Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологические свойства различных штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК ИНСТИТУТ Э'КСГСЁР НМЕНТЛЛЬНОИ И'КЛИНИЧЕСКОЙ .. В ЕТ Е Р И Н А Р И О Й- МЕД И И, И НЬI ^

На праУ^х рукописи

(Иоханнес Берхане Во.тьдеаб

иГЛ'ХПО,i-h.il.;: I!:зслО"I .(! ■<)

иммунобиологические свойства

различных Штаммов вируса

инфекционной бурсальной ? БОЛЕЗНИ

■: I /

16:00.03— ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и, иммунология.

А ВТ О, РЕ Ф ЕР А Тч

на срнскание.унечрй степени кандидата ' ветёринарных наук

Харьков — 1995 г.

Диссертация является рукаписьк»

Работа выполнена в лаборатории изучения -болезней птиц

статута экспериментальной и клинической ветеринарной медищ п ы У А АН.

Научный руководитель доктор ветеринарных наук,

профессор,

член-жорреапондент УААН, В- В. Герман

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

К- Е. Ко'наржевсшй

доктор< 'ветеринарных наук, профессор А. Я. Пустовар

Ведущая организация Сумской .сельскохозяйственный

институт, Минсельхозпрод Украины, г. Сумы

Защита диссертации состоится 995 года н

заседании специализированного Совета Д 02.32.01. в Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины по ад ресу: 310023, г. Харьков, ул. Пушкинская, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт экспериментальной и .клинической ветеринарной медицины,

г. Харьков — 23, ул. Пушкинская, 83.

Автореферат разослан « 4 Р. » года.,

Ученый секретарь

специализированного ученого Совета, | ^ Н. П. Чечепквн

доктор ветеринарных шаук

ёг

общая харантерстика работы Актуальность и степень изученности темы диссертации. Б настоящее время одной из важнейших проблем ветеринарной науки и практики является своевременная диагностика и профилактика инфекционной бурсадьной болезни (болезни Гамборо), которая регистрируется практически во всех странах мира с развитым птицеводством.

йя$?кциояяая бурсадъная Болезнь (ИББ) - это высококонтагиоэ-ное вирусное заболевание цыплят до 20-ти недельного возраста, возбудитель которого поражает лнмфоидную ткань фэбрициевой бурсы и другие иммукокомпетентные органы.

При возникновении этого заболевания экономический ущерб складывается-из потерь, связанных с гибелью птицы (от 5 до 80 %), недополучения продукции в результате отставания птицы в росте и развитии, увеличения брака тушек иэ-за наличия обширных геморра-гий в мышечной ткани груди и_ бедер.

ИББ на Украине впервые зарегистрирована в 1991 году в южных областях. В птицехозкйствах, где проявилась эта болезнь, общесанитарные и карантинные мероприятия, а также иммунизация птицы живой вирус-вакциной не давали должного эффекта (Герман Б. В. и со-авт. 1992). По сообщениям, полученным из различных стран с развитым- птицеводством, вспышки ИББ отмечены у вакцинированных цыплят с защитным уровнем антител ( Mohidin, 1994, Rosales, 198S, Saif, 1988). По наблюдениям (Ismail et al. 1990, Brown, 1986, Kibenge et al. 1988) вакцинация птицы коммерческими вакцинами, приготовленными из эталоного штамма вируса первого серотипа, в ряде стад ке обеспечивала надежную защиту. .

Накопленный многими исследователями опыт, касающийся диагностики и мер борьбы с ИББ свидетельствует о том, что вопросы изучения биологических свойств вакцинных и полевых штаммов вируса с. целью создания высокоиммунных . средств активной профилактики

требуют «^отлагательного решения.

Все это явилось основанием для изучения биологических свойств различных штаммов вируса ИББ с целью изготовления вакцин против данного заболевания.

Цель исследований. Изучить некоторые биологические свойства штаммов вируса ИББ, циркулирующих в птицехозяйствах Украины, а также входяшях в состав коммерческих вирус-вакцин зарубежного производства. Разработать способ изготовления иммуногенной инак-тивированной вакцины против ИББ.

Задачи исследований

- провести эпизоотологическое обследование неблагополучных птицехозяйств по болезни Гамборо с целью выделения, типирования и адаптирования штаммов вируса ИББ;

- дать сравнительную оценку антигенного родства вакцинных и полевых штаммов вируса б. Гамборо;

- изучить иммунодепрессивные свойства вируса ИББ .(штамм Еер-93) при вакцинации птицы против ньюкаслской болезни;

-' отработать режимы инактивации вируса ИББ и его контроля;

- приготовить и испытать в лабораторных условиях образцы инактивированных вакцин (гидроокисьалюминиевая и ' эмульсин) проив болезни Гамборо;

- изготовить биофабричные опытно-промышленные серии инакти-вированной вакцины и провести их комиссионное испытание в условиях птицефабрики.

Теоретическая и лраятшескаи пряность исследований и юс научная новизна. ' Изучены особености репродукции выделенного нами -вируса ИББ (штамм Бер-93) на развивавшихся эмбрионах кур- Установлена различная степень антигенного родства между вакцинными

штаммами, входящими в состав ряда коммерческих вакцин и полевыми, циркулирующими в птицехозяйствах Украины. Разработана технология изготовления инактивированной вакцины протиз ИЕБ из штамма Еер-93.

Разработана инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни (б. Гамборо).

Уровень реализации и внедрения результатов исследований. Результаты проведенных исследований использованы при разработке и составлении нормативно-технический документации на инактивиро-Еанную вакцину ИЗ и КЕМ против болезни Гамборо птиц:

Временное наставление по применению инактивирозанной вакцины иг штамма Еер-33 протиз инфекционной бурсальной Солеакк птиц (б. Гамборо) от 19 июля 1994 г. '

Технические условия (ТУУ 46.15 ГО 005-94). Утверждены ГУБ МСХ Украины 19 июля 1994 г.

Апробация и публикация результатов исследований. Основные материалы диссертации доложены и одобрены на заседаниях методических комиссий и отчетных сессиях Ученого Совета КЗКЕМ УААН (1993-1995 гг); научно-практической конференции "Сохранность молодняка с-х животных - залог развития животноводства Украины" (г. Белая Церковь, 28-29 сентября .1994 г.).

По материалам диссертации опубликовано 4 научных р«с'оты.

Структура и обвей диссертации. Диссертация изложена ка 130 . листах машинописного текста и включает: общую характеристику работы, обзор литературы, 'экспериментальные исследования, обсуаде- • нив результатов, выводы, предложи;® для практики, литературу, приложения. Работа иллюстрирована таблицами~и рисунками." Обзор

литературы включает 226 источников; из них 20 отечественных и 206 зарубежных.,

Личный шлад диссертанта в разработку научных тюлпяений, вы-восишх на защиту.

На основании анализа результатов экспериментов и сопоставления их с данными литературы диссертантом сформулированы такие положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения основных апологических свойств полевых и вакцинных штаммов вируса ИБЕ.

2. .Определение степени антигенного родства вакцинных и полевых штаммов ИББ.

3. Разработка кнактивированной вакцины против ИББ.

4. Результаты сравнительного испытания образцов инактивиро-ваных вакцин против ИББ;

йетодологяя и методы исследовании предмета н объекта.

Работа выполнена в лаборатории изучения болезней птиц ИЗ КВМ, Херсонской биофабрике, колхозе "Дружба Народов" (республика Крым) и Орельской птицефабрике (Днепропетровская область) в течение 1993-1994 гг.

Зпизоотологические данные были получены при обследовании пти-цехозяйетв разяичноигнаправления - яичных к мясных. При этом изучали особенности.течения заболевания, а также факторы, влияющие на тяжесть и продолжительность инфекционного процесса. Одновременно отбирали патологический материал для комлексных лабораторных исследований: вирусологических, бактериологических, серологических, гистологических и др. Анализировали состояние выполнения общих ветеринарно-санитарных и специальных мероприятий по охране хозяйств от заноса инфекции и защите птицы от болезней различной

этиологии, учитывали условия кормления и содержания.

При выполнении работы использовали следующие штаммы вирусов НЕЕ: 1) эпизоотические штаммы: Еер-93, УМ-93, ВГ-93. Кик-93, М-93; 2) вакцинные штаммы: SAL, Д-78, СТ и штаммы, входящие в состав вакцин Birmovae и Bjovitñ.

Специфические сыворотки получали путем гмпериммуниеации петухов, кроликов и морских сеянок.

При выполнении экспериментальных исследований нами использо-

!

вано 40 петухов, 2000 цыплят (от 1 до 180-ти дневного возраста), 5.тысяч куриных эмбрионов, 15 кроликов и 10 морских СЕИНОК.

Адаптацию вируса ИББ проводили к следующим клеточным культурам: , первичнотрипсиниэировакным культурам фибробластов развивающихся эмбрионов кур (РЗК), перевиваемым культурам клеток эмбриональной почки овцы (ЭПО) и Vero (почки зеленой африканской мартышки) .

Вирус выделяли от больных цыплят с характерными клиническими признаками. Еируссодержащий материал инокулировали на хорионал-лантоисную оболочку (ХАО) 9-дневным развивающимся эмбрионам кур (РЗК).' Затем эмбрионы инкубировали в термостате в течение 4-5 суток. Отобранный вируссодержащий материал после проверки на отсутствие гемагглютинации с 1 £-ой взвесью эритроцитов петуха, бактериальной и грибковой контаминации хранили при температуре -20' С.

Идентификацию вирусных изолятов проводили в реакции нейтрализации (РН) со специфическими сыворотками по методике Moses et al. (1959).

Хитрацию вируса проводили на куриных эмбрионах, культуре клеток куриных фибробластов и перевиваемой культуре клеток ЗПО по

. методике Reed и Mench- (1338). Степень антигенного родства определяли в реакции непрямой гемагглетикации (РКГА) по формуле Archet-ti и Horsfall (1950): R = г, + г2 где, R - показатель антигенного родства между двумя вирусами, когда два антигена и сыворотки используются в перекрестной реакции; rt - средний локазатель, который рассчитывают путем деления гетерогенного титра, полученного с вирусом 2 на гомологичный титр с вирусом 1; г2 - средний пс-каза тель, который устанавливают путем деления гетерогенного титра, полученного с вирусом 1 на гомологичный т'чтр с вирусом 2.

Если показатель R равен 1, то это свидетельствует о полной родстве двух штаммов. Степень антигенного родства определяется интервале-значений К, 'лизким к единице.

Степень поражения бурсы у зараженных и вакцинированных пгии определяли по результатам гистологических исследований, проведенных "под руководством академика Г. А. Красникова в лаборатории пэго-морфологш ИЭКБМ, и показателю бурсального индекса (ЕЙ), для определения ЕЯ использовали методику Benjamin et al. (Г379).

С целью изучения динамики репродукции вируса КЕБ штамм Бор-33 на РЭК, 9-дневные эмбрионы заражали вирусосодержащим материалом на ХАО в дозе 0,Е мл. Затем эмбрионы инкубировали в течение 5 дней. Через каждые сутки по 4 эмбриона вскрывали и от<5 ирали экстраэмбриональную жидкость (ЗЖЖ), ткани эмбриона и ХАО, после чего готовили образцы материала для определения концентрами ви- ' руса.

При изучении иммунодепрессивкого действия вируса ИББ из 100 цыплят было сформировано 5 опытных групп по 20 голое в каждой. Для иммунизации цыплят были использованы вирусвакцины ИЗКВМ про-' тив ИББ серии 1 и 2, наготовленные Херсонской биофабрикой, а так-

же вакцина против ньюкаслской болезни (КБ) - из штамма Ла-Сота, изготовленная Сумской биофабрикой. Заражение птицемолодняка проводилось полевым вирусом ИББ штамм Еер-93 и вирусом ньюкаслской болезни - штамм Дн-90.

Б суточном воэрасте цыплят первой и второй групп иммунизиро-Еали против ИББ, соответственно вакцинами 2 и 1. Третью группу заражали полевым вирусом ИББ Бер-93, а четвертую и пятую оставили в качестве контроля. Б 10-дневном возрасте у 4 цыплят каждой группы определяли бурсальный индекс.

Б 14-дневном возрасте у цыплят всех групп исследовали уровень антигемагглютининов против вируса НБ в РЗГА, затем вакцинировали птицу 1-4 групп вакциной против ньюкаслекой болезни. На 7 и 14 дни после вакцинации отбирали кровь для исследований в кро-векапельной реакции агглютинации на наличие вируса КБ. а также определяли актигемзгглютинины в гЗГА к вирусу НБ, после чего птицу всех групп заражали полевым вирусом ньюкаслекой болезни.

В предварительных опытах по изготовлении инактивированной вакцины против ИББ из штамма Еер-93 проводились опыты по установлению оптимальной концентрации гидроксида алюминия (А1 (0Н)5 ). С •этой целью на фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 готовили следующие концентрации гидроксида алюминия: 0,2; 0,5; 0,8 и 1 %. Затем в четыре лробирки с соответствующими концентрациями сорбента добавляли' равное количество вируса ИББ (шт. Бер-93), титр которого составлял 10 ЗИД/50 мл. Контролем служила смесь вируса (шт. Бер-93,1 и буфера. 1

После этого содержимое всех 5 проб подвергали шуттелированию в течение 60 мин, а затем оставляли на 24 часа при температуре +4' °С. По истечении этого времени материал каждой пробирки цент-

рифугйровали при 3000 об/мин в течение 30 минут.

Из полученной надосадочной жидкости каждой пробы готовили десятикратные разведения и проводили титрацию на 9-дневных БЭК по общепринятой методике. Титр вируса определяли по методу Рида и Менча.

При отработке режима - инактивации вируса ИБЕ (штамм Бер-93) • был использован формалин 40 % концентрации, из которого для проведения экспериментов были приготовлены следующие разведения: 0,1; 0,3; 0,5; 1,2 и 3 I К каждому из указанных разведений формалина добавляли равный объем вируса ИББ шт. Бер-93, титр Которого „

го равнялся 10 5ИД 50/мл. Контролем служила вируссодержзщая суспензия без формалина. Полноту инактивации определяли на девятидневных БоК.

Для определения иммуногенности вируса ИББ, обработанного формалином в концентрации 0. 5; 1. 0; 2.0 и 3. 0 % , его вводили цыплятам 120-дневного возраста внутримышечно в дозе 1 мл. Через 2, 3 и 4 недели проводили иследования сывороток крови в РКГА для выявления специфических антител.

Б опыте-по сравнительному изучению иммуногенных свойств различных вакцин против ИББ использовали:

1. Инактивированную эмульсионную вакцину ИЭКВМ ив шт. Бер-93

6,5

с титром 10 ЗИД 60/мл.

2. Инагсгивированную гидроокисьалюминиевую вакцину ИЭКВМ из шт. Бер93.

3. Реактивированную вакцину Та1оуас-301 (10 ЭЙД 50/мл) ТАД РЬагшгеиНзЬез кегк'ОМБН, 0-2190 СихЬауеп 1, ГКЗ.

Исследования проводились на 120-дневных цыплятах кросса Еэ-ларусь-9, которых в 35 дневном возрасте вакцинировали вирусвакци-

ной против ИББ и? штамма Д-7*3.

По принципу внэлогге были сформированы 3 опытны? и 3 контрольная группы, в кэадой ло 10 голое птпп. Б возрасти 1 дней цыплятам 1, 2, и 3 групп э дог* 1 мл внутримышечно вводил! соот-ветс7В;-юоз» взкцинк. В акопериментов проводили учет слепую-1щг:: покагагелей, херактеригуших эффективность векцинопрсфгдякхн-ки Праги» /ЕЕ: кжиичесшг состоят» пищы, учет кедшчгстрэ павшее, анализ причин гибели пли выбраковки по данным комплексны:-: лселейсаакий (вскрытия, вирусологических, бакт-римотическ.М и ДР-; ■

Динамику ЕЫраРоткп спещтфических антител в сыворотке крови И желтках яиц изучали в ТЕГА с арптроцитарным антигенсы ;"гКЕМ различные сроки после вакцинации - череа 1,2,3,4,6,6,10 и 12 недель.

результаты собственных исследования

•Всего было изолировано 5 полевых штамма вируса ИББ.- При их культивировании на развивающихся эмбрионах кур выраженные типичные изменения, характерные для вируса ИББ, постоянно наблюдали только у штамма Вер-93.

При изучении динамики репродукции вируса ИББ штамма Еер-ЭЗ на РЭК в зависимости от времени инкубации наивысший титр вируса выявили в тканях эмбриона (7,4 lg ЗИД 50/мл) на 4-е сутки. Максимальное накопление возбудителя ИББ, независимо от исходного материала для заражения, отмечалось после 4S чэсое инкубации и достигало максимума через 95 часов в тканях эмбриона (7.4 lg ЗИД 50''мл) к околоплодной жидкости (4.5 lg 3Щ 50/мл), а в ХАО - через 72 часа (6.97 lg ЗИД 50/мл).

При изучении адаптационных способностей пяти вакцинных и пяти полевых штаммов вируса ИББ к первичной культуре клеток фиброб-ластов куриных эмбрионов (КФ), перевиваемым клеткам почки зеленой африканской мартышки (Vero) и эмбриональной почки овцы (ЭПО) установили следующие особенности. Все вакцинные штаммы адаптировались к КФ после 1-4 "слепых" пассажей, а из полевых - только два. Цитопатичёское действие (ЦГЩ) наступало на 3-7 сутки и характеризовалось появлением участков дегенерации, состоящих из большого числа округлых и слегка увеличенных клеток, которые становились зернистыми и вследствие чего происходило нарушение целостности монослоя. К культуре Vero бег предварительного пассирования на KI адаптировались два вакцинных штамма (Д-78 и Sal), а вакцинный штамм СТ и. полевой Вг-93 были адаптированы только после предварительного пассака на КФ.

- п -

Б отличие от упомянутых штаммов вируса ИБЕ, к культуре ЭПО вакцинные штаммы Sal и СТ и полевей штамм Ум-93 адаптировались лишь после предварительного пассирования на КФ. ЦЩ на культуре '/его и ЭПО характеризовалось округлением клеток и грануляцией цитоплазмы, особенно вокруг ядра. Пораженные клетки через 5-10 дней отслаивались от стекла, вызывая при этом разрушение целостности монослоя.

Изучение степени антигенного родства меощу раалтншя штатами вируса ИББ

Определение степени антигенного родства-штаммов вируса ИББ проводили по результатам прямой' и перекрестной FKFA с соответствующими специфическими сыворотками и эритроцнтарными антигенами, с использованием формулы Archetti и Korsefall. Результаты этих исследований представлены в табл.1.

Как видно из данных таблицы, показатель антигенного родства R етандартого вакцинного штамма Sal и полевого штамма Ум-33 равен 1. Это позволяет сделать заключение об их близком антигенном-родстве.

Очень близкое родство на уровне 71 Z зарегистрировано между штаммами Sal и СТ, Sal и Еер-93, Д-78 и Вг-93, Бер-93 и Ум-93. Среди изученных штаммов наиболее отдаленное антигенное родство выявлено у штамма М-'ЗЗ, особенно в отношении штаммов Д-78 и Вг-93.

Таблица 1.

Результаты перекрестной реакции непрямой гетгглютинацин

I \ !

'¡Сыворотки '

янтигены

М-93 Ум-93 Вер-93

Бг-93

Д-7&

М-93 ! 1

Ум-93 | 0,25 1

"Вер-93 1 0,18 0,71 * А

Ег-93 1 0,13 0,50 0, 25 1

Д-78 I 0,13 0,25 , 0,25 0, 71 1

5АЬ | 0,25 ' 1 0,71 0,25 0,40 - 1

СТ I 0,50 0,50 0,50 0, 25 0,25 0,71

Изучение ишунодепрессивных свойств вируса ИББ

I

При изучении иымунодепрессивныл свойств вируса ИБЕ установлено, что у цыплят, зараженных штаммом Вер-93 в суточном возрасте значение бурсального индекса , составило 0,22 при норме 0,7-1,0. Это свидетельствует о большой степени атрофии бурсы.

По данным кровекапельной реакции агглютинации по выявлению виремии, через 7 дней после вакцинации претив ньвкаслскоЛ болезни установили, что в первой группе у 6 из 16, во второй у 8 из 16, в третьей у "13 из 16. а б четвертой у 4 из 15 птиц реакция была положительной. Через две недели наличие виремии было установлено лишь у цыплят третьей группы (в 50 % случаев). В то же время у контрольных цьшлят виремия отсутствовала.

'В этот же срок уровень антигемагглютининов к вирусу НБ в среднем по группам составил 3,6; 3,9; 2,1; 6,0 1с&'2 и 0 (соответственно). При определении наличия преципитиков в РДП к вирусу КЕБ все пробы сывороток вакцинированных и зарэ:*екных - цыплят были полонительными, а пробы иг 4 и 5 групп - отрицательными.

После заражения птиц всех групп вирулентным штаммом вируса НБ гибель птицы составила: в первой группе 12.5 во второй -6.25 %, в третьей - 81.25 в. четвертой - 6.25 % и в пятой -75,0 %. Это свидетельствует о том, что. заражение цыплят вирулентным штаммом вируса ИВЕ в суточном возрасте снижает эффективность вакцинации против ньвкаслкой болезни.

По фор оптимальной концентрации адьюнанта

С целью изготовления инактивирсвЕшкой вакцины против болезни Гамборо нами предварительно проводилось изучение елиянид различных концентраций гидроксида алюминия ка титр вируса ИЕБ итамм Бе'р-33. Б результате этого было установлено,. что наибольшая адсорбция вируса наблюдается" при использовании гидроксида алюминия в концентрации 0,8 %. Результаты этих исследовании представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Влияние рааличных концентраций гидооисида алюминия на титр вируса Т1ВЗ {штат Вер-93)

I 1 Концентрация А1 (0Н)3 (%) 1 1 " "0,2 0,5 0,8 ] ■1,0 [

1 I е,5 42 2А 1,15 1 2,3

1 Титр вируса ЗлД 50/мл 1 10 10 1 10 10 10 | !

Отработка реклиа инактивации вируса ИББ

При определении режима инактивации, вируса ИББ (шт.Еер-93) различными концентрациями формалина его полная инактивация,' как показалг результаты биологического контроля, наблюдается при использовании 0,5-3,0 % раствора формалина (таблица 3).

Таблица 3.

Испытание действия концентраций формалина на. вирус ИББ (шт. Бер-93).

| Концентрация | Количество пассажей 1 на эмбрионах кур !

| формалина (X) | I | 1 2 3 | I

1 1 1 0,1 | 3/6 . 6/6 1 6/6 1

1 0,3 1 1/6 'Б/5 5/5 |

1 0,5 ! 0/6 0/5 0/5 |

1 1.0 0/6 О/б 0/6 |

1 2,0 | 0/6 0/6 0/6 |

1 .3,0 ! 0/6 0/6 0/6 1

< 1 I 1 ' 1 0/6 0/6 5/5 ! <

Примечание: числитель - количество эмбрионов с поражениями, характерными для вируса ИББ; знаменатель - количество зараженных эмбрионов.

Определение антигенной активности вируса в зависимости от концентрации формалина

При сравнительном изучении ишунсгенности инактивированного' вируса различными концентрациями формалина установили, что при использовании формалина з концентрации 0,5 % наблюдается максимальный уровень специфических антител к вирусу ШБ (1:128) в РИГА. При увеличении количества формалина в препарате титр вируса уменьшался (табл.4).

Таблица 4.

Сравнительная оценка, влияния различных концентраций йсфмалнка на антигенную активность зиоуа ИББ

1 ! Концентрация 1Титр специфических антител в' БИТА череэ |

I 1 1 1 | ¡До ПОСЛЕД. [ 7 ДКт» ' 1 1 1 ! 14 1 дней- £8 Дней!

I 1 1 1 ! I 0.5 . \ - ) 1:15 1 ! 1: 64 1:1Е8 |

I 2 | I 3 1 I 4 [ I 5 I

Г. О 2. О

з: о ■ контроль

I 1:16 | !' 1:8 I I 1:4

' 1: 64 1: 32

I 1:8

I 1:32 ! ! 1:16 | ! 1:8 |

Сравнительное изучение ишуногенных. свойств 4 различных инактчънрованных вакцин против ИЕБ

Как показали результаты налюдений в первые 7 дней после вакцинации.' независимо от применяемого биопрепарата (инактивирован- -. ные вакцины КЗКЕМ и Та1оуас £01), б клиническом состоянии птиц всех групп не было установлено каких-либо изменений: угнетения, снижения потребления корма, признаков диареи и др. Как б опытных, так и в контрольной группах, сохранность цылллг за период эксперимента (12 недель) составила 100

■ Результат« серологических исследований по изучению иммунологического ответа у вакцинированных кур представлены в табл. 5.

-Таблица 5.

Результаты исследований сыворотки крови в РНГА

Г р У п п а Вакцины Лоза мл Средне-геометрические титры АТ (1оег)

Сроки проводимых исследований (недели)

12 3 4 6 8 10 12

1. ЙЭКБМ(маел) 1,0 0,5 1,2 3,0 6,2 СГ г-1 и , ! Б, Б 6,0 5,2

2. ИЗКВМ( ГОД) 1,0 0,5 2,0 3,5 4,2 4,5 4,2 4,2 3,5

3. Та1оуае 1.0 0,5 2,2 3,7 7.5 6,5 7,2 6,8 6,4

4: контроль "1 0,3 о, 7 0,7 0,5 и, 3 0, 6 0,7

Как видно Из таблицы 5, рост титров антител установлен через 2 недели после иммунизации всеми 3-мя вакцинадагми, В дальнейшем наблюдалось увеличение титров специфических антител, через 4-5 недель после вакцинации в группах 1 и 3 (5,2-7,5 log2).

Полученные материалы по сравнительной оценке трех инактиви-рованных вакцин позволяют сделать заключение об их безвредности и выраженной иммуногенности. В то же время.следует отметить.большую антигенную активность вакцины Talovac-301, что проявилось выработкой антител у привитой птицы в более высоких титрах. Так, раз-■ ница в показателях была на 0.7 и l',2 log;2 больше^ по сравнению с таковыми у птиц, вакцинированных инактивированной змульсионной вакциной ИЭКЕМ и почти на 2-3 log2 больше, чем гидроокисьалюми-ниевой вакциной в зависимости от сроков исследования.

Аналогичная закономерность зарегистрирована и при серологических исследованиях желтка яиц в' РИГА с эритроцитарным антигеном ЙБЕ. Разница в уровне антител составляла 1,4 log , а уровень антител в сыворотке крови несушек, вакцинированных Talovac-301 был на 0,5-0,8 logg выше, по еразнению с первой группой и нэ 2,0-3.D log'2 выше, чем во второй группе. Результаты этих исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6.

Результаты серологических исследований по определению антител в желтнах яиц

г—1-

|Г | вакцины

!р i |у I

|п. !

т-1

Среднегеометрические титры АТ (1оег) в желтках! -.-1

I—г

4 6 8 (недели)

10

12

|1 ] ИЭКБМ (масл. * * 3,0 5, 8 5 5 6,0 5,4 4. 8

\2 |ИЭКБМ (ГОД) * 3,0 3, 8 4, 0 3,8 3,9 3, 2

|3 |.Та1оуас * * 3,5 7, 2 в, 0 6,8 6,0 5, 8

|4 ¡контроль * ' * 0 0, 2 0 2 0 0 0, 2

* - не было снесено яиц.

Среднегеометические титры антител в желтке были на 0,2-0,7 1о£2 ниже по сравнению с уровнем антител в сыворотках несушек в соответствующие сроки.

За период наблюдения,- начиная с 4 недели, у вакцинированных кур молодок уровень специфических антител в сыворотке крови и желтке яиц независимо от применяемых вакцин, оставался постоянным. Колебания отмечалось лишь в пределах одного логарифма.

.При зтом следует отметить, что у птиц всех групп яйцекладка началась через 2-3 недели после вакцинации,, т. е. в 140-1-50 дневном воэросте лизни,. что совпадает с технологической характеристикой для кросса Беларусь-9.

Материалы по изготовлению и испытанию лабораторных образцов инактивированных вакцин были одобрены Главным управлением ветери-

1

нарной медицины МОХШ Украины, которое дало распоряжение об изготовлении опытно-промышленных серий эмульсннвакцины на биофабрике с последующим комиссионным испытанием з приззодстве.

В соответствии с приказом ГУВ -ветеринарной медицины МСХ и Л Украины N 12 от 6. 04. 94 была изготовлена серия инактивировэнной вакцины ИЭКВМ (шт. Еер-93) в объеме 100 л, которая после комиссионного биоконтроля проведенного с участием представителей госу дарственного научно-исследовательского института ветеринарных препаратоз и кормовых добавок, была испытана, на ПО тыс. кур. 130-140-дневного возраста на Орельской птицефабрике, Днепропетровской области.

Как показали результаты испытания, после Еэкцинеции в клиническом состоянии птицы не было зарегистрировано каких-либо патологических отклонений; ' падеж не превышал технологической кормы, вакцина обеспечила передачу пассивных антител цыплятам з течение 3-х месяцев. Пассивные антитела обнаруживались у птпцемолодняка в титре 1:8 и выше до "4-х дневного возраста.

ВЫВОДЫ.

1. Изолированы полевые и вакцинные штаммы вируса ИББ, которые были адаптированы к куриным эмбрионам и культуре клеток. Из подученных 5-ти полевых и 5-ти вакцинных штаммов вируса ИББ: все вакцинные и 2 полевых штамма репродуцировались в первичных клетках куриных фибробластов, 3 вакцинные и один полевой - в культуре клеток Vero и только 3 (два вакцинных-и один полевой)- б культуре клеток эмбриональной почки,'овцы.

2. Наивысший титр вируса ИББ (штамм Ум-93) получен на 5-е

сутки культивирования в первичных клетках куриных фибробластов 87

(10 ТЦД 50/мл).

3. Изучена динамика репродукции вируса ИББ (штамм Бер-93) на

развивающихся эмбрионах кур. Установлено, что максимальное накоп-

7*1

ление вируса в тканях эмбриона (10' ЭИД 50/мл) и околоплодных

Ч 5 •

жидкостях (10' ЭИД 50/мл) достигается через 96 часов инкубации,

6,37

а в хорионаллантоисной оболочке (10 ЗИД 50/мл) через - 72 часа.

4. В перекрестной реакции непрямой гемагглютинации выявлена различная степень антигенного родства (13-100 %) между полевыми и вакцинными штаммами вируса болезни Гамборо.

5. У цыплят, зараженных вирусом ИББ (шт. Бер-93) в суточном возрасте, развивается иммунодепрессивное состояние, характеризующееся снижением бурсального индекса к уровня гуморальных антител „ к вирусу ньюкаслской болезни.

6. Бысоковирулентный штамм Бер. 93 выделенный при острой вспышке ИББ обладает выраженными антигенными свойствами и высокой иммуногенностью при использовании его в составе инактивированной вакцины против ИББ.

7. Для сохранения оптимальной антигенной активности вируса

НЕЕ (шт.Бэр.93) Еер-'ЗЗ в инактивированной вакцине целесообразно использование формалина в 0,5-1% концентрации. Активность и/нактивированного вируса Гамборо повышается при добавлении а состав вакцины эмульгатора и гидроокись.алюминия.

8. При сравнительном изучении инактивированных вакцин KSKBM (эмульсионной, гидроокисьалюминиевой) к Talovao-301 (ФРГ) установлено, что все биопрепараты являются стерильными, безвредными и иммуногеннкми.

9. У кур, вакцинированных инактивированными вакцинами против ИЕБ, специфические антитела обнаруживаются как б сыворотках крови, так и в желтках яиц. Различие в титрах составляет 0.2 - 0,7 log 2.

10. Комиссионные испытания эмульсионной инактивированной вакцины ИЭКШ против Болезни Гамборо б родительском стаде кур- показали, что вакцина является эффективным препаратом. Она обеспечила передачу пассивных антител цыплятам в течение 3-х месяцев. Пассивные антитела сохранялись' у цыплят в титре 1:8 и выше до 24-х - дневного возраста.

Практические предложит.

Предложена инактивнрованная вакцина против инфекционной бурсальной болеенп (б. Гамборо).

Разработана и утверждена нормативно-техкическа документация на промышленное производство инактивированной вакцины ЛЭ КВЫ против инфекционной бурсальной болезни птиц:

1. инструкция;

2. технические условия (ТУУ 46.15 ГО 005-94),утвержденные ГУВ МСХ Украины 19 июля 1994 г;

^__31_временное наставление по применению инактивированной вакцины из шт. Бер-93 против инфекционной бурсальной болезни птицы (б. Гамборо).

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1.Вивчення 1мунолог1чно1 1 морфологячно\ реакц11 курчат ка введения деких вакцин проти ХЕороби Гамборо/ Б. 3. Герман, Г. А. Красников, Л. А. Ольховик, Я, Берхане././ Збереженнгсть молодняка с/г тварин - "запорукь тваринництва Укради: 56. наук, статей/ Наук. -лракт. конф. - Харкав, 1994. -С. 89-90.

2. Каучение имммуногенности 2-х модифицированных штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (болезни Гамборо)/ В. 3. Герман, Г. А. Красников, Л. А. Ольховик, Я. Берхане-'/ Кформ. Ст./ ИЗКВМ.- Харьков, 1995.- С. 122.

3. Изучение особенностей течения болезни Гамборо в птице хозяйствах Украины с помощью эритроцитарного диагностикума/ А. Л. Юрченко, Я. Берхане, В. Е. Герман. : Кнферм. листок. 1С 38-94/ ларьк. , ЦНТЭЙ. - Харьков, 1994. -5 с.

4. Инфекционная бурсалькал болезнь/ Б. Б. Герман, • Г. А. Красников, Я. Берхане, В. Бибин: Экспресс-информация. - Харьков, 1994. -13 с.

5. Испытание экспериментальных образцов вакцин .против инфекционной бурсальной болезни птиц (болеэни Гамборо)/ В. Б. Герман, Л А. Ольховик, И. Берхане и др.// йформ. бюл. / ЙЭКВМ.--Харьков, 1995.- С. 151. .

^ б. Красников Г. А. , Герман В. В. , Берхане Я. ПстолоПчн1 зм!ни ¿муно-комчетентких орган!в курчат при спалахах знфекшйно!

-бурсальнсл хвороби // /форы. бкл. / KSKEU. - Харьков, 1595.- С. 153.

7. Краен 1 ков Г. А. , Герман В. S. , Еерхане Ii. Гютодончн! bmihii фабрицкево! бурой шеля ¿нокуллцп вакцикних та оелаблених Етам1в Bipyca 1кфекц1Йнса бурсально! хвороби // Кформ. бюл. / КЗКВМ. -ларьков, 1995. - С. 152.

8. Шрфофункщ ональна структура фабрищево! бурей у курчат в онтогенеэ! та ix чутливють до хвороби Гамборо-' Г. А. ' Краенjко®, В. В. Герман, .10. Ольховик, Я. Верхане// ЗбереженнЮть молодняка с/г тварин - аапорука тзарпнкицтЕз. Украши 36. наук, статей/ Наук -практ. конф. - XapKiE, 1994. -С. SD-93.

Резюме.

Яохэняес Верхане. "Вивченмл }муш61олог1Чнмх властивоетей piiiHHx BiraMiB Bipycy }н$екц1йно} бурсальжН хвороби (хвороби Гэм-боро)".

Вгхищзетъся рукопт дисертащ i на вдэбуття паукового ступени кандидата гетерияарних наук га спещгдьнютю 16. 00. CP ~ Ее-тери-нгрна MiKfcGioJiosiJ, ырусологш, ешаоотолоегч та inymwsis.

¡нетитут експеркменхальй01 i KJiiHi4HGi ветеринарки медицина: УДАЛ, XapKiB, 1555.

Проведен! досл1д»оенн:я по вивченнв бюлопчних властивостей 10 полооеизс гаоляна та вакциннизс штамв bipycy 1БХ, серед якш: "BirtiCpaHO висс-ксварулектний штам Еер-93 для конструювання хнамти-вованих вакцин (емульсШно; та ГОД).

У птищ, вакциновано! гнактивованими вакцинами IEKBM, спецн-ф1чн! аятгамлэ реесгруюгься як у сироватщ Kposi, так i в когтках яець. Р1ЗКИЦЯ в титрах складае 0,2-0,7 log£.

За данями ком!сiйного випробувакня в умовах виробкицтва ¿кактивована вакцина 1ЕХБЫ забеэпечувала передачу' пасивни:-: антител курчатам через яйце на протяз! 3-х. теяц1Б. a i>: циркуляцию у кров 1 птахомолодняка. - до 24 д:б н зэхисних титрах. Ключовi слога: ISX, Bipyc, штам, вакцина, птица."

¡Зшмиагу.

YohaTosss Berhar~ Voidest

Immmobiologic properties of different strains of infectious bursal disease viruses.

Ph. a ttests,' in vet. _n*dicir* by the- subject .V 15. CO. 03 Ve-ierHtary microbiology, virology, epizoc-tology, and ltmir^logy.

Institute of Experimental and Clinical Vet. Vfed. , Kharkov, Ukraine. The biological properties of 5 field and 5 vaccine . strains of IED viruses was studied. A very.virulent strain of IED virus, Бер-33, used for the preparation of inactivated vaccines.

Broiler parent chickens vaccinated with inactivated vaccines of IECYU 'red specific, uniforw, and high levels of antibody.. The difference in the level of antibody in serum and yolk was 0.2-0,7 Log 2. Vhen the vaccine was' tested in field conditions in broiler parent chickens high levels of antibody persisted in their serum for 3 monthes. Maternally derived ISO antibody persisted in seru;« of progeny' '"or 24 days after, hatching'.