Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Вирусные гепатиты: клинико-эпидемиологический анализ и совершенствование тактики лечения

На правах рукописи

ООЗОБТЬ^

КЛИМОВА Елена Анатольевна

ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ: КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТАКТИКИ ЛЕЧЕНИЯ

14.00.10. - инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 2006

003067535

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ющук Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты;

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Ивашкин Владимир Трофимович

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Богомолов Борис Павлович

доктор медицинских наук,

профессор Шабалина Светлана Васильевна

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится « <Л2007 г. в « часов на заседании диссертационного совета Д.20&.1141)1 в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (111123, Москва, ул. Новогиреевская, д.За).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

» ^¿¿г^Аг^ 2ооб 1

Горелов Александр Васильевич

Актуальность проблемы

Снижение инфекционной заболеваемости является важнейшей составной частью охраны здоровья населения, в свою очередь составляющей один из основных приоритетов государственной политики. В 2006 г. начата реализация Национального проекта по здравоохранению, в котором борьба с вирусными гепатитами занимает ведущее место. Ежегодно инфекционные болезни являются причиной смерти более чем у 14 млн. человек, от гепатита В и С в мире каждый год погибает около 1 млн. человек, ещё большее количество инфицированных этими вирусами людей теряет трудоспособность и социальную адаптацию. В мире проживает по меньшей мере 2 миллиарда человек, которые перенесли острый манифестный или бессимптомный гепатит В, и около 350 млн. хронических вирусоносителей; вирусом гепатита С инфицировано 3% популяции (170 млн.), около 80% лиц, перенесших острую форму болезни, формируют хронический гепатит. (NIH, 1997, 2002, W.H.O., 1997, Alter M.J., 1999). Таким образом, свыше 500 млн. человек в мире страдают от хронического вирусного поражения печени. Это имеет особенно важное значение для медицинской науки и практики, поскольку доказана этиологическая связь между первичной гепатоцеллюлярной карциномой и вирусами гепатитов В и С, более 75% случаев рака печени обусловлены этими вирусами (Parkin D.M. et al.,1999), каждый из них повышает риск развития этого онкологического заболевания примерно в 20 раз (Donato F.et al., 1998). Хроническая HCV-инфекция является одной из основных причин смерти больных с циррозом печени и наиболее частым показанием для проведения ортотопической трансплантации печени (Prince M.I., Hudson М., 2002).

В России на смену резкому подъёму заболеваемости острыми вирусными гепатитами (Богомолов Б.П., 1998, Онищенко Г.Г., 1999, 2002, Кожевникова Г.М., 2000, Львов Д.К., 2002, Михайлов М.И, 2002, Ивашкин В.Т., 2003, Шахгильдян И.В., 2003, Акимкин В.Г., 2004), наблюдавшуюся в 1996-1999 гг., пришла эпидемия хронических вирусных гепатитов. Ежегодно регистрируется увеличение количества впервые выявленных случаев хронического поражения печени вирусной этиологии и числа носителей вирусов В и С (Брико Н.И., 2001, Шляхтенко Л.И., 2005). Экономические потери, связанные с парентеральными гепатитами, составляют основную долю ущерба от наиболее распространённых инфекционных заболеваний. Так, суммарный ущерб, наносимый обществу HCV-инфекцией, составил в 2003 г. почти полтора миллиарда рублей (Шаханина И.Л., Осипова Л.А., 2005). Научные разработки последних десятилетий позволили существенно расширить «алфавит» вирусных гепатитов за счёт идентификации новых вирусных агентов, способных вызывать развитие воспалительного процесса в ткани печени (Deinhardt F., 1967, Фаворов М.О., 1992, Simons J., 1995, K.K. Кюрегян, 1999, Быченко Д.В., 2003). Однако до настоящего времени роль отдельных вирусов (HGV, TTV, SEN) и их сочетаний в развитии поражения печени не вполне ясна и требует дальнейшего уточнения, в том числе при

фульминантном течении вирусного гепатита.

Возможности противовирусного лечения хронического гепатита С в настоящее время стали существенно шире (Шерлок Ш., 1998, Блюгер А.П., 2000, Ивашкин В.Т. с соавт., 2002, 2004, Блохина Н.П.с соавт, 2002, Никитин И.Г., 2003). Созданы и внедрены в клиническую практику лекарственные препараты, обладающие улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, используются разнообразные дозовые и временные режимы при проведении курса лечения, применяются комбинации препаратов с различным механизмом противовирусного действия. Однако по-прежнему проведение этиотропного лечения хронического гепатита С ограничивают его высокая стоимость и отсутствие надёжного эффекта у значительной части пациентов (Соринсон С.И., 2000, Серов В.В. и др., 2002, Hoofnagle, 2003, Мухин Н.А., 2004). Среди многообразных патогенетических механизмов развития хронического гепатита С важное место занимает развитие оксидативного стресса (Lai М.М. et al., 2002, Okuda М. et al., 2002), поэтому весьма перспективным является изучение эффективности лекарственных препаратов, способствующих уменьшению воздействия образующихся в процессе болезни свободных радикалов кислорода (Hellstrand К. et al., 1994, Houglum К. et al., 1997, Look M.P. et al., 1999).

Установленный факт циркуляции вируса гепатита С в организме человека в виде гетерогенной смеси близкородственных мутантных штаммов, принадлежащих к одному генотипу вируса, но имеющих генетические отличия в вариабельных областях вирусного генома (Martell М. et al, 1992, P. Farsi et al, 1997, 2000, Alfonso V. et al, 2004), несомненно, явился вехой для развития системы знаний, способствующих пониманию механизмов длительной (возможно, пожизненной) персистенции вируса. Однако имеется множество данных, свидетельствующих о квазивидовой природе популяции вирусов, циркулирующих в организме больного хроническим гепатитом С, в то время как сведения, касающиеся гетерогенности вируса гепатита С в острой фазе болезни, немногочисленны (Farsi et al, 2000), полученные данные противоречивы и крайне скудны, в то время как изучение свойств возбудителя и патологических сдвигов, происходящих в организме больного на ранних этапах инфекционного процесса, необходимо для разработки более эффективных методов борьбы с этим недугом.

Обнаружение рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С не только в сыворотке крови пациента, но и в других биологических субстратах организма (в ткани печени и мозга, в лимфоцитах периферической крови, в мышце сердца, костном мозге и др.), обусловило стремительность дальнейшего прогресса в области изучения патогенетических механизмов HCV-инфекции (Ackerman Z. et al., 1998). Однако до сих пор не решен вопрос о возможной экстрапеченочной репликации вируса гепатита С (Muller Н.М. et al, 1993, Bouffard P. et al, 1992), предметом дискуссии остаётся также существование взаимосвязи между выраженностью морфологических изменений в ткани

печени и частотой выявления RNA HCV в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и в ткани печени.

Предположения о механизмах повреждающего действия вируса на печёночную клетку изменяются по мере накопления результатов научных исследований. Прежние представления о преобладающем цитопатическом действии вируса (Kim D.W.et al, 1994, Moriya K.et al, 1997) расширены за счёт возможного иммуноопосредованного воздействия, направленного на внутриклеточные антигены вируса гепатита С (Nelson D.et al, 1998, Nasir A.et al, 2000 Кущ A.A. и соавт, 2000). В этой связи несомненный интерес представляет обнаружение белков вируса гепатита С в ткани печени, что, в свою очередь, создаст предпосылки для более полного понимания механизмов повреждения гепатоцита при развитии инфекции вирусом гепатита С.

Всё это обусловливает необходимость дальнейшего изучения вирусных гепатитов различной этиологии (А, В, С, Д, Е и др.) - с точки зрения своевременной и надёжной этиологической расшифровки, частоты встречаемости различных факторов риска их передачи, возможности условий прогрессирования патологического процесса в печени, максимально ранней диагностики инфекционного процесса для выработки оптимальной тактики противовирусного лечения. Большая актуальность изучения рассмотренных выше вопросов определила цели и задачи настоящей диссертационной работы и её научное значение.

Цель исследования.

Разработка программы и методов этиопатогенетического лечения хронического гепатита С на основе современной генно-инженерной диагностики и обоснования тактики комбинированной противовирусной терапии, а также анализ факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С с использованием методов аналитической эпидемиологии для совершенствования профилактических мероприятий в отношении парентеральных вирусных гепатитов.

Задачи исследования:

1. Сравнительное изучение этиологической структуры острых вирусных гепатитов среди пациентов, находившихся на лечении в Инфекционной клинической больнице №1 г. Москвы в период 1993-1994 и 1998 гг., в том числе их фульминантных форм, и роли микст-инфекции в развитии фульминантных гепатитов.

2. Определение роли вируса гепатита G в этиологии острого вирусного гепатита и его влияния на течение острого гепатита С и фульминантных вирусных гепатитов.

3. Исследование факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С с использованием методов аналитической эпидемиологии на основании анализа данных, полученных при опросе больных и лиц группы сравнения с

использованием анкеты, разработанной совместно с Центром по контролю заболеваемости и профилактике заболеваний (CDC, Атланта, США).

4. Определение генетической неоднородности и изменчивости индивидуальной популяции вируса гепатита С, циркулирующей в крови при острой желтушной форме вирусного гепатита С и сопоставление этих данных с уровнем вирусной нагрузки и показателями АЛТ.

5. Выявление зависимости между клинико - биохимическими особенностями хронического гепатита С, степенью морфологических изменений в печени и наличием рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С в различных биологических субстратах больных хроническим гепатитом С на основании определения геномной и/или репликативной формы RNA HCV одновременно в трех субстратах - сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и ткани печени.

6. Проведение сравнительного исследования экспрессии структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (core, NS3, NS4A, NS4B) в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью иммунопероксидазного метода с использованием моноклональных антител к белкам вируса гепатита С.

7. Оценка эффективности и безопасности использования гистамина дигидрохлорида в комбинации с рекомбинантным интерфероном-а2в для лечения больных хроническим гепатитом С.

8. Оценка эффективности и безопасности использования рибавирина в комбинации с рекомбинантным интерфероном-а2а для лечения больных хроническим гепатитом С.

Научная новизна исследования

Уточнена этиологическая структура острых вирусных гепатитов и подтверждено мнение о её выраженной изменчивости в зависимости от активности эпидемического процесса. Показана ведущая роль вирусов гепатита В и дельта в развитии летального исхода при фульминантном течении вирусного гепатита, а также наличие значительной доли микст-инфекции и недифференцированного вирусного гепатита среди этой категории пациентов. Изучены клинико-биохимические особенности течения фульминантных форм острых вирусных гепатитов различной этиологии и острого гепатита С при дополнительном инфицировании вирусом гепатита G. Впервые проведено исследование факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С с использованием методов аналитической эпидемиологии. Впервые определена генетическая неоднородность и изменчивость индивидуальной популяции вируса гепатита С при острой форме инфекции. Установлены общие закономерности циркуляции вируса гепатита С в организме больных хроническим гепатитом С, показана возможность детекции геномной и репликативной RNA HCV в различных биологических субстратах. Впервые исследована возможность репликации вируса гепатита С в лимфоцитах периферической крови.. Изучена взаимосвязь между степенью

б

морфологических изменений в ткани печени и обнаружением RNA вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и ткани печени. Впервые проведено исследование экспрессии структурных и неструктурных белков вируса гепатита С в клетках печени больных при различных вариантах течения болезни и при разной степени морфологических изменений. Показана высокая эффективность комбинированной терапии хронического гепатита С при использовании рекомбинантного интерферона с препаратами других фармакологических групп.

Практическая ценность работы.

1. Обоснована необходимость включения методов генной диагностики в стандарты диагностики острых вирусных гепатитов, что позволит существенно улучшить этиологическую расшифровку острых вирусных гепатитов.

2. Предложено комплексное обследование больных хронического гепатита С с использованием новейших достижений медицинской и биологической науки, включающее, наряду с эпидемиологическим и клинико-лабораторным исследованиями, проведение пункционной биопсии печени, определение RNA HCV (при необходимости - в различных биологических субстратах) и изучение её свойств.

3. Показана возможность выявления белков вируса гепатита С в ткани печени иммунопероксидазным методом с применением моноклональных антител, что может быть использовано для совершенствования диагностики вирусного гепатита С.

4. Продемонстрирована высокая клиническая эффективность и безопасность противовирусных препаратов отечественного производства (рибавирина и интерферона-а2а) для лечения больных хроническим гепатитом С.

5. Показаны преимущества этиопатогенетического лечения больных хроническим гепатитом С с использованием рекомбинантного интерферона-а2в и гистамина дигидрохлорида по сравнению с монотерапией препаратами интерферонового ряда.

6. Обоснована необходимость учёта ведущих факторов риска инфицирования в системе профилактики вирусных гепатитов В и С, значимость которых меняется в зависимости от эпидемиологической ситуации.

Апробация работы и внедрение в практику. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Российской академии медицинских наук (1997), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д и G - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики» (1997, 1999, 2001), Российско-германском симпозиуме «Новые технологии в клинической практике, хирургии и онкологии» (1999), 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в

современной медицине» (2000), IV, V, VI, VII, VIII, IX, X Российской конференции «Гепатология сегодня» (1998, 2000, 2001, 2002,. 2003, 2004, 2005), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2000, 2003, 2004, 2006), Научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)" в 2000 г., VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» и на Совещании по улучшению систем иммунизации и применению вакцины против гепатита В в странах Центральной и Восточной Европы и Новых Независимых Государств в г. Санкт-Петербурге (2000, 2001), на конференции «Эпидемиология, профилактика, контроль и лечение вирусных гепатитов» (Казахстан, г. Алматы, 2001), на заседании Общества врачей-инфекционистов г. Москвы (2002), на Совещании по вопросам ВИЧ-инфекции, СПИД и вирусных парентеральных гепатитов (Суздаль, 2002), на Восьмой Российской гастроэнтерологической неделе (2002), на Международном тренинге-конференции «Интегрированное слежение для контроля и профилактики ВИЧ/СПИД, вирусных гепатитов и ИППП в Центрально-Азиатском регионе» (Узбекистан, г. Ташкент, 2003), на IV съезде общества гастроэнтерологов (2004), научно-практической конференции «Вопросы инфекционной патологии Урала», (Тюмень, 2004), научно-практической конференции в Ставрополе (2004), на выездном пленуме Научного общества гастроэнтерологов России в Новосибирске (2004), на 5-й Восточно -Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения» (Красноярск, 2005). Стендовый доклад «Histological status in asymptomatic chronic HCV infection» представлен в г. Амстердаме (2001).

Основные положения диссертации изложены в 61 печатной работе, которые опубликованы в период с 1993 г. по 2006 г.

Выдвинутые на основании проведённых исследований положения вошли в методические рекомендации «Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение» (2000), «Методические указания по клинико-лабораторной диагностике и профилактике вирусных гепатитов» (2002), «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных» (2006), «Гепатит С» (2006) и другие инструктивно-методические документы. Основные положения диссертации вошли также в «Лекции по инфекционным болезням» под редакцией академика РАМН профессора Ющука Н.Д. (1996, 1999). Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе Московского государственного медико-стоматологического университета по подготовке студентов, интернов, клинических ординаторов, врачей - слушателей курсов на факультете постдипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий. Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Объём, характер и методы проведённых исследований.

Для решения поставленных в настоящей работе задач были проведены следующие клинико-лабораторные исследования:

1. Общеклиническое обследование, включавшее оценку жалоб пациентов и данных физикального осмотра (с учётом которых формировались основные клинические синдромы и определялась степень их выраженности) и анализ архивного материала осуществлялись при наблюдении за 4551 пациентом, среди которых было 4240 больных вирусными гепатитами различной этиологии в острой и хронической стадии болезни и 311 здоровых лиц группы сравнения. Данные о 3511 больных острыми вирусными гепатитами, госпитализированных в ИКБ №1 г. Москвы в 1993-1994 гг., о 430 больных острыми вирусными гепатитами, находившихся на лечении в этом же стационаре в 1998 г. и о 311 здоровых лиц группы сравнения были использованы для эпидемиологического анализа (популяционное исследование и исследование по типу «случай-контроль»). Исследование этиологической структуры летальных исходов при вирусных гепатитах осуществлялось на основании изучения 65 случаев, закончившихся смертью больных (от фульминантной формы острого вирусного гепатита - 17 из 3511 в 1993-94 гг, 18 - в 1999-2002 гг, от последствий хронического вирусного гепатита - 30 в 1999-2002 гг.). У 10 больных острым гепатитом С была исследована генетическая гетерогенность и изменчивость популяции вируса гепатита С, циркулирующей в сыворотке крови на протяжении 12 месяцев наблюдения. Обнаружение геномной и репликативной форм RNA HCV в различных биологических субстратах (сыворотка крови, лимфоциты периферической крови и ткань печени) проводилось у 72 больных хроническим гепатитом С, у 36 из них изучалась экспрессия структурных и неструктурных белков вируса гепатита С в клетках печени при различной степени активности воспалительного процесса и при разной стадии болезни. Эффективность и безопасность различных схем противовирусной терапии хронического гепатита С оценивалась при наблюдении за 169 больными, получавшими специфическую терапию (интроном-А в комбинации с гистамином дигидрохлоридом (Ceplene™); веро-рибавирином в комбинации с реафероном). Случаем острого вирусного гепатита считали заболевание, сопровождающееся желтухой кожи и склер и клиническими признаками гепатита - увеличением печени, астеновегетативными проявлениями, диспептическим синдромом; а также изменениями функциональных проб печени (гипербилирубинемия более 20 мкмоль/л, гиперферментемия, превышающая 10 норм AJIT), при наличии одного или нескольких маркеров вирусных гепатитов. Дополнительно анализировали случаи заболевания, при которых наблюдали клинико-биохимические и эпидемиологические признаки острого вирусного гепатита, однако ни один из известных маркёров вирусных гепатитов в сыворотке крови определить не удалось. Хронический вирусный гепатит С диагностировали в случае длительности заболевания более 6

9

месяцев при обнаружении клинико-лабораторных признаков болезни (наличия повышенной активности AJIT и\или анти-HCV и RNA HCV). У 106 пациентов с хроническим гепатитом С диагноз был подтверждён морфологическими данными при исследовании ткани печени, полученной путём пункционной биопсии печени.

2. Анкетирование, направленное на выяснение частоты встречаемости различных факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С, было проведено среди 611 пациентов (300 больных острыми вирусными гепатитами и 311 здоровых лиц). Пациенты были опрошены при помощи специальной анкеты, разработанной совместно с отделом диагностики вирусных гепатитов Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC, Атланта, США). Обработка полученных результатов проводилась с помощью компьютерной программы Epilnfo (версия 6), с использованием многофакторного анализа.

3. Биохимические исследования, включавшие фракционное количественное определение уровня билирубина методом Йендрашика, определение уровня активности аспартатаминотрасферазы, аланинаминотрансферазы методом IFCC на автоматическом биохимическом анализаторе Cobac Mira Plus (Hoffman-La-Roche, Швейцария), определение показателей тимоловой пробы модифицированным методом Mac-Lagan и протромбинового индекса, активность щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, количество общего холестерина, бета-липопротеидов, общего белка и белковых фракций методом электрофореза, уровня церулоплазмина.

4. Клиническое исследование периферической крови с подсчётом форменных элементов в единице объёма проводилось многократно всем больным, включенным в исследование, на автоматической гематологической системе ADIVA 60-СТ.

5. Определение в сыворотке крови маркёров вирусных гепатитов. Специфическая диагностика вирусных гепатитов проводилась в лаборатории ИКБ №1 г. Москвы методом ИФА при помощи различных коммерческих диагностическими тест-систем (HBsAg - "Органон"; анти-HBcore IgM, IgG -«Диагностические системы» или «Препарат», Нижний Новгород; анти-HCV -«Органон» или «ГепаСкан»; анти-HDV IgM, IgG - «Препарат», Нижний Новгород). Часть полученных образцов крови (791 проба) сохранялись при -20°С и переправлялись в лабораторию диагностики вирусных гепатитов Центра по контролю и профилактике заболеваний (DVH, NCID Centers for Disease Control and Prevention, CDC, Атланта, США) в условиях соблюдения температурного режима. В референс-лаборатории образцы сывороток крови всех обследуемых были исследованы на наличие маркёров вирусных гепатитов методом ИФА. Для выявления анти-HAV IgM, IgG, HBsAg, анти-HBcore IgM, IgG, анти-HDV IgM, IgG использовались коммерческие тест-системы (Abbot, North Chicaqo, USA). Определения анти-HCV проводили методом ИФА с помощью коммерческих диагностикумов Diagnostic System и

Abbot North Chicaqo (USA) с последующим подтверждением положительных образцов в иммуноблотинге (RIBA III Orto Diagnostic System). Определение анти-HEV (IgM, IgG) проводили методом ИФА с помощью диагностикума, основанного на Mosaic protein. В сыворотках крови умерших больных были определены маркеры HBV-, HDV-, HAV-, HEV-, HCV-, HGV- и TTV-инфекций. Пробы тестировались также на наличие DNA CMV, DNA EBV и Parvo-B 19-вируса, в них также определяли аутоиммунные антитела.

6. Ультрасонографическое исследование органов брюшной полости проводилось на аппарате Esaote Megas.

7. Морфологическое обследование заключалось в проведении пункционной биопсии печени и последующем изучении гистологического препарата. Пункционная биопсия печени проводилась чрезкожно при помощи пункционной иглы «Hepafix» (типа Menghini) диаметром 1,2-1,6 мм под местной анастезией. Часть биоптата использовалась для гистологического анализа (полученный биоптат фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин, гистологические препараты окрашивались гематоксилином и эозином, а также пирофуксином по методу Ван-Гизона), другая часть замораживалась и хранилась при температуре -70°С для исследования RNA HCV методом ПЦР и\или для детекции белков вируса гепатита С иммунопероксидазным методом. Оценка структурных изменений печеночной ткани проводилась полуколичественным методом с использованием индекса Knodell и шкалы METAVIR.

8. Полимеразная цепная реакция: качественное и количественное определение геномной и репликативной формы RNA HCV в различных биологических субстратах больных хроническим гепатитом С (сыворотка крови, лимфоциты периферической крови, ткань печени). Количественное определение RNA HCV проводили с помощью набора «Amplicor HCV monitor test» фирмы «Roche».

9. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP-анализ) для определения генотипа вируса гепатита С и изучения нуклеотидных различий гипервариабельного региона генома вируса гепатита С.

10.Исследование экспрессии структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (core, NS3, NS4A, NS4B) в клетках печени больных хроническим гепатитом С проводилось с помощью иммунопероксидазного метода с использованием моноклональных антител к белкам вируса гепатита С.

11. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью компьютерной программы Epilnfo (версия 6), с применением статистической программы BIOSTAT и STATISTICA 5.11. Для оценки статистической значимости результатов исследования применяли параметрические и непараметрические методы, при этом определялись критерии Стьюдента, Хи-квадрат, Манна-Уитни коэффициенты ранговой корреляции Спирмена.

Работа выполнена в клинике кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава (ректор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ющук Н.Д.) на базе ГУЗ г. Москвы ИКБ№1 ДЗ

г. Москвы (гл. врач - д.м.н., проф. Малышев Н.А., зав. консультативным специализированным гепатологическим отделом - д.м.н., проф. Блохина Н.П.). В выполнении отдельных фрагментов работы принимали участие сотрудники лаборатории диагностики вирусных гепатитов Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC, Атланта, США), лаборатории генной инженерии и иммуногенетики ФГУ «НИИ Физико-химической медицины» Росздрава, лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, ГУЗ г. Москвы ИКБ №1 ДЗ г. Москвы, компании Maxim Pharmaceuticals Inc. (США) и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ (д.м.н. Фаворов М.О., к.м.н. Яшина Т.Л.,

д.б.н., проф. Говорун В.М., к.б.н. Ильина Е.Н., д.б.н., проф. Кущ А.А., к.б.н. Масалова О.В., Келли Е.И., к.м.н. Брагинский Д.М., к.м.н. Знойко О.О., к.м.н. Кареткина Г.Н., к.м.н. Гаджикулиева М.М., к.м.н. Пылёва О.Г., к.м.н. Максимов С.Л.), которых искренно благодарю за помощь.

Приношу глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, ректору Московского государственного медико-стоматологического университета, заведующему кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, академику РАМН, профессору Николаю Дмитриевичу Ющуку за большую научно-консультативную помощь, оказанную при проведении настоящей работы.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, включает в себя введение, несколько глав собственных исследований, заключение выводы и практические рекомендации; работа проиллюстрирована 38 таблицами, 31 рисунком и 7 фотоизображениями. Обзор литературы составлен на основании анализа 428 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное исследование этиологии острых вирусных гепатитов, проведённое на основании анализа клинико-лабораторных показателей с использованием генных методов диагностики с пятилетним интервалом среди 3941 взрослых больных, госпитализированных в ИКБ №1 г. Москвы, показало значительное увеличение удельного веса вирусных гепатитов В и С и уменьшение доли вирусного гепатита А среди заболевших. Так, в 1993-94 гг. вирусные гепатиты В и С были диагностированы у 53% пациентов, вирусный гепатит А - у 45% больных, в то время как в 1998 г. удельный вес вирусных гепатитов с парентеральным путём передачи составил 78%, а доля вирусного гепатита А сократилась до 17% (рис.1).

12

Рисунок 1. Этиология острых вирусных гепатитов (г. Москва, ИКБ №1)

Аналогичные эпидемиологические особенности ОВГ были зарегистрированы и в других регионах России. Уровень заболеваемости парентерачьными гепатитами приобрел характер эпидемии: по данным Госсанэпиднадзора РФ в 1998 г показатель заболеваемости ОГВ в России в целом по стране вырос вдвое по сравнению с 1991 г., достигая в некоторых регионах России десятикратного и более увеличения (например, в Самаре и в Тольятти в 1998 г. было зарегистрировано 193,4 и 214,9 заболевших ОГВ на 100 тыс. населения соответственно).

Показатели заболеваемости ОГС в России в 1998 г. по сравнению с 1994 г. (первый год официальной регистрации) увеличились почти в 4 раза: с 3,2 до 11,6 на 100 тыс. населения. Реальное число заболевших, вероятно, существенно превышало данные официальной регистрации, в которых невозможно учесть случаи острых вирусных гепатитов, протекающих без желтухи. Указанные изменения в этиологической структуре острых вирусных гепатитов не соответствовали ожидаемому на фоне повсеместного внедрения в практическую медицину безопасной инъекционной практики, медицинских инструментов одноразового использования и современных методов тестирования донорской крови снижению числа заболевших парентеральными вирусными гепатитами. В связи с этим нами было проведено исследование,

направленное на выявление факторов риска передачи возбудителей вирусов гепатитов В и С с использованием методов аналитической эпидемиологии. Совместно с Центром по контролю заболеваемости и профилактике (CDC, Атланта, США) была разработана анкета, с помощью которой было опрошено 611 человек: 300 больных ОВГ, находившихся на лечении в отделении вирусных гепатитов ИКБ №1 ДЗ г. Москвы в 1998 г. и 311 здоровых лиц, составивших группу сравнения, наблюдавшихся в те же сроки; группы пациентов были сопоставимы по полу и возрасту.

Данные, полученные при обследования здоровых лиц, показали, что среди молодых москвичей в возрасте до 25 лет, проживающих в г. Москве, HBsAg обнаруживался почти вдвое реже, а антитела к вирусу гепатита С -почти в 3 раза чаще, чем среди доноров-москвичей, обследованных Кузиным С.Н. в 1998 г. (1% и 3% против 1,8% и 1,2% соответственно), при этом необходимо учесть, что возрастной ценз в группе доноров был выше, чем в наблюдаемой нами группе сравнения. Почти половина (46%) обследованных здоровых лиц в сроки, соответствующие инкубационному периоду парентеральных гепатитов, имели различные факторы риска инфицирования вирусными гепатитами В и С. Столь высокая частота встречаемости факторов риска среди здоровых лиц демонстрирует необходимость строжайшего соблюдения противоэпидемических мероприятий при проведении любых парентеральных манипуляций, практики безопасного секса и вакцинации против гепатита В.

2% молодых людей группы сравнения отмечали факт употребления наркотиков, что при данной величине выборки дает распределение частоты распространения наркомании в возрастной группе от 18 до 25 лет от 0,8 до 4,4% (Fleiss quadratic 95% CI), и все эти лица имеют шанс быть инфицированными вирусами, ассоциированными с внутривенным употреблением наркотических средств (вирусные гепатиты, ВИЧ и др.). Оценка результатов анкетирования больных ОВГ и участников группы сравнения, представленной здоровыми лицами, позволила определить значимость различных факторов риска в возникновении вирусных гепатитов различной этиологии.

В целом указания на наличие таких факторов риска парентерально передающихся инфекций, как инъекции в амбулаторных или стационарных условиях, переливание крови, внутривенное введение наркотических средств, беспорядочные сексуальные контакты и др., значительно чаще встречаются среди заболевших острыми вирусными гепатитами, чем среди здоровых лиц: среди больных ОГВ указанные факторы риска встречались у 90,2% (193\214), в группе сравнения - 45,6% (125V274, OR=10,96, 95%С1 6,4-18,9, р<0, 001), при ОГС - у 92%, что также значительно чаще, чем среди здоровых лиц (33\36, OR=13,l, 95%С1 3,7-54,98, р<0,001). Эти данные еще раз демонстрирует безусловную значимость перечисленных факторов риска в распространении указанных инфекций.

Вместе с тем, значение такого фактора риска, как переливание крови в передаче вируса гепатита В в настоящее время снизилось: в группе больных острым гепатитом В гемотрансфузии имели место у 0,5% (1\214) пациентов. Аналогичные данные получены среди здоровых лиц (0\274), OR=l,29, 95%С1 0,0-47,3, Fisher exact, р=0,7. Проведение многофакторного анализа позволило выявить среди больных ОГВ такую же закономерность: при исключении такого фактора, как внутривенное введение наркотических средств, переливание крови встречалось не чаще, чем у лиц контрольной группы - в 1,2% (1\84) и у 0\270 соответственно (OR= 3,24, 95%С1 0,0-119,9, Fisher exact, р>0,4). Аналогичные результаты для больных ОГВ были получены при дальнейшем проведении многофакторного анализа: при исключении других факторов риска (парентеральные вмешательства при обращении в поликлинику, к стоматологу или при госпитализации в стационар) переливание крови у больных ОГВ было отмечено не чаще, чем в группе сравнения - 4% (1\23) и 0\189 соответственно (OR= 8,55, 95% CI 0,0-326,6, Fisher exact, p=0,2). Указания на более редкую связь развития ОГВ с гемотрансфузиями в Москве в 1999 г. были отмечены и другими авторами -переливания крови были зарегистрированы только у 0,64% этой категории больных, вместе с тем, в 1989 г. в Москве таких больных было 13,7%, в 19901991 гг- у 7,7% (Шахгильдян И.В., 1999, 2003). Результаты, полученные нами, согласуются с данными Онищенко Г.Г. (2003), согласно которым развитие острого гепатита В регистрируется после переливаний крови и/или ее препаратов у 0,3-0,9% больных этими инфекциями. Таким образом, в последние годы в Москве существенно сократилось количество больных ОГВ, инфицирование которых произошло при переливании крови. Причиной этого, вероятно, явилось не только внедрение в работу службы крови высокочувствительных методов определения маркёров гепатита В (HBsAg), но и использование в практике лечебно-профилактических учреждений инструментов одноразового пользования. В настоящее время сообщается также о значительном сокращении числа случаев посттрансфузионного гепатита С, в ряде регионов России в 1997 г. удельный вес больных посттрансфузионным гепатитом С уменьшился с 45% в 1993 г. до 2-4% (Шахгильдян И.В.1999). По нашим данным, в группе больных острым гепатитом С, как и при ОГВ, указания на переливание крови встречались с такой же частотой, как и в группе контроля - у 2,8% (1 \36) больных (OR= 7,8, 95%С1 0,0-294,1, Fisher exact, р=0,088), однако при исключении наркомании как фактора риска передачи этой инфекции оказалось, что среди больных ОГС переливание крови встречалось у 14% (1\7) больных, что достоверно чаще, чем среди лиц группы сравнения (0\270, OR=44,8, 95%С1 0,0-1930,9 Fisher exact, р=0,04). Таким образом, в распространении вирусного гепатита С переливание крови по-прежнему продолжает играть определенную роль. Эти данные доказывают необходимость дальнейшего совершенствования методов,

направленных на предотвращение распространения этой инфекции при переливании крови и её препаратов.

Проведенные нами исследования показали, что парентеральное введение наркотических средств встречается больных ОГВ и ОГС в десятки раз чаще, чем в группе здоровых людей (61%, 80% и 1,5% лиц соответственно). При исключение таких факторов риска, как переливание крови, парентеральные вмешательства при обращении в поликлинику, к стоматологу или при госпитализации в стационар, показало, что внутривенное употребление психоактивных веществ было зарегистрировано у 79,2% (84М06) больных острым гепатитом В, у 2,1% (4\193) лиц группы сравнения (OR=180,4 95%С1 56,2-644,2, р<0,001) и у 89% (24\27) больных острым гепатитом С (OR=378,0, 95%С1 66,5-2714,9, р<0,001). Атрибутивный риск развития ОГВ при парентеральном введении психоактивных веществ составил 46%, а ОГС -78%. Анализ возрастного состава заболевших ОВГ выявил преимущественное вовлечение в инфекционный процесс молодых людей в возрасте от 15 до 29 лет. По нашему мнению, этот факт объясняется тем, что лица именно этой возрастной категории наиболее часто употребляют парентеральные наркотические средства. Полученные нами результаты подтверждают данные других авторов о том, что именно в последние годы наряду с ростом наркомании в стране регистрируется увеличение заболеваемости теми инфекциями, которые передаются гемоконтактным путем (Власов Н.Н и соавт, 1997, Кожевникова Г.М. 2000, Нестеров A.C., 2000). По данным экспертов, в России насчитывается более 3 млн. лиц, потребляющих наркотические и психотропные вещества треть из них составляет возрастная группа от 13 до 25 лет и проблема использования наркотиков признана национальной проблемой.

Несмотря на большое значение парентерального введения наркотических средств в распространении ОВГ, возникновение этих заболеваний по-прежнему может быть связано с другими факторами риска. Сопоставление частоты случаев госпитализации в стационар среди групп наблюдения показало, что среди больных ОГВ по сравнению с контрольной группой достоверно чаще регистрировались случаи парентеральных манипуляций в условиях стационара - 13,1% (28V214) против 6,4% (17\274) соответственно (OR = 2,28, 95%С1 1,16-4,5, р = 0,014). Другие исследователи также сообщают о том, что от 2% до 7% больных ОГВ и ОГС указывают на наличие данного фактора риска в сроки, соответствующие инкубационному периоду (Онищенко Г.Г. и др., 2003). В группе больных ОГС, в отличие от ОГВ, факт госпитализации встречался не чаще, чем среди лиц группы сравнения: у 8% (3\36) больных, OR = 1,37, 95%С1 0,3-5,36, Fisher exact, р=0,71.

В группе больных ОГВ стоматологические манипуляции встречались с такой же частотой, как и в группе сравнения: 23,4% (50V214) и у 16% (44V274) соответственно (OR=l,6, 95%С1 0,99-2,57, р=0,05). При проведении многофакторного анализа в группе больных ОГВ закономерность, выявленная

при однофакторном анализе, изменялась: среди больных ОГВ, отрицавших употребление наркотиков, стоматологические манипуляции регистрировались значительно чаще, чем в группе контроля - у 28,6% (24\84) против 16,3% (44X270) лиц соответственно (OR = 2,05, 95%С1 1,11-3,78, р = 0,019). Напротив, при ОГС не выявлено достоверной зависимости риска заражения от частоты стоматологических манипуляций - среди заболевших ОГС стоматолога посещали 8,3% (3X36) больных, в группе контроля - 16% (44X274) пациентов (OR= 0,48, 95%С1 0,11-1,7, р=0,22). Использование многофакторного анализа при наблюдении группы больных ОГС было невозможно в связи с малочисленностью группы больных, не употребляющих внутривенно вводимые наркотики.

Доля посещавших поликлинику (для проведения гастроскопии, колоноскопии, осмотра гинекологом, хирургом) была значительно больше среди больных ОГВ, чем среди группы контроля: 23,4% (52X214) и 11,7% (32X274) соответственно (OR=2,43, 95%С1 1,46-4,05, р=0,004). Напротив, среди больных ОГС парентеральные вмешательства при осмотре гинеколога, хирурга, при проведении гастроскопии, колоноскопии в амбулаторных условиях регистрировались у 11,1% (4\36) - не чаще, чем среди здоровых лиц (11,7%, 32X274), OR=0,95, 95% CI 0,26-3,05, Fisher exact, р=1,0.

Заключение в тюрьму отмечалось чаще среди больных острыми вирусными гепатитами - у 10% (22X214) больных ОГВ и у 14% (5\31) больных ОГС по сравнению с отсутствием этого фактора риска у лиц группы сравнения, OR=31,28 95% С1=4,44-628,7, р<0,001 и OR=44,19 95% С1=4,76-1033,01, Fisher exact, р<0,001 соответственно.

Татуировки в течение 6 месяцев до начала заболевания (анкетирования) сравнения с одинаковой частотой регистрировались у больных ОГВ и лиц группы сравнения- у 3,7% (8X214) и у 2% (7X274), при ОГС - чаще - у 11% (4X36), OR=4,77 95% CI=1,1-19,55, Fisher exact, р=0,028.

Механические средства контрацепции (презервативы) при половых контактах использовались в группе больных ОГВ существенно реже, чем у лиц контрольной группы - у 11% (21X193) против 22% (43X193), OR=0,4 95% CI=0,23-0,78, р=0,004; кроме того, сифилис и другие заболевания, передающиеся половым путем, значительно чаще встречались среди больных ОГВ, чем в контроле - у 11% (23X214) и 2,1% (4\274), OR=6,08 95% С1=1,93-21,28, р=0,005; 5% (114214) и 1,5% (4\274), OR=3,66 95% СМ ,06-13,83, р=0,038. Все это свидетельствует о том, что половой путь играет важную роль в передаче ОГВ.

Согласно полученным нами данным, подавляющее большинство больных острым гепатитом С являются парентеральными потребителями наркотических средств. Для решения вопроса о значении других парентеральных вмешательствах в распространении ОГС необходимо исследование существенно больших групп наблюдения. Разная значимость указанных фактора риска в распространении вирусных гепатитов В и С,

возможно, отражает природу вирусов, особенности их циркуляции в организме больных, а также различную устойчивость вирусов В и С в окружающей среде.

Увеличение показателей заболеваемости парентеральными вирусными гепатитами в 90-х годах отчасти может быть обусловлено повышением качества диагностики, использованием новых иммунологических методов для верификации диагноза и применением тест-систем последнего поколения. Особенное значение для этиологической расшифровки вирусных гепатитов имеет внедрение в клиническую практику современных методов диагностики (в том числе полимеразной цепной реакции. В наших наблюдениях у 54% (33X61) пациентов, выписанных из стационара с диагнозом «Острый вирусный гепатит не уточнённой этиологии», диагноз удалось верифицировать при дополнительном исследовании образцов сыворотки крови указанными методами. В одном случае при уточнении диагноза в группе больных с гепатитом ни А ни Е (28 пациентов) была обнаружена RNA HGV. Для оценки широты распространения этого маркёра среди больных острыми вирусными гепатитами различной этиологии дополнительно было обследовано 137 человек (25 - ГА, 23- ОГВ, 31 - ОГС, 38 больных кишечными инфекциями и 20 больных лакунарной ангиной составили контрольную группу). Все больные были обследованы на наличие RNA HGV в сыворотке крови. Только у 3,6% (1\28) с вирусным гепатитом ни А ни Е была обнаружена RNA HGV, в то время как среди больных ОГВ и ОГС RNA HGV в сыворотке крови обнаруживали достоверно чаще: у 35% и 39% больных соответственно (рис.2).

¡4%

100%

о%

1

35%

;;39%

223s

::i4 'А

ёшё

HAV

п=25

HBV

п=28

HCV

11=31

NANE

п=28

I 'I

Контроль

П=58

Рисунок 2. Частота обнаружения RNA HGV при острых вирусных гепатитах

различной этиологии 18

Таким образом, большинство наблюдаемых нами больных, в сыворотке крови которых была выявлена RNA HGV, были инфицированы вирусами гепатитов В или С, что позволяет думать об идентичности факторов, определяющих передачу этих вирусов. Полученные нами результаты совпадают с данными других исследователей (Simons J.N. et al., 1995), которые показали, что среди больных острым гепатитом ни А ни Е RNA HGV выявляется в 2%-6% случаев. Возможно, значительно более редкое определение RNA HGV в сыворотке крови больных гепатитом ни А ни Е может быть обусловлено непродолжительной фазой виремии или низкой концентрацией вирусной RNA на ранних этапах острой инфекции вирусом гепатита G. Среди доноров крови этот маркёр удаётся выявить примерно с такой же частотой (Михайлов М.И., 1997, Новиков Д.В. и др., 2000). Согласно данным Wiwanitkit V (2005), проанализировавшим 30 научных работ, у 649 человек из 13610 обследованных добровольных доноров крови выявлялась RNA HGV. Суммарная распространенность HGV составила 4,8%, из них 4,5% - среди представителей белой расы, 3,4% - азиатской и 17,2% - негроидной расы. Статистически достоверная связь этнической принадлежности доноров крови с частотой выявления RNA HGV отсутствовала. По-видимому, HGV-инфекция распространена во всех этнических группах в мире, что определяет глобальную значимость данного гепатита. Скрининг по RNA HGV в будущем может оказаться важным тестом в системе банков крови. Тот факт, что в наших исследованиях только у одного пациента с доказанным острым гепатитом без маркёров гепатитов А, В, С, Д и Е выявлена RNA HGV, позволяет предположить, что HGV-гепатит может существовать самостоятельно, но он не является основным возбудителем вирусного гепатита неизвестной этиологии. Сравнение некоторых эпидемиологических, клинических и биохимических данных у пациентов, у которых выявляли RNA HGV (включая микст-инфекцию HGV+HCV), с аналогичными данными пациентов с HCV-инфекцией и вирусным гепатитом ни А ни Е показало, что дополнительное инфицирование вирусом гепатита G не изменяло клинико-биохимических проявлений острого периода гепатитов С и не влияло на тяжесть его течения. Аналогичные результаты демонстрируют исследования других авторов: при ко-инфекции HGV с гепатитами А, В и С не выявлено значительных изменений в течении заболевания, обусловленных присутствием HGV (Brandhagen DW et al, 1999, Hess G. et al, 1999, Быченко Д.В, 2002). Ни у одного из наблюдаемых нами HGV-позитивных пациентов не наблюдалось тяжёлого поражения печени, вместе с тем, Yoshiba et al (1995) показали, что HGV может играть важную роль в развитии фульминантного и субфульминантного гепатита ни А ни Е. Другие исследователи (Fagan et al, 1992, 1994) описывают тоговирусподобные частицы в биопсийном материале при фульминантном гепатите неизвестной этиологии, которые предположительно могут быть GBV-C или HGV вирионами. Генные методы диагностики имеют большое значение для этиологической расшифровки

вирусных гепатитов с фульминантным течением, поскольку среди этой группы пациентов значительно чаще (у каждого шестого больного в наших наблюдениях), чем в группе больных с острым вирусным гепатитом в целом, не удаётся идентифицировать возбудителя при использовании рутинных методов, направленных на выявление антигенов вируса и антител к ним посредством иммуноферментного анализа. Образцы крови больных, умерших от фульминантного вирусного гепатита, были исследованы на наличие маркеров HBV-, HDV-, HAV-, HEV-, HCV-, HGV-, TTV-, Parvovirus В19, CMV-, EBV-инфекций, а также аутоиммунных антител. Для исключения болезни Вильсона-Коновалова исследовали уровень церулоплазмина. Как показали наши исследования, 76% умерших от острого вирусного гепатита не погибли бы, если были бы вакцинированы против гепатита В, поскольку у 13 из 17 пациентов была диагностирована острая НВ-вирусная инфекция, у 35% из них - одновременно с HDV-инфекцией. Подобная ситуация наблюдается в США и во Франции, где HBV является основным вирусным агентом, вызывающим фульминантный гепатит (Benhamou J.P, 1991, Hoofnagle JH, 1995), в то время как в Англии острая печеночная недостаточность вирусной этиологии составляет менее 30% случаев (Williams R, 1996). В наших наблюдениях у 6% умерших, имевших эпидемиологические и клинико-биохимические признаки вирусного гепатита, при использовании указанного набора диагностических тест систем, идентифицировать возбудителя не удалось. Более чем у 60% наблюдаемых пациентов регистрировалась микст-инфекция в различных сочетаниях (HBV \HDV \HCV \HGV \TTV \ParvovirusB19), что согласуется с данными других исследователей. Так, частота выявления RNA HCV в сыворотке крови больных с фульминантным гепатитом по данным разных авторов колеблется от 18 до 47%, частота обнаружения RNA HGV выше при фульминантном гепатите, чем при других формах гепатита (Villamil FG, et al 1995, Heringlake S, et al 1996, Moaven LD, et al, 1997), однако эти вирусы вряд ли являются важнейшими этиологическим агентом при фульминантным гепатите, а их присутствие, вероятнее всего -результат вторичного инфицирования, происходящего чаще всего при переливаниях крови и её продуктов. Согласно полученным данным, наличие RNA HGV в сыворотке крови больных с фульминантным течением острого гепатита В (30%) не изменяло характерных для фульминантной формы клинико-лабораторных показателей.

Бурное развитие междисциплинарных исследований в вирусологии, иммунологии, молекулярной биологии позволили существенно расширить современные представления о вирусных гепатитах. Важнейшей характеристикой HCV является выраженная изменчивость его генома, что, по мнению многих авторов, может являться одной из причин длительной персистенции вируса в организме инфицированного человека и играть ведущую роль в формировании хронического патологического процесса в печени. С гетерогенностью вирусной популяции связывают прежде всего

тяжесть поражения печени и устойчивость к про во айда й противовирусной терапии. Под нашим наблюдением находились 10 больных острым вирусным гепатитом С в возрасте от 17 до 39 лет, которым в течение одного года с интервалом 1,5-2 месяца проводилось исследование уровня АЛТЛАСТ, качественное определение RNA HCV, установление генотипа вируса методом SSCP, количественная оценка вирусной нагрузки с использованием набора "Ampiicor HCV monitor test" фирмы "Roche и оценка изменчивости Индивидуальной популяции вируса гепатита С по гипервариабельному локусу (363 п.н.) с помощью SSCЕ>-анализа. Среди наблюдаемых больных были выделены группы пациентов, течение заболевания которых характеризовалось различным уровнем AJ1T. RNA HCV в сыворотке крови больных сохранялась в течение всего периода наблюдения у всех пациентов (за исключением одного), преобладающим был генотип 1в (80% случаев). Ретроспективно проведена количественная оценка содержания RNA HCV в сыворотке крови пяти пациентов на каждом этапе исследования. Для опенки генетической гетерогенности индивидуальной популяции вируса гепатита С проведена амплификация фрагментов вирусного генома, содержащих HVR1 во всех клинических образцах. Полученные шп л иконы проанализированы методом SSCP, что позволяя© обнаружить различия в нуклеотидиом составе исследуемых участков RNA HCV (рис.3).

12 33 95 148 209 273 348 бо-1«н

Рисунок 3. Генетические изменения в гипервариабельном регионе генома вируса гепатита С в динамике болезни у пациента Р.

Для оценки изменчивости вируса гепатита С, персистирующего в организме одного больного, использовалась безразмерная величина, характеризующая накопление генетических изменений в каждой точке по сравнению с предыдущей. В течение 12 месяцев болезни была оценена гетерогенность индивидуальной популяции HCV по HVR1-области и его генетическая изменчивость для каждого из наблюдаемых больных. Корреляция между кривыми, описывающими концентрацию RNA HCV в сыворотке крови больного, уровень тканевой AJIT и накопление генетических изменений, вычисляли с помощью стандартного пакета программ "Microsoft Excel". Значительная генетическая гетерогенность вируса гепатита С наблюдалась как при 1в, так и при 2а и За генотипах. Полученные данные согласуются с результатами других авторов (Farci P. et al, 1997, 2001, Higashi К et al, 2005), показавших, что замены в аминокислотной последовательности HVR1 в острой фазе HCV-инфекции существуют и их скорость превышает 10,2% замен в месяц. Вероятно, наличие «квазивидов» обусловливает феномен ухода вируса от иммунологического ответа, неэффективную элиминацию HCV и, как следствие, его длительную персистенцию в организме человека и высокую частоту хронизации заболевания. В группе больных, заболевание которых протекало на фоне нормальных показателей уровня AJIT, гетерогенность индивидуальной популяции HCV была выражена умеренно (от 2 до 12 генетических вариантов). В течение всего срока наблюдения происходили периодическое увеличение гетерогенности индивидуальной популяции HCV и изменения в генетическом составе фрагментов RNA HCV (накопление числа новых генетических вариантов вируса по сравнению с предыдущими точками исследования). При этом повышение гетерогенности популяции вируса гепатита С, также как и ее снижение, происходили на фоне стабильно нормальных показателей уровня АЛТ. Изменения концентрации вируса в сыворотке крови больных (от 10000 до 800000 копий/мл) также не сопровождались изменением показателей активности трансаминаз. В группе больных с волнообразными колебаниями уровня АЛТ гетерогенность индивидуальной популяции HCV не отличалась от таковой у больных со стойко нормальным уровнем АЛТ. Очевидной корреляции между появлением новых генетических вариантов HCV и значительным повышением уровня АЛТ выявлено не было. Также не обнаружена взаимосвязь между уровнем ферментемии и концентрацией вируса, колебания которого составляли от 2000 до 700000 копий/мл. Особо следует отметить, что на пике гиперферментемии и гипербилирубинемии наблюдалась исключительно низкая гетерогенность индивидуальной популяции HCV, тогда как при последующей нормализации или снижении уровня АЛТ число квазивидов стремительно нарастало. Эти процессы сопровождались резким падением концентрации HCV в крови больного, как правило, на порядок. По данным некоторых исследователей (Yuki N. et al., 1997), высокий уровень гетерогенности индивидуальной популяции HCV по HVR локусу

обуславливает более тяжелое течение хронического гепатита С, характеризующееся волнообразным характером колебания уровня тканевых трансаминаз. Нам не удалось выявить указанной закономерности, гетерогенность индивидуальной популяции HCV в группе больных со стойко нормальным уровнем AJIT и среди пациентов с повышенным уровнем АЛТ не различалась. Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу об отсутствии какой-либо корреляции между степенью гетерогенности индивидуальной популяции HCV, уровнем виремии и ферментемии в крови больного. У некоторых больных прослеживалась взаимосвязь между изменением концентрации HCV в сыворотке крови и числом новоявленных генетических вариантов гипервариабельного участка вирусного генома. Интересен факт, что увеличение титра вируса и степени гетерогенности популяции HCV, указывающие на активную репликацию вируса в организме, не сопровождалось выбросом в кровоток тканевых трансаминаз (в частности, АЛТ), свидетельствующих о деструктивных процессах, происходящих в клетках печени. Подобная картина наблюдалась как в группе больных ОГС со стабильно нормальным уровнем АЛТ, так и с волнообразными её колебаниями. Ранее аналогичные данные были получены японскими учеными при исследовании сыворотки крови больных с ХГС (Naito М. .et al.,1995). В исследованиях Rossini А. с соавт. (1997) у пациентов с ОГС получены сходные с нашими данными результаты. Изменения последовательности HVR1 могут отражать существование различных клонов в острую фазу инфекции и адаптацию этих клонов при установлении хронической персистирующей инфекции у пациентов. Таким образом, выявленная генетическая неоднородность и изменчивость индивидуальной популяции HCV, циркулирующей в сыворотке крови больных острым гепатитом, косвенно отражает активность репликации HCV в гепатоцитах, однако не может являться прогностическими критериями при оценке вариантов течения острого гепатита С. Вероятно, генетическую гетерогенность вирусного генома необходимо рассматривать как адаптивную реакцию вируса, живущего в изменяющихся условиях организма хозяина. Отчасти этот тезис подтверждают установленные различия в субпопуляциях HCV, обнаруживаемых в гепатоцитах, мононуклеаров и сыворотки крови больных ХГС (Maggi F. et al., 1997), Кроме того, наблюдаемая в динамике генетическая изменчивость индивидуальной популяции HCV, наряду с изменением концентрации вируса в сыворотке крови больного, может служить косвенным маркером активности репликативных процессов, происходящих в клетках печени.

Для изучения закономерностей выявления RNA HCV (геномной и репликативной формы) в различных биологических субстратах организма при разной степени активности патологического процесса в печени было обследовано 72 больных с хроническим гепатитом С (38% обследованных составили женщины, 62% - мужчины, средний возраст - 24,07 +\- 1,08, более 80% больных были в возрасте до 30 лет, при этом половина из них - не старше

20 лет). Всем наблюдаемым больным с целью уточнения степени некрозо-воспалительных изменений в ткани печени и выраженности фиброза была произведена пункционная биопсия печени. У 76% больных отмечалось повышение уровня активности АЛТ, у 24% больных на протяжении 6 и более месяцев при кратности определения 1 раз в 1-3 месяца регистрировался постоянно нормальный уровень активности АЛТ. Определение RNA HCV в различных биологических субстратах больных ХГС проводилось методом ПЦР.

Исследовалась сыворотка крови, лимфоциты периферической крови и ткань печени, в которых определяли геномную форму RNA HCV; репликативную форму RNA HCV исследовали только в ТП и ЛПК, если в указанных образцах была обнаружена геномная форма RNA HCV. У 90% наблюдаемых больных RNA HCV была выявлена хотя бы в одном из биологических субстратов. Геномная форма RNA HCV была найдена в ТП у 83±4,4% больных, что оказалось значительно чаще, чем в CK (46±5,9%,) или в ЛПК (68±5,9%), р<0,01 и р<0,05 соответственно. Таким образом, в ткани печени RNA HCV обнаруживается достоверно чаще, чем при исследовании сыворотки и лимфоцитов крови. Кроме того, вирусная RNA в ТП определяется у 74,3±7,0% пациентов при её отсутствии в CK и у 48,7±2,5% - в лимфоцитах периферической крови у пациентов этой группы. Таким образом, резервом повышения качества диагностики и, возможно, совершенствования тактики ведения пациента с хроническим гепатитом С, является исследование RNA HCV не только в сыворотке крови, но и в других биологических субстратах - в лимфоцитах периферической крови и в ткани печени.

Отсутствие RNA HCV в сыворотке крови в случае обнаружения этого маркёра в других субстратах может объясняться низким уровнем виремии, находящимся за пределами чувствительности метода, а также блокированием вируса молекулами иммуноглобулинов, входящих в состав иммунных комплексов (Morita Т. et al., 1996) и особенностями высвобождения вирусных частиц из гепатоцитов под действием невыясненных пока факторов (Negro F. et al., 1998).

У части наблюдаемых больных в ткани печени обнаружить RNA HCV не удалось, что также может быть объяснено очень низкой концентрацией вируса или ингибированием различных звеньев полимеразной цепной реакции ферментами печени (Walker F.M. et. al. 1998). Репликативная форма RNA HCV в ткани печени была обнаружена у каждого третьего (17\54, 31%) пациента, в гепатоцитах которых выявлялась её геномная форма, что согласуется с результатами, полученными другими исследователями (Lerat Н. et. al. 1996, Laskus Т. et. al. 1997). Более частое обнаружение геномной формы RNA HCV в ткани печени больных хроническим гепатитом С по сравнению с «минус-цепью» RNA вируса гепатита С обусловлено прежде всего тем, что процесс репликации вируса гепатита С в гепатоцитах сопровождается накоплением значительно большего числа копий «плюс- цепей» RNA вируса гепатита С, в

10-100 и более раз превышающего количество «минус» цепей (Nouri Aria К.Т. et. al., 1993, Lanford R.E. et. al., 1995). Латентная фаза инфекционного процесса в момент обследования пациента также может быть причиной отсутствия репликативной формы RNA HCV в ткани печени больных хроническим гепатитом С (Gil В. et. al., 1993, Федоров H.A. с соавт., 1995).

Если вопрос о преимущественной репликации вируса в гепатоцитах является решённым, то возможность её репликации в других органах и тканях до настоящего времени окончательно не определена. Проведено исследование «минус-цепей» RNA HCV в лимфоцитах периферической крови 40 пациентов, содержавших геномную форму RNA HCV. Ни в одном из исследованных образцов не удалось обнаружить репликативную форму вирусной RNA, что свидетельствует об отсутствии репликации вируса гепатита С или об очень низком её уровне в лимфоцитах периферической крови: Подобного мнения придерживаются и другие исследователи (Okumura А. et. al., 1998, Lanford R.E. et. al., 1994, 1995). Вероятно, лимфоциты должны рассматриваться скорее в качестве резервуара вируса, чем места его репликации, однако необходимо учитывать, что при определённых условиях (например, при снижении иммунитета) появление репликативной активности в лимфоцитах периферической крови возможно (Radkowski М. et. al., 1998). Изучение RNA HCV в различных биологических субстратах у больных, заболевание которых сопровождалось повышением уровня АЛТ, показало (табл.1), что геномная форма RNA HCV выявляется чаще, чем при нормальных показателях этого фермента - в сыворотке крови (52,7±б,7% и 23,5±10,6%, р<0,05), лимфоцитах периферической крови (76,3±5,7% и 41,2±12,3%, р<0,01) и одновременно в трёх исследованных субстратах (сыворотка крови, лимфоциты крови и ткань печени - 47,2±6,% и 11,8±8,0% , р<0,01). Эти данные согласуются с мнением других исследователей (Aleksandru S. et al., 1998, Mathurin P. et al., 1998, Jamal M.M. et al., 1999) о наличии зависимости между частотой выявления RNA HCV в сыворотке крови и уровнем активности АЛТ. Вероятно, низкий уровень репликации вируса гепатита С, характеризующийся отсутствием RNA HCV, сопровождается минимальным повреждением гепатоцитов, протекающем без изменения биохимических показателей (уровня АЛТ). В ткани печени как геномная, так и репликативная форма RNA HCV обнаруживается в сравниваемых группах с одинаковой частотой.

Отдельному анализу в наших исследованиях подлежали случаи хронического гепатита С на разных морфологических стадиях с наличием или отсутствием вирусной RNA в различных биологических субстратах. Некоторые исследователи считают, что репликация вируса возрастает по мере прогрессирования болезни, и у больных с высоким уровнем воспалительной активности RNA HCV в печени выявляется значительно чаще, чем при её минимальном повреждении (Cho S.W. et al., 1996, Choi Y., 1999, Odenthal M., 1999, Dries V et al., 1999). Наши исследования, напротив, не выявили подобной зависимости: RNA HCV одинаково часто выявлялась в сыворотке крови,

лимфоцитах периферической крови и в ткани печени у пациентов с минимальной степенью воспалительного процесса в печени и начальной стадией болезни и у больных с умеренным хроническим гепатитом и тяжелым фиброзом (табл.1).

Таким образом, строгой зависимости между степенью морфологических изменений в ткани печени и обнаружением RNA HCV в указанных биологических субстратах больных хроническим гепатитом С не обнаружено. Аналогичные данные получены другими исследователями (Мс Guinnes Р. Н. et al., 1997, Tran A. et al., 1997, Negro F.et al., 1998, 1999, Rodriguez-Inigo E. et al., 1999). Вероятно, одного только присутствия вируса гепатита С в организме недостаточно для развития воспалительного процесса и фиброза в печени. Отсутствие зависимости между наличием RNA HCV в печени и выраженностью морфологических изменений позволяет предположить, что вирус гепатита С не оказывает прямого цитопатического действия на клетки печени. Вместе с тем, нельзя полностью исключить повреждение печёночных клеток при высвобождении вируса из гепатоцитов (Lerat Н. et al., 1996), поскольку механизм «выхода» вируса из клетки окончательно не ясен.

Особой оценке были подвергнуты результаты исследования белков вируса гепатита С в ткани печени больных ХГС. Среди наблюдаемых больных была выделена группа из 36 пациентов, дополнительно обследованных, среди которых женщины составляли 33%, мужчины - 67% средний возраст - 26,6 +\-1,2 лет. У 75% наблюдаемых больных отмечалось постоянное или эпизодическое повышение уровня активности AJIT. У 25% больных на протяжении 6 и более месяцев регистрировался постоянно нормальный уровень активности AJIT. При морфологической оценке состояния ткани печени по шкале Rnodell у 5,5% больных хроническим гепатитом С была минимальная активность некрозо-воспалительных изменений в печени, у 64% - слабовыраженная, у 30% - умеренная степень воспаления. У большинства больных (89%) был выявлен слабый фиброз, у 11% - выраженный фиброз.

После морфологического исследования ткани печени в гепатоцитах выявляли RNA HCV методом ПЦР и белки вируса гепатита С (core, NS3, NS4A, NS4B) при помощи иммуногистохимического метода с использованием моноклональных антител к белкам вируса (Masalova O.V., 1998, Абдулмеджидова А.Г., 2002). Использованные в настоящей работе моноклональные антитела были проверены со срезами ткани печени больных, не инфицированных вирусом гепатита С. В этом случае использование иммуногистохимического метода не выявляло положительных результатов.

RNA HCV в сыворотке крови была обнаружена у 58±8,2% пациентов, в ткани печени - у 86±5,8% больных. У 97% пациентов, в гепатоцитах которых определялась RNA HCV, в ткани печени были обнаружены белки вируса гепатита С. Соге-белок в ткани печени определялся у 54±10,4% пациентов, NS3 - у 76±10,7% , NS4 - у 80±7,3%, в том числе NS4A у 46±8,9%, NS4B - у 54±10,1 % больных ХГС.

Таблица 1. Частота выявления RNA HCV в различных биологических субстратах у больных хроническим гепатитом С в зависимости от выраженности цитояитического синдрома и степени морфологических изменений в ткани печени

Обнаружение ЯЫАНСУ АЛТ<1,5И п=17 АЛ1>1,5К п=55 ИГА 0 п=3 ИГА 1-3 п ~ 19 ИГА 4-8 п = 33 ИГА 9-12 п =17 ИФО п = 4 ИФ 1 п = 59 ИФ 3-4 п = 9

(количество положительных результатов\%±т)

Есть в одном из субстратов 12\70,6±11,0 51\92,7±3,5 2\66,7±33,3 18\94,7±5,1 28\84,8±6,2 15\88,2±8,1 2\50,0±28,9 52\88,1±4,2 9\100,0

Не выявлено нигде 5\29,4±11,4 4\7,3±3,5 1\33,3±33,3 1\5,2±5,1 5\15,1±6,2 2\11,7±8,0 2\50,0±28,9 7\11,7±4,2 0

Сыворотка крови 4\23,5±10,6* 29\52,7±6,7* 1\33,3±33,3 8\42,1±11,6 16\48,5±8,7 8\47,0±12,5 1\25,0±25,0 28\47,4±6,5 4\44,4±17,2

Лимфоциты периферической крови 7\41,2±12,3* 42\76,3±5,7* 2\66,7±33,3 13\68,4±10,9 23\69,7±7,9 12\70,б±11,4 1\25,0±25,0 39\66,1±6,2 8\88,9±11,1

Ткань печени П\64,7±11,9 49\89,1±4,2 2\6б,7±33,3 15\78,9±9,6 27\81,8±6,7 15\88,2±8,1 2\50,0±28,9 49\83,0±4,9 9\100,0

Репликативная формав ткани печени 3V30,0±15,3 п=10 14\31,8±7,0 п=44 1\50,0±50,0 п = 2 3\23,!±29,8 п= 13 10\41,7±10,3 п = 24 3\20,0±10,7 п= 15 1\50,0±50,0 п = 2 13\29,5±6,9 п = 44 3\37,5±18,3 п = 8

Сыворотка крови, лимфоциты периферической крови, ткань печени 2\11,8±8,0* 26\47,2±6,7* 1\33,3±33,3 5\26,3±10,4 14\42,4±8,6 8\47,0±12,5 1\25,0±25,0 23\38,9±б,3 4\44,4±17,2

Сыворотка крови лимфоциты периферической крови 0 2\3,6±2,5 0 1\5,3±5,28 1\3±2,96 0 0 2\3,4±2,4 0

Сыворотка крови, ткань печени 1\5,9±5,8 1\1,8±1,8 0 2\10,5±7,2 1\3±2,9б 0 0 3\5,1±2,9 0

Лимфоциты периферической крови, ткань печени 4\23,5±10,6 14\25,4±5,9 1\33,3±33,3 5\26,3±10,4 8\24,2±7,4 4\23,54±10,6 0 14\23,7±5,5 4\44,4±17,2

Только ткань печени 3\17,6±9,5 8\14,S±4,7 0 4\21±9,6 4\12,1±5,7 3\17,б±9,5 1\25,0±25,0 9\15,2±4,7 1\11,1±11,1

Только лимфоциты периферической крови 1\5,9±5,8 0 0 1\5,3±5,28 0 0 0 1\1,7±1,7 0

* - р<0,05

У 83,3±6,3% всех обследованных пациентов с хроническим гепатитом С в гепатоцитах определялись вирусные антигены, что существенно превышает частоту обнаружения RNA HCV в сыворотке крови у наблюдаемой группы больных.

Вирусные белки в печени приблизительно с одинаковой частотой обнаруживались как у пациентов с виремией, так и без неё - 57% и 43% соответственно, таким образом, корреляции между виремией и экспрессией белков вируса гепатита С в ткани печени выявлено не было. В работах Gonzalez-Peralta R. Р. et al. (1994), Yap S.-H. et al. (1994) были получены подобные результаты.

Объяснением этого может являться относительно невысокий уровень репликации вируса, что подтверждается обнаружением «минус-цепи» RNA HCV только у 44% (11\25) обследованных больных, имеющих геномную RNA HCV в ткани печени. Вирусные белки были выявлены у 72% (18\25) больных хроническим гепатитом С, в ткани печени которых была обнаружена геномная форма RNA HCV. У 82% лиц, содержащих «минус-цепь» RNA HCV, в гепатоцитах был выявлен соге-белок (9\11), NS3 - у 36% (4\11), NS4A - у 64% (7\11), NS4B - у 45% (5\11). Таким образом, репликативная форма RNA HCV чаще ассоциировалась с обнаружением соге-белка, т.е. с эффективной сборкой вирусных частиц.

Вирусные антигены выявляли исключительно в цитоплазме гепатоцитов (аналогичные данные получены Gonzalez-Peralta R. Р. et al., 1994, 1995, Sansonno D. et al., 1997, Negro F. et al., 1999), при этом не было обнаружено видимой связи между локализацией окраски и очагами воспаления и некроза ткани печени. Белки вируса гепатита С определяли как в кластерах гепатоцитов, так и единичных клетках (рис.4.). В очагах воспаления и некроза в ткани печени, в инфильтрирующих печень лимфоцитах и в эпителиальных клетках жёлчных протоков окрашенных вирусоспецифических белков обнаружено не было. Окрашивание носило диффузный характер в виде мелких гранул, иногда окрашивалась только часть цитоплазмы. Инфицированные гепатоциты в большинстве случаев выглядели морфологически нормальными, что является ещё одним свидетельством отсутствии прямого цитопатического действия вируса гепатита С (так же, как и отсутствие зависимости между наличием RNA HCV в ткани печени и выраженностью морфологических изменений). Достоверной зависимости между обнаружением антигенов вируса гепатита С и тяжестью течения хронического гепатита С выявить не удалось. При проведении сравнительного анализа частоты обнаружения структурных и неструктурных белков HCV в гепатоцитах и степени активности воспалительного процесса и фиброза в ткани печени больных ХГС не было выявлено статистически значимых различий. Средние показатели ИГА и ИФ среди тех пациентов, у которых в ткани печени обнаруживали белки вируса гепатита С, не отличались от аналогичных показателей больных, у которых детекция вирусных белков не

28

дала положительных результатов. Использование иммуногистохимического метода может внести существенный вклад в совершенствование диагностики вирусного гепатита С, а также явиться в будущем основой для разработки дополнительных критериев, определяющих стратегию и тактику проведения противовирусной терапии больным хроническим гепатитом С.

Рисунок 4. Иммуношстохимическое окрашивание среза печени. Клетки печени больного хроническим гепатитом С, МКА к белкам вируса гепатита С.

На протяжении последнего десятилетия изыскиваются разнообразные подходы к лечению вирусного гепатита С, поиск ведётся а различных направлениях, одним из которых является использование лекарственных препаратов, воздействующих на патогенетические механизмы развития этого заболевания. Так, для подавления оксидативкого стресса, играющего важную роль в развитии патологического процесса ири хроническом гепатите С (Larrea E.ei ai., 1998, Lai M.M., 2002, Jain S.K, et al,, 2002), было предложено (Hellstrand К. et al., 1994, 2000) использование гистамина - биогенного амина, образующегося при декарбоксилировании аминокислоты гистидина.

Нами была проведена оценка эффективности и безопасности использования гистамина дигидрохлорида в комбинации с интерфероном-а2Ь при лечении хронического гепатита С. Исследование проводилось в соответствии с разрешением Этического комитета МЗ РФ. «Правилами проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации», одобренными Фармакологическим Государственным комитетом МЗ РФ. Роль

оксидативного стресса в развитии патологического процесса при хроническом гепатите С показана в работах многих исследователей (Hellstrand К. et al., 1994, Larrea E.et al., 1998, Andreana A. et al., 1999, Lai M.M., 2002, Jain S.K. et al., 2002). Предыдущие исследования (Valgimlgli L. et al, 2000) показали, что уровень ROS повышается в клетках печени, инфицированной вирусом гепатита С, некоторые белки вируса гепатита С (NS3, core) способны активировать NADPH-оксидазу в моноцитах крови, что стимулирует продукцию ROS, вызывая развитие оксидативного стресса (Bureau С. et al., 2001, Okuda М. et al., 2002). Гистамин связывается с Н2 - рецепторами макрофагов, ингибирует продукцию и освобождение ROS из моноцитов\макрофагов, таким образом защищая NK клетки и Т - клетки от повреждения ROS. Вероятно, улучшение результатов лечения больных хроническим гепатитом С в наших наблюдениях связано с тем, что гистамин, являясь потенцирующим адъювантом цитокиновой терапии, оказывает синергидное с ИФН-а2Ь действие, «поворачивая» иммунную супрессию и таким образом повышая эффективность лечения.

Все больные ХГС наряду с интерфероном-а2Ь получали различные дозы гистамина дигидрохлорида, в связи с чем среди больных были выделены четыре группы наблюдения (табл.2). Группа А: ИФН-а2Ь - 3 млн ME в\м, 3 раза в неделю (понедельник-среда-пятница), в сочетании с 1 мг ГДХ, вводимого подкожно 3 раза в те же дни недели. Группа В: ИФН-а2Ь - 3 млн ME в\м 3 раза в неделю в сочетании с 1 мг ГДХ, вводимого п/к 5 раз в неделю (один раз в день, с понедельника по пятницу). Группа С: ИФН-а2Ь - 3 млн ME в\м 3 раза в неделю в сочетании с 1 мг ГДХ, вводимого п/к, 6 раз в неделю (два раза в день, понедельник-среда-пятница). Группа Д: ИФН-а2Ь - 3 млн ME 3 раза в неделю в\м в сочетании с 1 мг ГДХ, вводимого подкожно, 10 раз в неделю (два раза в день, с понедельника по пятницу). Полный вирусологический ответ включал отсутствие индикации RNA HCV методом. Полный биохимический ответ предполагал нормализацию уровня АЛТ в сыворотке крови по сравнению с исходным уровнем. Пациентам, не ответившим на проводимое лечение через 12 недель (если изменения вирусологических и биохимических параметров не соответствовали критериям частичного или полного ответа), лечение было прекращено. Эффективность противовирусной терапии оценивалась также в группах пациентов, сформированных в зависимости от генотипа и уровня вирусной нагрузки. Ответившие на терапию пациенты получали лечение еще 36 недель (всего 48 недель). После окончания курса лечения пациенты были обследованы через 24 недели (т.е. спустя 72 недели от начала исследования).

Данные о половом и возрастном составе наблюдаемых больных, давности заболевания, а также их основные серологические параметры (вирусная нагрузка, генотип, средние показатели АЛТ) представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Демографические данные, давность заболевания, биохимические и вирусологические характеристики больных ХГС, включенных в исследование по оценке эффективности и безопасности комбинированного лечения ГДХ и ИФН-а2в

Пациенты, включенные в исследование

А(п=32) В (п=34) С (п=28) Д(п=32) Всего (п=126)

Средний возраст 31,6 (18-63) 29,8 (18-60) 30,4 (18-74) 28,3 (18-62) 30,0 (18-74)

Мужчины/женщины 30/2 32/2 26/2 32/0 120/6

Давность заболевания (месяцы), п (%)

6 12(38) 12(35) 12 (43) 17 (53) 53 (42)

7-12 4(12) 5(15) 7(25) 5(16) 21 (17)

13-24 8(25) 9(26) 5(18) 8(25) 30 (24)

>24 8(25) 8(24) 14(14) 2(6) 22 (17)

Генотип НСУ, п (%)

1а 2(6) 2(6) 0 3(9) 7(6)

1в 15 (47) 14(41) 12 (43) 10(31) 51 (40)

2 2(6) 4(12) 2(7) 2(6) 10(8)

3 12(38) 14(41) 14 (50) 17 (53) 57 (45)

другие 1(3) 0 0 0 1(11

ГШ А НСУ

Среднее кол-во копий в мл 6,8 ± 9,9 6,9 ±8,3 6,5 ±8,1 5,6 ± 7,8 6,5 ± 8,5

Высокая вирусная нагрузка (>2 млн копий в мл), п (%) 14 (44) 20 (59) 15 (54) 18 (56) 67(53)

Низкая вирусная нагрузка (<2 млн копий в мл), п (%) 18(56) 14 (41) 13 (46) 14 (41) 59(47)

АЛТ

Среднее значение (х норм) 5,4±3,9 6,1 ± 3,5 4,7 ± 2,9 5,8 ±4,1 5,6±3,6

Отсутствие маркёров репликации вируса гепатита С в сыворотке крови через 24 недели после окончания курса противовирусного лечения ИФН-а2в в сочетании с ГДХ (рис.5) отмечено у 35% всех наблюдаемых пациентов (от 31%) до 38% в группах наблюдения), что существенно превышает показатели устойчивого вирусологического ответа при проведении монотерапии ИФН-а2. Так, согласно опубликованным на основе рандомизированных исследований данный Роупагс! Т. е1 а1. (1998), МсШйсЫбоп 3.0. е! а1. (1998), ВагЬаго в. et а1. (2000), устойчивый вирусологический ответ зарегистрирован у пациентов, леченных только ИФН-а2, в 19%, 13% и 14% случаев соответственно. Все пациенты (35%), достигшие устойчивого вирусологического ответа в результате лечения ИФН-а2Ь и ГДХ, имели также устойчивый биохимический

ответ, в то время как на фоне монотерапии ИФН-а2 он регистрировался примерно у 16% пациентов.

В наших исследованиях получены значительно лучшие, чем при монотерапии ИФН-а2, результаты лечения больных ХГС среди лиц, инфицированных 1в генотипом; УВО зарегистрирован у 29% больных, показатели в разных лечебных группах колебались от 18% до 42% (табл. 3), тогда как при монотерапии препаратами интерферонового ряда - у 7 - 11% больных; отсутствие ЯЫА НСУ в сыворотке крови через 24 недели после окончания курса лечения было обнаружено у 26% пациентов с высокой вирусной нагрузкой (15 - 39% в разных лечебных группах), тогда как на фоне монотерапии ИФН-а2 вирусологический ответ при таком уровне вире ми и регистрируется у 7-13% наблюдаемых больных (Роупагс! Т., е1 а1, 1998, \lcHutchison 1.0., е1 а],, 1998). Анализ полученных данных показал, что частота формирования УВО среди наблюдаемых нами пациентов (табл.3) приближается к аналогичному показателю (43%) , достигнутому при использовании комбинации интерферона-а2 и рнбавирина (Роупагс! Т., е1 а], 1998, МсНЛсЫэоп 1.0., е* з1. 1998).

Лечение Наблюдение ■*-и—■---■———►

Рисунок 5. Частота вирусологического ответа среди больных ХГС, получавших лечение различными дозами ГДХ и ИФН-а2Ь

Необходимо отметить, что большинство пациентов данном исследовании составляли мужчины, поскольку, согласно протоколу, в исследование включались включены женщины, находящиеся в менопаузе или стерильные. Davis G.L., Lau J.Y. (1997) было показано, что мужчины реже, чем женщины отвечают на противовирусную терапию (моно- и

32

комбинированную). Это позволяет предположить, что частота УВО на фоне лечения ИФН-а2Ь и ГДХ могла бы быть выше в том случае, если бы в составе исследуемой группы было больше женщин.

Дизайн данного исследования включал четыре различных режима дозирования ГДХ, однако исследование не планировалось как направленное на выработку оптимальной дозы, рекомендуемой для введения. Количеством больных в каждой группе наблюдения было недостаточным для выводов о достоверности различий между используемыми режимами введения ГДХ. Вместе с тем, среди пациентов, получавшие ГДХ дважды в день 3 или 5 раз в неделю, устойчивый вирусологический и биохимический ответы наблюдались чаще.

Таблица 3.

Частота биохимического и вирусологического ответов среди больных ХГС получавших лечение ГДХ и ИФН-а2Ь

Варианты ответа на лечение Количество ответивших\количество включенных (%) (95% С1)

А (п=32) ( В (п=34) С (п=28) Д(п-32)

Биохимический ответ 48 недель (конец лечения)

Полный ответ (95%С1) 15\32 (47) (29.6, 64.2) 16\34 (47) (30.3, 63.8) 16\28 (57) (38.8, 75.5) 13\32 (41) (23.6, 57.6)

72 недели (устойчивый биохимический ответ)

Полный ответ (95%С1) 9\32 (28) (12.5,43,7) 11\34 (32) (16.6,48.1) 11\28 (39) (21.2, 57.4) 13\32 (41) (23.6, 57.6)

Вирусологический ответ 48 недель (конец лечения)

Полный ответ (95%С1) 16\32 (50) (32.7,67.3) 16\34 (47) I 16\28 (57) (30.3,63.8) | (38.8, 75.5) 15\32 (47) (29.6, 64.2)

72 недели (устойчивый вирусологический ответ)

Полный ответ (95%С1) 10\32 (31) (15.2,47,3) 12\34 (35) (16.6,48.1) 10\28 (36) (18.0, 53.5) 12\32 (38) (15.2,47.3)

Комбинированная терапия ИФН-а2Ь и ГДХ хорошо переносилась, побочные эффекты соответствовали профилям безопасности, характерным для обоих препаратов. Полученные данные показывают, что схема лечения больных хроническим гепатитом С, в которую, наряду с интерфероном-альфа2 входит применение гистамина дигидрохлорида, является безопасной, допустимой и эффективной, представляя возможную альтернативу существующему в настоящее время стандарту лечения хронического гепатита С (пегилированному ИФН-а2 и рибавирину) в тех случаях, когда у пациента наблюдается отсутствие ответа на проводимую терапию, наличие выраженных побочных реакций или противопоказаний для применения стандартных схем лечения больных хроническим гепатитом С и др.

Одним из факторов, ограничивающих в настоящее время широкое использование в клинической практике комбинированной терапии, включающей пегилированный ИФН-а2 и рибавирин, является высокая стоимость указанных лекарственных препаратов. В связи с этим особое значение приобретает разработка и внедрение в практику противовирусных препаратов отечественного производства. Оценка эффективности и безопасности комбинированной противовирусной терапии с применением рибавирина (первого, произведённого в России) и ИФН-а2а для лечения больных хроническим гепатитом С проводилась нами на основании общепринятых критериев. Токсичность используемых препаратов и безопасность проводимой терапии оценивали среди всех пациентов, рандомизированных в данное исследование, на протяжении всего периода лечения и следующего за ним шестимесячного периода наблюдения, на основании регистрации клинических признаков неблагоприятных явлений и по клинически значимым изменениям лабораторных показателей, с учётом длительности, тяжести и степени регистрируемых побочных явлений.

В исследование было включено 43 больных, 34 мужчины и 9 женщин в возрасте от 18 до 64 года с хроническим гепатитом С в стадии компенсации, прежде не получавших противовирусной терапии. У 63% наблюдаемых больных заболевание было вызвано 1 генотипом НСУ, у 37% пациентов определялся не 1 генотип. Вирусная нагрузка была исследована у 20 пациентов, при этом высокая концентрация вируса (>2,0x106 копий\мл) определялась у 15 из них, низкая (<2,0x106 копий\мл) - у 5 больных. Все наблюдаемые пациенты получали ИФН-а2а по 3 млн МЕ три раза в неделю в\м и ежедневно - рибавирин внутрь в дозе 1000-1200 мг в сутки в зависимости от массы тела (при массе тела > 75 кг пациент получал внутрь 1200 мг рибавирина в сутки в 2 приёма, < 75 кг - 1000 мг в сутки внутрь в 2 приёма).; при 1 генотипе продолжительность лечения составила 48 недель, терапия прекращалась, если через 24 недели не был достигнут вирусологический ответ. При не 1 генотипе лечение продолжалось 24 недели.

Анализ полученных данных показал, что через 12 недель терапии нормализация биохимических показателей была зарегистрирована у 67±7,2% всех включенных в исследование больных, у 63±7,4% - спустя 24 недели терапии и у 56±6,5% пациентов - спустя 24 недели после отмены противовирусного лечения. Вирусологический ответ в наблюдаемой группе в целом через 12 и 24 недели лечения рибавирином в сочетании с ИФН-а2а был получен у 60±7,5% и 63±7,4% больных соответственно; устойчивый вирусологический ответ сформировался у 51 ±7,6% больных хроническим гепатитом С.

Как и ожидалось, частота устойчивого биохимического и вирусологического ответов зависела от генотипа, вызвавшего развитие хронического гепатита С: при 1 генотипе устойчивый биохимический ответ был достигнут у 44% больных, при не 1 генотипе - у 75% пациентов, что

34

соответствует данным других авторов. Устойчивый вирусологический ответ наблюдался у 41% пациентов при 1 генотипе и у 69% больных - при не 1 генотипе (рис,6),

11м«( 24чед ЗДнед УЙО

О Генотип 1 Ш Генотип не 1 О Группа в целом

Рисунок 6. Частота вирусологического ответа у больных ХГС, пoлvчaвшиx лечение рибавирином и ИФН-а2а

[

Таким образом, комбинированная противовирусная терапия с использованием рибавирина и ИФН-а2а приводила к нормализации АЛТ у 56% больных хроническим гепатитом С; устойчивого вирусологического ответа удалось достигнуть в целом в исследуемой группе у 51% больных. Переносимость указанной комбинированной терапии в целом была хорошей, Полученные данные показывают эффективность и безопасность комбинации рибавирина и ИФН-а2а при лечении больных хроническим гепатитом С, сопоставимую с аналогичными показателями, полученными другими исследователями (РоупзМ Т., е1 а!, 1998, МсНтсЫзоп е1 а!., 1998).

Выводы.

1, Особенностью этиологической структуры острых вирусных гепатитов в г. Москве в 1998 г по сравнению с 1993-1994 гг явилось значительное увеличение удельного веса вирусных гепатитов с парентеральным путём передачи (78% и 53% соответственно). Вирусы гепатита В и дельта играют ведущую роль в развитии фульминантного течения и летального исхода при остром вирусном гепатите, обусловливая развитие

заболевания в 80% случаев. У 6% пациентов, имевших эпидемиологические и клинико-лабораторные признаки фульминантного вирусного гепатита, идентифицировать возбудителя не удалось. Микст-инфекция в различных сочетаниях (HBV\TOV\HCV\HGV\TTV\Parvovims В19) регистрировалась более чем у половины умерших, однако одновременное инфицирование несколькими вирусными агентами не оказывало существенного влияния на клинико-биохимические проявления болезни.

2. Наибольшее значение в инфицировании вирусами гепатитов В и С в Москве в 1998 г. имело внутривенное введение психоактивных веществ. Атрибутивный риск развития острого гепатита В у потребителей инъекционных наркотиков составил 46%, острого гепатита С - 78%. Проведение гемотрансфузии не является существенным фактором риска заражения вирусом гепатита В, однако в инфицировании вирусом гепатита С переливание крови играет важную роль. Существует риск инфицирования вирусом гепатита В при проведении парентеральных манипуляций в стационаре, в амбулаторных условиях и при посещении стоматолога.

3. ; Вирус гепатита G не является основным возбудителем вирусного гепатита не установленной этиологии, RNA HGV обнаружена только у 3,6% пациентов с острым вирусным гепатитом ни А ни Е. Значительно чаще RNA HGV обнаруживается у больных острыми гепатитами В и С (35 - 40%). Дополнительное инфицирование вирусом гепатита G не изменяло клинико-биохимических проявлений острого периода гепатита С и не влияло на тяжесть его течения. У 38% больных с фульминантным течением острого гепатита В в сыворотке крови обнаруживалась RNA HGV, однако это существенно не изменяло характерных для этой формы болезни клинико-лабораторных показателей.

4. В начальном периоде инфекционного процесса при острой желтушной форме вирусного гепатита С, так же как и при хронической форме инфекции, выявляется генетическая неоднородность и изменчивость индивидуальной популяции вируса, циркулирующей в крови. Изменчивость генома вируса гепатита С выражена при различных генотипах вируса, у больных с шпералатемией и при стойко нормальных показателях AJIT и не зависит от уровня вирусной нагрузки.

5. Геномная форма RNA вируса гепатита С в различных биологических субстратах организма (при одновременном исследовании сыворотки крови, лимфоцитов периферической крови и ткани печени) определяется у 90% больных хроническим гепатитом С. RNA HCV значительно чаще обнаруживается в ткани печени, чем в сыворотке крови и в лимфоцитах периферической крови. Более чем у 70% больных хроническим гепатитом С при отсутствии вирусной RNA в сыворотке крови этот маркер определяется в ткани печени, у половины - в лимфоцитах периферической крови.

6. У больных хроническим гепатитом С выявлены количественные и качественные различия в соотношении структурных и неструктурных белков вируса гепатита С в клетках печени. Вирусные белки (core, NS3, NS4A, NS4B) обнаружены только в цитоплазме гепатоцитов, при этом не определяется связи между локализацией окраски, выявляющей белки вируса гепатита С, и очагами воспаления и некроза ткани печени.

7. Каждый третий больной хроническим гепатитом С, в ткани печени которого была обнаружена геномная форма RNA HCV, имеет репликативную форму вирусной RNA в этом субстрате, в то время как «минус цепь» RNA HCV в лимфоцитах периферической крови не была выявлена ни у одного пациента. Белки вируса гепатита С обнаруживались у 97% пациентов, имеющих геномную RNA в ткани печени. Выявление соге-белка значительно чаще ассоциировалось с репликативной формой RNA HCV.

8. При повышенном уровне активности AJIT RNA HCV достоверно чаще выявляется в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и при одновременном исследовании трех субстратов (сыворотка крови, лимфоциты периферической крови, ткань печени) по сравнению с пациентами, у которых хронический гепатит С протекает с постоянно нормальной активностью АЛТ. В ткани печени геномная и репликативная форма RNA HCV обнаруживались в сравниваемых группах с одинаковой частотой.

9. Степень морфологических изменений в ткани печени у больных хроническим гепатитом С не взаимосвязана с обнаружением RNA HCV в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и в ткани печени; достоверная зависимость между обнаружением антигенов вируса гепатита С в гепатоцитах, степенью воспалительного процесса и стадией хронического гепатита С также отсутствовала.

10. Проведение комбинированной противовирусной терапии с использованием лекарственных препаратов различных фармакологических групп у больных хроническим гепатитом С позволяет значительно повысить эффективность лечения. Устойчивый вирусологический ответ при лечении препаратами отечественного производства -рибавирином в комбинации с ИФН-а2а - зарегистрирован у 51% больных хроническим гепатитом С (при 1 генотипе - у 41 %, при не 1 генотипе - у 69% больных).

11. Комплексная терапия хронического гепатита С, включающая, наряду с рекомбинантным интерфероном-а2Ь, гистамина дигидрохлорид, позволяет существенно улучшить результаты лечения по сравнению с монотерапией рекомбинантным интерфероном-а2: устойчивый вирусологический ответ наблюдается у 35% пациентов, в группе больных, инфицированных генотипом 1- в 29% случаев.

Практические рекомендации.

1. Алгоритм диагностики хронического гепатита С должен быть основан на комплексном обследовании больных с использованием новейших достижений медицинской и биологической науки и включать, наряду с эпидемиологическими, клиническими данными и биохимическими исследованиями сыворотки крови, проведение пункционной биопсии печени, определение RNA HCV (при необходимости - в различных биологических субстратах) с последующим изучением её свойств.

2. Более чем у половины больных с острым вирусным гепатитом не уточнённой этиологии удалось расшифровать этиологическую природу заболевания, дополнительно применив современные медицинские технологии. Это указывает на необходимость использования генных методов диагностики (полимеразной цепной реакции), в тех случаях, когда не удаётся обнаружить маркёры вирусных гепатитов, используя иммуноферментный анализ. Необходимо включение методов генодиагностики в стандарты диагностики острых вирусных гепатитов. Ранняя постановка диагноза острого вирусного гепатита С и, как следствие, своевременное начало специфической противовирусной терапии коренным образом изменяет исход этого трудно поддающегося лечению заболевания.

3. Иммунопероксидазный метод для выявления белков вируса гепатита С с помощью моноклональных антител является эффективным инструментом как диагностики, так и изучения функций отдельных белков вируса гепатита С на клеточном уровне. Обнаружение белков вируса гепатита С позволяет существенно обогатить возможности диагностики и контроля за течением хронической HCV-инфекции.

4. Лечение больных хроническим гепатитом С с использованием противовирусных препаратов отечественного производства (ИФН-а2а и рибавирина) позволяет добиться клинической эффективности, сопоставимой с эффективностью аналогичных лекарственных препаратов при проведении контролируемых клинических испытаний, и существенно снизить стоимость противовирусного лечения хронического гепатита С.

5. Использование рекомбинантного интерферона- а2Ъ в сочетании с гистамином дигидрохлоридом при лечении больных хроническим гепатитом С продемонстрировало безопасность и высокую клиническую эффективность при сравнении с монотерапией интерфероном-а2а. Данная схема лечения может быть назначена больным хроническим гепатитом С в режиме индивидуального курса - в тех случаях, когда существуют противопоказания для лечения рибавирином или проведение стандартного комбинированного курса терапии невозможно в связи с развитием серьёзных побочных явлений рибавирина.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сопоставление частоты встречаемости тяжелых форм вирусного гепатита В, Д и С и их исходов / Е.А.Климова, О.ОЗнойко, Горбарец И.П. и др. //Актуальные вопросы инфекционной патологии,- Иркутск, 1993.- С.83-84.

2. Исходы острого вирусного гепатита С / О.О.Знойко, Е.А.Климова, И.Н.Хлопова, И.П.Горбарец и др.// Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний,- М.: 1994.- С.82-84.

3. Климова Е.А. Лекции по инфекционным болезням: М.:ВУНМЦ. 1996.: Гепатит С.-С. 153-161.

4. Этиологическая структура фульминантных гепатитов на материале Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы / Е.А.Климова, Т.Л.Яшина, М.О.Фаворов и др. // Тезисы докладов II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д и в - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики». -Москва, 1997,- С.96.

5. Диагностическая значимость метода ПЦР при обследовании больных с НСУ-инфекцией / Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний». - Москва, 1998.- С.71-78.

6. Ющук Н.Д., Климова Е.А. Вирусные гепатиты - надвигающаяся опасность для человечества // Сборник научно-практических работ Московского лечебно-санитарного объединения. - Москва, 1998.- С.77-93.

7. Климова Е.А. Фульминантные гепатиты с летальным исходом: этиология и особенности их течения // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии.- 1998.-T.VIII. №5,- С.40-44.

8. Выявление полиморфизма геномной РНК вируса гепатита С / Е.Н.Ильина, А.Е.Гущин, ЕЛ.Климова и др. // Тезисы докладов Пятого Российского съезда врачей инфекционистов,- Москва, 1998.- С.128.

9. Распространение НОУ-инфекции среди больных вирусными гепатитами различной этиологии / Е.А.Климова, Т.Л.Яшина, М.О Фаворов и др. // Тезисы докладов Пятого Российского съезда врачей инфекционистов.-Москва, 1998.- С.143-144.

10. Частота выявления вирусов группы герпеса методом полимеразной цепной реакции у больных парентеральными гепатитами / Н.Д.Ющук Е.А.Климова, М.М.Гаджикулиева и др. // Тезисы докладов Пятого Российского съезда врачей инфекционистов.- Москва, 1998.- С.367-368

11. Вирусные гепатиты у беременных / В.Н.Кузьмин, Н.А.Малышев, Е.А.Климова и др.// Сборник научных трудов II съезда акушеров-гинекологов Северного Кавказа. - Ростов-на-Дону, 1998,- С.215.

12. Биохимическая картина желтушной формы острого гепатита С у больных с различным спектром серологических маркёров и результатов анализа полимеразной цепной реакции/Н.Д.Ющук, О.Л.Огиенко, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др.//Тезисы докладов Пятого Российского Съезда инфекционистов, Москва, 15,16,17 декабря.-М., 1998.-С.370-371.

13; Выявление полиморфизма геномной РНК вируса гепатита С/ Е.Н.Ильина, А.Е.Гущин, В.М Говорун, Е.А.Климова и др.//Тезисы докладов Пятого Российского съезда инфекционистов, Москва, 15,16,17 декабря.-М.,

1998.-С.128.

14. Современные аспекты изучения вирусных гепатитов / Н.Д .Ющук., О.О. Знойко, Е.А.Климова, Г.Н.Кареткина // Сборник научных трудов к 70-летию со дня рождения академика В.И. Покровского «Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний».- Москва, 1999.- С.265-274.

15. Распространенность маркеров герпесвирусных инфекций у больных парентеральными гепатитами / Н.Д. Ющук, Е.А.Климова, М.М. Гаджикулиева и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии.-1999.-№5.- С.36-41.

16. Новый подход в генотипировании вируса гепатита С / ЕЖИльина, А.Г.Гущин, Е.А.Климова и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни.-

1999.-№5.- С.23-26.

17. Характер морфологических изменений в печени у больных с НСУ-инфекцией в зависимости от уровня активности АЛТ / Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов симпозиума «Человек и Лекарство».-1999.- С.264.

18. Оценка генетической гетерогенности РНК вируса гепатита С. Возможность прогнозирования течения заболевания / Е.Н.Ильина, А.Г.Гущин, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики», Москва, 22-24 июня.-М.,1999.- С. 88-89.

19. Персистенция НСУ в плазме и лейкоцитах больных с хронической НСУ-инфекцией до и после лечения / Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики», Москва, 22-24 июня.- М., 1999.-С.260.

20. Климова Е.А. Лекции по инфекционным болезням:М.: ВУНМЦ.1999.:Вирусные гепатиты. Общие вопросы.-Т.2.- С.3-8.

21. Климова Е.А. Лекции по инфекционным болезням: М.: ВУНМЦ.1999.: Гепатит С.-Т.2.- С.30-38.

22. Диагностическая значимость выявления маркеров НСУ в печени и лимфоцитах периферической крови. Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний / Е.И.Лакина, О.В.Масалова, Е.А.Климова и др. // Материалы научной

40

конференции, посвященной 70-летию Нижегородского НИИЭМ, Нижний Новгород, 5-7 октября 1999 г. Нижний Новгород, 2000.- С.48.

23. Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение: Метод, рекомендации / Н.Д.Ющук, Н.П.Блохина, Е.А.Климова и др.- Москва, 2000.-44 с.

24. Изменчивость генома вируса гепатита С при острой НС-вирусной инфекции /Н.Д.Ющук, Е.А.Климова, Г.Н.Кареткина // Тезисы 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 25-27 января. -М., 2000.- С.214-215.

25. Сравнительный анализ геномной и репликативной форм РЖ вируса гепатита С в ткани печени, лимфоцитах и сыворотке крови больных хроническим гепатитом С / Е.И.Лакина, Е.И.Самохвалов, Е.А.Климова и др. //Тезисы 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине». -Москва, 2000,- С.198-199.

26. Выявление позитивных (геномных) и негативных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции / Е.И.Лакина, Е.И.Самохвалов, Е.А.Климова и др. // Вопросы вирусологии.- 2000.-N4.- С.37-41.

27. Климова Е.А., Знойко О.О. Предварительные результаты 2 фазы испытаний Максамина™(гистамина дигидрохлорида) в комбинации с Интроном-А® (интерфероном а-2Ь) при лечении хронического гепатита С. Анализ 48 недель лечения //Тезисы докладов научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)».- Москва, 2000.- С.64-66.

28. Изучение структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (HCV) в клетках печени пациентов с хроническим гепатитом С / А.Г.Абдулмеджидова, Е.И.Лакина, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)" Москва, 26-27 сентября 2000 г. -М., 2000,- С.3-4.

29. Степень морфологических изменений в печени у больных хроническим гепатитом С в зависимости от уровня активности АЛТ и наличия РНК HCV в ткани печени / Н.Д.Ющук, О.Г.Пылсва, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)".- Москва, 2000.- С.176-177.

30. Quantitative detection of hepatitis С core protein circulating within virions and immune complexes in serum of HCV-infected patients / O.Masalova, T.V.Vishnevskaya, E.A.Klimova et al //Abstracts of the European Virology.-Glasgow, Scotland, 2000. J. Clin. Virol.- V.18 - N1-3. -P.81-82.

31. Comparativ analysis of positiv and negativ HCV RNA chains in the liver, lymphocytes and serum of patients with chronic hepatitis С / E.Lakina, E.Samokhvalov, E.A.Klimova et al // Abstracts of X International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease.April 9-13,- Atlanta, USA, 2000,- P.127.

32. Ющук Н.Д., Климова Е.А. Острые вирусные гепатиты // Русский медицинский журнал,- 2000.-Т8.№17 (118).- С.-672-678.

33. Редкий случай гепатита А, осложнившийся развитием внутрисосудистого гемолиза и острой почечной недостаточностью / Е.А.Климова, А.В.Пивник, А.Е.Литвинов, С.А.Кесельман // Русский медицинский журнал,- 2000.-Т8.№17(118).-С. 679.

34. Significance of changing in genetic heterogeneity of HCV genome in acute hepatitis С / E.N.Ilina, V.M. Govorun, E.A.Klimova et al // Journal of Hepatology.- 2000,-Vol 34. Suppl.l.- P.l 10.

35. Роль геномной и репликативной форм РНК вируса гепатита С в патогенезе гепатита С / А.А.Кущ, Е.И.Самохвалов, Е.А.Климова и др.// Труды VIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии».- Гурзуф, 2000.-С.106-107.

36. Direct detection of HCV by solid phase hybridization with fluorescent probe / E.N.Ilina, V.M.Govorun, E.A.Klimova et al // Journal of Hepatology.-2000.-Vol 34. Suppl.l.-P.l 10.

37. Клиническое значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С / Н.Д.Ющук, О.Г.Пылева, Е.А.Климова и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии.-2001.-Т.Х1. №1.- Приложение №12.- Материалы Шестой Российской конференции «Гепатология сегодня».- Москва, 2001.-С.21.

38. Выявление белка NS3 вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью моноклональных антител / А.Г.Абдулмеджидова, О.В.Масалова, Е.А.Климова и др.// Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D -проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 2001,- С.4-5.

39. Климова Е.А., Знойко О.О. Результаты 2 фазы испытаний Максамина™(гистамина дигидрохлорида) в комбинации с Интроном-А® (интерфероном а-2Ь) при лечении хронического гепатита С. Анализ 72 недель наблюдения // Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 2001.- С. 167-168.

40. Парентеральные вирусные гепатиты с летальным исходом / Г.Н.Кареткина, Е.А.Климова, Н.Д.Ющук и др. // Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D -проблемы диагностики, лечения и профилактики»,- Москва, 2001.- С. 162163.

41. Значение современных лабораторных методов в диагностике острых вирусных гепатитов Н. Д. Ющук, Е.А.Климова, М.М.Гаджикулиева и др. // Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики»,-Москва, 2001,-С. 407-408.

42. Ющук Н. Д., Климова Е.А. Острые вирусные гепатиты // Врачебная газета.-2001.-№6.- С.13-14.

43. Значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С / Н.Д.Ющук, Е.А.Климова, О.Г.Пылёва и др. // Клиническая медицина.- 2001.- №12,- С.67-71.

44. Листериоз: варианты клинического течения / Н.Д.Ющук, Г.Н.Кареткина, Е.А.Климова и др.//Терапевтический архив.- 2001 .-№11 .-С.48-51.

45. Этиология острых вирусных гепатитов в г.Москве / Н.Д.Ющук, Е.А.Климова, М.М.Гаджикулиева и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии.-Приложение №16.-Материалы Седьмой Российской конференции «Гепатология сегодня».-Москва, 2002.-С.15.

46. Изменчивость генома HCV при лабораторном мониторинге больных острым вирусным гепатитом/Е.Н.Ильина, В.М.Говорун, Е.А.Климова и др.//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии,- 2002.-T.XIII. №1.-С.30-37.

47. A multicentre, randomized study to evaluate the safety and efficacy of histamine dihydrochloride and interferon-alpha-2b for the treatment of chronic hepatitis С / Y Lurie, F.Nevens, E.A.Klimova et al // Journal Viral Hepat.- 2002.-Sep;9(5).- P.346-53.

48. Острый жировой гепатоз беременных в инфекционной и акушерской клинике. Н.Д.Ющук, В.Н. Кузьмин, Е.А.Климова и др.// Клиническая медицина.- 2002.-№10.-С.51-56.

49. Методические рекомендации по клинико-лабораторной диагностике и профилактике вирусных гепатитов: Метод, рекомендации / Н.Д.Ющук, Ю .В .Мартынов, Е.А.Климова и др.- М.,2002.-3 8 с.

50. Вирусные гепатиты и острый жировой гепатоз беременных / Е-А.Климова, Г.Н.Кареткина, В.Н.Кузьмин, Н.Д.Ющук // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии.- 2003.- T.XIII. №1.-С.59-64.

51. Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных острым гепатитом В / Л.Ц.Митрикова, Е.А.Климова, Н.Д.Ющук и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни,- 2003 .-№3.- С.34-37.

52. Исследование показателей Fas-зависимого апоптоза в сыворотке крови больных острыми вирусными гепатитами А и В / Митрикова Л.Ц., Е.А.Климова, Ющук Н.Д., Кушлинский Н.Е. и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии. -2003.-T.XI1L- №2 -С. 59-64.

53. Сравнительная характеристика биохимических и морфологических показателей у больных ХГС с постоянно нормальной и волнообразной активностью трансаминаз / О.О.Знойко, Н.Х.Сафиуллина, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов V Российской научно-практической конференции

«Гепатит В, С и Б - проблемы диагностики, лечения и профилактики».-Москва, 2003,- С. 112.

54. Летальные исходы от вирусных гепатитов и их последствий / Г.Н.Кареткина, О.О.Знойко, Е.А.Кпимова и др. // Тезисы докладов V Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и Б -проблемы диагностики, лечения и профилактики»,- Москва, 2003.- С.124-125.

55. Современные методы лабораторной диагностики острых вирусных гепатитов / О.О.Знойко, Е.А.Климова, М.М.Гаджикулиева, Н.Д.Ющук и др. // Тезисы докладов VI Российского съезда врачей-инфекционистов 29-31 октября 2003 г..- СПб, 2003.- С.449.

56. Хронический гепатит С: рациональная противовирусная терапия / Е.А.Климова, О.О.Знойко, С.Л.Максимов и др. // Фарматека.-2003.-№7 (70).- С.Ю-16.

57. Климова Е.А. Диагностика и лечение хронического гепатита В. Школа гепатолога: Приложение к журналу «Новое в медицине и фармации».-Алматы, 2004.-20 с.

58. Благоприятный исход печёночной комы при остром гепатите В с дельта-агентом (клиническое наблюдение) Е.А.Климова, В.Г.Петряев, А.Е.Литвинов и др./Тезисы докладов Десятой Российской конференция «Гепатология сегодня».-Москва,2005.-С.56.

59. Результаты комбинированной терапии хронического гепатита С отечественными препаратами / Е.А.Климова, О.О.Знойко, С.Л.Максимов, Н.Д.Ющук // Материалы 5-ой Восточно-Сибирская гастроэнтерологическая конференция с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения». -Красноярск, 2005.- С.194-199.

60. Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных пациентов // Методическое письмо // Н.Д.Ющук, Ю.В.Мартынов, Е.А.Климова и др.- М.,2006.-38 с.

61. Климова Е.А. Гепатит С: Практическое и методическое пособие/М.,2006.-С. 121-150.

Список сокращений

AJIT - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза HCV - вирус гепатита С ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ГА - гепатит А

ГДХ - гистамина дигидрохлорид

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

ИГА - индекс гистологической активности

ИФ - индекс фиброза

ИФА - иммуиоферментиый анализ

ИФНа2 - интерферон-альфа2

ЛПК - лимфоциты периферической крови

МКА - моноклональные антитела

ОВГ - острый вирусный гепатит

ОГВ - острый гепатит В

ОГС - острый гепатит С

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПБП - пункционная биопсия печени

CK - сыворотка крови

ТП - ткань печени

УВО - устойчивый вирусологический ответ ХГС - хронический гепатит С ЦП - цирроз печени ЩФ - щелочная фосфатаза

анти-HAV IgM\G - антитела к вирусу гепатита А иммуноглобулинов типа M\G анти-HBcore IgM\G - антитела к сердцевидному антигену вируса гепатита В

иммуноглобулинов типа M\G анти-HCV- антитела к вируса гепатита С

анти-HDV IgM\G - антитела к вируса гепатита дельта иммуноглобулинов типа M\G

анти-HEV - антитела к вирусу гепатита Е

HVR1 - гипервариабельный регион1

CDC - Центр по контролю заболеваемости и профилактике

DNA CMV - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) цитомегаловируса

DNA EBV - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) вируса Эпштейна-Барр

HBsAg- поверхностный антиген вируса гепатита В

HBV - вирус гепатита В

HCV - вирус гепатита С

HEV - вирус гепатита Е

HGV - вирус гепатита G

LE-клетки - клетки Хергрейвса

NANE - гепатит ни А ни Е

NK - натуральные киллеры

Parvo-B 19 - нарвовирус В19

RNA HCV - рибонуклеиновая кислота (РНК) вируса гепатита С RNA HGV - рибонуклеиновая кислота (РНК) вируса гепатита G ROS- реактивные метаболиты кислорода

SSCP - анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК TTV- вирус гепатита TT

Заказ №571. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палнха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Снижение инфекционной заболеваемости является важнейшей составной частью охраны здоровья населения, которая, а свою очередь, представляет один Hi основных приоритетов государственной политики. В 2006 г. начата реализация Национального проекта но "здравоохранению, в котором борьба с вирусными гепатитами, занимает ведущее место. Ежегодно инфекционные болезни являются причиной смерти более чем у t4 млн. человек, от гепатнтв В и С в мире каждый гол погибает около 1 млн. человек, ещё большее количество инфицированных этими вирусами людей теряет трудоспособность и социальную адаптацию, В мире проживает по меньшей мере 2 миллиарда человек, которые перенесли острый манифестный или бессимптомный гепатит В и около 350 млн. хронических анрусоноснтелей; вирусом гепатита С инфицировано 3% популяции {1^0 млн.), около 80% лиц, перенесших острую форму болезни, формируют хронический гепаткт (79г [70, 296, 402]. Таким образом, свыше 500 млн. человек в мире страдают от хронического вирусного поражения печени. В настоящее время доказана этиологическая связь между первичной гепатоцеллюлярной карциномой и ннрусами гепатитов В и С, более 75% случаев рака печени обусловлены этими вирусами [320], каждый из них повышает риск развития рака печени примерно в 20 раз [143]. Хроническая HCV-ннфскцня является одной из основных причин смерти больных циррозом печени и наиболее частым показанием для ортотопнческой трансплантации печени.

В России на смену резкому иодъёчу заболеваемости острыми вирусными гепатитами [3. 21, 29, 39. 43. 62]. наблюдавшуюся в 1996-1999 гг, пришла эпидемия хронических вирусных гепатитов, ежегодно регистрируется увеличение количества впервые выявленных случаев хронического поражения печени вирусной этиологи и и числа носителей вирусов В и С {10, 67]. Данные показатели, по мнению большинства исслелователей, являются заниженными, поскольку большая часть случаев острого вирусного гепатита протекает без желтухи, не попадая, таким образом» в поле зрения врачей.

Экономические потери, связанные с парентеральными гепатитами, со» ставляют основную долю ущерба от наиболее распространенных инфекционных заболеваний Так, суммарный ущерб, наносимый обществу HCV-инфекцией, составил а 2003 г. почти полтора миллиарда рублей J57] Научные разработки последних десятилетий позволили существенно расширить «алфавит» вирусных гепатитов за счет идентификации новых вирусных агента, способных вы плыть развитие воспалительного процесса н ткани печени [4, 12, 23, 138. 155. 367. 385J. Однако до настоящего времени роль отдельных вирусов (HGV, TTV. SEN) н их сочетаний в развитии поражения печени не вполне ясна и требует дальнейшего уточнения, в том числе при фульмннантном течении вирусного гепатита.

Возможности противовирусного лечения хронического гепатита С в настоящее время стали существенно шире [5, 6, 8, 17, 18, 37, 51, 63, 64]. Созданы и внедрены в клиническую практику лекарственные препараты* обладающие улучшенными фармакокннетнческнмн и фармаколннамнческнми свойствами, используются разнообразные лотовые и временные режимы при проведении курса лечения, применяются комбинации препаратов с различным механизмом противовирусного действия Однако по-прежнему проведение этиотропното лечения хронического гепатита С ограннчивакл его высокая стоимость и отсутствие надежного эффекта у значительной част пациентов (36, 46. 48, 203). Среди многообразных патогенетических механизмов развития хронического гепатита С важное место занимает развитие окендативного стресса [229, 318], поэтому весьма перспективным является изучение эффективности лекарственных препаратов, способствующих уменьшению воздействия образующихся в процессе болезни свободных радикалов кислорода [187, 188,205,252].

Установленный факт циркуляции вируса гепатита С в организме человека в виде гетерогенной смеси близкородственных мутантных штаммов, прныадлежащих к одному генотипу вируса, но имеющих генетические отличия в вариабельных областях вирусного генома |76, 150, 151,152,265J, несомненно, явился вехой для развития системы знаний, способствующих пониманию механизмов длительной {возможно, пожизненной) персистенцин вируса, Однако имеется множество данных, свидетельствующих о к ваш видовой природе популяции вирусов, циркулирующих в организме больного хроническим гепатитом С. в то время как сведения, касающиеся гетерогенности вируса гепатита С а острой фазе болезни, немногочисленны {151, 194, 376], полученные данные противоречивы и крайне скудны, в то время как изучение свойств возбудителя и патологических сдвигов, происходящих в организме больного на самых ранних эта* пах инфекционного процесса, необходимы для разработки более эффективных методов борьбы с зтим недугом. Обнаружение рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С. несушей генетическую информацию, характеризующую свойства данного возбудителя, не только в сыворотке крови, но и в других биологическим субстратах организма (в ткани печени и мозга, в лимфоцитах периферической крови, в мышце сердца, в костном мозге и др.) обусловило стремительность дальнейшего прогресса в области изучения патогенетических механизмов НС V-ннфекцнн {54, 72]. Однако до сих пор не решен вопрос о возможной экст-рапечеиочной репликации вируса гепатита С [98). Предметом дискуссии остаётся также наличие взаимосвязи между выраженностью морфологических изменении в ткани печени и частотой выявления RNA HCV в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и в ткани печени.

Предположения о механизмах повреждающего действия вируса на печёночную клетку изменяются но мере накопления результатов научных исследований Прежние представления о преобладающем цнтонатическом действии вируса, при котором на клеточные мембраны и структуры гепатоцита действуют компоненты внриона или виру специфических продуктов (37, 223, 287) расширены за счёт возможного иммуиоопосредоваиного воздействия. Не исключено, что иммуиооносредованное действие, направленное на внутриклеточs ные антигены НСV. играет ведущую роль (295, 303]. В этой связи несомненный интерес представляет обнаружение белков HCV в ткани печени, что, й свою очередь, позволит составить более полные представления о механизмах повреждения гепатоцнта

Вей это обусловливает необходимость дальнейшего изучения вирусных гепатитов различной этнологии {А. В, С, Д, Е и др.) - с точки зрения своевременной и надежной этиологической расшифровки, частоты встречаемости раз* личных факторов риска их передачи, возможности условий прогрессироваиия патологического процесса печени для выработки оптимальной тактики противовирусного лечения. Большая актуальность изучения рассмотренных выше вопросов определила цели н мдачн настоящей диссертационной работы и её научное значение.

Цель исследовании.

Разработка программы и методов этиопатогенетичеекого лечения хронического гепатита С на основе современных генно-инженерных методов диагностики и обоснования тактики комбинированной противовирусной терапии, а также анализ факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С с использованием методов аналитической эпидемиологии для совершенствовання профилактических мероприятий в отношении парентеральных вирусных гепатитов,

Задачи работы в соответствии с поставленной целью были следующие;

1 Сравнительное изучение этнологической структуры острых вирусных гепатитов среди пациентов, находившихся на лечении в Инфекционной клинической больнице №1 г Москвы в период 1993-1994 и J 998 гг., в том числе нх фульминат пых форм, и роли мнкст-ннфекпни в развитии фульмннант-иых гепатитов.

2. Определение роли вируса гепатит G в этнологии острого вирусного гепатита и его влияния на течение острого гепатита С и фульмииантных вирусных гепатитов,

3. Исследование факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С с непользованием методов аналитической эпидемиологии на основании анализа данных, полученных при опросе больных и лиц группы сравнения с использованием анкеты* разработанной совместно с Центром по контролю заболеваемости и профилактике заболеваний (CDC* Атланта* США).

4. Определение генетической неоднородности и изменчивости индивидуальной популяции вируса гепатита С, циркулирующей в крови при острой желтушной форме вирусного гепатита С н сопоставление этих данных с уровнем вирусной нагрузки и показателями АЛТ.

5. Выявление зависимости между клнннко - биохимическими особенностями хронического гепатита С, степенью морфологических изменений в печени и наличием рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С в различим* биологических субстратах больных хроническим гепатитом С на основании определения геномной и репликагивной формы RNA HCV одновременно в трех субстратах - сыворогке крови, лимфоцитах периферической крови и ткани печени.

6. Проведение сравнительного исследования экспрессии структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (core, NS3, NS4A, NS4B) в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью нммунопероксидазного метола с использованием моноклональиых антител к белкам вируса гепатита С

7. Опенка эффективности и безопасности использования гнетами на днгнлрохлорила в комбинации с рекомбннаиткым интерфероном-альфа2а для лечения больных хроническим гепатитом С,

8. Оценка эффектавности и безопасности использования рнбавирнна в комбинации с рекомбинантаым интерфероном-ал ьфа2в для лечения больных хроническим гепатитом С.

Работа выполнена в клннккс кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии а ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава (ректор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ющук Н.Д) на бате ГУЗ г Москвы ИКШ1 ДЗ г Москвы (гл. врач - д.м.н., проф. Малышев Н.Л , зав. консультативным специализированным гепатологическнм отделом - д.м.н., проф. Блохнна Н.П.), В выполнении отдельных фрагментов работы принимали участие сотрудники лаборатории диагностики вирусных гепатитов Центра но контролю н профилактике заболеваний {СЕКТ, Атланта, США), лаборатории генной инженерии и нммуно-генетнкн ФГУ «НИИ Физико-химической медицины» Росздрава, лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, ГУЗ г. Москвы ИКБ ДЗ г, Москвы, компании Maxim Pharmaceuticals Inc. (США), и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ (д.м.н. Фаворов М.О. к.м.н. Яшина TJL, Д.6.К., проф. Говорун В.М., к.б.н. Нчьнна Е-Н-, д.б.н., проф. Кущ А.А., к.б.н. Масалова О.В., Келли Е.И., к.м.н. Брагинский Д.М., к.м.и, Знойко О.О,, к.м.н. К'ареткнна ПН, к.м.н. Гаджикулиева М.М., к.м.н Пылбва ОХ. н к.м.н. Максимов СЛ.), которых искренно благодарю за помощь.

Приношу глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, ректору Московского государственного медико-стоматологического университета, заведующему кафедрой инфекционных болезней н эпидемиологии, академику РАМН, профессору Николаю Дмитриевичу Юшуку за большую научно-консультативную помощь, оказанную при проведении настоящей работы.

Няучнйн повита исследовании Уточнена этиологическая структура острых вирусных гепатитов и подтверждено мнение о ей выраженной изменчивости ь зависимости от активности эпидемического процесса. Показана ведущая роль вирусов гепатита В и дельта в развитии летального исхода при фульмнпаи гном течении вирусного гепатита, а также наличие значительной доли микст-инфекции и недифференцированно! о вирусного гепатита среди этой категории пациентов- Изучены клиинко-бнохимнческие особенности течения фульминаитных форм острых вирусных гепатитов различной этнологии и острого гепатита С при дополнительном инфицировании вирусом гепатита G Впервые проведено исследование факторов риска инфицирования вирусами гепатитов В и С с использованием методов аналитической эпидемиологии. Впервые определена генетическая неоднородность к изменчивость индивидуальной популяции вируса гепатита С при острой форме инфекции. Установлены общие закономерности циркуляции вируса гепатита С а организме больных хроническим гепатитом С, показана возможность детскими геномной и реплнкатнаной RNA HCV в различных биологических субстратах. Впервые исследована возможность репликации вируса гепатита С в лимфоингах периферической крови. Изучена взаимосвязь между степенью морфологических изменений в ткани печени и обнаружением RNA вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и ткани печени. Впервые проведено исследование экспрессии структурных и неструктурных белков вируса гепатита С в клетках печени больных при различных вариантах течения болезни и при разной стел сии морфологических изменений. Показана высокая эффективность комбинированной терапии хронического гепатита С при использовании рекомбинантпого интерферона с препаратами других фармакологических групп.

Практическая ценность работы.

1. Обоснована необходимость включения методов генной диагностики в стандарты днагностики острых вирусных гепатитов, что позволит существенно улучшить этнологическую расшифровку острых вирусных гепатитов.

2, Предложено комплексное обследование больных хронического гепатита С с использованием новейших достижений медицинской и биологической науки, включающее, наряду с эпидемиологическим и клннико-лабораторным исследованиями, проведение пункцнонной биопсии печени, onредслснис RNA HCV (при необходимости - в различных биологических субстратах) и изучение ее свойств.

3. Показана возможности выявления белков вируса гепатита С в ткани печени нммуиоперокс н д аз и ым методом с применением моноклональных антител, что может быть использовано для совершенствования диагностики вирусного гепатита С.

4. Продемонстрирована высокая клиническая эффективность противовирусных препаратов отечественного производства (рибавнрина и ннтерфе-рона-альфз2э) для лечения больных хроническим гепатитом С.

5. Показаны преимущества этиопатогенетичеекого лечения бальных хроническим гспал1том С с использованием ннтсрферона-альфа2в и гнетамипа лнгндрохлорнда по сравнению с ионотерапией рекомбннантными интерферо-намн.

6. Обоснована необходимость учёта ведущих факторов риска инфицирования в системе профилактики вирусных гепатитов В и С. значимость которых меняется в зависимости от эпидемиологической ситуации.

Анробанни работы н внедрение в практику, Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Российской академии медицинских наук (1997), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д н О - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики» (1997, 2001). Российско-германском симпозиуме «Новые технологии в клинической практике, хирургии и онкологии» 2 ноября 1999 г,, 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» 25 января 2000 г., V, VI, VII, VIII, IX, X Российской конференции чГепатология сегодня» {2000. 2001. 2002,. 2003. 2004, 2005), Российском национальном конгрессе «Человек н лекарство» (2000. 2003, 2004, 2006). Научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)" в 2000 r„ VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни; диагностика, лечение, профилактика* в декабре 2000 г. в г, Санкт-Петербурге, на Совещании по улучшению систем иммунизации и применению вакцины против гепатита В в странах Центральной и Восточной Европы и Новых Независимых Государств в г. Санкт-Петербурге, 27 июня 2001 г,, на конференции «Эпидемиология, профилактика, контроль и лечение вирусных гепатитов» 30 октября 2001 в г. Ллматы, Казахстан, на заседании Общества врачеи-иифекцнаиистов г. Москвы в мае 2002 г„ иа Совещании по вопросам ВИЧ-инфекпин, СПИД н вирусных парентеральных гепатитов I октября 2002 в г Суздаль, на Восьмой Российской гастроэнтерологической неделе 21 ноября

2002 г~ (Москва), на Международном тренинге-конференции «Интегрированное слежение для контроля н профилактики ВИЧ/СПИД, вирусных гепатитов и ИППП в Центрально-Азиатском регионе» (Ташкент, Узбекистан, 9 октября

2003 г.), на IV съезде общества гастроэнтерологов (4 февраля 2004 г., г. Москва), научно-практической конференции «Вопросы инфекпионной патологии Урала», (Тюмень, 18 мая 2004 г ), научно-практической конференции в Ставрополе 27 мая 2004 г., на выездном пленуме Научного общества гастроэнтерологов России в Новосибирске 24 ноября 2004 г., на 5-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клннико-эпидемнологнческие и тгао-экологичеекне проблемы заболеваний органов пищеварения» (г, Красноярск, 28 апреля 2005 Г.), Стендовый доклад «Histological status in asymptomatic chronic HCV infection» представлен в октябре 2001 г в г. Амстердаме.

Основные положения диссертации изложены в 6] печатной работе, которые опубликованы в период с 1993 г, по 2006 г

Выдвинутые на основании проведённых исследований наложения вошли в методические рекомендации «Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение» (2000), «Методические указания по клиннко-лабораторной диагностике и профилактике вирусных гепатитов» (2002). «Противовирусная терапия хроннческнх вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных» (2006), «Гепатит (2006) и другие инструктивно-методические документы. Основные положения диссертации вошли также в «Лекции по инфекционным болезням» под редакцией академика РАМН профессора Ющука Н.Д. (1996, 1999). Результаты настоящего исследования используются а учебном процессе Московского государственного медико-стоматологического университета по подготовке студентов, интернов, клинических ординаторов, врачей — слушателей курсов на факультете постдиплочного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий. Результаты диссертационной работы внедрены » практическую работу Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Структура и объем диссертации,

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, включает в себя введение, несколько глав собственных исследований, заключение и выводы, работа проиллюстрирована 38 таблицами, 3] рисунком и 7 фотоизображениями. Обзор литературы составлен на основании анализа 428 источников.

ВЫВОДЫ,

К Особенностью этиологической структуры острых вирусных гепатитов в г. Москве а 1998 г по сравнению с (993-1994 гг явилось значительное увеличение удельного веса вирусных гепатитов с парентеральным путём передачи (78% и 53% соответственно). Вирусы гепатита В и дельта играют ведущую роль в развитии фульминантного течения и летального исхода при остром вирусном гепатнге, обусловливая развитие заболевания в 80% случаев. У 6% пациентов, имевших эпидемиологические и клн и и ко-лабораторные признаки фульминантного вирусного гепатнта, идентифицировать возбудителя не удалось, Микст-инфекцня в различных сочетаниях (HB\AHDV^CVWGV\TTVVParvo virus В19) регистрировалась более чем у половины умерших, однако одновременное инфицирование несколькими вирусными агентами не оказывало существенного влияния на клиинко-биохимические проявления болезин.

2. Наибольшее значение в инфицировании вирусами гепатитов В и С в Москве в 1998 г имело внутривенное введение психоактивных веществ. Атрибутивный риск развития острого гепатита В у потребителей инъекционных наркотиков составил 46%, острого гепатита С -78%. Проведение гемотрансфузни не является существенным фактором риска заражения вирусом гепатита В, однако в инфицировании вирусом гепатита С переливание крови играет важную роль. Существует риск инфицирования вирусом гепатита В при проведении парентеральных манипуляций в стационаре, в амбулаторных условиях и при посещении стоматолога.

3. Вирус гепатита G не является основным возбудителем вирусного гепатита не установленной этиологии, RNA HGV обнаружена только у 3,6% пациентов с острым вирусным гепатитом ни А ни Е. Значительно чаще RNA HGV определялась у больных острыми гепатитами В и С (40%), Дополнительное инфицирование вирусом гепатита G не изменяло клмннко-бнохнмнчсских проявлений острого периода гепатита С И не влияло на тяжесть его течения. У 38% больных с фульминантным течением острого гепатита В в сыворотке крови обнаруживалась RNA IIGV, однако это существенно не изменяло характерных для ттоЙ формы болезни клннико-дибораторных показателей.

4. В начальном периоде инфекционного процесса прн острой желтушной форме вирусного гепатита С, гак же, как и прн хронической форме инфекции, выявляется генетическая неоднородность и изменчивость индивидуальной популяции вируса, циркулирующей в крови. Изменчивость генома вируса гепатита С выражена при различных генотипах вируса, у больных с гнперапатемней и при стойко нормальных показателях АЛТ и не зависит от уровня вирусной нагрузки.

5. Геномная форма RNA вируса гепатита С в различных биологических субстратах организма (при одновременном исследовании сыворотки крови, лимфоцитов периферической крови и тканн печени) определяется у 90% бальных хроническим гепатитом С. RNA HCV значительно чаше обнаруживается в ткани печени, чем в сыворотке крови н в лимфоцитах периферической крови Более чем у 70% больных хроническим гепатитом С при отсутствии вирусной RNA в сыворотке крови этот маркер определяется в ткани печени, у половины - в лимфоцитах периферической крови.

6. У больных хроническим гепатитом С выявлены количественные н качественные различия в соотношении структурных н неструктурных белков вируса гепатита С в клетках печени. Вирусные белки (core, NS3r NS4A, NS4B) обнаружены только в цитоплазме гепатонитов. при этом не определяется енязн между локализацией окраски, выяяляющей белки вируса гепатита С, н очагамн воспаления и некроза тканн печени.

7. Каждый третий больной хроническим апатитом С, в гкани печени которого была обнаружена геномная форма RNA HCV, имеет рсплнкатнвную форму вирусной RNA в этом субстрате, в то время как «минус цепь» RN А НС V в лимфоцитах периферической крови не была выявлена ни у одного пациента. Белки вируса гепатита С обнаруживались у 97% пациентов, имеющих геномную RNA в тканн печени. Выявление согс-бслка значительно чаше ассоциировалось с реплнкативной формой RNA HCV,

8. При повышенном уровне активности АЛТ RNA HCV достоверно чаше выявляется а сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и при одновременном исследовании трех субстратов (сыворотка кровн, лимфоциты периферической кровн, ткань печени) по сравнению с пациентами, у которых хронический гепатит С протекает с постоянно нормальной активностью АЛТ- В ткани печени геномная и реилнкатнвная форма RNA HCV обнаруживались в сравниваемых группах с одинаковой частотой.

9. Степень морфологаческих изменений в ткани печени у больных хронн'нгскнм гепатитом С не взаимосвязана с обнаружением RNA HCV в сыворотке крови, лимфоцитах периферической крови и в ткани печени; достоверная зависимость между обнаружением антигенов вируса гепатита С в гепатоцнтах, степенью воспалительного процесса и стадией хроническою гепатита С также отсутствовала.

10. Проведение комбинированной противовирусной терапии с использованием лекарственных препаратов различных фармакологических групп у больных хроническим гепатитом С позволяет значительно повысить эффективность лечения, Устойчивый вирусологический ответ при лечении рибавнрнном в комбинации с НФН-«2а отечественного производства зарегистрирован у 51% больных хроническим гепатитом С (прн 1 генотипе • у 41%, при не 1 генотипе - у 69% больных),

11. Комплексная терапия хронического гепатита С. включающая, наряду с рскомбинантным ннтсрфсроном-а2Ь, гнетами на днгидрохлорнд, позволяет существенно улучшить результаты лечения при сравнении с монотерапией рекомбииантным интерфероном^ устойчивый вирусологический ответ наблюдается у 35% пациентов, в группе больных, инфицированных генотипом 1- в 29% случаев.

Практические рекомендации,

I Алгоритм диагностики хронического гепатита С должен быть основой на комплексном обследовании больных с использованием новейших достижений медицинской и биологической науки и включать, наряду с эпидемиологическими и клиническими данными, биохимическими исследованиями сыворотки крови, проведение пупки нон ной биопсин печени, определение RNA IICV {при необходимости ■ в различных биологических субстратах) и изучение ей свойств,

2. Более чем у половины больных с острым вирусным гепатитом не уточнённой этиологии удалось расшифровать этиологическую природу заболевания, дополнительно применив современные медицинские технологии. Это указывает на необходимость использования генных методов диагностики {полнмеразиой цепной реакции), в тех случаях, когда не удаётся обнаружить маркёры вирусных гепатитов с использованием нммуноферментного анализа Необходимо включение методов генодиагностики в стандарты диагностики острых вирус ныл; гепатитов Ранняя постановка диагноза острого вирусного гепашта С и, как следствие, своевременное начало специфической противовирусной терапии коренным образом изменяет исход этого трудно поддающегося лечению заболевания.

3- Иммуноперокснлазиый метол для выявления белков вируса гепатита С с помощью моноклон альных антител является эффективным инструментом как диагностики, так и изучения функций отдельных белков вируса гепатита С на клеточном уровне, Обнаружение белков вируса гепатита С позволяет существенно обогатить возможности диагностики и контроля за течением хронической HCV- инфекции,

4. Лечение больных хроническим гепатитом С с использованием противовирусных препаратов отечественного производства (ИФН-о2а и рнбавирнна) позволяет добиться клинической эффективности, сопоставимой с эффективностью аналогичных лекарственных препаратов прн проведении контролируемых клинических испытаний, и существенно снизить стоимость противовирусного лечения хронического гепатита С.

5. Использование рекомбинантного интерферона- о2Ь в сочетании с гнетами и ом днгндрохлоридом при лечении больных хроническим гепатитом С продемонстрировало безопасность и высокую клиническую эффективность при сравнении с монотерапией ннтерфероном-а2а. Данная схема лечения может быть назначена больным хроническим гепатитом С а режиме индивидуального курса - в тех случаях, когда существуют противопоказания для лечения рибавирнном или проведение стандартного комбинированного курса терапии невозможно в связи с развитием серьёзных побочных явлений рнбавирина.