Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Уровень антител к HLA в прогнозе отторжения почечного трансплантата

На правах рукописи

ДОРОНИНА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

УРОВЕНЬ АНТИТЕЛ К НЬА В ПРОГНОЗЕ ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА

14.03.09. КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ, АЛЛЕРГОЛОГИЯ 14.01.24. ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ И ИСКУССТВЕННЫЕ ОРГАНЫ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 ОКТ 2014

Москва -2014

005553331

005553331

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи имени П.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы»

Научные руководители:

доктор медицинских наук Боровкова Наталья Валерьевна

член-корреспондент РАН,

доктор медицинских наук, профессор Хубутия Мотели Шалвович

Официальный оппонент:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией медицинской цитологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного

образования» Минздрава России Василенко Ирина Анатольевна

Официальный оппонент:

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела клинической трансплантологии, ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»

Минздрава России Шаршаткин Алексей Вячеславович

Ведущая организация:

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследоватеьский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Защита диссертации состоится «20» ноября 2014 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казенный, д. 5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, www.instmech.ru

Автореферат разослан: « ■> октября 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

Актуальность темы

Трансплантация органов в настоящее время считается полноправным клиническим методом, который широко используется во многих лечебных учреждениях во всём мире. Трансплантация органов включает в себя новейшие достижения в хирургии, реаниматологии, анестезиологии, иммунологии, фармакологии и других медико-биологических наук.

За последние десятилетия развитие эффективных иммуносупрессивных препаратов, а также достижения в области хирургической техники привело к очевидному улучшению в долгосрочном выживании трансплантируемого органа. Успехи клинической трансплантации - низкая смертность, высокая выживаемость трансплантатов и низкая частота эпизодов отторжения, затрудняют доказательство преимуществ новых подходов [Данович Г.М., 2009].

Данные литературы свидетельствуют, что важную роль в развитии хронической почечной дисфункции трансплантата и к его утрате играет гуморальный ответ на аллоантигены [Шумаков В.И., 2005; Akalin Е., 2008; Хубутия М.Ш., 2011; Хаитов P.M., 2013]. После трансплантации в организме реципиента развивается иммунный ответ на многочисленные антигены трансплантата. Наиболее изученные антигены человека, с которым связан иммунный ответ на трансплантат — это антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA - Human Leucocyte Antigens), иногда их называют трансплантационными антигенами [Dupont В., 1989]. Иммунный ответ на трансплантат обусловлен в первую очередь распознаванием антигенов HLA донора лимфоцитами реципиента. Это вызывает активацию Т-хелперов, которые, в свою очередь, стимулируют пролиферацию В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Предсуществующие донор-специфические антитела к антигенам трансплантата являются ведущей причиной развития сверхострого и острого гуморального отторжения. При пересадке органа донор-специфические антитела, взаимодействуя с антигенами сосудов трансплантата и формируя комплекс антиген-антитело, вызывают активацию комплемента, что приводит к развитию иммунного воспаления. В свою очередь, эти процессы индуцируют механизмы гемокоагуляции, что приводит к отложению фибрина и образованию тромбов в сосудах. Нарушение кровотока в пересаженном органе приводит к его гибели.

В хроническом отторжении трансплантата принимают участие как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции. При этом наблюдается развитие иммуновоспалительной реакции, индуцированной иммунными комплексами, развитие в органе дегенеративно-дистрофических процессов, замещение паренхимы органа фиброзной тканью, повреждение эндотелия сосудов и их облитерация. Все это приводит к потере органом функции и его гибели. Следует заметить, что процессы хронического отторжения трансплантата слабо поддаются иммуносупрессивной терапии.

Антитела к HLA обнаруживаются более чем у 30% населения, их выявление свидетельствует о предшествующей иммунизации HLA. Она возможна при многократном переливании цельной крови, во время беременности и после трансплантации. Ряд авторов отмечает, что донор неспецифические антитела к HLA являются одним из факторов не только риска острого, но и хронического отторжения трансплантата и учитываются, как плохой прогностический показатель [P.I.Terasaki, 2006; М. Morrel, 2011; М. Crespo, 2011]. Однако встречаются лишь единичные работы, указывающие на влияние предсуществующих антител к HLA на

функцию трансплантата и течение раннего посттрансплантационного периода у реципиентов.

Цель исследования: Оценить влияние антител к HLA на развитие реакции отторжения почечного трансплантата у реципиентов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ методов выявления антител к HL А.

2. Проанализировать выявляемость антител к HLA и MICA у пациентов из «листа ожидания» на трансплантацию почки.

3. Оценить влияние предсуществующих антител к HLA на развитие реакции отторжения трансплантата

4. Оценить влияние антител к HLA, образованных de novo, на развитие реакции отторжения трансплантата

5. Разработать алгоритм обследования пациентов в постгрансплантационном периоде для выявления факторов риска отторжения и коррекции иммуносупрессивной терапии.

Научная новизна исследования: При исследовании антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в зависимости от группы крови у реципиентов из «листа ожидания», отмечено, что наиболее сенсибилизированными к HLA явились женщины А (II) группы крови (52,4%). Наименьшее число пациентов с наличием антител к HLA зарегистрировано среди мужчин О (I) группы крови (14,6 %).

Выявлена корреляционная зависимость развития реакции отторжения трансплантата от степени сенсибилизации к HLA, оцениваемой по средней интенсивности флуоресценции при определении антител на платформе Luminex (р=0,56 при р=0,001).

Разработан способ получения диагностикума для определения у реципиента образованных de novo донор-специфических антител к HLA в

посттрансплантационном периоде, основанный на использовании лимфоцитов селезенки донора, длительных сроков хранения.

Практическая значимость исследования:

Разработан алгоритм обследования пациентов до трансплантации органа. Использование скрининга антител к HLA мультиплексным методом на платформе Luminex позволяет выявить предсуществующие антитела к HLA у реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию органа. Этих пациентов следует относить к группе риска развития реакции отторжения и проводить подготовку к трансплантации, направленную на снижение степени сенсибилизации к HLA.

Разработан алгоритм обследования пациентов в посттрансплантационном периоде, для выявления антител к HLA образованных de novo, играющих существенную роль в развитии дисфункции почечного аллотрансплантата, кризе отторжения и его утрате. Мониторинг антител к HLA в посттрансплантационном периоде, который включает в себя: скрининг антител к HLA, выявление донор-специфических антител, с использованием диагностикума, а также идентификацию антител к антигенам донора, даёт возможность корректировать иммуносупрессию, обоснованно проводить процедуры плазмафереза и оценивать их эффективность.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для более точного определения степени сенсибилизации к HLA у реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию органа следует использовать мультиплексный анализ на платформе Luminex.

2. Частота развития криза отторжения почечного трансплантата возрастает у реципиентов при повышенной степени сенсибилизации к HLA.

3. Образование de novo антител к HLA у пациентов в посттрансплантационном периоде может спровоцировать развитие криза отторжения.

Внедренне результатов исследования:

Разработанный алгоритм обследования пациентов в посттрансплантационном периоде используется в отделении пересадки почки и поджелудочной железы ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗ г. Москвы.

Разработанный способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости внедрен в клиническую практику и активно используется в лаборатории иммунотипирования клеток и тканей ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. В настоящее время в криобанке ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского хранится 93 образца клеток селезенки доноров органов, которые применяются для определения донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения.

Апробация работы: Апробация работы состоялась 28 февраля 2014 года на заседании Проблемно-плановой комиссии № 9 «Трансплантация клеток, тканей и органов» в ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗ г. Москвы.

Основные материалы исследования доложены и обсуждены на:

• городском семинаре «Почечная недостаточность после трансплантации органов в многопрофильном стационаре», 2010 г. - г. Москва

• конференции «Новые технологии в лабораторной диагностике», 2011 г. — г. Москва

• 26 Конгрессе Европейской федерации иммуногенетиков, 2012г. - г. Ливерпуль

• VI Всероссийском съезде трансплантологов, 2012 г. — г. Москва

Публикации:

Опубликовано 9 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК. Результаты, полученные при выполнении работы, легли в основу Патента РФ на изобретение: «Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения» / патент РФ № 2491552, опубликовано: 27.08.2013 бюлл. № 24 / авт.: М.Ш. Хубутия, Н.В. Боровкова, Н.В. Доронина, В.А. Гуляев, М.Г. Минина, C.B. Жерздев, И.Н. Пономарев, В.Б. Хватов

Объём и структура работы:

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. Библиографический указатель включает 122 источников, из них 104 иностранные авторы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 17 таблицами.

Материалы и методы исследования:

Работа основана на анализе данных исследования антител к HLA в крови 440 реципиентов из «листа ожидания» в отделении пересадки почки и поджелудочной железы ГБУЗ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского в период с 2010 по 2013 годы. Основанием к включению в «лист ожидания» было наличие у пациента хронической почечной недостаточности (ХПН). ХПН развилась вследствие перенесенных хронического гломерулонефрита и пиелонефрита, или в результате поликистоза почек у 415 реципиентов и на фоне сахарного диабета I типа у 25 пациентов.

Сыворотки крови 440 реципиентов (245 мужчин и 195 женщин в возрасте от 28 до 63 лет) обследованы на наличие антител к HLA до

трансплантации почки. Из них у 68 пациентов (30 мужчин и 38 женщин в возрасте от 25 до 58 лет) выполнена аллотрансплантация трупной почки (АТТП) (таблица 1). Этих пациентов обследовали в срок до 3 месяцев после операции.

Таблица 1. Распределение обследованных пациентов

Реципиенты Всего обследовано Пол муж/жен Средний возраст, лет

При постановке в «лист ожидания» на трансплантацию почки 440 245/195 48,8±4,2

В постгрансплантационном периоде 68 30/38 41,5±3,8

Иммуносупрессивная терапия проводилась следующим образом: в 70% случаях назначали комбинированную 4-х компонентную иммуносупрессию; в 30% случаях при АТТП у реципиентов с высокой степенью сенсибилизации к НЬА, при повторных трансплантациях, у пациентов с системной красной волчанки (СКВ), геморрагическим васкулитом, у молодых женщин с А (II) группой крови, применяли комбинированную 4-х компонентную иммуносупрессию и поликлональные антитела (АТГ, иммуноглобулин антимоцитарный). Особенности течения посттрансплантационного периода 68 обследованных реципиентов представлены в таблице 2. У 27 пациентов из 68 отмечалась отсроченная функция почечного трансплантата, которая могла быть обусловленная развитием, как острого канальцевого некроза, так и острым кризом отторжения. Развитие подтвержденного острого криза отторжения отмечали в 24 случаях, что у 8 реципиентов привело к потере почечного трансплантата (таблица 2).

Таблица 2. Особенности течения послеоперационного периода у _обследуемых пациентов_

Параметры послеоперационных осложнений Всего пациентов %

Отсроченная функция трансплантата 27 39,6%

Развитие острого криза отторжения 24 35,3%

Утрата трансплантата, вследствие криза отторжения 8 11,7%

Принципы формирования групп пациентов:

В зависимости от поставленных задач исследований пациентов распределяли на группы по следующим принципам:

I принцип. С целью проведения сравнительного анализа методов выявления предсуществующих антител к системе HLA: а) выделено 20 пациентов, выявление антител которым проводили параллельно с помощью комлимент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ) и мультиплексным анализом; б) выделено 20 пациентов, выявление антител у которых проводили параллельно методом ИФА и мультиплексным анализом.

II принцип. Чтобы оценить выявляемость антител к HLA до трансплантации, в зависимости от группы крови, 440 реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию почки разделены следующим образом: 0(1) — 146 пациентов (82 мужчины и 64 женщины), А(П) — 167 человек (85 мужчин и 82 женщины), В(Ш) - 99 пациентов (61 мужчина и 38 женщин), AB(IV)-28 человек (15 мужчин и 13 женщин).

III принцип. Для оценки влияния антител к HLA на течение посттрансплантационного периода 68 пациентов разделены на группы в зависимости от наличия или отсутствия предсуществующих антител к HLA: первая группа, основная - 30 реципиентов (17 женщин и 13 мужчин в возрасте от 23 до 55 лет) с выявленными предсуществующими антителами к HLA; вторая группа, сравнения 38 реципиентов (23

женщин и 15 мужчин в возрасте от 25 до 58 лет), до трансплантации антитела к HLA не выявлены.

IV принцип. Для оценки влияния антител к HLA, образованных de novo на течение посттрансплантационного периода 38 пациентов (15 мужчин, 23 женщины) разделены на группы в зависимости от наличия или отсутствия антител к HLA, образованных de novo: первая группа, основная - 7 реципиентов (4 мужчины и 3 женщины) в посттрансплантационном периоде выявлены антитела, образованные de novo; вторая группа, сравнения - 31 реципиент (11 мужчин и 20 женщин), у которых в посттрансплантационном периоде антитела к HLA не образовывались.

Выявление предсуществующих антител к HLA проводили следующими методами:

1. Серологический метод. С 40 образцами лимфоцитов доноров крови проводили тест комплемент-зависимой цитотоксичности. Результат выражали в виде коэффициента серопозитивности, представляющий отношение числа образцов лимфоцитов, вызывающих положительную реакцию, к общему числу образцов в панели, выраженное в процентах

2. Качественный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), наборами (QUIKSCREEN®) и (B-SCREEN®) фирмы GTI Diagnostics (США). В качестве носителя твёрдой фазы использовали микропланшет, на который нанесены гликопротеины HLA I и II классов очищенные при помощи аффинной хроматографии.

3. Мультиплексный анализ на платформе Luminex (хМАР Technology) с помощью наборов LABScreen фирмы One Lambda(CILIA). Метод основан на использовании панели микросфер, имеющих различные спектральные характеристики и покрытых очищенными HLA-антигенами I, II класса и MICA. Реактивность сыворотки оценивали по флуоресцентному сигналу от каждой микросферы. В норме средняя

интенсивность флюоресценции (MFI - mean fluorescence intensity) не превышала 500 ед.

4. Идентификацию антител по локусам к HLA донора проводили с помощью наборов LIECODES ID Class I, II Antibody (донорские антигены) фирмы GEN-PROBE (США).

5. Определение донор-специфических антител мультиплексным анализом на платформе Luminex (хМАР Technology) с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) фирмы Invitrogen (США).

Мониторинг антител к HLA в посттрансплантационном периоде у 68 реципиентов проводили только мультиплексным анализом на платформе Luminex.

Для статистической обработки рассчитывали средние величины, среднеквадратичное отклонение (а). Для сравнения переменных с нормальным распределением пользовались парным t- критерием Стьюдента. При проведении корреляционного анализа использовали коэффициент корреляции рангов Спирмена.

Результаты исследования

Сравнительный анализ методов выявления антител к системе HLA

Для выявления сенсибилизации у пациентов к HLA использовали три метода: традиционный серологический метод, основанный на комплемент-зависимой цитотоксичности, и два метода основанные на твердой фазе: иммуноферментный анализ и мультиплексный анализ на платформе Luminex. Результаты сравнительного анализа методов КЗЦ, ИФА и мультиплексного анализа на платформе Luminex представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3. Выявление антител к НЬА у реципиентов методами комплемент-зависимой цитотоксичности и на платформе Ьитшех

Всего пациентов Определение АТ к НЬА методом КЗЦ Определение АТ к НЬА на платформе Ьитшех

Выявлены АТ к НЬА Выявлены АТ к НЬА

Абс. % (М±б) Абс. % (М±б)

20 6 30±10,5 10 50±11,5*

♦различия достоверны при р<0,05

Для сравнительного анализа методов КЗЦ и на платформе Ьигшпех одновременно обследовали 20 пациентов. Как показано в таблице 3, антитела к НЬА мультиплексным методом выявлены у 10 пациентов из 20, методом КЗЦ только у б человек. Другие 20 пациентов обследованы одновременно методам ИФА и мультиплексным анализом. Из них антитела к НЬА выявлены с помощью ИФА только у 7 человек, мультиплексным анализом у 9 (таблица 4).

Таблица 4. Выявление антител к НЬА у реципиентов методами

иммуноферментного анализа и на платформе Ьитшех

Всего пациентов Определение АТ к НЬА методом ИФА Определение АТ к НЬА на платформе Ьигшпех

Выявлены АТ к НЬА Выявлены АТ к НЬА

Абс. % (М±б) Абс. % (М±б)

20 7 35,0±10,9 9 45,0±11,4*

♦различия достоверны при р<0,05

Таким образом, более информативным и чувствительным является мультиплексный анализ на платформе Ьитшех, по сравнению как с КЗЦ, так и с ИФА. Отметим, что серологический метод позволяет выявить антитела к I классу НЬА, тогда как ИФА и мультиплексный анализ определяют антитела как к I , так и II классу. Также при мультиплексном анализе результаты оцениваются по средней интенсивности

флуоресценции (N№1), что позволяет косвенно судить о степени сенсибилизации к НЬА и проводить мониторинг антител в посттрансплантационном периоде.

Влияние антител к НЬА на течение посттрансплантационного периода у реципиентов после трансплантации почки

При обследовании 440 пациентов, включённых в «лист ожидания» на трансплантацию почки, антитела к НЬА выявлены в 29,6% случаев, что соответствует данным, полученным N. ЬасИтапп, Р. I. Тегаэак! и С. БсИоепетапп, 2006. Самыми сенсибилизированными к НЬА оказались реципиенты, имеющие А (II) группу (38,3%). У женщин антитела к НЬА выявлялись чаще, чем у мужчин 41,6±3,5% и 19,7±2,6% соответственно (табл. 5). Более высокий процент женщин, связан по нашему мнению с предшествующей сенсибилизацией в результате беременностей. У реципиентов ожидающих повторную трансплантацию органа, выявляемость антител к главному комплексу гистосовместимости составила 82,2%, что почти в 4 раза больше, чем у пациентов, находящиеся в «листе ожидания» на первичную трансплантацию (23,7%).

Таблица 5. Выявляемость предсуществующих антител к НЬА у

реципиентов из «листа ожидания» в зависимости от группы крови

Группа крови Число обследованных пациентов Число пациентов с выявленными НЬА-антителами

Все го Муж Жен Всего Мужчины Женщины

Абс % Абс %(М±б) Абс %(М±б)

0(1) 146 82 64 36 24,6 12 14,6±9,0* 24 37,5±6,1*

А(И) 167 85 82 64 38,3 21 24,7±4,7 43 52,4±5,5

В(Ш) 99 61 38 21 21,2 10 16,3±4,7* 11 28,9±7,4*

АВ(1У) 28 15 13 9 32,1 5 33,3±12,1* 4 30,7±12,8*

ИТОГО 440 243 197 130 29,5 48 19,7±2,6* 82 41,6±3,5*

* - различия достоверны по сравнению с пациентами А (II) группы крови при р < 0,05

Для оценки влияния предсуществующих антител к НЬА на течение посттрансплантационного периода обследовано 68 пациентов после трансплантации почки (30 пациентов сенсибилизированных к НЬА до операции и 38 без антител).

При оценке влияния предсуществующих антител к НЬА на течение посттрансплантационного периода выявлено, что у пациентов сенсибилизированных к НЬА в 3,6 раза чаще отмечается отсроченная функция трансплантата, медленнее происходит нормализация уровня азотистых оснований (креатинин, мочевина). Острый криз отторжения диагностирован в 60% случаев у пациентов с предсуществующими антителами к НЬА и в 15,8% случаев у реципиентов без антител к НЬА. Утрата трансплантата отмечена в обеих группах в основной группе (с антителами к НЬА) в 16,6% случаев, в группе сравнения (без антител к НЬА) в 7,8% случаев (табл. 6).

Таблица 6. Особенности течения послеоперационного периода у

обследуемых пациентов

Осложнения Основная группа (с НЬА-антителами) п=30 Группа сравнения (без НЬА-антител) п=38

Абс. %(М±б) Абс. %(М±б)

Отсроченная функция трансплантата 20 66,6±8,8 7 18,4±8,1*

Среднее время нормализация азотистых оснований (сутки) 11 36±3,1 31 81,6±1,0*

Острый криз отторжения 18 60±7,8 6 15,8±6,0*

Утрата трансплантата 5 16,6±6,9 3 7,8±4,3

* - различия достоверны (р<0,05)

Выявлено, что наличие предсуществующих антител к I и II классам НЬА, достоверно коррелировало с отсроченной функцией трансплантата (коэффициент корреляции Спирмена р= 0,47 при р=0,001 и р=0,3 при

р=0,001, соответственно), а также с развитием острого криза отторжения (р=0,5б при р=0,001 и р=0,4 при р=0,001, соответственно).

При дальнейшем анализе пациентов основной группы распределили на группы в зависимости от степени сенсибилизации к HLA. Более половины пациентов основной группы перед трансплантацией почки имели высокую и среднюю степень сенсибилизации к HLA. Отмечено, что у пациентов с высокой степенью сенсибилизации к HLA риск развития острого криза отторжения значительно выше, чем у пациентов с низкой степенью сенсибилизации. Так среди пациентов, с высокой интенсивностью флюоресценции выше 3000,0 у.е. криз отторжения трансплантата диагностирован у 10 человек из 11, что в 5 случаях закончилось утратой трансплантата. У пациентов с MFI в пределах от 1000,0 до 3000,0 у.е. отторжение почки развилось в 7 случаях из 14, а при низкой степени сенсибилизации (MFI 500,0-1000,0)— у 1 из 5.

У пациентов с предшествующей сенсибилизацией к HLA мониторинг антител после трансплантации позволяет оценить эффективность проводимой иммуносупрессивной терапии и сеансов плазмафереза. Повышение степени сенсибилизации к HLA после трансплантации можно рассматривать как неблагоприятный прогностический признак в плане развития реакции отторжения трансплантата и послужить обоснованием к необходимости коррекции иммуносупрессивной терапии. Итак, пациенты, сенсибилизированные к HLA, находятся в группе риска развития реакции отторжения, и требуют мониторинга уровня антител к HLA как до трансплантации почки, так и в послеоперационном периоде.

Образование de novo антител к системе HLA и их значение в реакции отторжения при трансплантации почки

■ У большинства пациентов, несенсибилизированных к антигенам главного комплекса гистосовместимости, при благоприятном течении

посттрансплантационного периода антитела к HLA не образовывались. Однако в 18,4% случаев отмечали образование de novo донор-специфических антител к HLA в ранние сроки после трансплантации. Таблица 7. Влияние de novo образованных донор специфических

антител на развитие реакции отторжения и утраты трансплантата

Реципиенты

Параметр с ДСА п=7 (18,4%) без ДСА п=31 (81,6%)

Абс. % (М±б) Абс. % (М±б)

Реакция отторжения 4 57,1±20,2* 2 6,4±4,3

Утрата трансплантата 3 42,9±20,2* 0 0±1,8

*- различия между группами достоверны, р<0,05

Пациенты, у которых в посттрансплантационном периоде образуются антитела к HLA, также относятся к группе риска, как и реципиенты с предсуществующими антителами. Сложность в ведении этих пациентов заключается в том, что к ним нет такого пристального внимания, как к пациентам с предсуществующими антителами к HLA. Им коррекцию иммуносупрессии проводят только при появлении клинических признаков дисфункции трансплантата. Результаты исследования показывают, что у пациентов при образовании de novo ДСА в 57,1% может развиться реакция отторжения трансплантата, а 42,9% случаях это приведет к его утрате (табл. 7). Скрининг антител к HLA, в плановом порядке на 7 и 14 сутки позволяет выявить таких пациентов до первых признаках дисфункции трансплантата. Выявление антител к HLA требует проведения дополнительных анализов идентификации антител, или определение ДСА, чтобы своевременно провести коррекцию иммуносупрессивной терапии, направленной на предотвращение развития криза отторжения трансплантата и его утрату.

Для определения у реципиента de novo образованных ДСА в посттрансплантационном периоде мы разработали способ на основе

17

диагностикума из лимфоцитов селезенки донора, длительных сроков хранения. Для получения лимфоцитов заготавливали небольшой (2x2 см) фрагмент селезенки по время операции по изъятию органов от донора. Фрагмент селезенки гомогенизировали. После выделяли суспензию лимфоцитов и оценивали их количество, фенотип и жизнеспособность. Затем приготовляли раствор криопротектора с конечной концентрацией ДМСО 10%. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с раствором криопротектора вносили по 1,5 млн лимфоцитов и сразу помещали в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4°С. Криоконсервирование проводили по следующей программе: стартовая температура: +4°С, охлаждение 1°С/мин до -70°С, охлаждение 70°С/мин до -196°С. Затем образцы лимфоцитов донора переносили в отдельно выделенное хранилище криобанка и хранили при температуре -196°С. Размораживание лимфоцитов донора для анализа осуществляли в водяной бане при температуре 37°С до полного исчезновения кристалликов льда. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволила получить диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. В нашей лаборатории проводили анализ на выявление донор-специфических антител с помощью разработанного диагностикума и набора LIFECODES Donor Specific Antibody (ДСА) на платформе Luminex. В результате из 7 реципиентов, у которых при скрининге выявлены антитела к HLA в посттрансплантационном периоде, в 7 случаях антитела были специфичны к антигенам донора.

Таким образом, определение антител к HLA имеет важное диагностическое и прогностическое значение и должно проводиться у реципиентов как ожидающих трансплантацию почки, так и в постгрансплантационном периоде. Своевременная коррекция

иммуносупрессии в посттрансплантационном периоде основанная на результатах мониторинга уровня антител к НЬА является перспективным методом для улучшения отдаленных результатов трансплантации почки.

На основании анализа полученных данных можно рекомендовать следующий алгоритм обследования пациентов до и после трансплантации почки (рис. 1,2,3)

Рис. 1 Алгоритм обследования пациентов при постановке в «лист

ожидания» и перед трансплантацией

Реципиенты без антител к HLA

Ж

Первичная функция трансплантата

3ZI '

ж

Скрининг антител 14 сутки

; Отсроченная функция трансплантата |

ЗЕ

Антител не выявлено

Скрининг антител 5-7 сутки

Ж

Ж

Прогноз благоприятный,

коррекции иммуносупрессии не требуется

Скрининг антител

после каждого сеанса

плазмафереза ;

Образование антител к HLA de novo

Прогноз не благоприятный,

возможно развитие реакции отторжения, требуется коррекция иммуносупрессии и проведение плазмафереза

Ж

Идентификация антител или кросс-матч реакция на Lurninex {каждые 5-7 дней для контроля эффективности иммуносупрессии до купирования криза отторжения, в дальнейшем каждые 3-6 месяцев)

Рис. 2 Алгоритм обследования в посттрансплантационном периоде пациентов не сенсибилизированных к НЬА

[ Реципиенты спредсуществующими антителами к Н1А |

(_ Г I

[ Первичная функция трансплантата |

Скрининг антител 7 сутки

MFI снижается или не меняется |

г

I Отсроченная функция трансплантата!

Скрининг антител 3-4 сутки

MFI увеличивается

коррекции иммуносупрессии _не требуется

Скрининг антител

после каждого сеанса

_гиазмаФевеза_

Прогноз не благоприятный,

возможно развитие реакции отторжения, требуется коррекция иммуносупрессии и проведение _ПлазмаДи»!)«^_

V

Идентификация антител или кросс-матч реакция на 1иттех (каждые 5-7 дней для контроля эффективности иммуносупрессии до купирования криза отторжения, в дальнейшем каждые 3-6 месяцев)

Рис. 3 Алгоритм обследования в посттрансплантационном периоде пациентов с предшествующей сенсибилизацией к НЬА

выводы

1. Наиболее точным из существующих сегодня методов выявления антител к HLA является мультиплексный анализ, основанный на использовании хМАР-технологии (Luminex), позволяющий определить степень сенсибилизации к антигенам I и II классов на основании значений средней интенсивности флуоресценции (MFI).

2. Антитела к HLA определяются в сыворотке крови у 29,6% пациентов из «листа ожидания» на трансплантацию органа, при этом самыми сенсибилизированными к главному комплексу гистосовместимости являются реципиенты А (II) группы крови, процент сенсибилизированных пациентов среди женщин выше, чем у мужчин, у реципиентов ожидающих повторную и более трансплантацию органа, выявляемость антител к HLA достигает 82,2%.

3. У пациентов с наличием предсуществующих HLA-антител в 66,6% случаев наблюдается отсроченная функция трансплантата, в 60% развивается криз отторжения, что в 16,6% приводит к его утрате. Частота развития криза отторжения достоверно возрастает при повышении степени сенсибилизации к HLA.

4. В посттрансплантационном периоде образование de novo антител к HLA отмечается в 18,4% случаев и сопровождается развитием криза отторжения в 57,1% случаев.

5. Диагностикум длительного срока хранения, изготовленный из лимфоцитов селезенки донора, позволяет в посттрансплантационном периоде выявлять у реципиента образованные de novo донор-специфические антитела к HLA в 18,4% случаев.

6. Разработанный алгоритм обследования пациентов в постгрансплантационном периоде позволяет своевременно выявить повышение степени сенсибилизации к HLA, что является прогностически

неблагоприятным фактором и может быть скорректировано изменением тактики иммуносупрессивной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. При постановке в «лист ожидания» на трансплантацию почки проводят мультиплексный анализ на платформе Luminex для определения антител к I и II классам HLA, что позволяет выявить сенсибилизированных реципиентов с высоким риском развития реакция отторжения в послеоперационном периоде.

2. У реципиентов, несенсибилизированных к HLA, скрининг антител проводят на 7 сутки при осложненном и на 14 сутки при благоприятном течении посттрансплантационного периода для выявления образования антител к HLA de novo, которые могут вызвать дисфункцию трансплантата, а также криз отторжения.

3. У реципиентов, сенсибилизированных к HLA, скрининг антител проводят на 3-4 и 7 сутки и, используя среднее значение флуоресценции, оценивают эффективность проводимой иммунокорекции.

4. Диагностикум длительного срока хранения, изготовленный из лимфоцитов селезенки донора, а также идентификация антител, позволяет в постгрансплантационном периоде выявлять у реципиента наличие донор-специфических антител к HLA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Антитела к антигенам системы HLA и их значение при трансплантации почки /Боровкова Н.В., Доронина Н.В., Сторожев Р.В., Сторожева М.В., Перцев A.C., Пинчук A.B. // Сборник материалов городского семинара «Почечная недостаточность после трансплантации органов в многопрофильном стационаре». - т. 217. - Москва. - 2010. - С. 19-24.

2. HLA-антитела и их значение при трансплантации почки /Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В., Доронина Н.В., Сторожев Р.В., Сторожева М.В., Перцев A.C., Пинчук A.B. // Трансплантология. - №3-4. - 2010. - С. 32-36.

3. Значение исследования HLA антител I и II класса и MICA антител при трансплантации почки /Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В., Доронина Н.В., Пинчук A.B., Александрова И.В. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - №4. - С. 32-36

4. Боровкова Н.В., Доронина Н.В., Мушта H.A. Методы определения сенсибилизации к HLA у реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию органов // Трансплантология, 2011. - № 4. — С. 37-40

5. Borovkova N.V., Doronina N. V., Storozhev R.V. Early postoperative period in kidney transplant recipients with pre-existing non-donor-specific HLA antibodies //Tissue Antigens. -V. 79. -N 6. - 2012. - P. 491.

6. Сравнительный анализ методов определения донор специфических антител в посттрансплантационном периоде /Хубутия М.Ш., Доронина Н.В., Пинчук A.B., Воробьёв В.В., Пожарова О.В. // Вестник трансплантологни и искусственных органов. - T. XIV. - 2012. - С. 343.Тез. докл. VI Всерос. съезда трансплантологов, г. Москвы, 24-27 сен. 2012 г.

7. Методы определения антител к главному комплексу гистосовместимости /Боровкова Н.В., Доронина Н.В., Воробьев В.В., Пожарова О.В. //Медицинский алфавит. Современная лаборатория . - 2012. - № 4. - С. 22-26

8. Определение антилейкоцитарных донор-специфических антител в раннем посттрансплантационном периоде /Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В., Доронина Н.В., Шмарина Н.В., Сторожев Р.В., Чудакова JI.B. // Молекулярная медицина. — 2013. — № 1. — С.38-41.

9. Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения /М.Ш. Хубутия, В.А. Гуляев, М.Г. Минина, Н.В. Боровкова, Н.В. Доронина, C.B. Жерздев, И.Н. Пономарев, В.Б. Хватов //Патент РФ на изобретение № 2491552, опубликовано: 27.08.2013 бюл. № 24.

Список сокращений

МНС - главный комплекс гистосовместимости HLA - человеческие лейкоцитарные антигены АТ - антитела

MICA - антиген (гликопротеин), относится не к HLA PRA - панель - реактивные антитела КЗЦ - комплементзависимая цитотоксичность ХПН - хроническая почечная недостаточность АТТП - аллотрансплантация трупной почки СКВ - системная красная волчанка

ИФА - иммуноферментный анализ РЫРР - паранитрофенилфосфата

- иммуноглобулин в Апй - Ни ^О — античеловеческий иммуноглобулин ^М - иммуноглобулин М ДСА - донор-специфические антитела

Подписано в печать 24.09.2014 Заказ X» 23666 Тираж 100 экз. Объем 1,25 п.л. Отпечатано: ООО «ВП24» г. Москва, ул. Трубная, д. 21 Телефон 651-64-48 www.vp24.rii