Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние лектина Paenibacillus polymyxa на процесс фагоцитоза бактерий

Актуальность темы. Одним из перспективных направлений в современной микробиологии является лектинология. Лектины представляют собой уг-леводсвязывающие белки неиммунного происхождения. Благодаря специфической связи с углеводными рецепторами, они обеспечивают процесс взаимодействия в популяциях эукариотических и прокариотических клеток, участвуют во многих внутриклеточных метаболических процессах (Линевич, 1979; Лахтин, 1992; Карпунина, 2002; 2005; Никитина, 2001; 2005; Шендеров, Лах-тин, 2004). Лектины и лиганды - углеводы занимают важное место в обеспечении функционирования системы иммунологического надзора в организме. Благодаря лектин-углеводным взаимодействиям макро- и микроорганизмов осуществляются многие реакции неспецифической защиты и адаптивного иммунитета (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др., 2003; Тихомирова, 2005).

Применение лектинов в биологических и медицинских исследованиях требует дальнейшего изучения их биологического воздействия на клетки иммунной системы животных и человека.

К настоящему времени известно преимущественно о влиянии лектинов растительного происхождения на активность фагоцитирующих клеток (Маян-ский и др., 1986; Иммунология, 1987; Горудко, Тимошенко, 2000). В отношении бактериальных лектинов имеются отдельные сведения о том, что патогенные бактерии с помощью поверхностных лектинов могут взаимодействовать с перитонеальными макрофагами человека, крысы и белых мышей и по-лиморфноядерными лейкоцитами человека, что приводит к активации последних (Kelly et al., 1989; Mork, Hancock, 1993; Ofek et al., 1995; Ruhl, Sandberg, Cisar, 1997; Engel, 1999). О лектинах, полученных из непатогенных бактерий, такие сведения практически отсутствуют. Поэтому исследование влияния лектинов из непатогенных бактерий на процесс фагоцитоза является весьма интересной и актуальной задачей.

Цель работы - изучить влияние лектина JUI Paenibacillus polymyxa 1460 на процесс фагоцитоза бактерий и функционально-метаболическую активность макрофагов.

Задачи исследования:

1. Определить влияние лектина Л11 Paenibacillus polymyxa 1460 in vivo на активность и завершенность процесса фагоцитоза бактерий: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica.

2. Изучить влияние лектина JUI P. polymyxa 1460 in vitro на активность и завершенность фагоцитоза бактерий.

3. Исследовать взаимодействие лектина JIII P. polymyxa 1460 с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов.

4. Оценить влияние лектина JUI P. polymyxa 1460 на кислородзави-симый и кислороднезависимый киллинг бактерий по активности щелочной и кислой фосфатаз, катионных белков, миелоперокси-дазы и образованию активных форм кислорода.

5. Изучить влияние лектина ЛИ P. polymyxa 1460 на содержание гликогена и липидов в макрофагах при фагоцитозе бактерий.

6. Провести сравнительный анализ изменения фагоцитарной и метаболической активности перитонеальных и альвеолярных макрофагов на фоне действия лектина ЛИ P. polymyxa 1460.

Научная новизна. Впервые in vivo и in vitro изучено влияние лектина ЛИ, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий P. polymyxa 1460, специфичного к галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе-1,6-дифосфату, глюкозамину, на активность и завершенность процесса фагоцитоза бактерий: S. aureus 100 б, Е. coli Са 53, Y. enterocolitica 29582. Показано, что лектин ЛИ P. polymyxa 1460 усиливает адгезивную функцию фагоцитирующих клеток, приводя к эффекту перенасыщения фагоцитов бактериями.

Впервые показана специфичность взаимодействия лектина JIII P. polymyxa 1460 с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов.

Проведена оценка механизмов кислородзависимого и кислороднезависи-мого киллинга бактерий макрофагами. Показано, что лектин не нарушает метаболический статус и энергетический обмен клеток.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов активации одного из основных факторов естественной резистентности - фагоцитоза, исход которого во многом определяет развитие специфических иммунологических реакций организма.

По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Изучение влияния лектинов бацилл на активность процесса фагоцитоза патогенных бактерий» (в соавторстве с Е.И. Тихомировой, Е.С. Му-хачевой и JI.B. Карпуниной, 2004) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области микробиологии и иммунологии, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 2 от 4 ноября 2003 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова, Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского, Саратовском государственном техническом университете при выполнении курсовых и дипломных работ, а также при чтении лекций по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского государственного аграрного университетеа им. Н.И. Вавилова и при чтении лекций по курсу «Молекулярная иммунология» для студентов биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лектин ЛИ P. polymyxa 1460 in vivo и vitro усиливает адгезивную способность фагоцитирующих клеток, приводит к эффекту перенасыщения фагоцитов бактериями, но не влияет на завершенность фагоцитоза.

2. Лектин ЛИ P. polymyxa 1460 специфически взаимодействует с поверхностными структурами альвеолярных и перитонеальных макрофагов, изменяя их функционально-метаболическую активность.

3. Лектин Ш1 P. polymyxa 1460 in vitro влияет на активность отдельных микробоцидных факторов в цитоплазме нефагоцитирующих макрофагов, но не изменяет активность кислородзависимого и кислородне-зависимого киллинга бактерий макрофагами.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически активных веществ (лекти-нов) в регуляции метаболизма растений и животных» и при частичной поддержке грантом РФФИ 45434 - программой «Развития научного потенциала высшей школы, раздел развития научно-исследовательской работы молодых преподавателей, научных сотрудников, аспирантов, студентов» (2005).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на конференциях: Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Россия, Санкт-Петербург, 2002); межрегиональной научной конференции молодых ученых аграрных вузов, НИИ и ИПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов, СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2003); объединенном иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004); второй региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Россия, Саратов, ИБФРМ РАН, 2004); конференции профессорскопреподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2004 год (Саратов, СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005); 7th John Humphrey advanced summer programme in immunology «The interface between immunology and medicine» (Россия, Москва, 2005); региональной конференции молодых ученых «Вавилов-ские чтения - 2005» (Саратов, СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 14 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных материалов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 145 страницах, иллюстрирована 31 рисунком и содержит 16 таблиц. Список использованных литературных источников включает 138 наименований, в том числе 52 зарубежных.

выводы

1. Установлено влияние лектина JUI P. polymyxa 1460 in vivo на активность макрофагов при фагоцитозе бактерий: Staphylococcus aureus 100 б, Escherichia coli Са 53, Yersinia enterocolitica 295-82. Введение лектина в концентрации 0,4 мкг/мл белым мышам увеличивало адгезивную способность макрофагов, не влияя существенно на завершенность процесса фагоцитоза бактериальных клеток.

2. Лектин ЛИ в концентрации 0,04 мкг/мл при действии in vitro на макрофаги мышей усиливал процесс адгезии и поглощения бактерий S. aureus 100 б, однако процесс фагоцитоза завершался гибелью большинства макрофагов. Снижение концентрации лектина до 0,004 мкг/мл незначительно усиливало адгезию макрофагами бактериальных клеток, но не влияло на завершенность процесса фагоцитоза Е. coli Са 53 и Y. enterocolitica 295-82.

3. Показана возможность специфического прикрепления лектина ЛИ к поверхностным структурам макрофагов. Использование в аналогичных условиях белка нелектиновой природы - BSA не приводило к усилению адгезии макрофагами бактериальных клеток. При действии лектина ЛИ, блокированного специфичными углеводами фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов не изменялась по сравнению с контролем, у альвеолярных макрофагов - увеличивалась.

4. Показано влияние лектина ЛИ P. polymyxa 1460 на активность отдельных микробоцидных факторов в цитоплазме нефагоцитирующих макрофагов. Выявлено увеличение активности миелопероксидазы и кислой фосфатазы, усиление образования активных форм кислорода в альвеолярных макрофагах; увеличение содержания катионных белков и снижение активности щелочной фосфатазы в перитонеальных макрофагах.

5. Установлено, что лектин JHI не оказывал влияния in vitro на активность кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий макрофагами.

6. Показано, что лектин JIII P. polymyxa 1460 способствовал увеличению содержания гликогена и липидов в интактных перитонеальных макрофагах по сравнению с контролем (в 1,3 раза), а при фагоцитозе бактериальных клеток запас этих соединений оставался на постоянном уровне.

7. Выявлены различия в фагоцитарной и метаболической активности перитонеальных и альвеолярных макрофагов на фоне действия лектина JIII in vitro и in vivo: ПМФ были более активны в процессе фагоцитоза разных видов бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время одним из перспективных направлений в современной микробиологии является лектинология. Лектины представляют собой широко распространенные в природе высокоспецифичные углеводсвязывающие белки неиммуного происхождения. Активные центры лектина избирательно связываются с остатками определенных моносахаридов, входящих в состав углево-дсодержащих биополимеров и такое углевод-белковое взаимодействие лежит в основе образования различных ассоциаций на разном уровне развития живого (Лахтин, 1992, 1994; Линевич, 1979; Карпунина, 2002, 2005; Никитина В.Е., 2001, 2005). В связи с этим знания роли этих соединений важны как в фундаментальном, так и прикладном плане. Особый интерес представляют работы связанные с изучением их роли в метаболизме животных.

В литературе имеются данные о том, что патогенные бактерии благодаря поверхностным лектинам взаимодействуют с перитонеальными макрофагами человека, крысы и белых мышей и полиморфноядерными лейкоцитами человека. Такое взаимодействие приводит к активации фагоцитирующих клеток, поглощению и киллингу бактерий. Добавление специфичных Сахаров ингиби-рует связывание бактерий с фагоцитирующими клетками, в результате чего снижается их активность (Ofek et al., 1995; Engel, 1999; Baorto, Dustin, Abraham, 1996; Sofer, Gilboa-Garber, 1996). В настоящее время выделяют 4 варианта лектинопосредованных контактов между бактериями и фагоцитами: 1) лектиноподобный рецептор принадлежит фагоциту, а терминальный (ре-цептируемый) углевод - бактериям; 2) обратная ситуация - лектин несут бактерии, а углевод - фагоциты; 3) сочетание обоих вариантов в одной системе; 4) связка между углеводными остатками фагоцита и мишени через «посторонний» лектин-посредник (Sharon, 1976; Маянский и др., 1986; Ofek et al., 1995).

Сведения о влиянии лектинов, полученных из непатогенных бактерий, на фагоцитирующие клетки практически отсутствуют. В тоже время представляется перспективным в прикладном аспекте использование именно этих лектинов для возможной коррекции активности фагоцитов при развитии инфекционного процесса. Получение лектинов из непатогенных бактерий с точки зрения организации биотехнологического процесса безопасно и более экономично.

Вопросы, связанные с изучением активности фагоцитирующих клеток и их значении в защите макроорганизма от различных бактерий, традиционно относятся к классической противоинфекционной иммунологии.

Известно, что иммунитет подразделяется на естественный, иннатальный или врожденный, с одной стороны, и приобретенный или адаптивный, с другой. При этом основными свойствами естественного в отличие от приобретенного иммунитета всегда считалась быстрая реакция на чужеродные агенты и полное отсутствие какой-либо специфичности ответа. Данные, полученные в последние годы, заставляют совершенно по-новому взглянуть на роль механизмов естественной резистентности, лежащих в основе врожденного иммунитета. (Colonna et al., 2002; Godfrey et al., 2004). На настоящий момент стало совершенно очевидно, что эффекторы естественной резистентности способны различать свои и потенциально опасные для организма чужеродные структуры (Luster, 2002). Доказано также, что система естественной резистентности выполняет инструктивную функцию, определяя в каком направлении будет развиваться приобретенный иммунитет (Fearon, Locksley, 1996).

Активация клеток естественного иммунитета вызывается консервативными структурами патогенных микроорганизмов (Harding et al., 2003), которые распознаются целой серией разнообразных рецепторов (Greenberg, Grinstein, 2002). В процессе эволюции у фагоцитов выработались рецепторы, распознающие молекулярные структуры, ассоциированные с возбудителем. С.A. Janeway (1997) назвал их PAMPs рецепторами, распознающими структуру возбудителя (PRR), которые могут находиться на клетках (интегрины CD 14) и в составе сывороточных белков. Прежде всего, это лектиновые рецепторы и scavenger-рецепторы (рецепторы для производных лигандов сиаловых кислот), которые реагируют на пептидогликан, зимозан, липопептиды, ЛПС, фибронектин, флагеллин, вирусную и бактериальную ДНК (Underbill, Ozin-sky, 2002; Akira, 2003). Кроме того, на макрофагах активизируются CD40, В7, MHC-I/II, CD115-рецептор для фактора роста моноцитов M-CSF (моноцит-колониестимулирующий фактор) и CD 163, рецептор для «хвостов» (Fc-фрагмент) IgG - FcyRI (Ройт и др., 2000). Сигналом для активации клеток системы естественной резистентности может служить также изменение экспрессии собственных антигенов МНС и родственных им молекул (Spada et al., 2002; Vivier et al., 2002).

Фагоцитоз занимает особое место среди факторов естественной резистентности. Явление фагоцитоза стало предметом изучения, а затем и методом исследования функции фагоцитирующих клеток, благодаря работам И.И. Мечникова.

Известно, что способностью к фагоцитозу обладают две популяции клеток: микрофаги (гранулоциты периферической крови) и макрофаги (моноциты крови и тканевые мононуклеары). Первыми на антигены, проникшие в организм или собственного организма, реагируют нейтрофильные лейкоциты, которые по определению И.И. Мечникова (1892) «являются наиболее деятельными клетками организма». Не менее важная роль в осуществлении фагоцитоза принадлежит мононуклеарной фагоцитарной системе, которая включает моноциты мозга и крови, свободные и фиксированные тканевые макрофаги (Фрейдлин, 1984; Тотолян, 2000). Макрофаги отличаются целым рядом признаков: количеством рецепторов для Fc-фрагментов IgG, IgM, IgE; компонентов комплемента СЗб, СЗа, С5а; эндотоксинов, лектинов и других факторов, а также хемотаксической и бактерицидной активностью (Логинов и др., 1986). На тканевых макрофагах есть рецептор, связывающий маннозу, которого нет на нейтрофилах.

Гетерогенность макрофагов определяется их источником, локализацией, органотипичностью. Примером межпопуляционной гетерогенности могут служить альвеолярные, перитонеальные макрофаги, моноциты крови. Внутри одной популяции гетерогенность макрофагов обусловлена разной степенью их зрелости, функциональной активности, так как они могут находиться в состоянии покоя или активации (Doughterty et al., 1984), а также стадией диффе-ренцировки и пролиферативной активностью (Фирстова, 1998).

Фагоцитоз начинается с взаимодействия между клеткой-фагоцитом и микроорганизмом. Это взаимодействие происходит по типу рецептор — лиганд и инициирует процесс поглощения, активируя «мускулатуру» или двигательный аппарат фагоцита. Взаимодействие микроорганизма с цитоплазматиче-ской мембраной фагоцита инициирует образование псевдоподий, которые, окружая микроорганизм, сливаются между собой, формируя фагосому. В дальнейшем киллинг и переваривание микроорганизмов происходят именно в фа-госомах при условии, что последние успешно сливаются с лизосомами, образуя фаголизосому (Сепиашвили, 2002). Имеющиеся в литературе научные данные свидетельствуют о том, что фагоциты обладают мощными бактерицидными системами: кислородзависимой и кислороднезависимой. Компоненты первой действуют неспецифично, разрушают грамположительные и гра-мотрицательные бактерии, вирусы и клетки организма-хозяина, включая сами фагоциты. Вторая система состоит из множества белков и пептидов, обладающих в разной степени выраженной антимикробной активностью по отношению к различным клеткам-мишеням. Один из таких белков — бактерицидный, усиливающий проницаемость белок (B/PI), который действует лишь на грамотрицательные бактерии, содержащие ЛПС. Известны также CLCP (хе-мотрипсиноподобный катионный белок) и дефенсины. Неферментные кати-онные белки являются одним из мощных факторов неспецифической защиты организма, т.к. обладают сильным антибактериальным действием и выполняют функцию нейтрализации и умерщвления фагоцитированных бактерий (Тотолян и др., 2000).

К другим белкам, обладающим антимикробным действием, относится фермент миелопероксидаза (или вердопероксидаза, благодаря зеленому цвету при окраске). Это ферментный железосодержащий катионный белок, который вместе с перекисью водорода и галоидами образует мощную миелоперокси-дазную систему фагоцитов. Существует несколько концепций о системах регенерации перекиси водорода в покоящихся и фагоцитирующих нейтрофилах. Согласно одной из них, ведущей системой регенерации перекиси водорода является НАДФ-Н2-оксидазная система (Ройт и др., 2000).

Следует отметить также, что кроме антибактериального действия миело-пероксидазная система обладает и антитоксической функцией. Таким образом, фагоциты имеют на вооружении «мощную миелопероксидазную систему с многогранным спектром действия». Исследованию состояния микробицид-ных систем уделяется в последние годы особое внимание, поскольку показана их важная роль в обеспечении фагоцитарной реакции, а также определенные возможности в диагностике и прогнозировании инфекционной и неинфекционной патологии (Коротяев, Бабичев, 2002).

Несмотря на неспецифичность самого фагоцитарного акта, фагоциты принимают участие в подготовке антигенов и переработке их в иммуноген-ную форму. Кроме того, они участвуют в кооперации Т- и В-лимфоцитов, необходимой для инициирования иммунного ответа. Таким образом, фагоциты принимают участие и в специфических формах реагирования на чужеродные субстанции (Пинегин, 2000).

Актуальность изложенных выше проблем определила цель нашего диссертационного исследования - изучить влияние лектина Л11 Paenibacillus polymyxa 1460 на функционально-метаболическую активность макрофагов в процессе фагоцитоза бактерий. В ходе решения поставленных задач нами было показано влияние лектина ЛИ, специфичного к галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе- 1,6-дифосфату и глюкозамину, in vivo и in vitro на активность и завершенность процесса фагоцитоза бактерий.

Введение лектина белым мышам в концентрации 0,4 мкг/мл внутрибрю-шинно увеличивало активность перитонеальных макрофагов во все сроки иммуногенеза при фагоцитозе стафилококков, а именно, усиливало адгезию макрофагами бактерий и продлевало активацию до завершающих этапов процесса. Можно предположить, что лектин, взаимодействуя с поверхностными структурами ПМФ, способствует более длительному процессу адгезии ими бактериальных клеток при фагоцитозе. Активность АМФ во все сроки исследования после введения мышам лектина достоверно не отличалась от активности контрольных макрофагов в процессе фагоцитоза клеток S. aureus 100 б.

И для АМФ и для ПМФ, выделенных из организма мышей, иммунизированных лектином JIII P. polymyxa 1460, был характерным незавершенный фагоцитоз стафилококков независимо от срока исследования.

Аналогично не было отмечено достоверного влияния лектина и на завершенность процесса фагоцитоза Е. coli Са 53 и Y. enterocolitica 295-82 перито-неальными макрофагами во все сроки иммуногенеза. Усиление фагоцитарной активности и частичного переваривания эшерихий АМФ сопровождалось разрушением значительного их числа к 6 часам инкубации с бактериями. Показано, что макрофаги иммунизированных лектином мышей отличались от макрофагов интактных животных при фагоцитозе бактерий повышенной адгезивной способностью не зависимо от вида бактериальных клеток. Динамика активности ПМФ и АМФ во все сроки исследования после действия лектина in vivo была практически аналогичной контрольным макрофагам в процессе фагоцитоза in vitro разных штаммов бактерий. При этом ПМФ были более активными в процессе фагоцитоза стафилококка и эшерихий, чем АМФ. В процессе фагоцитоза иерсиний активность и ПМФ, и АМФ была сходной на всех этапах фагоцитоза. Полученные результаты позволили сделать заключение, что лектин Ш1 P. polymyxa 1460 при введении в организм экспериментальных животных усиливает адгезивную способность макрофагов, но не оказывает существенного влияния на завершенность фагоцитоза разных штаммов бактерий.

На следующем этапе было изучено взаимодействие лектина ЛИ P. polymyxa 1460 на клеточном уровне с макрофагами белых мышей в культуре in vitro. Проведенные исследования показали, что лектин ЛИ в концентрации 0,04 мкг/мл усиливал адгезию и поглощение макрофагами мышей в процессе фагоцитоза S. aureus 100 б. Однако активизация начальных стадий фагоцитоза завершалась гибелью большинства макрофагов. Данный факт был связан нами с возможно большой дозой лектина для исследований in vitro. Поэтому для дальнейших исследований использовали лектин ЛИ в концентрации 0,004 мкг/мл.

В процессе исследований было обнаружено незначительное усиление адгезии макрофагами бактериальных клеток Е. coli Са 53 и Y. enterocolitica 29582 и отсутствие влияния на завершенность процесса фагоцитоза на фоне действия in vitro лектина.

Для оценки специфичности взаимодействия лектина с макрофагами были проведены аналогичные эксперименты с белком нелектиновой природы — БСА и лектином, блокированном специфичными углеводами. Показано, что динамика активности макрофагов в процессе фагоцитоза in vitro бактерий на фоне действия БСА была аналогичной таковой у интактных макрофагов и обработанных лектином, но при этом БСА не усиливал адгезию макрофагами бактериальных клеток. Данный факт позволил сделать вывод о специфичности взаимодействия лектина ЛИ с поверхностными структурами макрофагов.

При моделировании процесса фагоцитоза in vitro бактерий макрофагами, обработанными лектином, блокированном специфичными углеводами, было отмечено некоторое повышение фагоцитарной активности макрофагов, особенно АМФ, по сравнению со всеми ранее полученными данными. Аналогичные результаты были получены и рядом других авторов, которые показали неполное подавление бактериальной адгезии при использовании углеводов для торможения реакции взаимодействия макрофагов с бактериями, имеющими пилийные адгезины (Sharon, 1976; McArtur, Ceri, 1983). Это доказывает многофакторную природу рекогносцировочных реакций. В них сочетаются комплементарность различных структур фагоцита и бактерий, а также комплекс неспецифических реакций - гидрофобных, электростатических и др. (Маянский и др., 1986). Следовательно, можно предположить, что на молекулярном уровне лектин ЛИ P. polymyxa 1460 помимо специфического взаимодействия с рецепторными структурами макрофагов может участвовать и в различных неспецифических реакциях.

В дальнейших исследованиях было изучено влияние лектина ЛИ in vitro на активность киллинга бактерий макрофагами в процессе фагоцитоза. Для оценки кислородзависимого киллинга определяли активность миелопероксидазы и уровень образования синглетного кислорода по показателям спонтанного и индуцированного НСТ-теста в макрофагах в процессе фагоцитоза in vitro бактериальных клеток. Показано, что лектин ЛИ увеличивает активность миелопероксидазы в интактных нефагоцитирующих альвеолярных макрофагах, но не оказывает достоверного влияния на активность данного фермента в макрофагах при фагоцитозе бактерий.

Известно, что миелопероксидаза локализуется непосредственно на клеточных стенках бактерий, находящихся в фагоцитарной вакуоли (Ройт, Бро-стофф, Мейл, 2002). Бактерицидное действие миелопероксидазы проявляется при наличии в среде перекиси водорода и галоидов, создающих миелоперок-сидазную систему. Поэтому механизм бактерицидного действия этой системы связывают с галогенизированием белков бактерий, в частности, аминокислот. В бактерицидной миелопероксидазной системе «галогенизацию» бактерий могут осуществлять иодиды, бромиды и хлориды. Если система миелоперок-сидаза-Н202-бромид проявляет антимикробную активность за счет бромиро-вания поглощенных бактерий, то антимикробная активность системы миелопероксидаза-Н202-хлорид осуществляется за счет перокислительного дезами-нирования и декарбоксилирования аминокислот микроорганизмов (Арнхольд, 2004). Необходимым условием для активации системы является наличие в среде перекиси водорода, содержание которой напрямую связано с активностью образования синглетного кислорода в макрофагах.

В наших исследованиях содержание активных форм кислорода в макрофагах оценивали по показателям спонтанного НСТ-теста. Отмечено достоверное увеличение этого показателя у АМФ на фоне действия лектина in vitro по сравнению с ПМФ и контрольными значениями. В тоже время, аналогичные данные были получены при действии на альвеолярные макрофаги БСА и лектином, блокированным смесью специфичных углеводов.

Содержание активных форм кислорода в фагоцитирующих макрофагах оценивали по показателям индуцированного НСТ-теста. В наших исследованиях не было выявлено достоверного влияния лектина Jill P. polymyxa 1460 на интенсивность «респираторного взрыва» в макрофагах при фагоцитозе бактерий Е. coli Са 53 и Z enterocolitica 295-82. Такие же показатели индуцированного НСТ-теста были получены и при действии на фагоцитирующие макрофаги BSA. Для макрофагов, обработанных лектином, блокированным смесью специфичных углеводов, отмечено снижение показателей индуцированного НСТ-теста, что свидетельствовало об угнетении активности кислородзависимого киллинга бактерий. При фагоцитозе клеток S. aureus 100 6 перитонеаль-ными макрофагами, обработанными лектином JHI, показатели активности киллинга достоверно отличались от контрольных значений.

В дальнейшем было изучено влияние лектина ЛИ P. polymyxa 1460 in vivo на активность механизмов кислородзависимого киллинга бактерий макрофагами по показателям индуцированного НСТ-теста. Отмечено увеличение этих показателей по сравнению с контролем для АМФ, выделенных на 1 сутки после введения мышам лектина. В последующие сроки исследования активность кислородзависимого киллинга АМФ при фагоцитозе in vitro бактерий была на уровне контрольных значений.

Наибольшие показатели индуцированного НСТ-теста были отмечены для ПМФ, выделенных на 7 сутки после введения мышам лектина, однако, эти значения соответствовали контрольным показателям. В фагоцитирующих ПМФ, выделенных из организма мышей в другие сроки исследования, показатели активности механизмов кислородзависимого киллинга были ниже контрольных значений.

Таким образом, лектин ЛИ P. polymyxa 1460 на организменном уровне оказывал незначительное влияние на кислородзависимый киллинг бактерий макрофагами. На клеточном уровне достоверного влияния лектина на кислородзависимый киллинг бактерий в фагоцитирующих макрофагах отмечено не было. Показано, что лектин ЛИ увеличивал показатели спонтанного НСТ-теста и активность миелопероксидазы при действии на интактные нефагоци-тирующие альвеолярные макрофаги.

Для оценки влияния лектина in vitro на кислороднезависимый киллинг определяли содержание в макрофагах щелочной и кислой фосфатаз и количество катионных белков в процессе фагоцитоза бактериальных клеток S. aureus 100 б.

Установлено, что лектин ЛИ увеличивал активность кислой фосфатазы в интактных нефагоцитирующих АМФ, но не оказывал достоверного влияния на активность данного фермента при фагоцитозе бактерий. В тоже время этот лектин снижал активность щелочной фосфатазы как в интактных, так и в фагоцитирующих ПМФ, но не влиял на активность данного фермента в АМФ.

Показано, что обработка макрофагов лектином ЛИ способствовала увеличению содержания катионных белков в цитоплазме ПМФ и не влияла на их содержание в интактных АМФ. При фагоцитозе бактерий как АМФ, так и ПМФ на фоне действия лектина уровень катионных белков достоверно не отличался от показателей интактных макрофагов. Следовательно, лектин ЛИ

P. polymyxa 1460 способствовал усилению активности отдельных микробо-цидных факторов преимущественно в альвеолярных макрофагах, но не влиял на кислороднезависимый киллинг бактерий.

Известно, что бактерицидное действие катионных белков основано на нарушении структуры и функции мембран микробной клетки, и начинается с их электростатического взаимодействия с анионными компонентами фагоцитированной бактериальной стенки. Бактерии с измененной жизнеспособностью могут подвергаться дальнейшему воздействию лизосомальных ферментов (Тотолян и др., 2000). В литературе имеются данные, показывающие си-нергический антимикробный эффект миелопероксидазы и катионных белков. Кооперативный эффект является, по-видимому, следствием того, что катион-ные белки нарушают проницаемость клеточной стенки бактерий и способствуют проникновению миелопероксидазы в бактериальную клетку, где она и осуществляет широкий спектр ферментативных реакций, ведущих к снижению жизнедеятельности микроба и его умерщвлению. Следует особо подчеркнуть, что при недостаточности миелопероксидазы резко снижается переваривающая функция клетки.

Для оценки влияния лектина JUI P. polymyxa 1460 на метаболическую активность макрофагов нами были проведены эксперименты по определению количества гликогена и липидов в цитоплазме этих клеток в процессе фагоцитоза S. aureus 100 6.

Отмечено лишь небольшое увеличение содержания гликогена в цитоплазме нефагоцитирующих ПМФ на фоне действия лектина, для АМФ подобный эффект установлен не был. Было обнаружено достоверное увеличение содержания гликогена в цитоплазме ПМФ только через 3 часа инкубации с бактериями на фоне действия лектина. У АМФ в аналогичных условиях содержание гликогена не изменялось. Изучение содержания липидов в цитоплазме ПМФ выявило достоверное увеличение через 3 и 6 часов инкубации с бактериями на фоне действия лектина по сравнению с фагоцитирующими макрофагами без лектина. Полученные данные совпадают с данными фагоцитарной активности макрофагов на фоне действия лектина, когда через 6 часов инкубации с бактериями было отмечено значительное количество активных макрофагов, хотя процесс фагоцитоза был незавершенным.

Согласно литературным данным, общепризнанным является факт снижения содержания гликогена и липидов при фагоцитозе макрофагов (Назарова, Вапидов, 1980; Cannon, Swanson, 1992; Rabinovitch, 1995; Фаллер, Шилдс, 2003). Полученные нами данные свидетельствовали о том, что, лектин JIII P. polymyxa 1460 способствовал небольшому увеличению энергетических запасов (гликогена и липидов) в интактных перитонеальных макрофагах и их поддержанию на стабильном уровне в динамике процесса фагоцитоза бактериальных клеток.