальмонелл по разработанным нами методикам.

ВЫВОДЫ

*

1. Модифицированы способы .предварительной обработки проб, выделения и иммобилизации ДНК сальмонелл и определены их оптимальные варианты для различных объектов ветеринарио-санитариого и экологического контроля (мясо, мясопродукты, корма, сода, воздух).

2. Предложенные модификации отличаются достаточной универсальностью и позволяют существенно упростить и ускорить ход анализа. На их основе разработаны методы индикации я идентификации сальмонелл с использованием 3Н и биотннилированных ДНК зондов.

3. Чувствительность методов индикации сальмонелл с применением 3Н и бноткннлироваиных ДНК зондов составляла соответственно 105-106 и ÍOMO5 клеток в пробе, длительность анализа - 6-8 часов.

4: Метод вндоспецнфичной нндихацнн Sal. typhimurium с использованием амплнфикацнонного ДНК зонда дает возможность проводить анализ в смеси микроорганизмов без предварительного обогащения.

5 Разработаны методы ускоренной идентификации сальмонелл па основе меченых тритием тотальных ДНК бактерий, позволяющие дифференцировать сальмонеллы внутри рода и семейства Enterobacteriaceae

6. Сравшгтельная оценка разработанных нами методов ускоренной индикации и идентификации сальмонелл, основанных на использовании ДНК зондов, с общепринятыми методами микробиологического янаппза показала высокую степень корреляции результатов исследований.

7. Созданы экспериментальные тест-наборы для ускоренной индикации и идентификации сальмонелл в объектах ветеринарно-сашттгрного и экологического контроля на основе меченых 3Н и биотннилированных ДНК зондов, пригодные для практического использования.

8 Показана возможность приборной реализации методов н тест-наборов для нняитаиши и идентификации сальмонелл как в лабораторных, так и полевьпс условиях с использованием переносной портативной укладки.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Материалы диссертации вошли в "Методические рекомендации по опредпенич) Sal. typhimurium в продуктах и кормах с использованием ДНК зонпог." (утержаены Отделением ветеринарной медицины РЛСХН 15.0: у, i ' ,

Il,

Для m iu4ii KibaiiKN в ветеринарной практике могут быть рекомендованы 1><ира6о1анные памп тес i наборы ли экспрессной индикации и H;irn 1»ф>1»«пни мим itit in в продуй ах кормах и обьеюах окружающей

( иисок опубликованных рабог по теме диссертации

I До.иов В А ( ьеишчкин ВВ, Доля l' A, Квянсовскан А К) I Hwiipia. С1))дш1ня и применения îcci-cucieM на основе lënnoro 10,,лИ|н1н.и1ич и практике beiepmiapito-caiiuiapmiB лссиершщ <7 Сб н трудов ННИИИП 1, IW6, i 102, cip 112-115

* 1'вс1|1нчкш1 11 H JKuiioB В А , Хафншв Д Ф , Доля НА, Квят конская А И ) Ускоренна* индикации живых микроор1 анизыов на основе меченых iipe^ineciuciitiiiKuu < шшла нуклеиновых кислоi и ДНК гибридизации // С б и >(>> /н»ь ВНИНВС.'ГЗ. 1997 1. 103, стр 19-21

I Долл h А Индикация сальмонелл в продуктах и кормах с использованием бжшшилироьаиних ДНК зиилов // Ма<ериалы 2-ой Mi *Л) пародии!» кчнференчии «Аыуальиые проблемы воеринариой ые .шпицы и ваерннарно-саншарною контроля сельсюхошКчвешшх tipuKVKioB» Москва 1997

ВННИНСI У 19У/1 Москва, Звеншлюдское шоссе, 5, ты тираж 80 экз