Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биохимические характеристики различных штаммов листерий

о

на правам рукописи

Староверов Сергей Александрович

биохимические кагэо1ств|эисти1си

различным штаммов листвоий

16.00.03.- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Казань

1938

Работа выполнена в казанской государственной академии ветеринарной медицины им,Н.Э. Баумана и Всероссийском Научно исследовательском институте с р. Казань). Научный руководитель - доктор ветеринарию наук.

профессор, госманов Р. Г. Научный консультант г- доктор ветеринарных наук.

пройбссор, алимов a.m.

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук,

профессор. Хазипов Н.з. доктор'медицинских наук, профессор, Поздеев O.K. Ведущая организация - Омский государственный

аграрный университет

— о о

защита состоится г, в_£л_часов

на заседании диссертационного совета Д-120.22.01 в Казанской академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана с420074. Казань. ул. Сибирский тракт» 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке казанской государственной академии ветеринарной медицины им н.э. Баумана.

Аторефзрат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук,

доцент В. Е. Чеботарев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы! Анализ эпизоотической ситуации проведенный в последние годы как в нашей стране, так и за рубежом. Свидетельствует о широком распространений листериоза;сельскохозяйственных животных в различных регионах С Бакулов И. А.. 1967: Селиванов А. В.. Котылев 0. А». 1983? Burden Pat.. 1990: Ralovich В. .1989: Terplan G. .1989: '¿teslô A.. Peterz M.. 1932: Beumer R.R.. GifTell M.C, et ¿11,1992).

ущерб причиняемый этой инфекцией как экономике нашей страны, так. и других стран очень значителен■ (Казаков А. В..1939:Бакулов H.A..1983: Dominguer. Lucus F. 1985: Beumer R.R..Í992: Fuch R.C.. Sirvas S., 1931: Jonson.J. Dovle M.1938: Michalskl M., Rola J.G. .1994: Albrecht.M. 1991: Bemezet P.A. Delà Osa. 1991).

. Одной из основных причин широкого распространения лиоте-риоза является способность возбудителя длительное время сохраняться, а в ряде случаев и размножаться в окружапйей среде СKava Murezzim .Schmidt Udo, 1931: Lver T.. Varna Р..19Э4; Славчеа Георги. Милашки стесан. 1334: Fianders К., ttor.elly С., 1994: KhaLtab АА, Machmond M. А.. Lsbodv Ahl..1993: Burning V., Grawforri, 19S6). Кроме того, больше количество серологических типов листерйй затрудняет, диагностику листердаза. CMclauchllnä J.. Shah S Л992: Garcia D.. Domlntíuez L..1990: Rocourt Jùceivne, Seellger Heinz. 1985).

Следует отметить, что сущеетзУщиа бактериолдгические. биохимические, серологические с FCK и РА)-метод, и конъгкти-

еальная проба не полностью позволяют своевременно и точно диагностировать листериоз. В последний голы как отечественные, так и ззрубежные исследователи для диагностики им1ек-ционных болезней и типизации выделенных возбудителей- начали использовать современные штодыСИМ. РИА. гибридизация нуклеиновых кислот и полинеразная цепная реакция). В отношении лис-териоза имеются только отпельные сообщения г.о использованию имунноОерментного анализа. С Melaren J. Sa-nue 1 D.. l939:Cantoni С. d'Aubert S..1994; ArLache.V.. Van . Kuvhn C. Ash.M.,1983: Coml G. Cantonl C. ,1990: Noah Charles V.. Ramos Nora. C.1931: Russell E,1989: Berner H.. Brinkman E..1939) и полимеразной цепной реакции С ПНР) (Border Р., Howorü J..1990: Battcarl А.. Bsal Nöda, 1991: Jaton К.. Sahll R., 1992: Holmlrom Kl m. Rossen . Lone.1992: Ермолаева С,A... Зигангирова H.A. и ДО.1994).

Аля совершенствования диагностики и наиболее полной расшифровки патогенеза листериоза важны исследования биохимической характеристики структурных компонентов клеток различных серологических типов лисерий. Кроме того, для оптимизации условий культивирования снижения себестоимости производимых диагностических и npoít жтических средств, применяющихся при листериозе существе! ное значение имеет усовершенствование питательных сред для получения биомассы в достаточном количестве.

Целы Усовершенствовать диагностику и идентификацию возбудителя листериоза на основе биохимического анализа клеток л истерий. Для выполнения этой цели были поставлены следушие задачи,

I) огтшизироваггь питательную среду и репам культизиро-

вания листерий..

2) Фракционировать клеточные стенки и цитоплазматичес-кии фракции листерий различным штаммов и определить их поли--пептидный состав,

3) изучить биохимическую характеристику и гиперкромный эффект ДНК листеит.

4) получить антиген из листерий для иммуноадрыептного анализа,

5) изучить выживаемость листерий в мясе.

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований БНМВИ по заданию 48.01-П0ддеркать и. изучить молеку-лярно-гене~чческие характеристики музейных, производственных, вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителей инфекционных болезней животных.см.Гос.регистрации 01970002407,инв. N 02970001632)

Научная новизна: механической дезинтеграцией клеток, с последующим дифференциальным центрифугированием Фракционированы клеточные стенки и цитоплазматическиа Фракции разным серог-рупп листерий и изучен их полипептидный состав методом электрофореза в полиакриламидном геле. Установлены определенные отличия в полипептидном составе клеточных стенок и иитоплаз-матических Фракций в зависимости от вирулентных и антигенных свойств листерий. Выделена да различных штаммов листерий и изучен ее гиперхромный эффект. Усовершенствована питательная среда для культивирования листерий и разработан способ получения антигена для иммуноФерментного анализа, которые признана рационализаторскими предложениями (м.N161-97 и 162-97 ).Показано. что листерш длительное время сохраняются в мясе , что необходимо учитывать при проведении проткаолистери'чкых

мероприятий.Установлено.что ДНК-ДИК гибридизация обеспечивает ускоренное выявление листерий в мясе не зависимо от присутствия в нем посторонней микрофлоры.

Теоретическая и практическая ценность работы: Полученные данные по полипептидному составу,гиперхромному эядакту ДНК и антигенным свойствам клеточных стенок, цитоплазматичгК-ких Фракций и экстрактов листерий расширяет существующие представления по их биологии. Результаты исследований могут использоваться для серологической дифференциации листерий. Усовершенствованная питательная среда мол«т применяться при наработке биомассы листерий С рац.пред.N 162-97).Антиген, получаемый по разработанному способу с рац. пред. N 161-97).может быть использован для иммуноФерментного анализа.

Основные положения, выносимые на эааиту:

- Оптимизация питательной среды для культивирования листерий.

- Сравнительная биохимическая характеристика клеточных стенок, цитоплазматических фр ;шй и ДНК различных штаммов возбудителя листериоза.

- Фракционирование антиге а из листерий и оценка его эффективное™ для имму(Ю(йэрментного анализа при листериозе.

- Изучение выживаемости листерий в мясе при различных условиях хранения.

Апробация работы". Материалы диссертации изложены на 2 научно-производственных конференциях 'сигаем 1ЭЗЗ. 19.37, 199ЭГ.), годовых отчетах о НИР С1995. 1933. 1997 г.г.) и н:

расширенном- заседании сотрудников кафедр миксобиологии, вирусологии. биохимии, ветсанзкспертизы. Эпизоотологии, ОВД Казанской государственной академии ветеринарной медицины и лаборатории биохимии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

структура и обгем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты исследований), обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 4 таблицами.ю рисунками. Указатель литературы включает 186 источника, из них 132 на иностранных языках.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводили в период с 19Э5 по 13Э7 годы на кафедре микробиологии и вирусологии Казанской ' государственной академии ветеринарной медицины им. н. Э. Баумана и в лаборатории биохимии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института.

Объектом исследований служили пять штаммов возбудителя листериоза, относящиеся к различным сем группам: 9-123, 9-128 (II серогруппа):.ауф, аисх, "Бугульма "СI серогруппа). Все штаммы получены из музея лаборатории биохимии ¿НИЗИ С г Ка-

- а -

зань) и ик поддерживали путем периодических пекгсевов на полужидком агаре.

Посевы бактериальных культур проводили на печбноч-но-пептонный глисозо-глицериновый агар и агар Хоттшгйя с добавлением IX глюкозы и IX. печёночного экстракта, выращивание листерий проводили в термостате при температуре 37-с в течение 1-2 дней. При выделении листерий из мяса применяли синтетическую элективную среду. разработанную Алимовым a.m. с соавторами с 1974г.).

Для окраски мазков, приготовленных из колоний, выросших на поверхности обычной и элективной сред, использовали метод Грама. Окрашенные препараты исследовали под световым микроскопом с применением иммерсионной системы.

Хромосомальную ДНК листерий выделяли па общепринятой методике (Магтцг,1381г.).

Концентрацию, а также степень чистоты выделенных препаратов ДНК. определяли по спектрам поглощения в области 190-310 нм на спектрофотометре "Percin-Eimer" С Швеция).

Содержание пуриновых и -кримидиновьк оснований устанавливали по температуре плавлен я ДЖ сгерхард Ф.1934Г).

ЭлектроФоретические npoi -¡ли белков клеточных стенок, ци-топлазматических Фракций и SDS экстрактов листерий исследовали в полиакриламндном геле с разделяиднм градиентом 12,5-20%. Использовали вертикальный пластинчатый аппарат "Хийу-Калур".

ИммуноФерментнш анализ выполняли по непрямому методу, описанному Н. с.Умновым с 1937г.). ,

При индикации применяли ДНК-зонды со следушими характеристиками длина Фрагментов 20-23 т. п. н, удельная радиоактивность 2*10^-íb»i0® имп/мин/мкг ДНК. Спехтрооотометрические

характеристики-: на полисахариды 1.9-2,0 ел. на белки 1.7-2.0 ед.

ЛНК-зонд готовили по методу Фаизова т. X. с 1996). Для этого -лик, выделенную из листерий штамма ауф ,Фрагментирова» ли ультразвуком при 22 кГц в течение з минут. '

Мечение ДНК проводили 'жр методом "ник-трансляции". При этом в качестве источника '¿'¿р использовали дезокситимшин 5/_ трийосФзт/ с удельной активностью 20 МБК/моль. Для

мечения ДНК Фрагментов брали 50 мкм ^-Р-триФосаата на 1 мкг ДНК. Очистку меченого днк-эонда," от не включившегося триФос-Фата. проводили на колонке с сеФадексом й-50.

При определении гомологии ДнК бактерий радиоактивность проб измеряли на жидкостном станииляционном ;четчике Марк-2. Активность в гомологичной реакции принимали 2? 100%. Результаты ДНК-ДНК гибридизации оценивали метолом гадиоавтогра-Фии. Чувствительность ДНК-зонда листерий составляла 20 тыс. мк. т. на точку.

Гибридизацию с радиоактивными зондами С отжиг) проводили в запаяных полиэтиленовых мешочках при -температур3 42- С в течение 12 часов.' Экспонирование препаратов проводили с рентгеновской пленкой Я>1-1.

Для выделения цитоплазматических Фракций и клеточных стенсс иактериальные клетки разрушали в механическом дезинтеграторе в присутствии стеклянных бус "Баплотени" с последующим выделением нужных Фракций методом препаративного центрифугирования.

Термостабильный антиген получали кипячением одномиллиардной взвеси листерий ь течение 20 минут. После кипячения проводили центрифугирование бактериальной взвеси при 5000 е

-15мин.. В реакции- использовали надосадочную жидкость.

Додецил-сульФат экстракт i-рлучали в результате кипячения одно миллиардной «чзвеси листерий с 0.01% допецилсульФата натрия в течение 10 минут. После кипячения проводили осаждение бактериальных- клеток центрифугированием при 5000 g 20 минут.

Сыворотки получали иммунизацией кроликов антигенами, полу ченными из листерий первой и второй серогрупп. Титр нарастания специфических антител в сыворотке крови проверяй в реакции агглэтинации по общепринятой методике.

При изучении выживаемости листерий в мясе, кусочки мяса заражали суточной агаровой культурой листерий шт. Аисх. Затем проводили ."посевы из каждой пробы на мла с 2% теллурита калия и синтетическую элективную среду для выделения листерий.

Опыты по культивированию проводили в колбах аппарата "Вибротерм" в течение 10-24 часов при скорости перемешивания 120 об/мин.. Концентрацию микробных тел определяли при помощи Сотоколс'риметра КФК-2 по заранее построенной калибровочной прямой.

результаты исследования

1. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И К ПЬТУРА1ЬН0-Б1ЮХШ1ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЖГГЕРИЯ

Провчленнье исслепвания показали, что испытуемые нами штаммы облапают типичными для Listeria monocytogenes морфологическими и культуоалъно-биохимическиш свойствами. Все штаммы проявляют свойства, характерные для S-Форм листерий. ^ни разлагают до кислоты без газообразования глюкозу, левул'зу, рам-

позу, лактозу и не расщепляли арабинозу. сорбит и маннит. Клетки в мазках из молодых культур окрашивались положительно по Граму. спор и капсул не образовывали. Рост культум на плотных и жидких питательных средах был характерным для типичных S-Форм листерий. Все штаммы листер.ta давали пслохительнуи реакцию агглютинации с поливалентной и соответствующими групповыми сыворотками.

При исс. едовании ростовых свойств проводили культивирование листерий в срзде Хоттингера. модифицированной L-цисгеи-ном. вносимым в среду в концентрации 1ÓO и 200 мкг/мл. При культивировании листерий на данной среде с добавлением L-цис-теина в концентрации loo мкг/мл происходило уьель. ¡ение выхода бактериальной массы на 1.5-2. С раза, по сгэвнению с культивированием в среде без Ь-цистеикэ. Увеличение концентрации L-цистеина от 100 мкг/мл до 200 мкг/мл не приводило к существенному увеличению роста листерий. Пш внесении в питательную среду иистеина и глюкозы выход бактериальной массы увеличевался в 2.8 раза.

При разработке оптимальной посевной дозы листерий. нами. были получены следуише результата.

Наиболее эффективной о"азалась посевная доза, равная 10? мк. т. /мл. Эта доза позволяет получить наибольший иыход бак.е-риальной массы с 4.9 ± О.ООГ млрд. м. т. /мл) за 24 часа.

Уменьшение посевной дозы до 10& микрсб.-ш тел на миллилитр питательной среды приводило к более медленному росту и к 24 часам выход бактериальной массы составил 2,5 °-02 млрд. м. т./мл, что почти в 2 раза мэныяе по сравнению с предыдущим показателем.

2. ГШИПЕ1ТГШШ СОСТАВ иИТОПЛАЗМАТОЧЕСК'ЛХ ФРАКШИ, КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК И ДОДЕЦИЛ-СУЛЬФАТ ЭКСТРА!',ТОВ

. Методом злектгоФореза в полиакрилампяном геле в составе препаратов.цитоплазматических фракция листерий первой и второй серогрупп било обнаружена примерно одинаковое количество белковых Фракций, колеблшееся от по до :м Фгакпий у отдельных штаммов. Однако, следует отметить, что как.в пглделах одной серогруппы. та$ и между серогруппьми. б 'Лковые Фракции листерий имели различнуь электрофоретическуи подвижность. что в дальнейшем позволяло выявить 4 электроФо! .ггичес-ких типа листерий на осно;»знии электроФоретической подвижности их полипептидов.

При изучении электрофорезом клеточных стенок листерий первой и второй серогрупп нами Фиксировалась полная идентичность штаммов АУФ и Аисх,являющихся представителями первой серогруппы. У обоих штаммов обнаруживалось одинаковое количество белковых фракций, равное 38, а так-же наблюдалась их идентичная электрофоретиче :ыя подвижность. У штаммов 9-123 и 9-128 второй серогруппы ^ и отмечены сходный результат: у обоих штаммов наблюдалос одинаковое количество белковых фракций, равное 33, имеющих одинаковую подвижность. Однако, при сравнении злектрофореграмм.полученных из препаратов клеточных стенок первой и второй серогрупп, выявлялись различия как в общем количестве белковых Фракций, так и в их злектрофо-рчтической подвижности.В частности "легочные стрнки листерий первой серогруппы содержали на 5 полипептидов болыда по сравнении: со штаммами второй серогруппы.

При выделении додецил-сульфат экстрактов из листерий и

1о

изучении их полипептидного профиля, нами было установлено, что штаммы ЛУФ и Аисх. относящиеся к первой серогруппе. содержат одинаковое количество белковых Фракций, равное 35. иша-цих одинаковую электрофоретическув подвижность.

При сравнении штаммов а-129 и 9-128. относящихся к второй серогруппе листерип также обнаруживается одинаковое количество белковых Фракций. равное 30. обладашие одинаковой электроФоретическоп подвижностью. Однако, при сравнении элек-троФорстрамм лодецил-сульФат экстрактов, выделенных из штаммов первой и второй серогрупп. отмечаются гх^.ич; ; ; ак в об-цем количество белковых Фракций так и в их . легтрсИератической подвижности. Для додепил-сульФат экстракте.) листерип первой серогруппы было характерно содержание на пять Фракций больые по сравнению с представителями второй серогруппы.Полученные данные свидетельствуют о том,что белковый состав поверхностных структур клеток листерий определяет их антигенную активность.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО АНТИГЕНА И ДОДЕЦИЛ-СУЛЬФАТ ЭКСТРАКТОВ, КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК И 11ИТС. ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ФРАКЦИИ ЛИСТЕРИЙ В »МУНОФЕтЕКТНОМ АНАЛИЗЕ

Для определения серологической активности и специфичности полученных термостабильных антигенов и' додецил-сульФат экстрактов использовали иммунные сыворотки крови кроликов, полученные после введения живой и убитой культуры листерий

первой и мк второй серогрупп.

В проведенных опытах нами был Установлено, что полученные сыворотка и антигены обладали как серологической активность». так и специфичностью. При сравнении специфичности и серологмческой активности термостабильного антигена ч доде-цил-сульФат экстракта нами отмечалось следушее:доде-иил-сульфат экстракт и термостабильный антиген реагировали в иммуноиеи-энтном анализе со специфически сывороткой в одинаковых титрах. При взаимодействии термостабильного антигена, выделенного из штамма АУФ первой ^ерогруппы, с сыворотками первой и второй серогрупп предельный титр с сывороткой крови первой серогруппы составил 1:6400 и коэффициент специфичности равен 3.2.

Лодецил-сульфат экстракт так-же показал титр, равный 1:6400, но коэффициент специфичности в данном случае равнялся 4.7. Этот антиген проявлял более высокую специфичность и . при более низких разведениях сывороток по сравнению с термостабильным антигеном.что свидетельствует о его достаточной специфичности.

При взаимодействии термостаби.пного антигена, полученного из штамма 9-129 второй серогруппы, с сыяоротками первой ' и второй серогрупп специфическая реакция происходит с сывороткой второй серогруппы. При этом максимальный титр сыворотки составил 1:800СкоэЩшенте специфичности,равном 2,5).При дальнейших разведениях сырчроток специфичность реакции сохранялась но коэффициент варьировал в пределах 1.7-1,9.

Лодецил-сульфат экстракт с сывороткой второй серогруппы по::азал скодную активность, однако при разведениях сыворотки 1:3200 и 1:6400 коэШошнт специфичности был несколько

- 1Ь -

вышеСна 0,3-0,4 ел.) по сравнению w термостабильным антигеном.

При более низких разведениях сывоготки ci:50-l:200) ло-децил-сульФзт экстракт проявлял еюе более вькпку» rnemi.li"-i-ность.то есть коэффициент специфичн: сти был в 1.5-2 раза elf-ше. по сравнению с термоэкстрактом.

При исследовании специфичности препаратов клеточный стенок и иитоплазматических фракций в иммуноФерм^нтом анализе нами было установлено.что цитоплазматические Фракции листерий первой и второй'"серогрупп неспециФичны в отношении сывороток первой и второй серогг пп. Они дали перекрестны^ режции с гетерологичными серо групповыми сыворотками, а препараты клеточных стенок проявляли высокую се< оптмь.'н спешь Фичность. то есть они не вступали в реакции с г^теролигичныш серогрупповыми сыворотками. Эти данные позеоллст констатировать о том, что группо;» :-.щиФические антигены листерий локализованы в клеточных стоиках, а цитог пазматические Фракции содержат об1ые антигены. Результаты этих данных следует учитывать при получение специфических.антигенов листерип для использования в серологических анализах.

3. ГИПЕРХРОМНЫй ЭФФЕКТ ПРЕПАРАТОВ ДНК ЛЧСТЕРШ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ГОМОЛОГИИ

При сравнении полученных нами данных по изучению гипер-хромного эффекта и процентногс содержания гуанина+иитозина, можно заключить, что препарата ДНГ L. monocytogenes первой се-рогр"ппы АУФ. Аисг. Бугульма имеют сходные показатели температуры плавления равной, 85.5+0.41*с, что соответствует содержанию Г+U в пределах 38.6-38,8 мол*. Штаммы листерий вто-

рой серогруппы 9-128 и 9-129 имели 'температуру плавления, равную 86-86.5* С. Это свидетельствует о том. что содержанию Г+Ц у них состав 1яет 40-40.1 молх. как видно из зтих ' данных, наблюдаются незначительные различия состава нуклеиновых • "кислот у разных серотипов листерий.но они являются статически незначимыми (Р>0.05).

" табл.1.

Гомологичность.ДНК листерий различных штаммов и серогрупп (п=3). '"!

1 ...... ■ (наименование штаммов 1 ' .....- ..............1 1 % гомологии . М + m 1

1 ДНК - зонд из листерий штамма АУФ с репер) 1

1 АУФ с 1 серогруппа) 100,0 ¿3.0 1

1 "Бугульма" 90.0 + s,0 1

1 Аисх 98,0 + 5.0 1

1 9-128 С II серогруппа) 96,0 + 5,0 1

1 .Е. insidiosa С контроль) ! 5.0 + 2,0 • 1 1

В то же время следует иметь в виду, что'нуклеотидный состав - это "негативный" критерий, так как функция генома определяется последовательностью расположения нуклеотидов, то есть возможны случаи, когда микроорганизмы с одинаковым нуклеотид-ным составом■генетически различны. В связи с этим для подтверждения ' генетической близости необходимы определения степени гомологи!! ДНК. Поэтому мы определяли гомологию ДНК у

1V -

изучаемых штаммов'листерий.

Результаты мучения гомологии ЛИК листерий с помощь» ЛНК-зонда , меченого '¿'¿Р. приведены на табл. N 1.

Из таблицы N 1 видно, ч^-о днк листерий имела высокий процент гомологичности СЭО-93%) не зависимо от вирулентности изучаемых штампов ( АУФ. Аисх,"Бугульма". 9-128). ДНК-зонд, приготовленный из Фрагментов ДНК штамма " АУФ ".пюяьлял высокую специфичность.

4.ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИС~,:Р.Й i !•'■ .СК МЕТОДОМ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АК'ЛЗА И ДНК-ГИБРИДИЗАЦИИ

В результате проведенных исследований нами были получены следущие результаты: при хранении мяса при температуре С-20-С) в течение первых 22 дней количество листерий в мясе не изменялось и составляло 100% от начальной дозы внесения, в течение последущих дней наблюдалось снижение количества бактериальных клеток в пробе на 252. которое удерживалось вплоть до 60 дня опыта'и составляло через 43 дня 75%. через 49 дней 75.3%. через 60 дней 75%. ДНК-ДНК гибридизация нами ставилась параллельно с бактериологическим методом индикации на 7, 22, и 60 дни исследования. ДНК-ДНК гибридизация так-»й дала положительный р<--гультат, что говорит о наличии в пробах лис-териозных нуклеиновых кислот.

В мясе, хранившемся при температуре +4* С, количество листерий в течение первых 14 дней оставалось пЬ^ктически без изменений. В последущем, на 22 день наблюдалось снижение листериозных клеток до 50%. в дальнейшем. . количество листе-

рий в пробах продолжало снижаться и на 43 день составляло 35.5%. на 49 день - 142. На 55 и 60 дни исследований листе-рии в мясе бактериологическим методом не обнаруживались. По мере увеличения срока хранения мяса количество посторонней микрофлоры С кокки, дрожжевые клетки, бациллы ) повышалось и происходила порча мяса. При постановке ДНК-ДНК гибридизации мы проводили индикацию на ?. 22. 43. 49. 55 и по дни. ДНК-ДНК гибридизация дала положительные результаты в пробах через г. 22. 43. 49. 55 дней хранения млса при 4-С. на 60 день хранения листерий реакция ДНК-ДНК гибридизации была отрицательной. Таким образом, полученные данные св1.летельствуот о том. что листерии длительно сохраняются в мясе при хранении при разных температурах. Реакция ДНК-ДНК гибридизации в отличие от бактериологического метода обеспечивает индикацию листерий в мясе даже на фоне увеличения количества посторонней микрофлоры.

ВЫВОДЫ

1.Установлено,что все исследуемые штаммы обладали сходными культурапьно-морфологическими и ферментативными свойствами и оказались типичными представителями 1.гсопоеЛойеадз I САУФ. Аисх. Бугульма) и И (9-123. 9-128) серогоупп.

2. Посевная доза листерий оказывает существенное влияние на скорость роста и еыход бактериальной массы. Наиболее оптимальным является внесение 1С' микробных' тел на 1 мл питательной среды при культивировании листерий в условиях аэрации. Добавление к среде Хоттингерэ незаменимой для лплерпп аминокислоты цистеина й 1% глюкозы приводит, к значительно-

му увеличению-выхода бактериальной массы в 2.8 раза.

3. Получены нативные препараты клеточных стенок и ци-топлазматаческих Фракций листерий и определены в них электро-Форетические профили полипептдов. Для клеточных стенок характерна серогрупповая специфичность, а иитоплазматическиэ Фракции содержат общегрупповые антигены, дащие перекрестные реакции в !/№А.

Б составе нативных препаратов клеточных стенок обнаружено 33-38 полипептидов, имеших молекулярную массу от 10 до 100 кд. Цитоплазматические фракции листерий сс у,-».,- '.^рл полипептидов с молекулярной массой от 10 до 9С к<.

4. Полипептидныя спектр клеточных спи % .чиггерий варьирует з зависимости от их серогруппозой принадлежности. Б частности, у штаммов листерий 1 серогруппы обнаружено на 5 полипептидных Фракций больше.так как у штаммов П серогруппы отсутствовали белковые Фракции, имешие молекулярную массу 100-90КД, 68кД .40кД. ЗОКД и 17кД.

5. Полипаптидный состав цитоплазматических Фракций листерий имеет штаммовыа отличия и не может служить риФФеренци-руицим признаком по их серогрупповой принадлежности.

6.ЭлектроФоретические профили полипептидов 506-зкстрак-тов листермй. относящихся к разным серогруппам, имеют существенные отличия. Антиген, полученный экстракцией микробных клеток додецилс-' ььфаггом натрия, может быть использован для иммуноФерментного анализа при определении специфических антител к возбудителям листериоза.

7. Установлена эффективность ДНК-ДНК гибридизации для индикации листерий в мясе. Данная реакция обеспечивает выявление листерий за более короткий срок С36-48 часов) по сравне-

нию с бактериологическим методом.

S. Различные штаммы листерий. независимо от вирулентных и антигенных отличий, проявляют сходный гиперхромный эффект и содержание Г+Ц у них составляет 38, 6 - 40.7%.

9. Установлено, что листнрии длительно выживают в мясе при различных температурных режимах хранения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ '

1. Антиген, полученный экстракцией клеток листерий доде-цил-сульфатом натрия, рекомендуется использовать для диагностики листериоза с помощью иммуноФерментного анализа. С Рационализаторское предложение 161-97 от 23.11. Э7г. , принятое Казанской Государственной академией ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана.)

2. Для культивирования листерий предлагается использовать бульон Хотгингера с добавлением цистеина и глюкозы, с Рационализаторское предложение 162-97 от 23.11.97г., принятое Казанской Государственной академией ветеринарной медицины им. И. 3. Баумана.)

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Фаизов Т.л-, Равилов Р.Х., Гришкевич H.A., Староверов С. А. ДНК - зонды, полимеразная цепная реакция для выявления зооантропонозов // мат. респ. каучно-произв. конФ. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии.-.Казань, 19Э6-С.43

2. Староверов с. А.. Госманов Р. Г. Суспензионное культивирование листег-.й // Мат. респ. научно-произв. конФ. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии.- Казань. 139S-C. 34

3. Староверов С. А. Выделение ДНК из листерий и её Физико-химические свойства // Мат. респ. научно-произв. кон®, по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань,1933 - С. 35

4. Староверов С. А.. Алимов А. И-. Госман .в J.r, I j.ntnen-тидный состав клеточных стенок и цитоплазма. *'-, -ск <н фга-гший различных штаммов листерий // Тез.докл. респуб. научно-произ-в.конФ. по актуальным проблемам ветеринарии и животноводства.-1997-C.4S

5. староверов С. А. Изучение выживаемости листерий в продуктах Бетеринарно-сонитарного надзора // тез. докл. респуб. на^чно-прсизв. конФ. по актуальным проблемам ветеринарии и живэтноводстьа. -1997-е.45

6. Староверов С.А..Алимов А.М..Госманоа Р.г. Получение и оценка эффективности для ИФА антигенов листерий.// Между-нар. конФ., посвямен. 125-летаю КГВАМ им. Н. э. Баумана, Казань -1338 г.