Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Ассоциированная вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

Армавирская биофабрика и Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

На правах рукописи УДК 619:616.98:579.843.115:615.371

СЕМЁНОВ ЛЕОНИД ВЛАДИМИРОВИЧ

АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ АНАЭРОБНОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ И ЭШЕРИХИОЗА ПОРОСЯТ"

(изготовление, контроль, применение)

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук, профессор КИРИЛЛОВ Л.В.

доктор ветеринарных наук, профессор МАЛАХОВ Ю.А.

МОСКВА, 1998

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

1. Введение...............................................4

2. Обзор литературы........................................9

2.1. Clostridium perfringens и его роль в инфекционной патологии животных..................................9

2.2. Распространённость энтеротоксемии........ ............13

2.3. Средства специфической профилактики и лечения энтеротоксемии......................................19

2.4. Escherichia coli и её роль в инфекционной патологии животных...........................................23

2.5. Факторы вирулентности энтеропатогенных эшерихий . . . ... .23

2.6. Вакцинопрофилактика эшерихиоза......... .............33

2.7. Заключение.........................................35

3. Собственные исследования................................37

3.1. Материалы и методы.................................37

3.2. Работа с производственными штаммами.................49

3.3. Определение оптимального соотношения в вакцине эшерихиозного и клостридиозного антигенов.............56

3.4. Разработка промышленной технологии изготовления ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят.......................60

3.5. Сравнительная оценка активности ассоциированной вакцины и моновакцин................................75

3.6. Определение иммунизирующих доз ассоциированной вакцины для свиноматок...........................78

3.7. Разработка методов контроля и применения ассоциированной вакцины.................................83

3.8. Производственные испытания ассоциированной

вакцины............................................90

стр.

4. Выводы..............................................92

5. Практические предложения.............................94

6. Список литературы.....................................95

7. Приложения.........................................108

1. ВВЕДЕНИЕ

Создание крупных свиноводческих комплексов, внедрение индустриальных методов производства мяса и других продуктов животноводства сопровождалось резким изменением эпизоотической ситуации по ряду инфекционных болезней и активизацией условно патогенных микроорганизмов.

На первый план выдвинулись желудочно-кишечные болезни и болезни с поражением дыхательных путей.

Актуальной задачей стало изучение этиологии болезней органов пищеварения у поросят и разработка мероприятий по их предупреждению.

Инфекционные болезни, в том числе анаэробная энтеротоксемия (дизентерия, инфекционный некротический энтерит) и эшерихиоз (колибактериоз) поросят стали существенным препятствием, сдерживающим рост поголовья свиней.

Анаэробная энтеротоксемия и эшерихиоз поросят регистрируются стационарно практически во всех крупных свиноводческих хозяйствах Российской Федерации.

Основным возбудителем анаэробной энтеротоксемии поросят является Clostridium perfringens типа С, который часто выделяется от больных животных в ассоциации с энтеропатогенными эшерихиями.

Эшерихиоз поросят вызывает обширная группа энтеропатоген-ных эшерихий различных серогрупп, обладающих адгезивными антигенами (К88, К99, 987Р, F41 и др.) и продуцирующих термолабильные и термостабильные энтеротоксины и гемолизины.

Оба заболевания поражают поросят преимущественно первых дней жизни, но в отдельных случаях болезни регистрируются до 2-месячного возраста и сопровождаются высокой заболеваемостью и летальностью. Защита новорождённых поросят осуществляется за счёт колострального иммунитета, который формируется при вакцинации супоросных свиноматок, а поросят старшего возраста - вакцинацией перед отъёмом, последнее не всегда осуществимо при использовании моновакцин из-за высокой уплотнённости схемы лечебно-профилактических мероприятий у поросят.

Вакцина против анаэробной энтеротоксемии поросят впервые разработана в ВГНКИ в 70-е годы, но была испытана на ограниченном количестве животных и не была внедрена в ветеринарную практику. В 90-х годах эти работы были продолжены и вакцина с положительным результатом была испытана в неблагополучных хозяйствах Тульской, Московской и Липецкой областей. Вакцина против эшерихиоза также разработана в ВГНКИ в 80-е годы и постоянно совершенствуется в зависимости от этиологической структуры болезни, выявления новых факторов патогенности и их выраженности у возбудителя.

Учитывая, что обе болезни (анаэробная энтеротоксемия и эше-рихиоз поросят) являются токсикоинфекциями, поражают животных одного возраста, имеют сходный патогенез с участием энтеропатоген-ных факторов, мы поставили цель создать ассоциированную вакцину против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят, разработать способы её изготовления, методы контроля и применения.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

-провести отбор и селекцию производственных и контрольных штаммов;

-определить оптимальное соотношение эшерихиозного и клост-ридиозного антигенов в иммунизирующей дозе препарата;

-определить оптимальные иммунизирующие дозы вакцины для супоросных свиноматок;

-разработать промышленную технологию изготовления ассоциированной вакцины и методы её контроля на лабораторных животных;

-изготовить 2-3 промышленные серии вакцины и испытать их в неблагополучных свиноводческих хозяйствах Российской Федерации;

-разработать и согласовать проекты нормативной документации по технологии изготовления, методам контроля и применения ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшери-хиоза поросят.

Научная новизна

Установлена иммунологическая совместимость и оптимальные соотношения антигенов О.регйтхщепБ типа С и энтеропатогенных эшерихий в ассоциированной вакцине, обеспечивающие формирование иммунитета необходимой напряжённости у вакцинированных свиноматок с целью передачи новорождённым поросятам специфических колостральных антител.

Разработаны промышленная технология, методы контроля и применения ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят (положительное решение на выдачу Патента № 97120415 по заявке с приоритетом от 21 декабря 1997г.).

Практическая значимость работы

Определяется серийным изготовлением в промышленных объёмах и успешным применением в свиноводческих хозяйствах Российской Федерации ассоциированной вакцины против анаэробной энте-ротоксемии и эшерихиоза поросят.

Наставление по применению вакцины и технические условия № 9384-050-049185-94 утверждены Департаментом ветеринарии МСХ и Продовольствия РФ 14 марта 1994 года.

Инструкция по изготовлению и контролю вакцины утверждена директором Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов А.Н. Паниным 12 марта 1996 года. Указанные документы прилагаются.

Апробация

Результаты исследований по диссертационной работе обсуждены и получили положительную оценку :

-научно-технического совета Армавирской биофабрики в 1996, 1997,1998 гг.;

-конференции "Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных", посвящённой 50-летию Краснодарской НИВС, Краснодар, 1996 г.;

-Всероссийской научно-производственной конференции "К 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России", Курск, 1996 г.;

-на межлабораторном совещании при рассмотрении диссертации в ВГНКИ ветпрепаратов, Москва, 1998 г.

Основные положения, выносимые на защиту

Создание ассоциированной вакцины против анаэробной энтеро-токсемии и эшерихиоза поросят, разработка промышленных способов её изготовления, методов контроля и применения.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Среди болезней, продолжающих наносить ощутимый ущерб свиноводству, значительное место занимают анаэробная энтеротоксе-мия, вызываемая CI. perfringens типа С и эшерихиоз, возбудителями которого являются энтеропатогенные эшерихии различных сероваров и серогрупп. Обе болезни убиквитарны, поражают поросят преимущественно первых дней жизни, а в свиноводческих комплексах и крупных свиноводческих хозяйствах часто проявляются как смешанная инфекция.

2.1. CI. perfringens и его роль в инфекционной патологии животных

Впервые CI. perfringens выделен в 1884 году Розенбахом как возбудитель газовой гангрены человека. В последующие годы этот микроорганизм неоднократно описывали под разными наименованиями в различных странах. До 20-х годов CI. perfringens считали возбудителем только газовой гангрены (злокачественный отёк).

В 1926-1928 гг. Dalling установил, что одной из причин гибели ягнят первых дней жизни является микроб идентичный CI. perfringens по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам, но отличающийся в иммуногенном отношении (85, 86).

Микроорганизм получил название Lamb dysentry bacillus, а позднее был определён как CI. perfringens типа В.

McEwen в 1930 г. в Англии выделила от овец, павших от болезни, получившей у фермеров название "stiyck" (удар), новый тип того же возбудителя, который вначале приняли за неизвестный ранее мик-

роорганизм - Вас. paludis (болотный), в дальнейшем идентифицированный как CI. perfringens типа С.

В 1932 году Bennetts в Австралии выделил от павших овец возбудителя, сходного с CI. perfringens, и назвал его Вас. ovitoxicus, в дальнейшем он был идентифицирован как CI. perfringens типа Д (79).

В 1933 году Wildson, исследовав 50 штаммов разного происхождения, выделенных у людей при газовой гангрене, у ягнят при дизентерии, у овец при болезни "struck" и инфекционной энтеротоксемии (мягкая почка), не нашёл никаких различий в их морфологии, культу-ральных и ферментативных свойствах, но на основании обнаруженных различий в антигенных свойствах выделяемых ими экзотоксинов разделил их на четыре типа, обозначаемые прописными буквами латинского алфавита: А, В, С и Д (138).

В 1943 году Boswozth выделил пятый тип, образующий токсин, отличающийся от ранее описанных, и идентифицировал его как С1. perfringens типа Е (82).

В 1949 году Zeissles, Rosslend-Sternberg описали шестой тип С1. perfringens - тип F, выделенные от людей, больных некротическим энтероколитом (140). В дальнейшем (1980 г.) CI. perfringens типа F был определён как серовар типа С.

Таким образом, в настоящее время описаны пять самостоятельных типов CI. perfringens, различающихся по антигенной структуре выделяемых ими экзотоксинов и патогенности; известны 12 токсинов, обозначаемых буквами греческого алфавита.

Альфа-токсин (лецитиназа) - основной летальный токсин С1. perfringens типа А, в меньших количествах этот токсин продуцируется всеми известными типами CI. perfringens, обладает летальными, некротическими и гемолитическими свойствами.

и

По данным Ф.А. Чертковой и Е.С. Шайн (1950), большинство исследованных ими штаммов CI. perfringens типа А вырабатывало же-латиназу, причём этот фермент инактивировался цистеином, цианидом, цитратом и нормальной сывороткой крови лошади (68).

Бета-токсин является основным токсином CI. perfiingens типов В,С и F. Он обладает летальными, некротическими и гемолитическими свойствами, термолабилен.

Эпсилон-токсин вырабатывается CI. perfringens типов В и Д. Он является главным токсическим фактором типа Д, обусловливающим клинические и патологоанатомические изменения, характерные для инфекционной энтеротоксемии овец (мягкая почка).

В 1960 году М.Д. Полыковский, Ф.И. Каган, В.М. Подкопаев сообщили, что при обработке щелочного фильтрата культуры CI. perfringens типа Д раствором трипсина (панкреатина) в течение одного часа при температуре 37°С малоактивный протоксин превращается в

S-токсин, который увеличивает свою летальную активность для белых мышей в 100 и более раз (58).

По данным В.И. Ленькова, Б.Д. Быченко (1958), 8-токсин термостабилен, устойчив к изменениям рН, поэтому его часто удаётся обнаружить в фильтратах содержимого кишечника животных, павших от энтеротоксемии, даже через несколько часов после их гибели (45).

Гамма-токсин вырабатывается штаммами CI. perfringens типов В, С и F, обладает выраженными летальными свойствами. Smith (1955) указывает, что единственный способ, с помощью которого определяется этот токсин, лишённый гемолитического и некротического факторов, основывается на количественных несоответствиях в реакциях токсина с антитоксинами (130).

Дельта-токсин продуцируется Cl. perfringens типов В и С. Он является основной составной частью токсина типа С, обладает гемолитическими и летальными свойствами. Гемолитические свойства проявляются в отношении эритроцитов крупного рогатого скота, овец, коз и свиней. По данным Oakley, Warrack (1953), Е.М. Губорева (1955)

и др., 8-токсин можно определить на основании этих свойств (120,

21).

Эта-токсин обладает только летальными свойствами и выявляется редко. По данным Smith (1955), токсин не имеет большого значения в патологии, вызываемой Cl. perfringens (130).

Тета-токсин образует Cl. perfringens типов В, С, Д и Е, обладает летальными и гемолитическими свойствами. Отдельные штаммы типа А также способны продуцировать тета-токсин.

Йота-токсин подробно изучен Bosworth (1943), Oakley (1949), (82). Он образуется только штаммами типа Е как протоксин в малоактивной форме и активируется трипсином.

Капа-токсин вырабатывается Cl. perfringens типов А, С и Е и некоторыми штаммами типа Д. Oakley, Warrack, Warren (1948), Mac

Ferlant (1948) установили, что К-токсин содержит фермент коллагена-зу, которая разрушает мышцы, воздействуя на ретикулин. Этот фактор токсина обусловливает размягчение и расплавление мышц, наблюдающиеся при гангрене у человека и морской свинки (119,109).

Лямбда-токсин вырабатывается Cl. perfringens типов В и Е и некоторыми штаммами типа Д, обладает свойствами протеолитического фермента желатиназы, действует на коллаген. Mac Ferlant (1948),

Oakley, Warrack, Warren (1948) и др. показали, что А,-токсин растворя-

ет порошок из кожи животных, а также желатин, казеин и гемоглобин (109,119).

Мю-токсин является ферментом гиалуронидазой, способным расщеплять один из распространённых мукополисахаридов организма - гиалуроновую кислоту (С.М. Бычков, 1948), (11).

Ню-токсин - фермент, разрушающий дезоксирибонуклеиновую кислоту. Действие этого фермента можно наблюдать в гистологических препаратах ткани : он лишает клеточные элементы способности к окраске (Smith, 1955), (130).

По культуральным и морфологическим свойствам микробные клетки всех типов и вариантов CI. perfringens не отличаются друг от друга : это крупные неподвижные палочки с обрубленными концами, в молодом возрасте положительно окрашиваются по Граму, но по мере старения культуры в её популяции увеличивается количество грам-отрицательных форм. CI. perfringens - строгий анаэроб. Его культуры активно растут в специальных жидких питательных средах (среда Китт-Тароцци) с выделением газа.

На кровяном агаре, приготовленном по прописи Цейслера, образуются круглые, выпуклые, матовые колонии, окружённые зоной гемолиза. При контакте с атмосферным воздухом колонии приобретают зеленоватый цвет.

2.2. Распространённость энтеротоксемии

Первые сведения об энтеротоксемии относятся к заболеваниям

овец.

В 1910 году в Тасмании Gilruth, а в Новой Зеландии Gill в 1933 году описали заболевание овец с нервными явлениями и высокой

смертностью. Характерным патологоанатомическим признаком было размягчение почек, от чего болезнь получила название "мягкая почка". Истинную причину болезни авторам установить не удалось (94,93).

Впервые этиологию инфекционной энтеротоксемии овец установил Bennetts в Австралии в 1932-1936 гг., который из тонкого отдела кишечника павших овец выделил возбудителя, названного им Вас. ovitoxicus. Помимо возбудителя он обнаружил в содержимом кишечника специфический токсин (79, 80).

В 1931 году в Англии Roberts, McEven установили другую форму энтеротоксемии овец, известную под названием "struck" - удар (125). После работ Bennetts и McEven энтеротоксемия овец была установлена почти во всех странах мира (в США в 1952 г.; в Германии в 1953, Mitscherlich, Bratke, 1954 (113); в Шотландии Roberts, 1959 (126); в Турции Raffi, 1961 (124) и т.д.).

Griner, Johnson (1954) отмечали в США острое течение болезни среди ягнят первых дней жизни, обусловленной CI. perfringens типа С. Заболевание проявлялось признаками острого геморрагического энтерита и заканчивалось, как правило, летальным исходом (95).

Аналогичное заболевание среди овец наблюдали Семерджиев Б. и Матева В. (1956) в Болгарии (129).

По данным Butorn, Mihajlovic (1959) в Югославии и Toratscu (1961) в Румынии, возбудителем энтеротоксемии овец является С1. perfringens типов С и Д (84, 137).

По сообщению Bolduin (1959) в США энтеротоксемия овец вызывается CI. perfringens типов А, В, С и Д.

В нашей стране инфекционную энтеротоксемию овец впервые описали С.Н. Муромцев и Л.С. Новикова (1936), установив, что забо-

левание обусловлено всасывание�