Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетическую регуляцию транскрипции



На правах рукописи

ШАЛГИНСКИХ НАТАЛЬЯ АНДРЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ КАНЦЕРОГЕННЫХ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ КСЕНОБИОТИКОВ НА ЭПИГЕНЕТИЧЕСКУЮ РЕГУЛЯЦИЮ ТРАНСКРИПЦИИ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ОКТ 2014

Москва-2014

005553317

005553317

«Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина»

Российской академии медицинских паук

Директор - академик РАН и РАМН Михаил Иванович Давыдов

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Якубовская Марианна Геннадиевна

НИИ Канцерогенеза

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Сычева Людмила Петровна, ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минзрава России, Москва

кандидат медицинских наук Иевлева Аглая Геннадиевна, научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «НИИ онкологии им.Н.Н.Петрова» Минзрава России, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук, г.Москва

Защита диссертации состоится и?3ъ c~/U£tx<i/y 2014 года в часов

на заседании диссертационного совета Д 001.017.(Й Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте шутJonc.ru

Автореферат разослан <

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Химические канцерогены являются одним из самых распространенных этиологических факторов онкологических заболеваний человека. Наряду с индукцией повреждений структуры ДНК, они могут влиять на процессы метилирования ДНК, модификации гистонов и РНК-интерференции, вызывая изменения эпигенетической регуляции экспрессии генов. Такие изменения, в свою очередь, приводят к нарушению механизмов регуляции большинства биологических процессов: клеточной дифференцировки, пролиферации, репарации ДНК и апоптоза, что в конечном итоге вызывает опухолевую трансформацию и способствует опухолевой прогрессии. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что помимо канцерогенных соединений эпигенетически активными являются также противоопухолевые препараты, относящиеся к алкилгалогенидам, алкенам, эпоксисоединениям. Они способны необратимо ингибировать метилтрансферазы, эпигенетически модулируя экспрессию генов. Имеются также отдельные данные о влиянии некоторых химиопрепаратов на состояние гистонов, что играет большую роль в репарации повреждений ДНК, обеспечивая эффективность комбинированной химиотерапии. Однако, несмотря на активное развитие исследований отдельных эпигенетических изменений в процессе канцерогенеза и при проведении химиотерапии, проблема оценки эффектов химических соединений на реактивацию эпигенетически репрессированных генов изучена недостаточно. Таким образом, изучение влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. Помимо более детального понимания молекулярных механизмов влияния ксенобиотиков на системы эпигенетической регуляции генов, данное исследование представляется целесообразным в плане определения новых стратегий создания химиотерапевтических препаратов, а также скрининга потенциально опасных вновь синтезированных химических соединений.

Основные цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на процессы эпигенетической регуляции экспрессии генов.

В соответствии с основной целью нашего исследования были поставлены следующие

задачи:

1. Оценить возможность использования модельной системы, представляющей собой субпопуляцию HeLa клеток, несущую ретровирусный вектор с эпигенетически репрессированным репортерным геном зеленого флуоресцентного белка GFP, для скрининга химических соединений на способность реактивировать экспрессию генов.

2. Провести скрининг химических канцерогенов и химиотерапевтических препаратов на способность реактивировать экспрессию генов на данной модельной системе.

3. Оценить эффекты канцерогенов и химиотерапевтических препаратов, вызвавших реактивацию экспрессии GFP, на метилирование ДНК.

4. Исследовать влияние канцерогенов и химиотерапевтических препаратов на модификации гистонов.

5. Изучить влияние соединений, оказавших реактивирующее действие на экспрессию GFP, на активность отдельных факторов эпигенетической регуляции экспрессии генов.

Научная новизна. В данном исследовании впервые был предложен метод скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на модельной системе клеток человека, несущих эпигенетически репрессированный ретровирусный геном, содержащий флуоресцентный белок GFP. В результате скрининга был исследован эффект широкого ряда химических и противоопухолевых ксенобиотиков на реактивацию транскрипции эпигенетически репрессированных генов, исследовано их влияние на гистоновые модификации и метилирование ДНК. Впервые продемонстрированы эпигенетические эффекты противоопухолевых препаратов Bortezomib, MLN4924, Mimosine, Bleomycin. Также было показано, что реактивацию экспрессии генов способны вызывать соединения класса узкобороздочных лигандов, что является одним из первых экспериментальных свидетельств влияния соединений Hoechst 33342 и Hoechst 33258 на модификации гистонов и метилирование ДНК. Впервые был показан синергизм действия данных соединений в различных комбинациях с эпигенетическими препаратами (трихостатином-А (TSA) и 5-азацитидином (5-azaC)).

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования. На основании результатов настоящего исследования было расширено понимание механизмов химического канцерогенеза, в частности, для Bleomycin, известного генотоксического

агента, вызывающего двунитевые разрывы, выявлена способность к эпигенетической регуляции экспрессии генов. Также в работе был оптимизирован метод быстрого скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков, позволяющий выявлять соединения, вызывающие значимую реактивацию экспрессии эпигенетически репрессированных генов. Оценка влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетические механизмы регуляции генов может послужить руководством к выбору стратегий синтеза новых химиотерапевтических препаратов и разработки путей их внедрения в клинику.

Положения, выносимые на защиту:

• Модельная клеточная линия HeLa-TI, несущая эпигенетически репрессированный ретровирусный геном, содержащий зеленый флуоресцентный белок GFP, является адекватной системой для быстрого скрининга химических соединений на способность реактивировать эпигенетически репрессированные гены.

• В ходе скрининга широкого ряда химических соединений в их механизме действия выявлен эпигенетический эффект, приводящий к реактивации эпигенетически репрессированных генов как путем изменения профиля метилирования ДНК, так и путем различных охарактеризованных в работе модификаций гистонов.

• Принадлежащие к группе узкобороздочных лигандов соединения Hoechst 33258 и Hoechst 33342, отличающиеся лишь заместителями в пара-положении фенильного кольца, реактивируют экспрессию эпигенетически репрессированных генов по различным механизмам: Hoechst 33258 - за счет снижения метилирования ДНК в промоторной области гена и увеличения уровня ацетилирования гистонов НЗ/Н4, а Hoechst 33342 - только путем изменения модификаций гистонов, без влияния на метилирование ДНК.

Апробация работы и публикации. Диссертация апробирована и рекомендована к защите 4 июля 2013 года на совместной научной конференции отделов химического канцерогенеза, трансформирующих генов опухоли, эпидемиологии и профилактики опухолей и лабораторий вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, генетики опухолевых клеток, молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 6 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Список литературы содержит 348 литературных источников, в том числе 8 в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы следующие методы: выделение ДНК/РНК, клонирование ДНК в бактериальные штаммы, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, трансфекция, иммуноблотинг, флуоресцентная микроскопия, проточная цитофлуориметрия, количественная ПЦР в реальном времени и метилчувствительная ПЦР, метод иммунопреципитации хроматина (ChIP), бисульфитного секвенирования и иммуноферментный анализ (ELISA), статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика модельной системы

1.1. Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических ингибиторов эпигенетических факторов

На основании опубликованного ранее явления эпигенетической репрессии генома вируса саркомы птиц в человеческих клетках [Katz, Jack-Scott et al., 2007], была разработана модельная система, представляющая собой популяцию клеток HeLa, несущую транскрипционно-молчащий ретровирусный вектор с репортерным геном зеленого флуоресцентного белка (GFP) [Poleshko, Einarson et al., 2010]. Основным признаком подавления транскрипции гена GFP в модельной системе клеток HeLa-TI является сохранение GFP-отрицательного фенотипа клеток, в то время как реактивация транскрипции сопровождается накоплением в них флуоресцентного белка GFP, что позволяет оценивать уровень экспрессии методом проточной цитофлуориметрии.

Клеточная линия HeLa-TI представляет собой смешанную популяцию клеток,

содержащих различные сайты интеграции провируса. Таким образом, одной из проблем корректной оценки реактивирующего действия химических ингибиторов эпигенетических факторов в этой модельной системе является влияние «позиционного эффекта». Для оценки влияния сайтов интеграции мы провели сравнение степени реактивации гена GFP в родительской популяции HeLa-TT и в отдельных клонах, содержащих только одну копию провируса с разными положениями интеграции. Анализ проводили методом проточной цитофлуориметрии после обработки трихостатином-А (TSA) для оценки ингибирования гистоновых деацетилаз или 5-азацитидином (5-azaC) для оценки ингибирования ДНК-метилтрансфераз. Наблюдаемая реактивация экспрессии гена GFP после добавления TSA или 5-azaC для родительской популяции клеток представляла собой усредненный уровень реактивации по сравнению с отдельными клонами, что позволило в дальнейшем пренебречь влиянием отдельных сайтов интеграции провируса на реактивацию транскрипции гена GFP.

1.2. Определение гистоновых модификаций на промоторе и гене GFP Для оценки возможности дальнейшего использования полученной модельной системы для скрининга химических соединений на эпигенетическую активность, было необходимо оценить влияние различных механизмов эпигенетической репрессии. Реактивация транскрипции гена GFP после применения TSA свидетельствует о прерывании эпигенетической репрессии в модельной системе, вызванной изменениями модификаций гистонов, в частности, ацетилированием. Однако известно, что TSA имеет широкий спектр ингибирования гистоновых деацетилаз 1-го и Н-го класса - белков, ответственных за данную модификацию [Barski, Cuddapah et al., 2007]. Для точного определения гистоновых деацетилаз, вовлеченных в эпигенетическую репрессию, мы использовали метод РНК-интерференции. За счет деградации матричной РНК белка после взаимодействия со специфической миРНК происходила реактивация транскрипции гена GFP. Для белка HDAC1 реактивация достигала 60% (Рисунок 1А), что свидетельствовало о вовлечении данного фактора в процесс эпигенетического подавления транскрипции. Для подтверждения специфичности метода нокдауна посредством миРНК относительно белков одного семейства со схожей молекулярной структурой и специфичности вовлечения белка

Н0АС1 в процесс эпигенетической репрессии были проанализированы другие представители данного семейства (ШЭАС2 и 1ГОАСЗ) (Рисунок 1В).

□ САРОНр ВСРРр ■ СРРЙЭ

||

в Не1_а-Т1

Ро1 II НЗКЭтеЗ Н4К20теЗ НЗас Н4ас

НГОАС1

НЮАС2

НОАСЗ

10 10 10 10 10 РИ-Н

10" 10' 1<? 10" 10 РИ-Н

Л?

10 10 10 10 10 РИ-Н

гб О / #

/

-о

•у ^

/

/

10 10 10 10 10 РИ-Н

£ Л / ^ # *

/ /

Рисунок 1 Участие гистоновьгх модификаций на промоторе и гене СКР в регуляции транскрипции. (А) Уровень экспрессии гена ОБР представлен в % ОРР-положительных клеток после нокдауна гистоновой деацетилазы-1 (РЮАС1) и гистоновьгх метилтрансфераз (КМТ1Е и КМТ5С). (Б) Анализ модификаций гистонов на промоторах генов ОРР и ОАРБН методом иммунопреципитации хроматина. Результаты ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к промоторным областям генов вАРОН (ОАРОНр) и вИР (ОРРр), а также к области, содержащей сайт старта транскрипции гена ОРР (ОРРйэ). Линии погрешности отражают значения стандартного отклонения. (В) Данные проточной цитофлуориметрии, отражающие степень реактивации экспрессии гена гена ОРР в клетках НеЬа-Т1, и соответствующие им результаты иммуноблоттинга после нокдауна белков РГОАС1, НОАС2 и НОАСЗ с использованием миРНК. Для внутреннего контроля загрузки проводили инкубацию мембран с антителами к ОАРБН.

Эффективность и специфичность миРНК нокдауна исследуемых белков была продемонстрирована методом иммуноблоттинга (Рисунок 1В). Известно, что наряду с гистоновыми деацетилазами, в процессах эпигенетической регуляции транскрипции принимают непосредственное участие гистоновые метилтрансферазы. Триметилирование аминогрупп в положениях НЗК9теЗ и Н4К20теЗ ассоциировано с гетерохроматиновой областью и репрессией генов [Grunstein, 1997; Wolffe and Hayes, 1999]. Белковые факторы КМТ1Е и КМТ5С функционируют как гистоновые метилтрансферазы для НЗК9теЗ и Н4К20теЗ модификаций соответственно. Нами было продемонстрировано, что данные белки участвуют в поддержании эпигенетической репрессии гена GFP так, как и деацетилаза HDAC1: после нокдауна данных белков происходила реактивация транскрипции GFP (Рисунок 1А).

Для исследования паттернов эпигенетической репрессии ретровируса в клетках HeLa-TI, нами был проведен детальный анализ гистоновых модификаций в промоторной области гена GFP, в области сайта старта транскрипции. Оценка модификаций гистонов проводилась с использованием метода иммунопреципитации хроматина (ChIP) с антителами, распознающими различные модификации гистонов. Мы подтвердили наличие репрессорных гистоновых модификаций в интересующих нас областях гена GFP и его промотора, что также указывает на участие белковых факторов, ответственных за их образование в поддержании эпигенетического молчания (Рисунок 1Б). Дополнительно был проведен сравнительный анализ гистоновых модификаций в области LTR промотора в HeLa-TI и HeLa-TI-L клетках, несущих идентичный эпигенетически молчащий ген GFP в составе того же ретровирусного вектора, но при отсутствии внутреннего CMV промотора (Рисунок 2). Данный анализ позволил нам исключить влияние самого CMV промотора на механизмы эпигенетической регуляции, связанные с изменением гистоновых модификаций, поскольку обе модельные системы обладали одинаковым равномерным распределением гистоновых модификаций по всей длине интегрированного ретровирусного вектора.

Таким образом, нами было показано, что эпигенетическая репрессия GFP в составе интегрированного ретровирусного вектора обеспечивается за счет модификаций гистонов (НЗК9теЗ и Н4К40те), и осуществляющих эти модификации гистоновых деацетилаз (HDAC1) и метилтрансфераз (КМТ1Е и КМТ5С).

Рисунок 2 Схема распределения модификаций гистонов и участие привносящих их белков для различных ретровирусных систем.

1.3. Анализ метилирования ДНК интегрированного провируса Для оценки влияния метилирования ДНК на экспрессию репортерного гена GFP, входящего в состав интегрированного провируса, мы использовали субпопуляции HeLa-GFP(+) и HeLa-TI клеток, полученных в результате разделения по уровню экспрессии GFP общей родительской популяции инфицированных клеток HeLa. На рисунке ЗА представлено изменение профилей флуоресценции GFP в процессе сортировки клеток. Если при первом инфицировании клеток без сортировки профиль экспрессии GFP имеет широкий разброс, то при формировании популяции HeLa-TI в процессе сортировки экспрессия GFP снижается, в то время как для HeLa-GFP(+), наоборот, возрастает.

Поскольку известно, что метилирование ДНК промоторных областей генов приводит к эпигенетической репрессии последних [Brooks, Harkins et al., 2004], нами было проведено сравнение уровня метилирования промоторной области LTR (Рисунок ЗВ), а также фрагмента гена GFP (Рисунок ЗГ) в культуре клеток HeLa-TI, содержащей эпигенетически инактивированный ген GFP, с уровнем метилирования в популяции клеток HeLa-GFP(+), активно экспрессирующих GFP.

A LTR метилирование

й j

1 г-

J

78%

1<Р 1ci 1<? l5 10* FL1-H

- HeLa-ТИ клетки, GFP(-)

— Инфицированные HeLa (без сортировки) -Инфицированные HeLa (GFP(+) клетки)

ASV LTR

HeLa-'

GFP(+) клетки: 27%

GFP rejH

-ОО-ОСССОСССССОСО*

HeLa-ТИ: 22%

GFP(+) клетки: 23%

юто'к^ютси

Рисунок 3 Влияние метилирования отдельных областей ДНК провируса на экспрессию GFP. (А) Сравнение профилей флюоресценции GFP в родительской популяции инфицированных клеток HeLa, а также в субпопуляциях HeLa-GFP(+) и HeLa-TI клеток. (Б) Оценка реактивации экспрессии гена GFP (представлена в % GFP-положительных клеток) после нокдауна ДНК метилтрансфераз с использованием миРНК. (В) Метилирование LTR интегрированного провируса. Схема распределения CpG пар внутри LTR промотора с указанием сайтов локализации праймеров для ПЦР. Черные кружки - метилированные CpG, белые - неметилированные. Профили флуоресценции GFP для HeLa-TI и HeLa-GFP(+) клеток. Профиль метилирования для каждой области был получен путем сравнения сиквенсов ДНК после бисульфитной обработки с немодифицированной областью. (Г) Метилирование гена GFP. Схема распределения CpG пар внутри гена GFP с указанием сайтов локализации праймеров для ПЦР.

Далее нами было проведено сравнение уровня метилирования промоторной области CMV, под непосредственным влиянием которой происходит транскрипция GFP. Методом бисульфитного секвенирования нами было обнаружено, что уровень метилированных CpG промотора CMV не превышает 2% от контроля (Рисунок 4). Также при сравнении популяций клеток (Рисунок 4) нами был обнаружено изменение паттернов метилирования соседних с CMV регионов: при наличии CMV промотора снижается метилирование области гена env, находящейся в непосредственной близости от промотора. Таким образом, CMV промотор не только не подвергается метилированию, но и препятствует

метилированию ДНК соседних областей, что согласуется с анализом литературных данных [8уоЬос1а, Нераг й а!., 2000].

Рисунок 4 Схема распределения белковых факторов на ДНК.

Таким образом, было выявлено, что только метилирование LTR коррелирует с уровнем репрессии GFP: в популяции клеток HeLa-TI при 1,5% GFP-положительных клеток, уровень метилирования LTR достигал 78%, а в популяции HeLa-GFP(+), где количество GFP-положительных клеток составляло до 90%, уровень метилирования LTR оказался лишь 27% (Рисунок 4).

В поддержании уровня метилирования ДНК, а также в обеспечении этой модификации de novo участвуют различные белковые факторы, в частности, семейство ДНК-метилтрансфераз. Для определения отдельных представителей этого семейства, участвующих в эпигенетической репрессии интегрированного провируса нами был проведен их нокдаун с помощью миРНК. На рисунке ЗБ представлены результаты степени реактивации экспрессии GFP после нокдауна следующих ДНК-метилтрансфераз: DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L. Оказалось, что в поддержании эпигенетической репрессии гена GFP участвуют de novo ДНК метилтрансферазы, DNMT3A и DNMT3B. Полученные данные, указывающие на участие DNMT3A и DNMT3B в поддержании

эпигенетической репрессии в клетках HeLa-TI, были дополнительно подтверждены методом иммунопреципитации хроматина (Рисунок 4).

2. Реактивирующее действие химических соединений

2.1 Тестирование химических соединений на модели HeLa-TI Изучение эпигенетических эффектов химических соединений является необходимым как для понимания молекулярных механизмов патогенеза онкологических заболеваний, так и для поиска новых и эффективных методов их лечения. Влияние химических соединений на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов представляет особый интерес, так как было показано, что многие противоопухолевые препараты (цисплатин, доксорубицин, митоксантрон, митомицин С, циклофосфамид и др.) обладают и генотоксическими, и эпигенетическим эффектами [Parker, Cutts et al., 2001; Parker, Buley et al., 2004; Davies, Hardman et al., 2000; Barton, Robaire et al., 2005; Wetherill, Hess-Wilson et al., 2006].

Для тестирования способности модельной системы HeLa-TI выявлять эпигенетически активные химические соединения был проведен эксперимент с использованием соединений с известным эпигенетическим действием (Таблица 1).

Таблица 1 - Список химических соединений, представленных в тесте на реактнвациоиную способность и результаты

Описание действия (группа) соединения Л Название препарата Реактивация в % GFP + стандартное отклонение

Ингибиторы гистоновых деацетилаз 1 *П>А (Трихостатин А) 34,1 + 1,7

2 БАНА (Субероланнлидгидроксамовая кислота) 19,4+0,9

3 УРА (Вальпроевая кислота) 18,8+ 1,1

4 Оер$1рерН<1е (Бициклический пептид) 21,4+0,9

5 РопиГегш (Флаваноид) 28,1 + 1,3

6 МБ275 (Епипс^аО 15,9 ± 1,6

Ингибиторы гистоновых метилтрансфераз 7 В1Х01294 (Производное диазепинхиназолинамина) 11,2 +1.1

8 ОНЧер (З-диазенпланоцин А) 14,4+0,7

Ингибиторы ДНК метилтрансфераз 9 <1-агаС (5-аза-2'дезоксицитидин, \'н1л/.а) 24,1 ±1,1

10 5-агаС (5-азацитидин) 26,9*0,9

11 1?С108 (Ы-фталил-Ь-трштгофан) 14,9 + 0,7

Растворитель ВМ5Ю (Диметил сульфокснд) 7,9+ 0,6

НеЬа-Т1 без обработки 5,5 ±0,6

(Тестирование проводили при различных концентрациях соединений, в таблице представлены результаты для концентрации веществ 5мкМ.)

В результате анализа полученных данных реактивирующее действие было подтверждено для всех протестированных агентов, что подтверждает возможность использования данной модели для выявления эпигенетически активных соединений.

Далее нами был проведен скрининг химических соединений различных классов, для большинства которых исследование эпигенетической активности ранее не проводилось (Таблица 2). При проведении скрининга эффект определялся как положительный, если средняя величина GFP-положительных клеток превышала 12% по отношению к контролю (р<0,001). Z'-фактор (0.7) указывает на высокую чувствительность и воспроизводимость результатов данной системы, а также подтверждает перспективность её использования для оценки влияния химических соединений на механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов в клетках [Pannell, Osborne et al., 2000].

При анализе результатов, полученных в результате скрининга на эпигенетическую активность, было выявлено, что соединения, обладающие как генотоксическим эффектом, так и другими механизмами цитотоксического действия на клетки, способны вызывать восстановление экспрессии эпигенетически инактивированных генов. Используя в скрининге обширный список лекарственных препаратов и канцерогенных соединений, нам не только удалось показать возможность применения данной экспериментальной модели эпигенетической репрессии для поиска препаратов, являющихся потенциальными модуляторами эпигенетических изменений в клетке, но и продемонстрировать эпигенетические эффекты таких противоопухолевых препаратов, как Bortezomib, MLN4924, Mimosine, Bleomycin. Также следует отметить, что все тестируемые узкобороздочные лиганды (таблица 2) обладали реактивирующим эффектом.

2.2. Влияние химических соединений на уровень эпигенетических модификаций

Для соединений, имеющих положительный эффект на реактивацию экспрессии гена GFP в скрининге (Таблица 2), мы оценили их влияние на общий уровень гистоновых модификаций. На рисунке 5 представлен анализ изменений гистоновых модификаций в культуре клеток HaLa-TI после обработки данными соединениями. Ожидаемое снижение уровня модификаций, характерных для гетерохроматиновых областей (НЗК9теЗ и Н4К20теЗ), по сравнению с интактными HeLa-TI наблюдалось для модификации

Таблица 2 - Результаты анализа активности химических соединений в тесте на способность к реактивации экспрессии эпигенетически репрессированных генов

Реактивация в

Описание действия соединения Jft Название препарата % GFP + стандартное отклонение

Узкобороздочные лиганды

Взаимодействие с ДНК по малой бороздке, 1 Hoechst 33342* 34,6+0,9

показана специфичность к АТ-богатым 2 Hoechst 33258* 16,6 + 0,6

последовательностям ДНК 3 DAPI* (4',6-диамино-2-фенилиндол) 34.8-1.2

4 Netropsin (Congocidine, Sinanomycin) 19,6+1,2

5 Diminazene (Azidin, Berenil, Ganasag) 21,9 + 0,9

б Pentamidine 16,8 х 0,5

Генотоксические соединения 6,4 + 0,6

Образовании сшивок 7 Cisplatin (Cisplatinum)

Образование ДНК- аддуктов 8 DMBA (7,12-диметилбенз (а) антрацен) 4,9 + 0,6

Алкилирующее соединение 9 Aranose (Арабинопиранозилметил 6,4 + 0,7

нитрозомочевина)

Образование ДНК- аддуктов и сшивок 10 Cyclophosphamide (Сарколизин, Мелфалан) 1,3 + 0,9Т

Индукция двуцепосчечных разрывов ДНК 11 Bleomycin (Антибиотик из Streptomyces 35;3±0,5

verticillus)

Контрольные соединения с эпигенетическим действием 34,1 + 1,7

12 TSA (Трихостатин A)

13 5-azaC (5-азацигидин) 26,9 + 0,9

Соединения с различными механизмами действия 22,3 ЦД

Глюкокортикостероид 14 FA (Флуоцинолона ацетонид)

Нестероидный аналог глюкокортикоидов 15 CpdA (2-(4-ацетоксифенил)-2-хлор-И- 8,2 + 1,1

метилэтиламмоний хлорида)

Ингибитор убиквитинирования 16 MLN4924 (Сульфоновая кислота)

Холнноблокатор 17 BZ (Хинуклидил-З-бегоилат) 9,8 + 0,6

Ингибиторы активности протеасом 1S CFZ (Тетрапептид эпоксикетон) 11,7 + 0,9

19 Bortezomib (Velcade) 28.2 ♦ 0.7

20 MG132 71.7 j. 1.7

Ингибитор топоизомеразы I 21 Camptothecin (Topotecan, Irinotecan.) 23,6 + 0,7

Ингибитор топоизомеразы II 22 Etoposide (Эгопозид фосфат) 22,6 1,1

Антагонист опиоидных рецепторов 23 Sobuzoxane (Buprenorphine, Виргепех) 11,4+1,1

Ингибитор протеинкиназ. 24 Staurosporine (AM-2282) 9,3 + 1,1

Ингибитор ДНК метилтрансфераз и 25 EGCG (Эпигаллокатехин галлат, полифенол) 11,5 + 0,4

теломераз. Catechin (Фенол, флаваноид) 15,1 ±0,4

Ингибитор гистидин декарбоксилаз 26

Ингибитор репликации ДНК 27 Mimosine ф-З-гидрокси-4 пуридин) 13,8 + 0,6

Ингибитор топоизомераз, синтеза 28 Suramin А (Полнсульфонированная 15,8 + 0,5

стероидных гормонов нафтилмочевина)

Ингибитор протеаз 29 Lopinavir 13,5+ 1,1

Цитостатики, индукторы оксидативного 30 Arsenic trioxide (Neosalvarsan) 73,8 + 3,5

стресса. 31 Piperlongumine (PPL) 19,5 + 1,2

Гормоноподобный эффект 32 Bisphenol A (BPA) 21,1 ± 1,8

Иммуносупрессор 33 Cbloroquine (4-аминохинолин,С0) 8,1+0,5

Ингибитор рецепторов УЕОП1-1, \'Ы(}ГК- 34 Pazopanib 7,8 + 0,6

2, УЕОП1-3, РГЮРК-аф.

Растворитель DMSO (Диметил сульфоксид) 7,9 + 0,6

HeLa-TI без обработки 5,5 + 0,6

(*- соединения, обладающие собственной флуоресценцией; скрининг проводили при концентрациях соединений 1 мкМ и 5мкМ, в таблице представлены результаты для концентрации веществ 5мкМ).

H4K20me3 практически во всех образцах (исключение составили 5-azaC, Hoechst 33342 и Camptothecin). Снижение уровня НЗК9теЗ было наиболее выражено в образцах клеток, обработанных Camptothecin и MG132, а для остальных было на уровне контроля.

нзкэтез

• » Штттшш^^

ГТ

НЗк

нз

Рисунок 5 Изменение общего уровня модификаций гистонов. (А) Анализ гистоновых модификаций, характерных для нетранскрибируемых генов НЗК9теЗ и Н4К20теЗ; (Б) Анализ гистоновых модификаций, характерных для активно транскрибируемых генов НЗК4шеЗ и асНЗ/Н4 Анализ проводили методом иммуноблотгинга.

Также нами было показано, что обработка HeLa-TI клеток TSA, Hoechst 33342, DAPI, Camptothecin, Etoposide и MG132 приводит к увеличению общего количества НЗК4теЗ -модификации, локализованной в областях активной транскрипции. Во всех образцах наблюдалось увеличение уровня ацетилирования гистона НЗ, что свидетельствует об активации транскрипции генов. Таким образом, можно заключить, что в результате обработки клеток химическими препаратами происходит и общее перераспределение гистоновых модификаций в клетке, о чем свидетельствует реактивация экспрессии GFP.

Другим важным показателем эпигенетической активности химических соединений является изменение уровня метилирования ДНК. Общий уровень метилирования ДНК в клетке оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием антител, специфически распознающих метилированную ДНК. Однако полученные данные свидетельствовали лишь о незначительном изменении общего уровня метилирования ДНК в клетках HeLa-TI после обработки большинством исследуемых соединений. Дополнительно методом метилчувствительной ПЦР нами было показано влияние некоторых из исследуемых химических агентов на уровень метилирования LTR в области

сайта старта транскрипции гена GFP (Рисунок 6).

ASV LTR

I

-CCGG--GGCC- Hpall

\J

1.8

5 «

к- 1.4

I 12

S i

0 0.8 g 0.6 = 0.4

1 0.2

О

о.

II.I.Hill,I

i * * * ihn

Рисунок 6 Изменение уровня метилирования в области LTR. (А) Схема LTR с расположением сайта рестрикции для метилчувствительного фермента Hpall и праймерами для ПЦР. CpG пары обозначены в виде кружков. (Б) Результаты ПЦР-анализа в реальном времени. Нормализация результатов проводилась по отношению к внутреннему контролю - количеству GAPDH. Статистически значимое (р<0,01) снижение уровня метилирования отмечено (*).

3. Изучение механизмов эпигенетических эффектов узкобороздочных лигандов

Бисбензимидазолы Hoechst 33258 и Hoechst 33342, синтезированные в 1974 г.

[Pommier and Marchand, 2005], в настоящее время широко применяют для окрашивания ДНК. Эти соединения обладают высокой аффинностью к ДНК благодаря их способности

образовывать водородные и ван-дер-ваальсовые связи по ее узкой борозде [Cherepanova, Zhuze et al., 2010]. Хотя эти соединения не связываются ковапентно с ДНК, их присутствие

в узкой бороздке приводит к изменению активности ряда ферментов, в частности,

топоизомераз I и II [Egbe-Nwiyi et al., 2003; Grant, Baron et al., 2009], хеликаз, ТАТА-

связывающих белков, репликативного белка А и др. [Grant, Sun et al., 2006]. Изучается

возможность их применения для лечения вирусных инфекций и химиотерапии опухолей

[Khan and Pilch, 2007; Khan, Shah et al., 2012].

Данные, полученные нами в ходе скрининга, указывают на способность

узкобороздочных лигандов влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. Однако при сравнении результатов для соединений Hoechst 33258 и Hoechst 33342 было выявлено, что Hoechst 33342 обладает более выраженной реактивационной активностью (Таблица 2). Следует отметить, что оба вещества обладают очень схожей молекулярной структурой и рекомбиногенным действием, за счет ингибирования активности топоизомеразы I [Meng, Dai et al., 2008], но при сравнении мутагенной активности, большим действием обладает Hoechst 33258 [Patra, Patra et al., 2008]. Сравнение общего уровня модификаций гистонов в популяции клеток HeLa-TI после обработки данными соединениями не показала значительного снижения уровня модификаций, характерных для нетранскрибируемых генов (НЗК9теЗ и Н4К20те). Однако для обоих красителей наблюдалось увеличение уровня ацетилирования гистонов асНЗ/Н4, что характерно для общей реактивации транскрипции (Рисунок 5). Также эти данные были подтверждены методом иммунопреципитации хроматина для промоторной области LTR. При анализе метилирования в промоторной области нами было показано, что наряду с 5-azaC, только Hoechst 33258 снижает метилирование в области LTR (Рисунок 6Б), что также было подтверждено методом бисульфитного секвенирования (снижение метилирования области LTR составило 56% для Hoechst 33258 по сравнения с 71% для Hoechst 33342, причем изначальный уровень метилирования в необработанных клетках достигал 78%).

Таким образом, экспериментальная оценка эпигенетического действия Hoechst подтвердила, что, обладая сходной молекулярной структурой, данные соединения по-разному влияют на реактивацию транскрипции гена GFP. При одновременном воздействии на систему регуляции модификаций гистонов, только Hoechst33258 оказывает деметилирующее действие на промоторную область LTR. Однако реактивирующая способность его при тех же концентрациях ниже по сравнению с Hoechst33342.

4. Синергическое действие узкобороздочных лигандов и эпигенетических ингибиторов

Механизмы эпигенетической репрессии генов, описанные выше, предполагают совместное участие как гистоновых модификаций, так и метилирования ДНК. В ряде исследований показано, что максимальный эффект реактивации репрессированных генов

наблюдается при одновременной обработке культур клеток ингибиторами гистоновых деацетилаз и ДНК-метилтрансфераз [Fabbri, Garzón et al., 2007]. Наши данные согласуются с такими исследованиями: при обработке клеток ингибитором гистоновых деацетилаз TSA и ДНК-метилтрансфераз 5-azaC как индивидуально, так и в комбинации наблюдается потенцирующее действие TSA на эффект 5-azaC (17% + 30 % // 52%) (Рисунок 7). Таким образом, можно сделать вывод об упорядоченности процессов деметилирования ДНК и ацетилирования гистонов при поддержании эпигенетической репрессии, причем процесс деметилирования ДНК с последующим ацетилированием гистонов способствует усиленной реактивации транскрипции гена GFP.

Рисунок 7 Синергическое действие эпигенетических ингибиторов. Уровень реактивации (выражен в доле GFP-положительных клеток) при обработке эпигенетическими ингибиторами и узкобороздочными лигандами (Hoechst 33342 и Hoechst 33258). Данные проточной цитофлуориметрии через 48 часов после начала эксперимента. (+) - совместная обработка; (->) -последовательная обработка. Концентрации соединений: TSA - 0,5мкМ; 5-azaC - 2,5мкМ; Hoechst 33342 и Hoechst 33258 — 2,5 мкМ (*) отмечены образцы, в которых наблюдали статистически значимое увеличение реактивации эпигенетически молчащих генов.

Используя следующую схему обработки (индивидуально, последовательно и одновременно) мы проанализировали возможное функциональное взаимодействие препаратов Hoechst с TS А и 5-azaC. При анализе полученных данных было установлено, что статистически значимое увеличение экспрессии GFP наблюдалось при одновременной обработке препаратами Hoechst 33342 и TSA (19% + 25% // 76%), а также Hoechst 33342 и

5-azaC (19% + 17% // 44%), что указывает на их потенцирующее действие (Рисунок 7). Кроме того, следует отметить, что при одновременном применении Hoechst 33342 и Hoechst 33258 эффект их действия суммировался (19% + 16% // 35%). Также был выявлен потенцирующий эффект и при последовательных обработках: TSA-> Hoechst 33342 (25% + 19% // 58%); 5-azaC Hoechst 33342 (17% + 19% // 42%) и при обработке Hoechst 33342 TSA (19% + 25% // 54%), при этом обработка Hoechst 33342 -> 5-azaC не давала подобного эффекта. Следует отметить, что максимальный потенцирующий эффект наблюдался при совместном применении Hoechst 33342 и TSA - реактивация экспрессии в данном случае достигала 76%. Таким образом, данный эксперимент позволил нам выявить синергическое действие Hoechst 33342, но не Hoechst 33258, с известными эпигенетическими препаратами.

Для дальнейшего изучения синергического действия соединений Hoechst с эпигенетическими модуляторами транскрипции, а также для повышения избирательности эффекта данных препаратов, нами были определены таргетные белки, потенциально участвующие в синергическом действии. Для этого мы исследовали эффекты Hoechst на фоне нокдауна каждого из эпигенетических модуляторов транскрипции (Рисунок 8).. При

!

таком подходе обработка химическими соединениями может служить предпосылкой для синергического действия препарата и исследуемого белка.

Для проведения эксперимента мы отобрали миРНК для ингибирования гистоновых деацетилаз (HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC4) и ДНК метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L). При анализе данных было выявлено, что применение TS А на фоне ингибирования HDAC1 и DNMT1 усиливает эффект последнего, такое взаимодействие является аддитивным: TSA - HDAC1 (17% + 45% // 63%), TSA - DNMT1 (17% + 24% // 41%). Эффект Hoechst 33342 сходен с эффектом TSA на фоне ингибирования HDAC1 и DNMT1: Hoechst 33342 - HDAC1 (14% + 45% // 64%) и Hoechst 33342 - DNMT1 (14% + 24% // 39%). Также нами было показано, что для Hoechst 33342 наблюдается аддитивный эффект и при ингибировании DNMT3B и DNMT3L: Hoechst 33342 - DNMT3B (14% + 17% // 39%) и Hoechst 33342 - DNMT3L (14% + 12% // 26%). В данном эксперименте было отмечено, что эффект Hoechst 33258 также отличался от действия Hoechst 33342. Для Hoechst 33258 был показан аддитивный эффект только на фоне ингибирования HDAC1 (12% +45%//57%).

v.o^vvo^3

Рисунок 8 Синергическое действие химических соединений на эпигенетическую реактивацию экспрессии генов. Результат реактивации экспрессии гена GFP (выражен в доле GFP-положительных клеток) после нокдауна генов методом РНК интерференции гистоновых деацетилаз (HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC4) и ДНК метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L). В качестве контроля использовали несмысловую миРНК. NT- клетки без обработки, химические соединения: TSA -0,5мкМ; 5-azaC - 2,5мкМ; Hoechst 33342 и Hoechst 33258 - 2,5мкМ. Результаты проточной цитофлуориметрии через 120 часов после начала эксперимента. (*) отмечены образцы, в которых наблюдали статистически значимое увеличение реактивации эпигенетически молчащих генов.

Полученные данные указывают на возможность взаимодействия химических канцерогенных веществ с эпигенетическими факторами. Также следует отметить, что белковые факторы могут взаимодействовать между собой и нельзя исключать эффект их совокупного действия наряду с химическими канцерогенами. Тем не менее, синергический эффект подобного рода важно учитывать в комбинированной терапии с целью повышения эффективности препарата, снижения применяемой дозы, и достижения синергического противоопухолевого эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Клеточная линия HeLa-TI с интегрированным ретровирусным вектором, содержащим репортерный зеленый флуоресцентный белок GFP под промотором CMV, является адекватной модельной системой для тестирования химических соединений на способность реактивировать эпигенетически репрессированные гены.

2. Ксенобиотики с известными эпигенетическими эффектами реактивируют

репрессированные гены в клетках HeLa-TI посредством модификаций гистонов и метилирования LTR промотора, в частности, за счет специфически локализованных гистоновых ацетилаз HDAC1 и метилтрансфераз КМТ1Е/КМТ5С а также ДНК-метилтрансфераз DNMT1/3A/3B.

3. Скрининг 43 ксенобиотиков выявил реактивирующее действие на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов 21 соединения. Для 14 соединений, обладающих сильным реактивирующим действием, охарактеризовано их влияние на гистоновые модификации и метилирование ДНК.

4. Впервые продемонстрированы эпигенетические эффекты противоопухолевых препаратов Bortezomib, MLN4924, Mimosine, Bleomycin. Подтверждена способность Lopinavir реактивировать эпигенетически репрессированные гены.

5. Впервые продемонстрировано влияние узкобороздочных лигандов Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, Diminazene, Pentamidine, Netropsin на эпигенетическую регуляцию транскрипции, связанное как с процессами метилирования и ацетилирования гистонов, так и метилирования ДНК.

6. Эффекты Hoechst 33258 и Hoechst 33342, различающихся лишь заместителями в пара-положении фенильного кольца, характеризуются разной направленностью действия: Hoechst 33258 оказывает реактивирующее действие за счет изменения ацетилирования гистонов и снижения метилирования ДНК, a Hoechst 33342 - за счет изменения ацетилирования гистонов и модификации НЗК4теЗ, но не влияет на метилирование ДНК.

7. Процессы деметилирования ДНК и ацетилирования гистонов оказывают взаимное влияние друг на друга: наибольшая степень реактивации транскрипции гена GFP наблюдается при проведении деметилирования ДНК на 1 этапе с последующим ацетилированием гистонов.

8. Hoechst33342 оказывает потенцирующее действие на реактивацию транскрипции гена GFP эпигенетическими ингибиторами ацетилирования гистонов и метилирования ДНК, в то время как для Hoechst 33258 подобного эффекта не наблюдается.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК РФ

1. Павлиш, О. А. Мутации гена LMP1 вируса Эпштсйна-Барр у российских больных лимфоидной патологией и здоровых лиц / О. А. Павлиш, С. В. Дидук, К. В. Смирнова, Л. Н. Щербак, Е. В. Гончарова, Н. А. Шалгииских, В. В. Архипов, М. Ю. Кичигина, В. Н. Степина, Н. В. Белоусова, Е. А. Османов, Л. С. Яковлева, В. Э. Гурцевич // Вопросы вирусологии (Москва). - 2008. - Т., №1. - С.10-16.

2. Poleshko, A. Identification of a functional network of human epigenetic silencing factors / M. B. Einarson, N. Shalginskikh, R. Zhang, P. D. Adams, A. M. Skalka, R. A. Katz // Journal of Biological Chemistry. -2010. - V. 285, № 1. - P. 422-433.

3. Shalginskikh, N. Retroviral DNA methylation and epigenetic repression are mediated by the antiviral host protein Daxx / N. Shalginskikh, A. Poleshko, A. M. Skalka, R. A. Katz // Journal of Virology. - 2013. - V. 87, -№ 4. - P. 2137-2150.

4. Шалгииских, H. А. Эпигенетические эффекты узкобороздочных лигандов / Н. А. Шалгииских, К. И. Кирсанов, Е. А. Лссовая, Г. А. Белицкий, Р. А. Кац, М. Г. Якубовская // Молекулярная медицина. -2013. - Т. 5.— С. 43-48.

5. Шалгииских, Н. А. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов в химическом канцерогенезе / Н. А. Шалгииских, Н. Ю Карпеченко, А.М Оглоблина, Е. А. Лесовая, К. И. Кирсанов, Г. А. Белицкий, М. Г. Якубовская //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2014, №3, с. 46-68.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

6. Shalginskikh, N. Mechanism of epigenetic silencing: interplay between histone modifications and DNA methylation / N. Shalginskikh, A. Poleshko, A. M. Skalka, R. A. Katz // 14th Annual postdoctoral and graduate student research conference. - Philadelphia, PA, USA. -2009. - Abstract 22.

7. Shalginskikh, N. Role of host factors in the initiation and maintenance of retroviral epigenetic silencing / N. Shalginskikh, A Poleshko, A. M. Skalka, R. A. Katz // 15th Annual postdoctoral conference. - Philadelphia, PA, USA. -2010. - Abstract 38.

8. Shalginskikh, N. Identification of host factors that initiate and maintain retroviral epigenetic silencing / N. Shalginskikh, A. Poleshko, A. M. Skalka, R. A. Katz // Cold Spring Harbor Laboratory, - Cold Spring Harbor, NY, USA, Retroviruses (oral presentation). - 2010. - Abstract 218.

9. Shalginskikh, N. Physical and functional studies suggest a pathway for engagement of retroviral DNA with epigenetic silencing factors / N. Shalginskikh, A. Poleshko, A. M. Skalka, R. A. Katz // 16th Annual postdoctoral and graduate student research conference (oral presentations-Philadelphia, PA, USA. - 2011. - Abstract 2.

10. Poleshko, A. Functional networks of human epigenetic factors / A. Poleshko, N. Shalginskikh, R. A. Katz // Cambridge University Press. - 2012. - P. 30-46.

11. Shalginskikh, N. Rapid retroviral DNA methylation and epigenetic repression as an antiviral host response / N. Shalginskikh, A. Poleshko, A. M. Skalka, R. A. Katz // Cold Spring Harbor Laboratory. - Cold Spring Harbor, NY, USA, Retroviruses. - 2012. - Abstract 238.

12. Шалгииских П.А. Влияние канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетическую регуляцию транскрипции / Н. А. Шалгииских, К. И. Кирсанов, М. Г. Якубовская // Международный Молодежный медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2013», - Санкт-Петербург, Россия. - 2013. - С. 147-148

Подписано в печать:

17.07.2014

Заказ № 10210 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru