Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Трансплантация селезеночной ткани в профилактике и лечении инсулиновой недостаточности (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ГИМЕРБУЛАТОВ ШАМИЛЬ ВИЛЕВИЧ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СЕЛЕЗЕНОЧНОЙ ТКАНИ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ИНСУЛИНОВОИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (клинико-экспериментал ьное исследование)

14.00.27-хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на I кандидата 1

■ ученой : наук

УФА-2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Радик Радифокич Фая зов Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Вячеславович Плечев доктор медицинских наук, профессор Валерий Алексеевич Привалов Ведущая Организация: Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова Росздрава.

Защита диссертации состоится "__"_____2007 года в__часов

на заседании диссертационного совета Д 208.006.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г, Уфа, ул. Ленина, 3.

С Диссертацией можно ознакомиться Щ библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования <(Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г, Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан"'_"___ 2007 года-

Ученый секретарь диссертационного совета, до г гор медицинских наук, профессор

Р. Т. Нигматуллин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема профилактики и коррекции ин-сулиновой недостаточности (ИН) в абдоминальной хирургии, в частности при тяжелых сочетай пых повреждениях двенадцатиперстной кишки (ДПК) и поджелудочной железы (ПЖ), а также в тяжелых случаях хронического диффузного панкреатита, что предполагает тотальное удаление данных органов в комплексе с селезенкой, все еще не решена [Карагюлян РГ, 1989, Стойко ЮМ, 2000, Плечев В В с соавт, 2002, ВМ Тимербулатов с соавт , 2006, С В Готъе с соавт, 2006, Gruessner А, Sutherland DER., 1998] Предложенные способы аутотрансплантации микрофрагментов эндокринной ткани ПЖ из-за отсутствия ощутимого эффекта широкого клинического применения не нашли [Шумаков В И с соавт, 1985, Скалецкий НН с соавт , 1994, Shapiro AM, et al, 2000]. Используемые в настоящее время методы коррекции ИН путем алло- и ксенотрансплантации культур островко-вых клеток и введения больших доз инсулина не приводят к желаемым результатам, т.е не позволяют достичь строгой компенсации углеводного обмена и тем самым замедлить или остановить прогрессирование поздних сосудистых осложнений сахарного диабета (СД) [Скалецкий НН, 1999, Шумаков В И, Тоневицкий А Г., 1999, Привалов В А с соавт 2003, Diem Р et al, 1990, Bolinger J et al, 1991] Выход из создавшейся ситуации видится в обнадеживающих исследованиях по применению стволовых клеток при лечении СД, а также в подтверждении факта наличия пролифирации р-клеток у взрослого человека [Онищенко НА с соавт, 1999, Берсенев А В, 2005, Шевченко ЮЛ, 2006, Ramia VK etal, 2000]

В свою очередь вынужденная спленэктомия при тотальной дуодено-панкреатэкгомки приводит к выраженному постспленэктомическому иммунодефициту [Сафаров СЮ, 1981, Бордуновский ВН, 1997, Григорьев ЕГ с соавт, 2001, УсейновЭБ с соавт, 2006, SeufertR etal, 1986] Широко применяемый при повреждениях селезенки способ аутотрансплантации селезеночной ткани (ACT) в данных ситуациях не используется, хотя в большинстве случаев не имеет противопоказаний. С позиции современных исследований в области клеточных технологий ACT и изученные ее результаты можно рассматривать как вариант восстановительной терапии стро-мальными стволовыми клетками селезенки [Апарцин К А, 2001, Тимербулатов MB с соавт, 2004, Hofstetter С et al, 2002]. Подтверждением этому является появившиеся в печати сообщения ряда исследователей о том, что для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях различного фенотипа можно использовать селезеночную ткань, которой присуща не только иммуногенетическая, но и морфогенетическая функция [Онии;енко НА с соавт, 1997, Цыпин А Б с соат, 2000, Про-копъев МВ, 2001].

Следовательно, с большой вероят ностью можно утверждать с существовании взаимосвязи между ACT и возможностью дифференцировки стволовых клеток имплантата в необходимые организму клеточные структуры, а после тотальной панкреатэктомии в инсулинопродуцирующие клетки. Данное предположение подтверждается сообщением группы ученых из Massachusetts General Hospital (Бостон, США), обнаруживших, что селезенка может быть источником взрослых стволовых клеток, которые способны восстанавливать инсулинопродуцирующие участки поджелудочной железы Они выявили, что эти взрослые стволовые клетки продуцируют протеин Hoxll, который, как предполагалось ранее, присутствует у млекопитающих лишь в период эмбрионального развития По предположениям ученых стволовые клетки селезенки способны развиваться в большее число разновидностей тканей, чем другие взрослые клетки, и в экстремальной ситуации трансплантация клеток селезеночной ткани может позволить осуществить регенерацию селезеночных и ß-клеток с их помощью [Musaro A et al, 2004, KodamaS et al, 2004, 2005]

В профилактике и коррекции нарушенных функций организма, в том числе постпанкреатэктомической ИН, определенную роль помимо ACT, могут сыграть другие варианты трансплантации селезеночной ткани Как известно, врожденные добавочные селезенки обнаруживаются у 14-30% больных и выявляются в воротах и связках селезенки, а также в большом сальнике [Григорьев ЕГ с соавт, 1996, Попов MB с соавт, 2001, Arzoumaman А , Rozenthall L , 1995, Grechus S et al, 2003] Экто-пичная селезеночная ткань обнаруживается в гистологических препаратах, взятых у больных из различных отделов слизистой желудочно-кишечного тракта во время кровотечения или же при резекции, а также в составе тканей различных органов и систем [Hayward I et al, 1992, AI-Ahmadi et al, 1998, Deutsch J С et al, 1999] Эктопичная селезеночная ткань, получившая развитие после спленэктомии, в литературе обозначаемая как спленоз, представляет собой очаги регенерации селезеночной ткани, диссеменированной во время травмы и кровотечения в брюшную полость, или остаток фрагмента ткани на своем месте как неудаленный участок [Апарцин КА, 2001, Урман МГ, 2003, Фаязов Р Р с соавт, 2003, Gar amella J J, Hay L, 1954, Expert JJ, 2001] С позиции современных клеточных технологий перспективным направлением может явиться спленоз, получаемый путем трансплантации культивированных клеток селезеночной ткани в различных вариантах Но, работ, посвященных изучению роли и значимости спленоза в коррекции нарушенных функции организма, в том числе ИН, нет

Наличие актуальной проблемы в абдоминальной хирургии и возможность решения некоторых ее задач с позиций современных клеточных технологий явились основанием для проведения экспериментально-клинического исследования.

Цель исследования:

Улучшить результаты профилактики и лечения больных с инсулино-вой недостаточностью в хирургической практике.

Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные модели экспериментальной панкреатэкто-мической и аллоксановой инсулиновой недостаточности

2 Изучить возможности профилактики и коррекции экспериментальной панкреатэкгомической инсулиновой недостаточности путем ауготранс-плантации селезеночной ткани

3 Разработать методы использования клеточных культур фетапьной селезенки для коррекции экспериментальной аллоксановой инсулиновой недостаточности

4 Обосновать технологию использования соматических стволовых клеток селезенки аллогенной линии для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности.

5. Разработать и внедрить в клиническую практику методы трансплантации клеточных культур селезеночной ткани (спленоза) для профилактики и коррекции нарушенных функции организма, в том числе инсулиновой недостаточности

6 Изучить результаты клинического исследования

Научная новизна:

Впервые изучена возможность проведения профилактических и лечебных мероприятий при экспериментальной ИН путем использования клеточных культур селезеночной ткани в различных вариантах. Доказана эффективность использования ACT для профилактики экспериментальной панкреатэкгомической ИН Обоснована возможность и показана эффективность использования клеточных культур фетальной и соматической селезенки при лечении экспериментальной аллоксановой ИН. Впервые в хирургической практике при проведении дуоденопанкреатэктомии показана эффективность профилактики ИИ путем ACT Впервые в клинической практике изучена роль спленоза, представлена его классификация и исследовано возможное участие различных его вариантов для коррекции нарушенных функции организма, в том числе ИН

Практическая ценность работы: Полученная в эксперименте возможность профилактики и коррекции панкреатэкгомической ИН с использованием ACT и ее клеточных культур в послеоперационном периоде имеет практическую ценность в абдоминальной хирургии. Изученная в эксперименте возможность коррекции аллоксановой ИН с использованием трансплантации клеточных культур фетальной селезеночной ткани и аллотранс-плантации культивированных клеток соматической селезеночной ткани имеет практическую ценность в эндокринологии Разработанный способ ACT при тотальной дуоденпанкреатэктомии в случаях травмы и хронического диффузного псевдотуморозного панкреатита позволит провести профилактику постспленэктомического синдрома и ИН в раннем и отдаленном послеоперационном периодах. Исследование роли спленоза и его классифициро-

вание имеет практическое значение в клинике и позволяет научно обосновывать возможность их участия в коррекции нарушенных функций организма

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Экспериментальная аллоксановая и панкреатэктомическая ИН в настоящее время является наиболее удобной моделью СД человека и продолжает сохранять значение в научных исследованиях.

2 ACT при выполнении дуоденопанкреатэкгомии в эксперименте способствует профилактике ИН

3 Аутотрансплантация клеточных культур селезеночной ткани после выполнения дуоденопанкреатэкгомии в эксперименте приводит к коррекции ИН в отдаленном послеоперационном периоде

3 Трансплантация клеточных культур фетальной аллогенной селезеночной ткани приводит к коррекции экспериментальной аллоксановой ИН

4 В клеточных культурах селезеночной ткани присутствуют функционально активные родоначальные клетки крови (гемопоэтические и мезенхи-мальные), которые участвуют в восстановлении инсулинопродуцирующих клеток организма

5 Спленоз является одним из компенсаторных механизмов организма и в послеоперационном периоде участвует в профилактике и коррекции нарушенных функции организма, в том числе ИН

Внедрение в практику. Тема работы входила в план научных исследований ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Результаты проведенных исследований внедрены в отделениях хирургических болезней БСМП г. Уфы, ГКБ №21 и №8 г Уфы

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на заседаниях Ассоциации хирургов РБ (Уфа, 2004, 2005, 2006, 2007), научно-практической конференции, посвященной 15-летию кафедры хирургии и медицины катастроф ИПО БГМУ (Уфа, 2004), Всероссийской конференции молодых ученых (Казань, май 2005), международном хирургическом конгрессе «Новые технологии в хирургии» (Ростов-на-Дону, 2005), Всероссийской конференции хирургов (Махачкала, 2005), XII международной конференции хирургов-гепатологов России и стран СНГ (Ташкент, 2005), Межрегиональной конференции «Достижения и проблемы современной клинической и экспериментальной хирургии» (Уфа, 2006), XIII международной конференции хирургов - гепатологов России и стран СНГ (Алматы, 2006)

Объем и структура работы. Диссертация состоит из 165 страниц машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, 3 главы собственных клинико-экспериментальных исследований, заключения, выводов, практических рекомендации и списка литературы В работе использованы 143 отечественных и 107 зарубежных печатных публикаций

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 20 печатных работ и получен патент на изобретение

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальное исследование выполнено на 263 белых половозрелых крысах линии Wistar с достижением панкреатэктомической и ал-локсановой ИН и на 8 кроликах обоего пола породы Шиншилла весом от 2,8 до 4,5 кг Экспериментальное исследование носило поэтапный характер, и на каждом этапе решались определенные задачи, поэтому материал исследования был подразделен на 8 групп (табл. 1)

Таблица 1

Объем оперативных вмешательств и изучаемый _результат в эксперименте_

Группы Объем операции Изучаемый результат

1 группа, крысы (10) Дуоденопанкреатэктомия Моделирование метода

2А группа, крысы (30) Панкреагэктомия с ACT Возможность профилактики ИН

2В группа крысы (25) Панкреаоктомия без ACT Контрольная группа

3 группа беременные крысы (38) Лапаротомия, извлечение плодов, забор эмбриональной селезеночной ткани Культивирование клеток в условиях лаборатории трансплантологии

4 группа крысы (10) Подкожное введение 5% водного раствора аллоксана из расчета 150 мг/ кг массы тела животного Моделирование метода

5А группа, крысы (75) Подкожное введение 5% водного раствора аллоксана из расчета 125 мг/ кг массы тела животного + на 7-е сутки имплантация ал-логенного клеточного материала, культивированного из фетальной селезеночной ткани Возможность коррекции ИН

5В группа, крысы (75) Подкожное введение 5% водного раствора аллоксана из расчета 125 мг/ кг массы тела животного + на 7-е сутки имплантация ал-логенной клеточной культуры из соматической селезенки То же

6 группа, кролики (8) Аллогенная трансплантация зародышевой селезенки в дерму уха кролика, перенесшего спле-нэктомию Возможность аллогенной трансплантации зародышевой селезенки

Учитывая, что выполнение тотальной дуоденопанкреатэктомии у 10 крыс (1 группа) привело к летальному исходу во всех случаях, нами был модифицирован метод экспериментальной тотальной панкреатэктомии, суть которого заключался в удалении правой доли ПЖ с селезенкой, а левая доля удалялась с использованием радиохирургического аппарата «Бшрй-оп»

(США) Использование радиоскальпеля у 55 крыс (2 группа) позволило выделить ткань ПЖ из интимно сращенных с ДПК зон, избежать при этом коа-гуляционного некроза стенки кишки и общего желчного протока и получить панкреатэктомическую ИН Уровень сахара в крови определялся 2 раза в сутки глюкометром «One touch ultra» (США), в моче - в лабораторных условиях Пол животных не учитывался Для достижения хронического опыта коррекция ИН проводилась однократным введением в сутки пролонгированного инсулина подкожно, в расчете 0,5 ЕД /кг массы тела животного.

Для изучения эффективности клеток селезеночной ткани в профилактике и лечении ИН в разные сроки после операции экспериментальные животные 2 группы были разделены на 2 подгруппы. Подгруппу 2А составили 25 крыс, которым панкреатэкгомия производилась с использованием ACT. В целях изучения возможности профилактики ИН выполнялась аутотранс-плантация Vi части селезенки в большой сальник в фрагментированном виде Оставшаяся часть селезеночной ткани направлялась в лабораторию для выделения и последующего культивирования жизнеспособных клеток селезенки по общепринятой методике Для исследования клеточной структуры и морфологической картины аутотрансплантата на 7-е сутки 5 крыс подверглись острому опыту, в ходе которого извлекали фрагменты, измельчали их в стеклянном гомогенизациторе в растворе CellWash (BD), затем окрашивали и осуществляли цитометрию Подгруппу 2В составили 25 крыс, которым ACT не проводилась, у данной категории животных была изучена эффективность культивированных клеток соматической селезенки в послеоперационном периоде

В ходе эксперимента по мере необходимости производилась подсадка самок к самцам с целью оплодотворения В общей сложности у 38 самок получена беременность, которые составили 3 группу На 12—14-е сутки беременности под эфирным наркозом крысам производили лапаро-томию, извлекали у плодов зародышевую селезенку, которая направлялась в лабораторию для культивирования В лаборатории иммунофармакологии УрО РАН проводилось изучение фенотипической структуры культуры зародышевой селезеночной ткани путем проточной цитофлюорометрии на цитометре FACSCalibur.

Культивирование клеток селезеночной ткани производилось в проблемной научно-исследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» по следующей схеме изолированные клетки селезенки взрослых крыс и эмбрионов получали по модифицированному методу Сеглена (Seglen Р О, 1976). Сразу же после извлечения органы помещали в стерильную чашку Петри. Далее ткани измельчали ножницами на кусочки размерами примерно 1 мм3 и четыре раза промывали в фосфатно-солевом буферном растворе {раствор Дюль-бекко) Затем отмытые кусочки трижды диссоциировали на магнитной мешалке по 10 минут при температуре 37°С в растворах Дюльбекко и ДМЕМ (1 1), содержащем для селезенки взрослой крысы 0Д% коллагеназы и 0,1% трипсина, для эмбриональной селезенки - 0,05% коллагеназы и 0,12% трип-

сина (Difco,CUIA). Клеточные взвеси переливали в стерильные флаконы через батистовый фильгр Далее клетки отмывали от ферментов в питательной среде ДМЕМ (Биолот, Санкт-Петербург) методом центрифугирования в течение 10 минут при 1500 об/мин. Надосадок сбрасывали, а осадок нежно ресуспензировали путем пипетирования. С каждого объема осуществляли выемку диссоциированных клеток селезенки для подсчета методом окрашивания 0,1% раствором трипанового синего Наносилась одна капля красителя, окрашивание проводилось в термостате при температуре +37°С в течение 10 минут Степень окрашивания контролировалась под микроскопом Подсчет числа живых клеток производился в камере Горяева под световым микроскопом Гибнущие клетки с поврежденной мембраной имели синюю окраску цитоплазмы Результаты исследований регистрировались и сравнивались между собой Под микроскопом подсчитывалось общее количество клеток, в том числе окрашенных клеток в 25 «больших» квадратах камеры Горяева Дальнейший подсчет клеток проводился по формуле

X^N S 10000, где

X - количество клеток в 1 см3 суспензии, N - количество клеток в 25 больших квадратах, S - кратность разведения суспензии красителем

Процентное содержание живых клеток (К) подсчитывалось по формуле

(общее количество клеток - количество мертвых клеток) х 100%

К =---

общее количество клеток

При использовании предложенной нами методики мы получили 84% живых клеток

Отмытые клетки селезенки помещали в стерильные пластиковые флаконы для культивирования объемами 40, 50 и 100 мл (Orange Scientific, Бельгия) с плотпостью 1,5 млн клеток в 1 мл Для клеток селезенки взрослых крыс культуральная питательная среда состояла из 90% среды ДМЕМ, 10% сыворотки эмбрионов коров (Биолот, Санкт-Петербург) и 40 мг/мл гента-мицина, а для клеток эмбриональной селезенки - 85% среды ДМЕМ, 15% сыворотки эмбрионов коров, 30 мг/мл гентамицина. Для клеток эмбриональной селезенки однократно добавляли набор заменимых аминокислот. На дно некоторых культуральных флаконов устанавливали стерильные обезжиренные покровные стекла для дальнейших исследований на иммерсионном микроскопе

Все клетки культивировали в А7 2 -инкубаторе (Jouan, Франция) в условиях iV/ 2-5% при +37°С в течении 7 суток Через 2 суток после помещения клеток в культуру среду заменяли на новую. В дальнейшем среду меняли на 4-е и 6-е сутки культивирования.

Ежедневно проводили динамическое наблюдение за первичными культурами клеток на инвертированном микроскопе с программным обеспечением {Leica, Германия) и регистрацией морфологических признаков

При разработке метода экспери ментальной аллоксановой ИН возникли сложности, связанные с определением и уточнением дозы препарата, необходимой для получения хронического течения заболевания У 10 крыс (4 группа) при подкожном введении 5% водного раствора аллоксана в дозировке более 150 мг/кг веса получили токсическую реакцию (диабетико-уремический синдром), что привело к гибели лабораторных животных на 3-й сутки Гибель животных объясняется не только ИН, а поражением печени, почек и других органов. Снижение дозировки препарата до 125 мг/кг веса у 10 крыс позволило получить острую форму диабета, которая характеризовалась быстрым развитием симптомов заболевания, но введение инсулина во всех случаях позволило улучшить состояние животных и получить хроническое течение заболевания

Учитывая данные результаты, экспериментальную аллоксановую ИН у 150 крыс (5 группа) вызывали путем однократного подкожного введения 5% водного раствора аллоксана из расчета 125 мг/ кг массы тела животного на фоне 24-48 часового голодания Данной группе животных на 7-е сутки после начала эксперимента вводили аллогенный клеточный материал в двух вариантах Группу 5А составили 75 крыс, которым вводился аллогенный клеточный материал, культивированный из селезеночной ткани 14-суточного эмбриона Группу SB составили 75 крыс, которым вводился аллогенный клеточный материал, культивированный из части удаленной селезеночной ткани взрослой крысы Клеточный материал в количестве 1 мл, что соответствует 1 млн клеток, вводился с помощью инъекции в хвостовую часть лабораторного животного

Материал для морфологических исследований брали из ПЖ, в первую очередь у здоровых крыс, затем у крыс, подвергнутых аллоксановой ИН и аллогенной трансплантации селезеночной ткани

Экспериментальное исследование по обоснованию возможности достижения трансплантационного спленоза фетальными клетками проводилось на 8 кроликах (6 группа). Суть данного исследования заключалась в имплантации эмбриональной селезеночной ткани кролика в дерму уха предварительно сплегоктомированного животного Через 1,5 месяца после аллогенной трансшинтации зародышевой селезеночной ткани производили забор ткани из зоны трансплантации. Микропрепараты (срезы толщиной 7 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином.

Клиническое исследование выполнено у 64 больных, госпитализированных в клинику Больницы скорой медицинской помощи г. Уфы за период с 1996 по 2006 гт (табл. 2). Возраст больных варьировал от 19 до 49 лет, мужчин было 51 (79,7%), женщин -13 (20,3%)

Клиническое исследование включало изучение анамнеза жизни и заболевания, жалоб больного, механизма получения травмы, общего и локального статуса Инструментальные методы исследования включали рентгенологические, эндоскопические и УЗИ Компьютерная томография (рентгеновский компьютерно-томографический сканер для всего тела, модель ТСТ-500S, TOSHIBA) проводилась пострадавшим с травмами селезенки при ран-

ней диагностике, а также в послеоперационном периоде, при наличии осложнений и для выяснения степени развития спленоза

Таблица 2

Распределение клинического материала по причинам развития _спленоза и методам диагностики_ _

№ п/п Метод диагностики и вид операции Аутотранс-плантационный спленоз Постравма-тический спонтанный спленоз Врожденная добавочная селезенка Всего

1. Лапаротомия: 34 14 . 48

а) Спленэкгомия без ACT 14 14

в) Спленэктомия с ACT 31 31

г) Дуодено-панкреат-эктомия с ACT 3 3

д) Аппендэктомия - - 1 1

е) Неотложные заболевания брюшной полости 6 6

2. Лапароскопия - - 4 4

3. УЗИ 26 14 6 46

4. Компьютерная томография 4 4

Всего... 34 14 16 64

Целенаправленное УЗИ по выявлению спленоза выполнено 48 (75,0%) больным, у которых в анамнезе имелась травма селезенки и была выполнена сштенэктомия, из них в 34 (70,8%) случаях она была дополнена ACT в большой сальник, в 14 (29,2%) случаях - не проводилась Сроки наблюдения после операции составили от 2 до 10 лет Наличие добавочной селезенки выявляли случайно во время лечебно-диагностических мероприятий у 16 хирургических больных Из них в 4 случаях она выявлена во время лапароскопии, выполненной по поводу абдоминальной травмы и при диагностике острого аппендицита, в 6 - во время лапаротомии и ревизии органов брюшной полости, в 6 - при УЗИ органов брюшной полости, у 4 больных с целью дифференциальной диагностики дополнительно потребовалась компьютерная и ядерно-магнитная резонансная томографии

Иммунологический статус больных оценивали по содержанию иммуноглобулинов классов G, А, М, Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, изучению лейкоцитарной формулы

Эндоскопические исследования заключались в проведении диагностической лапароскопии и ФЭГДС При помощи эндоскопических методов ис-

следований определяли наличие повреждений органов и ич осложнений, а также изучали результаты лечения в послеоперационном периоде

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты экспериментального исследования показали, что у экспериментальных крыс 2А группы через несколько часов после полного удаления ПЖ наступали гипергликемия и глюкозурия, максимальные величины которых отмечались со 2-3-го дня после операции (табл. 3). Содержание сахара в крови колебалось от 33 до 40 ммоль/л К началу третьей недели у крыс данной группы коррекция сахара инсулином была отменена, и по показателям уровня сахара крови отпала её необходимость. Всего за данный период погибли 8 крыс в разные сроки после операции, из них 5 крыс - после острого опыта Данное исследование позволяет сделать вывод, что тотальная панкреатэктомия у крыс вызывает выраженное гипергликемическое состояние, что приводит к гибели в первые сутки и недели после операции в результате развития кетоацидоза. Введение соответствующей дозы инсулина позволяет острый эксперимент перевести в хронический, т е подавляющее большинство экспериментальных животных можно использовать для изучения течения заболевания В нашем опыте на ранних этапах послеоперационного периода ИН корригировалась введением пролонгированного инсулина, после его отмены гипергликемия не приобретала крайнего характера, что позволяет сделать вывод о наличии компенсаторного механизма, и данным механизмом могут выступать имплантированные ткани собственной селезенки К концу первого месяца эксперимента лабораторные животные стали активными, исчезла выраженная вялость, стали проявлять интерес к пище Изучение показателей сахара в крови в динамике показало тенденцию к резкому его снижению, хотя заместительная терапия инсулином не проводилась К концу первого года после операции крысы выглядели совершенно здоровыми, показатели сахара в крови приблизились к нормальным. У экспериментальных крыс 2В группы также через несколько часов после полного удаления ПЖ наступали гипергликемия и глюкозурия, максимальные величины которых отмечались со 2 и 3-го дня после операции

К концу второй недели попытка отмены коррекция сахара инсулином привела к гибели 12 крыс Продолжение курса заместительной терапии пролонгированным инсулином позволило перевести остальных 13 животных в хронический опыт К концу третьей недели данной группе экспериментальных животных проводился курс клеточной терапии, т.е. в хвостовую часть проведена трансплантация путем инъекции культивированных клеток взрослой селезенки, после чего заместительная инсулинотерапия была отменена К началу 3-го месяца эксперимента крысы данной подгруппы стали более активными, заметно начали прибавлять в весе. Исследование показателей сахара крови выявило тенденцию к постепенному снижению с приближением к нормальным показателям К концу первого года жизни после операции

лабораторные животнью вели себя активно, выглядели здоровыми, показатели сахара крови приблизились к нормальным единицам

Таблица 3.

Показатели сахара в крови у экспериментальных крыс с панкреатэктомиче-_ской инсулиновой недостаточностью_

Сроки после операции 2А группа 2В группа

До операции 4,88±0,19 4,72±0,20

2-е сутки (начало инсулинотерапии) 38,5±2,75 р>0,05 37,6±2,60 р>0,05

5-е сутки (инсулииотерапия продолжается) 23,5±1,32 р>0,05 24,8±0,26 р<0,001

8-е сутки (инсулииотерапия продолжается) 15,1±1,58 р>0,05 17,8±1,20 р>0,05

14-е сутки (отмена инсулинотерапии) 17,2±1,10 р>0,05 23,3±2,75 р>0,05

21-е сутки 12,9±1,28 р<0,001 31,5±2,30 р<0,01 (введение клеточных культур)

28-е сутки 11,0±0,83 р>0,05 19,0±1,77 р>0,05 (отмена инсулинотерапии)

40-е сутки 9,77±1,27 р<0,001 17,2±1,20 р>0,05

60-е сутки 7,66±1,03 р<0,001 11,9±1,28 р<0,001

90-е сутки 7,11±1,70 р<0,005 11,0±1,07 р<0,001

Через 6 месяцев 6,61±0,32 р<0,001 7,72±1,27 р<0,005

Через 1 год 5,66±0,21 р>0,05 7,31±1,40 р<0,005

Данное исследование позволило сделать вывод, что тотальная пан-креатэктомия без ACT у крыс вызывает выраженное гипергликемическое состояние, что приводит к гибели в первые сутки и недели после операции в результате развития кетоацвдоза Введение соответствующей дозы инсулина позволяет острый эксперимент перевести в хронический, т е более половины экспериментальных животных можно использовать для изучения течения заболевания В данном опыте на ранних этапах послеоперационного периода ИН корригировалась введением пролонгированного инсулина, после его отмены гипергликемия приобретала крайний характер, что позволяет сделать вывод об отсутствии компенсаторного механизма у данной категории животных. Только трансплантация культивированных клеточных культур селе-

зеночной ткани взрослой крысы позьолила продолжить эксперимент, избежать летального исхода в половине случаев и в конечном итоге стабилизировать показатели сахара в крови Данное исследование еще раз убедительно показало, что в клеточной структуре селезеночной ткани лабораторных животных имеется компенсаторный механизм, который имеет прямое отношение к коррекции ИН

Гистологическое и гистохимическое исследования аутотрансплантата селезенки экспериментальных животных показали, что трансплантат характеризуется ростом и развитием ангиогенеза и восстановлением циркуляции крови по кровеносным сосудам Вполне вероятно, что в трансплантате селезенки имеющиеся стволовые клетки кроветворного органа получают стимул реализации генетической информации, что и способствует восстановлению, росту и функционированию р - клеток панкреатических островков при искусственной ИН

Цитофлюрометрическое исследование с целью определения феноти-пических особенностей аутогенных спленоцитов, трансплантированных в брюшную полость крысы после спленэктомии, проводилось спустя 7 дней после оперативного вмешательства

В культурах спленоцитов взрослых крыс количественно преобладали зрелые, С045+СБ90- клетки, доля стволовых гематопоэтических клеток (С045-С090+) составила около 11 % (табл. 4) В культурах эмбриональных спленоцитов количественно преобладали стволовые гематопо-этические клетки Причем, несмотря на небольшое число наблюдений (п = 3) в рамках однофакторного дисперсионного анализа, были выявлены статистически значимые различия (Р - критерий Фишера — 23,4, Р = 0,0084) В культурах эмбриональных спленоцитов идентифицировались клетки, которые экспрессировали антиген СЭ90, но не экспрессировали лейкоцитарный антиген СГ)45. Такой фенотип характерен для стромальных стволовых клеток Клеточная структура извлеченных из брюшной полости ау-тологичных фрагментов селезенки также характеризовалась как наличием зрелых форм гематопоэтических клеток, так и стволовых гематопоэтических и стромальных клеток (рис. 1)

Таблица 4

Фенотипическая характеристика эмбриональных спленоцитов и зрелых спленоцитов после 7-суточного культивирования и спленоцитов, полученных __из реплантированных в брюшную полость фрагментов_

Вид клеток Относительное содержание клеток, %

СВ45+СБ90- С045+СБ90+ СВ450)90-

Эмбриональные спле-ноциты 20,2±15,1 31,5±10,4* 9,6±8,8

Зрелые спленоциты 77,7±5,0 10,9±1,7 0,3±0,3

Спленоциты, полученные из фрагментов селезенки 6,6±16 4,2±1,8 0,5±1,2

* достоверные различия между группами 1 и 2 (Р<0,05)

Полученные в настоящем исследовании результаты убедительно подтверждают сохранность и наличие стволовых гемато по этических и строгальных клеток в составе трансплантируемых аллогенных спленоцитов после длительного культивирования. Кроме того, зрелые лейкоциты, гемато-поэтические и стромалыше стволовые клетки идентифицированы в ауто-логичных фрагментах селезенки, реплантированных в брюшную полость после спленэктомии. Этот факт весьма интересен с точки зрения подходов к коррекции ИН,

О

Зрелые Эмбриональные

3 С045+С090- ■ С045+0090+ Щ С045-С090+

Рис. 1. Суйпопу ли цн о «ш а н структура клеток в 7-суточных культурах зрелых и эмбриональных спленоцитов крыс (проточная цнтофлюо ромегрия).

В 5 группе экспериментального материала агтлоксзновая ИН получена у всех животных. Первые 3 дня являются критическими, 8 крыс погибли в эти сроки. Коррекция ИН проводилась введением пролонгированного инсулина, что позволило перевести остальных лабораторных животных в хронический эксперимент. К концу недели всем животным проводилась инъекция аллогенных клеточных культур в 2 вариантах - эмбриональной (5А подгруппа) и «взрослой» (56 подгруппа) селезенки.

Клеточный материал в количестве 1 мл, что соответствует 1 млн. клеток, вводился с помощью инъекции в хвостовую часть лабораторного животного, Крысам продолжалась заместительная коррекция ИН еще в течение недели, после чего она была отменена. Если в 5А группе крыс отмечалось более ускоренное, значительное и стойкое снижение, то в 5В группе снижение показателей носило длительный и волнообразный характер. К концу первого месяца трансплантации лабораторные животные стали более актив-

ными, у них появился хороший алпетит Данное исследование позволило убедиться, что аллогенная имплантация селезеночной ткани с течением времени (более 4 недель) в большинстве случаев приводит к постепенной коррекции ИН до нормальных показателей к концу 60 суток (табл. 5)

Таблица 5

Показатели сахара в крови у экспериментальных крыс с аллоксановой инсулиновой недостаточностью

Сроки после операции 5А группа 5В группа

До операции 5,5±0,19 р<0,05 5,05±0,28 р>0,05

2-е сутки (начало инсулинотерапии) 39,5±1,75 р>0,05 38,6±1,60 р>0,05

5-е сутки (инсулинотерапия продолжается) 23,5±1,32 р>0,05 24,8±0,26 р<0,001

8-е сутки (инсулинотерапия продолжается, трансплантация клеточных культур) 15,1±1,58 р>0,05 17,8±1,20 р>0,05

14-е сутки (отмена инсулинотерапии) 17,2±1,10 р>0,05 21,3±1,75 р>0,05

21-е сутки 12,9±1,28 р<0,001 17,5±2,30 р<0,01

28-е сутки 11,0±0,80 р>0,05 16,0±1,17 ¿>0,05

40-е сутки 9,77±1,27 р<0,001 10,2±1,31 р>0,05

60-е сутки 7,66±1,03 р<0,001 10,9±1,38 р<0,001

90-е сутки 7,11 ±1,70 р<0,005 8,0±1,07 р<0,001

Через 6 месяцев 6,91±0,33 р<0,001 7,72±1,27 р<0,005

Через 1 год 5,11±0,22 р>0,05 6,37±1,40 р<0,005

Полученные результаты позволили убедиться, что культивированные клетки селезеночной ткани также обладают компенсаторным механизмом при коррекции ИН. Более эффективным в этом отношении являются клетки эмбриональной селезеночной ткани, что и понятно с позиции их меньшей дифференцированности Клеточные культуры «взрослой» селезенки также показали свою эффективность, хотя привели к коррекции ИН в более длительный период времени

Рис. 2. Мезенхимальные стволовые клетки в культуре. Микроскопия.

Увеличение х100.

При динамическом микроскопическом наблюдении за культурой клеток селезеночной ткани крыс выявлено образование монослоя на 4-е сутки Среди монослоя образуются шаровидные скопления клеток с выраженной пролиферацией В центре «шара» видны единичные крупные клетки с крупными ядрами и выраженной цитоплазмой (мезенхимальные стволовые клетки) Начиная с 10-х суток из «шаров» отделяются скопления клеток, которые также приобретают шаровидную форму, в них также идет интенсивная пролиферация Такое сосуществование «клона» с микроокружением, выраженная пролиферация клеточной культуры еще раз подтверждают, что в ткани селезенки сосредоточены запасы стволовых клеток (рис. 2)

Гистологическое и гистохимическое исследования зоны аллогенной трансплантации зародышевой селезеночной ткани под кожу уха кроликам (6 группа) показали, что иммунная система взрослого кролика остается толерантной к трансплантату эмбриональной селезенки, что подгверждается отсутствием реакции иммунокомпетенгных клеток взрослого организма, а также сосудистой реакцией вокруг трансплантата В самом трансплантате селезеночной ткани отмечается наличие белой и красной пульпы со всеми клеточными элементами, форменных элементов крови и макрофагов, что характеризует высокую функциональную активность трансплантата Небольшие очаги лимфоидной ткани в непосредственной близости от трансплантата образуются, по-видимому, благодаря делению камбиальных клеток трансплантата.

Результаты клинического исследования показали, что единого подхода к классификации спленоза нет Здесь сразу хочется подчеркнуть, что существующее разночтение в определениях «эктопичная селезенка», «до-

полнигельная селезенка», «добавочная селезенка» и «спленоз» приводит к некой путанице Поэтому мы упорядочили существующее разночтение в определении и обозначениях структурных единиц спленоза (рис. 3)

Вся эта группа, обозначенная нами как спленоз, является нормальной и необходимой организму в функциональном отношении структурной единицей Как любому органу брюшной полости, ему присущи патологические состояния, приводящие к тяжелым осложнениям и требующие хирургической коррекции Поэтому предлагаемая нами классификация при выявлении спленоза в клинической практике позволит более адекватно оценить тактику хирургического лечения, а в научном плане - оценить роль различных его вариантов в профилактике приобретенного постспленэктомического иммунодефицита, а в случаях панкреатэктомии — в профилактике ИН

Рис. 3. Классификация спленоза.

Таким образом, учитывая вышеперечисленное, мы можем следующим образом определить понятие спленоз - это разрастание селезеночной ткани вне зоны естественной локализации селезенки, которое может быть врожденным в виде добавочной селезенки и эктопии в тканях других органов или приобретенным, которое возникает в результате травмы селезенки и имплантации ее клеток на соседние органы, и предназначено для компенсации функции утраченной селезенки

Случайное выявление врожденного спленоза в клинической практике, во время лечебно-диагностических мероприятий и при отсутствии патологии должно ограничиться констатацией факта, и больной об этом должен быть извещен Удаление добавочной селезенки может быть оправдано только в гематологической практике, при выполнении лечебной спленэктомии Также

по отношению к приобретенному спленозу должна соблюдаться органосбе-регающая тактика Но в отличие от врожденной формы мы здесь можем предварительно предположить о наличии постспленэктомического спонтанного и аутотрансплантационного спленозов, предназначенных для профилактики аспленизма и подтвердить это неинвазивными и малоинвазивными методами исследования Роль постравматических спленозов при органосбе-регагощей тактике в хирургии селезенки сводится скорее всего к профилактике и коррекции гипО!,пленизма

В 2 случаях резидуальная ткань селезенки в области большой кривизны желудка размерами 2,0x3,0 и 3,0x4,0 см, соответственно, была ошибочно расценена как опухолевидное образование брюшной полости и удалена Удаление резидуальной ткани селезенки у данных больных связано с отсутствием у хирургов информации относительно возможности наличия оставленной ткани селезенки после спленэктомии у ворот органа и ее регенерации Данная тактическая ошибка приводит к пост-спленэктомическому синдрому при отсутствии резидуальной ткани в других областях брюшной полости.

У одного больного при выполнении аппендэктомии выявлен заворот пряди большого сальника и в составе некротизированной пряди выявлено опухолевидное образование размерами 1,5x1,5 см В результате гистологического заключения подтвердился некроз добавочной селезенки В этом случае нельзя исключить, что пусковым механизмом заворота оказалась добавочная селезенка

В другом случае при выполнении лапароскопической диагностики по поводу открытой абдоминальной травмы добавочная селезенка размерами 1,5x2,0 см была повреждена и явилась источником активного кровотечения. Удаление добавочной селезенки привело к стойкому гемостазу, других повреждений органов брюшной полости не было выявлено Удаленная добавочная селезенка послужила материалом для морфологического исследования

У 3 больных после выполнения тотальной дуоденопанкреатэктомии была использована методика ACT Если в первом случае имела место травма ПЖ и ДПК, то в 2 случаях дуоденпанкреатэкгомия была выполнена в плановом порядке у больных с хроническим диффузным туморозным панкреатитом В послеоперационном периоде коррекция ИН проводилась в первые 2 недели После отмены заместительной инсулинотерапии у всех больных показатели сахара в крови оставались невысокими, т е приблизились к нормальным

Таким образом, ACT у ряда больных после тотального удаления ПЖ может выполнять коррекцию ИН. Данный результат, полученный в эксперименте на лабораторных животных и подтвержденный в клинической практике, можно объяснить с позиции исследований в области клеточных технологии в медицине С этих подходов становится понятным, что селезенка является тем органом, который отвечает не только за иммунную систему орга-

низма, но и за процессы регуляции, а так же процесс «стажировки» стволовых клеток организма.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальная аплоксановая и панкреатэкгомическая инсули-новая недостаточность в настоящее время является наиболее удобной моделью сахарного диабета человека и продолжает сохранять значение в научных исследованиях.

2. Тотальная дуоденопанкреатэктомия у лабораторных животных во всех случаях приводит к летальному исходу Поэтому при моделировании экспериментальной панкреатэкгомической абсолютной инсулиновой недостаточности хронический опыт у крыс можно получить путем удаления левой доли поджелудочной железы хирургическим способом, а правую долю путем радиохирургической деструкции с использованием аппарата «Суржи-трон». Данный способ наиболее удобен для изучения патогенеза и результатов лечения инсулиновой недостаточности в хирургической панкреатологии

3 Использование способа ауготрансплантации селезеночной ткани при выполнении панкреатэктомии позволяет провести профилактику инсулиновой недостаточности у большинства экспериментальных животных, что дает основание предположить о возможности получения подобного эффекта при применении в клинической практике

4 Использование трансплантации аллогенных клеточных культур фе-тальной и «взрослой» селезеночной ткани при аллоксановой инсулиновой недостаточности позволяет достичь ее коррекции у большинства экспериментальных животных

5. Морфологическое, цитофлюрометрическое и микроскопическое исследования трансплантируемых аллогенных спленоцитов после длительного культивирования, а также аутологичных фрагментов селезенки, реимпланти-рованных в брюшную полость, показали, что в их составе идентифицируются гемоггоэтические и стромальные стволовые клетки, которые участвуют в восстановлении инсулинопродуцирующих клеток в организме экспериментального лабораторного животного.

6 У больных с тяжелой травмой поджелудочной железы и хроническим псевдотуморозным панкреатитом, которым проводится тотальная дуоденопанкреатэктомия, использование ауготрансплантации селезеночной ткани должно быть обязательным пособием, позволяющим предупредить развитие постспленэктомического синдрома и инсулиновой недостаточности

7. В клинической практике спленоз в 25,0% случаев является врожденным, после спленэктомии в 53,2% случаев он достигается аутотрансплан-тацией селезеночной ткани, в 21,8% - развивается спонтанно и выступает компенсаторным механизмом при нарушенных функциях организма

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Оптимальной диабетогенной дозой для получения острой формы экспериментальной инсулиновой недостаточности у крысы является подкожное введение 125 мг/кг веса 5% водного раствора аллоксана. Данная модель наиболее пригодна для изучения патогенеза и результатов лечения сахарного диабета

2 Для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности и перевода экспериментальных животных в хронический опыт необходимо однократное введение в сутки пролонгированной формы инсулина подкожно в расчете 0,5 ЕД/кг массы тела, предварительно разбавленного на 100 мл физиологического раствора

3 Клеточные культуры аутологичной селезеночной ткани можно использовать в отдаленном послеоперационном периоде, если на момент операции имелись противопоказания к аутотрансплантации

4. Случайное выявление врожденного спленоза в клинической практике, во время лечебно-диагностических мероприятий и при отсутствии патологии должно ограничиться констатацией факта и больной об этом должен быть извещен.

5 Удаление добавочной селезенки может быть оправдано только в гематологической практике, при выполнении лечебной спленэкгомии

6 В отношении приобретенного спленоза должна соблюдаться орга-носберегающая тактика

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Профилактика инсулиновой недостаточности путем аутотрансплантации селезеночной ткани после панкреатодуоденэктомии / В М Тимербу-латов, Р Р Фаязов, Ш В 1 имербулатов [и др ] // Здравоохранение Башкортостана Спец выпуск Труды ассоциации хирургов РБ - 2005 - №1 - С 25-29.

2 Изучение возможности хирургической профилактики панкреатэк-томической инсулиновой недостаточности в эксперименте / РР Фаязов, М М Саяпов, Ш В Тимербулатов [и др ] // Анналы хирургической гепатоло-гии - Материалы XII международной конференции хирургов - гепатологов России и стран СНГ- Ташкент, 2005. -Т.10 №2 - С 169-170

3 Возможности профилактики и коррекции постспленэктомических состояний / Р.Р. Фаязов, М.М Саяпов, Ш В. Тимербулатов [и др ] // Международный хирургический конгресс « Новые технологии в хирургии» Сборник трудов -Ростов-на-Дону, 2005 - С 35-36.

4 Миниинвазивная и органосберегательная хирургия абдоминальных повреждений / Р Р Фаязов, А.Г. Хасанов, Ш В Тимербулатов [и др ] // Международный хирургический конгресс «Новые технологии в хирургии» -Сборник трудов. Ростов-на-Дону, 2005 - С 39-40

5. Изучение возможности хирургической профилактики панкреатэкто-мической инсулиновой недостаточности в эксперименте / Ш.В Тимербула-тов, Р Р. Фаязов, М.М. Саяпов [и др.] // Международный хирургический конгресс «Новые технологии в хирургии» : Сборник трудов - Ростов-на-Дону, 2005 - С. 97.

6 Возможности профилактики и коррекции поетепленэктомических состояний / Ш.В. Тимербулатов, Р.Р. Фаязов, М.М. Саяпов [и др.]// Мевду-народный хирургический конгресс « Новые технологии в хирургии». Сборник трудов -Ростов-на-Дону, 2005- С.327

7. Изучение возможности хирургической профилактики панкреатэк-томической инсулиновой недостаточности в эксперименте / В М. Тимербулатов, Р Р. Фаязов, Ш.В Тимербулатов [и др.] // Материалы Всероссийской конференции хирургов. Махачкала, 2005- с.191-192

8. Изучение возможности профилактики и коррекции постспленэкто-мического иммунодефицита/ Р.Р. Фаязов, М.М. Саяпов, Ш В. Тимербулатов [и др ] // Материалы Всероссийской конференции хирургов Махачкала, 2005-С 195-196

9 Профилактика инсулиновой недостаточности путем аутотрансплан-тации селезеночной ткани при панкреатодуоденальной резекции / В М. Тимербулатов, Р Р. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов [и др ] // Здравоохранение Башкортостана.- 2005.- №1 - С.25-29.

10. Методы лечения экспериментального аллоксанового сахарного диабета / Ш В. Тимербулатов, M M Саяпов, ВА Шавалеев // X Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» -Казань, 2005. -С 262

11. Перспективы использования трансплантации селезеночной ткани при экспериментальной инсулиновой недостаточности /В.М Тимербулатов, Р Р. Фаязов, III В. Тимербулатов [и др ] // Вестник уральской медицинской академической науки -2006. -№1. -С.113-116

12 Возможности использования трансплантации селезеночной ткани для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности / В.М. Тимербулатов, Р Р. Фаязов, Ш В. Тимербулатов [и др ] // Здравоохранение Башкортостана. Спец. выпуск №1. Труды ассоциации хирургов РБ-2005. Т.10 -С.14-19.

13 Возможна ли коррекция инсулиновой недостаточности путем ау-тотрансплантации селезеночной ткани при проведении дуоденопанкреатэк-томии*? / В.М. Тимербулатов, PP. Фаязов, ШВ. Тимербулатов [и др.] // Хирургия. Журнал им. Н.И Лирогова. -2006. -№3. - С.22-27.

14. Мининвазивные технологии, сохраняющие и замещающие селезенку операции в хирургической тактике при травматических повреяедениях поджелудочной железы / В.М Тимербулатов, Р Р Фаязов, Ш В Тимербулатов [и др.]// Анналы хирургической гепатологии - Материалы XIII международной конференции хирургов-гепатологов России и стран СНГ - г Алматы, Т.11.№3 — 2006 - С 59-60

15. Профилактика инсущново| ¡Недостаточности после готальной данкреатэктомии в эксперименте / P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов, М.М. Саяпов // Медицинский Вестник Башкортостана - Сборник научных трудо п Межрегиональной конференции «Достижения и проблемы современной клинической и экспериментальной хирургии» - г. Уфа, 2006 - №1 -СЛ16-117.

16. Мининвазивныетехнологии, сохраняющие и замещающие селезенку в хирургии поджелудочной железы / Р.Р Фаязов, Ш.В. Тимербулатов, М.М. Саянов [и др.] // Медицинский Вестник Башкортостана - Сборник научных трудов Межрегиональной конференции «Достижения и проблемы современной клинической н экспериментальной хирургии» - г. Уфа, 2006 -№1 - С. 124-125.

17. Клеточные технологии в хирургия: мировой опыт и перспективы развития в Республике Башкортостан / P.P. Фаязов, А.Г, Хасанов, Ш.В. Тимербулатов [и др.] // Медицинский Вестник Башкортостана - Специальный выпуск - г. Уфа, 2007 -№2 - С.135-143.

18. Миншшвазненые, сохраняющие и замещающие селезенку оперативные пособия: возможности, результаты и перспективы / В.М. Тимербула-тов, P.P. Фаязов, Ш.В, Тимербулатов [и др.] // Анналы хирургии, - 2007, -Ш.-С.39-43.

19. К вопросу о значимости спленоза в хирургической практике / В.М. Тимербулатов, P.P. Фаято«,, Ш.В. Тимербулатов [и др.] II Хирургическая ге-патология. -2007. С.90-96.

20. Изучение возможности коррекции экспериментальной инсулино-вой недостаточности путем трансплантации клеточных структур селезеночной ткани / В.М, Тимербулатов, P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов [и др.] // Медицинский Вестник Башкортостана - 2007- -№1. -Т.2.-С.62-68.

ИЗОБРЕТЕНИЕ

Патент 2272582 Российская Федерация, МПК А 61 В 17/00. Способ профилактики инсулинозой недостаточности / В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, А.Г. Хасанов, МБ. Тимербулатов, С,И. Рахматуллин, A.M. Хайбул-лин, Ш.В. Тимербулатов, М.М. Саянов, P.M. Сахаутдинов. -№2004124698/14; заявл. 16.08.04,; опубл. 27,03.06., Б юл. №9.

Тнмербулатов Шамиль Внлевнч

Трансплантация селезеночной ткани в профилактике и лечении инсулине вой недостаточности (клинико-экспери ментальное исследование)

14.00.27 - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Лиц. на издат. деят. Б848421 от 03.11,2000 г. Подписало и печать 12.03.2007. Формат 60X84/16. Компьютерный набор. Гарнитура Times New Roman. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. я. — 1,1. Уч.-щд. л. - 1.5. Тираж 100 экз. Заказ Ns^Jj

ИПК Ы'! 1У 450000, ¡ .Уфа, ул. Октябрьской революции, За

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Проблема профилактики и коррекции инсулиновой недостаточности (ИН) в абдоминальной хирургии, в частности при тяжелых сочетанных повреждениях двенадцатиперстной кишки (ДПК) и поджелудочной железы (ПЖ), а также в тяжелых случаях хронического диффузного панкреатита, что предполагает тотальное удаление данных органов в комплексе с селезенкой, все еще не решена [59, 66, 78, 87, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 128, 129, 136]. Предложенные способы аутотрансплантации микрофрагментов эндокринной ткани ПЖ [86] из-за отсутствия ощутимого эффекта широкого клинического применения не нашли. Используемые в настоящее время методы коррекции ИН путем алло - и ксенотрансплантации культур островковых клеток [102, 139] и введения больших доз инсулина [54, 66] не дают желаемых результатов, т.е. не позволяют достичь строгой компенсации углеводного обмена и тем самым замедлить или остановить прогрессирование поздних сосудистых осложнений сахарного диабета (СД). Выход из создавшейся ситуации видится в обнадеживающих исследованиях по применению стволовых клеток при лечении СД, а также в подтверждении факта наличия проли-фирации р-клеток у взрослого человека [10, 78, 86, 120].

В свою очередь, вынужденная спленэктомия при тотальной дуодено-панкреатэктомии приводит к выраженному постспленэктомическому иммунодефициту [3, 4, 7, 8, 9, 10, 12, 20, 21, 27, 28, 32, 45, 49, 73, 78, 79, 86, 90, 94, 95, 96, 107, 110, 111, 114, 122, 124, 126, 131, 178, 191]. Широко применяемый при повреждениях селезенки способ аутотрансплантации селезеночной ткани (ACT) при данных состояниях не используется, хотя в большинстве случаев не имеет противопоказаний [108, 109, 127]. С позиции современных исследований в области клеточных технологий в медицине ACT и изученные ее результаты можно рассматривать как вариант восстановительной терапии стромальными стволовыми клетками селезенки [1, 2, 4, 5, 7, 10, 11, 15, 17, 18, 21, 24, 26, 28, 29, 33, 47, 56, 63, 77, 83, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 109, 110, 116, 117, 120, 122, 124, 134, 188, 195, 250]. Подтверждением этому являются сообщения исследователей о том, что для регуляции восстановительных про5 цессов в поврежденных органах и тканях различного фенотипа возможно использование селезеночной ткани, которой присуща не только иммуногенети-ческая, но и морфогенетическая функция [4, 5, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 47, 48, 50, 56, 64, 65, 67, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 82, 83, 84, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 106, 111, 112, 114, 116, 117, 120, 121, 122, 125, 126, 132, 133, 134, 142].

Становится понятным, что замещение постспленэктомического иммунодефицита происходит за счет участия в регенерации стволовых клеток селезеночной ткани под воздействием биохимических сигнальных веществ, т.е. белковых молекул, способствующих хоумину - способности клеток к миграции в "нужное место" - "родной" орган и ткань (в свою стволовую нишу) или в область повреждения. Безусловно, миграционная способность клеток обусловлена биохимическими сигналами, исходящими из "нужной" области, системой рецепции клетки и способностью к хемотаксису. К настоящему времени наиболее изучен хоуминг гемопоэтических стволовых клеток. Самым изученым фактором хоуминга для стволовых клеток является белок -stromal-derived factor-1 (SDF-1). Совсем недавно появилось исследование об insulin-like growth factor-1 (IGF-1) - зависимом хоуминге [222, 247]. Следовательно, с большой вероятностью можно утверждать о существовании взаимосвязи между ACT и возможностью дифференцировки стволовых клеток имплантата и костного мозга в необходимые организму клеточные структуры [18, 56, 78, 86, 89, 108, 109, 110, 111, 116, 117, 119, 120, 134, 142,215].

Группа ученых из Massachusetts General Hospital (Бостон, США) обнаружила, что селезенка может быть источником взрослых стволовых клеток, которые способны восстанавливать инсулин-продуцирующие участки ПЖ [195]. Оказалось, что эти взрослые стволовые клетки продуцируют протеин Hoxll, который, как предполагалось ранее, присутствует у млекопитающих лишь в период эмбрионального развития [197]. Эти сообщения подтверждают наличие в селезенке стромальных стволовых клеток, которые способны развиваться в большее число разновидностей тканей, чем другие взрослые клетки, и в экстремальной ситуации трансплантация клеток селезеночной ткани может осуществить регенерацию селезеночных и |3-клеток.

Учитывая данные сообщения, можно предположить, что в профилактике и коррекции нарушенных функций организма, в том числе постпанкреа-тэктомической ИН, определенную роль помимо ACT могут играть другие варианты трансплантации селезеночной ткани. Как известно, врожденные добавочные селезенки обнаруживаются у 14-30% больных и выявляются в воротах и связках селезенки, а также в большом сальнике [33, 84, 149, 160, 181]. Эктопичная селезеночная ткань обнаруживается в гистологических препаратах, взятых у больных из различных отделов слизистой желудочно-кишечного тракта во время кровотечения или же при резекции, а также в составе тканей различных органов и систем [147, 169, 186, 187, 198, 221, 223, 240]. Эктопичная селезеночная ткань, получившая развитие после спленэк-томии, в литературе обозначается как спленоз. Она представляет собой очаги регенерации селезеночной ткани, диссеминированной во время травмы и кровотечения в брюшную полость, или остаток фрагмента ткани на своем месте как неудаленный участок [7, 8, 9, 10, 158]. С позиции современных клеточных технологий определённую надежду мы возлагаем на изучение и применение состояния спленоза, вызываемого трансплантацией культивированных клеток селезеночной ткани в различных вариантах. Но работ, посвященных изучению роли и значимости спленоза в коррекции нарушенных функции организма, в том числе ИН нет.

Наличие актуальной проблемы в абдоминальной хирургии и возможность решения некоторых ее задач с позиции современных клеточных технологий явились основанием для проведения экспериментально-клинического исследования.

Цель исследования:

Улучшить результаты профилактики и лечения больных с инсулиновой недостаточностью в хирургической практике.

Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные модели экспериментальной панкреатэкто-мической и аллоксановой инсулиновой недостаточности.

2. Изучить возможности профилактики и коррекции экспериментальной панкреатэктомической инсулиновой недостаточности путем аутотранс-плантации селезеночной ткани.

3. Разработать методы использования клеточных культур фетальной селезенки для коррекции экспериментальной аллоксановой инсулиновой недостаточности.

4. Обосновать технологию использования соматических стволовых клеток селезенки аллогенной линии для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности.

5. Разработать и внедрить в клиническую практику методы трансплантации клеточных культур селезеночной ткани (спленоза) для профилактики и коррекции нарушенных функций организма, в том числе инсулиновой недостаточности.

6. Изучить результаты клинического исследования.

Научная новизна:

Впервые изучена возможность проведения профилактических и лечебных мероприятий при экспериментальной инсулиновой недостаточности путем использования клеточных культур селезеночной ткани в различных вариантах. Доказана эффективность использования аутотрансплантации селезеночной ткани для профилактики экспериментальной панкреатэктомической инсулиновой недостаточности. Обоснована возможность и показана эффективность использования клеточных культур фетальной и соматической селезенки при лечении экспериментальной аллоксановой инсулиновой недостаточности. Впервые в хирургической практике при проведении дуоденопанкреатэктомии показана эффективность профилактики инсулиновой недостаточности путем,аутотрансплантации селезеночной ткани. Впервые в клинической практике изучена роль спленоза, представлена его классификация и исследовано возможное участие различных его вариантов для коррекции нарушенных функций организма, в том числе инсулиновой недостаточности.

Практическая ценность работы:

Возможность профилактики и коррекции панкреатэктомической инсулиновой недостаточности с использованием аутотрансплантации селезеночной ткани и ее клеточных культур в послеоперационном периоде имеет практическую ценность в абдоминальной хирургии. Изученная в эксперименте возможность коррекции аллоксановой инсулиновой недостаточности с использованием трансплантации клеточных культур фетальной селезеночной ткани и аллотрансплантации культивированных клеток соматической селезеночной ткани имеет практическую ценность в эндокринологии. Разработанный способ аутотрансплантации селезеночной ткани при тотальной дуоден-панкреатэктомии при травме и хроническом диффузном псевдотуморозном панкреатите позволит провести профилактику постспленэктомического синдрома и инсулиновой недостаточности в раннем и отдаленном послеоперационном периодах. Исследование роли спленоза и его классифицирование имеют практическое значение в клинике и позволят научно обосновывать возможность участия в коррекции нарушенных функций организма.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальная аллоксановая и панкреатэктомическая инсулиновой недостаточности в настоящее время является наиболее удобной моделью сахарного диабета человека и продолжает сохранять значение в научных исследованиях.

2. Аутотрансплантация селезеночной ткани при выполнении дуодено-панкреатэктомии в эксперименте способствует профилактике инсулиновой недостаточности.

3. Аутотрансплантация клеточных культур селезеночной ткани после выполнения дуоденопанкреатэктомии в эксперименте приводит к коррекции инсулиновой недостаточности в отдаленном послеоперационном периоде.

3. Трансплантация клеточных культур фетальной аллогенной селезеночной ткани приводит к коррекции экспериментальной аллоксановой инсулиновой недостаточности.

4. В клеточных культурах селезеночной ткани присутствуют функционально активные родоначальные клетки крови (гемопоэтические и мезенхи-мальные), которые участвуют в восстановлении инсулинопродуцирующих клеток организма.

5. Спленоз является одним из компенсаторных механизмов организма и в послеоперационном периоде участвует в профилактике и коррекции нарушенных функций организма, в том числе инсулиновой недостаточности.

Внедрение в практику. Тема работы входила в план научных исследований ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет». Результаты проведенных исследований внедрены в отделениях хирургических болезней БСМП г. Уфы, ГКБ №21 и 8 г. Уфы.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на заседаниях Ассоциации хирургов РБ (Уфа, 2004, 2005, 2006, 2007); научно-практической конференции, посвященной 15-летию кафедры хирургии и медицины катастроф ИПО БГМУ (Уфа, 2004); Всероссийской конференции молодых ученых (Казань, 2005); международном хирургическом конгрессе

Новые технологии в хирургии» (Ростов-на-Дону, 2005); Всероссийской конференции хирургов (Махачкала, 2005); XII международной конференции хирургов-гепатологов России и стран СНГ (Ташкент, 2005); Межрегиональной конференции «Достижения и проблемы современной клинической и экспериментальной хирургии» (Уфа, 2006); XIII международной конференции хирургов - гепатологов России и стран СНГ (Алматы, 2006).

выводы

1. Экспериментальная аллоксановая и панкреатэктомическая инсули-новая недостаточность в настоящее время является наиболее удобной моделью сахарного диабета человека и продолжает сохранять значение в научных исследованиях.

2. Тотальная дуоденопанкреатэктомия у лабораторных животных во всех случаях приводит к летальному исходу. Поэтому при моделировании экспериментальной панкреатэктомической абсолютной инсулиновой недостаточности хронический опыт у крыс можно получить путем удаления левой доли поджелудочной железы хирургическим способом, а правую долю -путем радиохирургической деструкции с использованием аппарата «Surgitron». Данный способ наиболее удобен для изучения патогенеза и результатов лечения инсулиновой недостаточности в хирургической панкреа-тологии.

3. Использование способа аутотрансплантации селезеночной ткани при выполнении панкреатэктомии позволяет провести профилактику инсулиновой недостаточности у большинства экспериментальных животных, что дает основание предположить о возможности получения подобного эффекта при применении в клинической практике.

4. Использование трансплантации аллогенных клеточных культур фетальной и «взрослой» селезеночной ткани при аллоксановой инсулиновой недостаточности позволяет достичь ее коррекции у большинства экспериментальных животных.

5. Морфологическое, цитофлюрометрическое и микроскопическое исследования трансплантируемых аллогенных спленоцитов после длительного культивирования, а также аутологичных фрагментов селезенки, реимплан-тированных в брюшную полость, показали, что в их составе идентифицируются гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, которые участвуют в восстановлении инсулинопродуцирующих клеток в организме экспериментального лабораторного животного.

6. У больных с тяжелой травмой поджелудочной железы и хроническим псевдотуморозным панкреатитом, которым проводится тотальная дуо-денопанкреатэктомия, использование аутотрансплантации селезеночной ткани должно быть обязательным пособием, позволяющим предупредить развитие постспленэктомического синдрома и инсулиновой недостаточности.

7. В клинической практике спленоз в 25,0% случаев является врожденным, после спленэктомии в 53,2% случаев он возникает в результате аутотрансплантации селезеночной ткани, в 21,8% - развивается спонтанно и выступает компенсаторным механизмом при нарушенных функциях организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оптимальной диабетогенной дозой для получения острой формы экспериментальной инсулиновой недостаточности у крысы является подкожное введение 125 мг/кг веса 5% водного раствора аллоксана. Данная модель наиболее пригодна для изучения патогенеза и результатов лечения сахарного диабета.

2. Для коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности и перевода экспериментальных животных в хронический опыт необходимо однократное введение в сутки пролонгированной формы инсулина подкожно в расчете 0,5 ЕД/кг массы тела, предварительно разбавленного в 100 мл физиологического раствора.

3. Клеточные культуры аутологичной селезеночной ткани можно использовать в отдаленном послеоперационном периоде, если на момент операции имелись противопоказания к аутотрансплантации.

4. Случайное выявление врожденного спленоза в клинической практике, во время лечебно-диагностических мероприятий и при отсутствии патологии должно ограничиться констатацией факта и больной об этом должен быть извещен.

5. Удаление добавочной селезенки может быть оправдано только в гематологической практике при выполнении лечебной спленэктомии.

6. В отношении приобретенного спленоза должна соблюдаться орга-носберегающая тактика.