Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Структура интимы сосудов и роль клеток крови в изменении ее организации (экспериментально-морфологическое исследование)

12,1 12 ЗД

Харьковский медицинский институт

на правах рукописи

Мензотова Наталья Геннадьевна '

"СТРУШРА штш СОСУДОВ И РОЛЬ КЛЕТОК КРОВИ

В ИЗМЕНЕНИИ ЕЕ ОРГАНИЗАЦИИ" ' /экспериментально-морфологическое исследование/

14.00.02 - Анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 1992

Работа выполнена в. лаборатории экспериментального ате-•исклероза Харьковского научно-исследовательского института /ерапии ЫЗ Украины и в проблемной лаборатории кафедры внутренних болезней Харьковского медицинского института.

Научный руководитель : доктор биологических наук,

профессор Самойлов Н.Г.

Научный консультант : доктор медицшскж наук,

.академик Маша ЛX

Официальные оппоненты : доктор медицшскж наук,

' профессор Костыленко ЮЛ. доктор медицинских наук, профессор Решетияов В.И. Ведущее учреждение - Киевский медшрнский институт.

Защита состоится " ^ " 1993 г. в ^ '-асов

на заседании специализированного совета Д 088.23.03 при Харьковском медицинском институте (Харьков-22, пр. Правды, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Харьковского медицинского института С Харьков-22, пр. Ленина, 4). !

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук,

доцент

Сорокина И.В.

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМ/.

Возрастные изменения в системе кровообращения, не являясь первичными в генезе старения, в значительной мере определяют его характер и темпы, ограничивая адаптационные возможности стареющего организма (Решвтилов ВЛ.,1975, $901; Костиленко Ю.П., 1981; Чеботарев ДЖ и др.,1982; Би: серина В.П. и др., 1986). Склеротические изменения стенки сосудов являются неизбежным возрастным биологическим феноменом, присущим человеку (Давыдовский О. ,1966). Если на ранних этапах онтогенеза склерозирование носит адаптационно -физиологический характер, то в поэтом возрасте атеросклероз возникает в результате нарушения гсмеосгаза и является неотъемлимым компонентом старения (Дилъман В.М.,3963Х Динамика возрастных склеротических процессов во многом определяется генетической программой, но она, безусловно, находится в тесном взаимодействии с факторами внешней среды (характер питания, психо-эмоциональные- нагрузки, двигательная активность и др.). Прогрессируйте разрастание интимы крупных, жизненно важных сосудов, формирование .бляшек, б результате чего частично" или полнсстьз закрывается просвет сосудов, является причиной преадевременшй смерти пслгввш населения в возрасте старее 40 лет ¡Репин Б.С.,1930). В связи с зтим изучение факторов, влияггак на развитие возрастных изменений сосущ^той" системы, в настоящее вреня имеет важкуз обсгебиологическуш значимоеть.

Одним из ведущих направлений в исследовании возрастных

особенностей сердечно-сосудистой системы, приводящих к -развитию атеросклероза» является изучение структурно-метаболических изменений артериальной стенки» Нспешное применение методов морфологического анализа в работах Рехтера М.Д. и сотр. (1991), Бобрика И.И. и сотр. (1991), Кондакова И.К. (1989) позволило обнаружить начальные изменения в стенке сосудов (долипидные изменения), установить различнуш устойчивость участков сосуда к атероскяеротическш повреждениям, волнообразное течение атеросклероза и роль различных факторов риска. Однако, несмотря на определенные успехи, достигнутые в изучении морфогенеза атеросклеротических повреждений, многие центральные вопросы в этой области еще - далеки от окончательного решения, в частности роль липопротеидов и клеток крови в развитии морфологических' перестроек стенки сосуда.

Одним из' перспективных направлений в исследовании атеросклероза является' его изучение с иммунологических позиций. Согласно аутоиммунной теории патогенеза атеросклероза, образование иммунных комплексов липопротеид-антитело явля-

ртга итпиртшм мпмрнтпм плэпмтиа ятрппгк гтрпптнийгклй fiiromra

W 1 WVI 1 ЛНЛЛШ Ь>||| ил wiliuil * WU1 WWWJ 14* Atf А Ш i WWW W* WIW^W W илиьшллл 4 4

Многолетние исследования Климова Й.Н. и его сотрудников (1986) показали существование прямой корреляции между концентрацией иммунных комплексов и развитием атеросклероза, а такне его клинических проявлений» Было обнаружено, что аутоиммунная модификация' липопротеидов повышает их атероген-носгь (Климов Й.Н.,1988). В культуре моноцитымакрофаги фагоцитируют иммунные комплексы и, накапливая лилиды в цитоплазме, превращаются в клетки, которые по морфологии сходны с пенистыми клетками атеросклеротических бляшек. Однако,

■.,.•■..• - 3 -

механизм взаимодействия штунных . комплексов с моноцита-мм-мащзирзгами' в сосудистой стекке еще далеки от полного

■ понимания. Поэтому исследование, морфологически оссбеннос-■; тей стопки сосудов и щеток крови, а также эксперимента б

культуре монацитов могут внести неноторр ясность в иммунологические аспекте -развития атеросклероза,' Исходя из выше... изложенного и/дчитавая недостаточна разработанность проб. лешу было гфедгршто настоящее исследование, .. ' . « ; У [¡т и ЗЙЩШ'ИШМВРШ -

*

Цвльш настоящей. раоо гр бшвд издчение стрдктдано-кота-

-баяических аспектов■вэа^лодейсгпм-ионоцитов крови сп стенкой сосудов в норме и в прессе формирования атероснлеро-тических бляшек. .

Для достижения 4 указанной цэли были поставлены следрн . ;тв задачи. • '

' 1. Исследовать' особенности взаимодействия моноцитов крови - ■ со стенкой сосудов с-позиций их структурно-метаболических

■ ■' изменений и участия в захвате лшопротеидов.

. -2. Изучить аорфофуккщзональше особенности зажата шща-Тгж *!щтнннк но-'олексов.

•3, Обосновать нехзнизш ингибирозаниа морфогенеза и рвгрес-

■ сии атеросклсротичзских бляжек,

' кетвя ковизш тот.

• При 'помощи аакрошфоскогшеского ¿¡рйшрщюв^ит и нс,-р-■.; фраетрии установлено шшм&пзо ггор&фр^жеа ате^зскляио-

тичееких бляшек на единице площади лшинашшй поверхности -грудной-и-бритой"аорты, . ,

2» Методами скашрущей и трасшссионнрй. электронной микроскопии показана избирательная адгезия дасцитов на неповрежденном эвдотелш в зоне жвдных-полос и ишиграща моноцитов в интммд через мемкяеточше контакта эндотелия» В. субзндотелиальном пространстве' выявлено два таги макрофагов интимы : секреторные макрофаги и пенистые клетки» Первый тип макрофагов участвует в местных иыыунологичесюж реакциях, Второй тип клеток'происходат из макросов/учас'твушр-а • в захвате липопротеидов^ проникших в интиму. Морфологически продемонстрирована возможность выхода .'пенистых '.клеток, из ■субэндотелиальногр пространства» в результате чего избыток липидов удаляется из стенки сосуда» ' .

3. Впервые показадо,.-что-аррш«ушше комплексы липопрйтеид :: низкой плотности-антитела, выделенные "из крови больных ИБС» способствует накоплении липидов в цитоплазме морртов и превращении их в макрофаги, корфологически сходные с ,пенистыми клетками интимы сосуда» Структурная реорганизация клеток б процессе накопления липидов сопровождается снижением активности аденшвгциклазной системы и изменешем количест- . ееншх соотношений продуктов обмена арахидоновой кислоты..

4. Процессы нерегулируемого рецепторного захвата иммунных комплексов ш накопления лщщов в клетках подавлявтся инги-битрраш фагоцитоза, • в основе действия которых лешт нару- , "шение структурной реорганизации цитоскелега. Агента с подобным механизмом действия перспективны в плане целенаправленной регуляции процессов регрессии очагов атеросклероти- : ческих поранений стенок сосудов»

■ 5. Установлено, что одним из механизмов, препятстзуЕжн накоплении лишдов в метках» ксает быть'активация обратного транспорта холестерина в составе мультизезикуляргаос телец, которые формируются под воздействием кариилз. 8. В работе установлена стрртурно-функцноналънэя близость процессов адгезии и фагоцитоза и возношность их регуляции одшки к теш же веществами, .клеточной мииеньш которых является цитоскелет.

Результаты проведенных исследований позволили ефопму-лировать следущие ношения, выносящиеся на защиту.

1. Нарушение взаимодействий з систпе моноцит-стенка спру-да-лшогфотевды' является одюй из причин развития атероск-лераттескнх поврвщеШ ствкзш сосуда.

2. Одним из прикладных аспектов ториожения развитая ате-росклеротических бляшек .и предупреждения атеросклеротичзс-ких повреждений сосуда является коррекция функций нокоци-

ТОВ-М21фОфаГОВ Г

- подавление нерегулируемого захвата иммунных комплексов ;

- активация обратного транспорта холестерина (ретрозндоцп--тоза). .

■ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЯ^ГС.

Анализ результатов исследования лсзвйлил установить, что" одним из возможный; аспектов патогенеза атеросклероз могут быть нарушения в системе мЬноцит-зндотей5й-су5з.:щг!:-2--лиальный макрофаг, вызванные появлением в крови аутом^ун-' ных-комплексов липопротсид низкой плотности-антитело. Изу- •

чение очагов атеросклероткческих поражений как зон иммунологических конфликтов открывает возможность использования в .клинической кардиологии имнуномодуляторов в качестве .агентов, защищащих стенку сосуда от повреждения.

Моделирование в культуре клеток элементарных событий морфогенеза атеросклеротических поразений представляет несомненный интерес для теоретической медицины и биологии. Исследование ыорфофункшональных аспектов накопления липи-дсв в моноцитах-макрофагах открывает возможность разработки стратегических направлений' целенаправленной фармакологической регуязшги обратного транспорта липидов из-стенки сосуда и атеросклеротическж бляшек, что. безусловно,

является актуальном для 'успеха лекарственной терапии этого заболевания, Оценка патогенности ЩфкулируЕщих аутоиммунных кС'1ШЕ1ексов е зависимости от -их влияния на морфология кле-:ск. ^сто-кш сщенилатциклазной система, и обмена арахидо-нозсЛ кислоты мозет использоваться как диагностический критерий для определения степени тякести заболевания • и контроля за эффективностьш лекарственной терапии в клинической практике.

Все вышеперечисленное открывает возможность ранней диагностики нарушения морфофункциональной целостности стенки сосуда, разработки комплекса превентивных мер и аффективного воздействия, на течение процесса заболевания. * *

' ЯПРООАНИЙ РАБОТЫ. '

Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуздены на Всесоюзных конференциях "Новые пришше-

ния морфометрии и математическое моделирование в медико-биологических исследованиях" /Харьков, 1990/,"Структурно-функциональные единицы и ИХ' компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии" /Харьков,. 1991), на научно-практической конференции "Фундаментальные и прикладные аспекты нетрадиционной медицины" /Харьков, 1992), на международных симпозиумах по Атеросклерозу (Чикаго, 1991; Ницца, 1392), на международаой конференции . по. Бторичташ мессендщзам (Глазго, 1992), на IX Европейское анатомическом конгрессе (Краков, 1992'),

РЕАЛИЗАЦИЯ шагах ЙССЩОВт

Основные положения диссертеции отражены в 10 пубдика-. циях, Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедрах анатомии человека, гистологии, пропедевияш внутренних болезней Харьковского медицинского института, на кафедрах анатомии человека Запорожского и Тернопольского медицинских институтов, в работу научно-исследовательского центра при Винницкой, медицинском институте. Полученные данные использртся в клинической.практике в отделении артериальной гипертонии НИИ Терапии /г» Харьков/,

ОБЪЕМ И СТРВКТЗРЙ РАБОТ!

■ /"диссертация изложена на 185 страницах машинописи. Состоит из введения, обзора ш{тературы, главы, освещающей материал и методы исследования, изложения полученных, розулъ-татрв и их обсуждения, зек течения, выводов и сгонка

■ -8' '

читературы» насчитывающего 297 источников ( из них 52 оте- -явственных и 244 зарубешш). Работа включает 15 таблиц, 10. -рафиков» 5 гистограм, 49 микрофотографий, б рисунков, '

2/ ШТЕРЙШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом исследования служили крупные артериальные . сосуда (грудная и бршная аорты) мужчин в возрасте от 50 до 57 лет с диагнозом коронарного,атеросклероза и мунчин в возрасте от 25 до 34 лет, причиной смерти которых не являлась сердечно-сосудистая патология, Материал был' получен в патологоанатомическом отделе Харьковского НИИ Терапии.

В экспериментах использовалась стабилизированная/0,А7. ЗДТА донорская кровь (мужчины в возрасте от 25 до 45 лет) с' Харьковской станции переливания крови и лейкоцитарная масса -больных ИБС, полученная в процессе плазмафереза в „отделении ■ атеросклероза НИИ Терапии, Эта группа доноров,была щзедс-тавлена мужчинами в возрасте от 43 до 57 лет с диагнозом коронарного атеросклероза, с клиническими проявлениями хронической ИБС : стенокардия напряжения и покоя 3 -й 4 функционального классов и прогрессирущая стенокардия напряжения по классификации Канадской Ассоциации Кардиологов в модификации ВКНЦ АЙН СССР, Клинически у всех пациентов было выявлено нарушение липидного обмена с повышением- уровня липоп-ротеидов низкой и очень низкой плотности (7,86 ± 1,87 г/л). За месяц до госпитализации пациенты прекращали принимать антагонисты кальция, но пролонгированные нитраты и нитроглицерин не отменялись. Процедура плазмафереза назначалась на следушщий день после госпитализации.' Перед процедурой из

локтевой вены у пациента брали 20 мл крови без стабилизатора для выделения аутоиммунных комплексов.

Иммуноглобулины класса Б из сыворотки крови человека получали на ДЭАЕ-целлшозе (Френель Г.,1987). Аутоиммунные комплексы из сыворотки крози больных ИБС выделяли 5'/. ПЗГ-6000 (Стручков Н. Н, и др., 1985). Холестерин в иммунных комплексах определяли с помощьш ферментных наборов фирмы АжегзЬаш (Англия).

Количество исследованных сосудисто-тканевых.комплексов и число доноров, кровь которых использовалась в зкспериыен-. тах, представлены в таблице 1. •

После вскрытия грудной и бршной полостей аорты ]треш-рировали по Воробьеву В.П. (1925). Сосуды фиксировали в 10л' формалине. После, окрашивания спирт-формалиновым раствором судана.ГП (Непряхин Г.Г.,1979) макроскопические препараты анализировали морфометрическими методами с использованием . тестовых сеток (Автандилов Г. Г.,1990).

Гистологические препараты стенок сосуда готовили по методу Ьо]с1а 2.(1971) и окрашивали гематоксилин-эозином.

Все электронномикроскопические исследования были проведены в лаборатории экспериментального атеросклероза НИИ Терапйи (зав. Кондаков И.К.). Автор благодарит к.к.к. Кондакова И.К. за помощь и.практические рекомендации в получении препаратов.

Фрагменты сосудов фиксировали 2.5% глетаровым альдегидом, постфиксировали 0,17 0з04. обезвоживали в' спиртах и ацетоне, заливали в эпон-зралдит (Гайер Г.,1974). Ультратонкие срезы ' контрастировали уранил ацетатом, цитрате^ свинца и анализировали в трансмиссионном микроскопе

Таблица 1.

Количество исследаванг&х сосудисто-тканевых комплексов и доноров крови, которая использовалась в экспериментах.

Доноры Больные ИБС

Возраст Количество Возраст Количество

Кровь 25 8 43 - ' 3

31 6 50 5. . '

33 3 53 6 .

42 5 55 9 -

- 45 2 5? 5

• Всего : 24 Всего : 28

. Случайные травмы ИБС

. (норма)

Возраст * ■ Количество Возраст Количество

Сосудисто- 25 7 50 - 5 ' ■•■'

тканевые 30 5 51 7

комплексы 31 6 52 4

'33 5« 53 . 4"

34 4 57 5

Всего : 2? Всего : 25

-11 -

сканирущей микроскопии обезвоженные в спиртах и ацетоне образцы высушивали в критической точке й нашшшзи серебром.

Моноциты выделяли по методу Recalde H.R.% (1984). Чистоту полученной популяцйи моноцитов определяли, окрашивая-зафиксированные в 4% формальдегиде клетки по Гиыза, а такяе по результатам гистохимических реакций на пероксидазу (Graham R.C.,1966) и.эстеразд (BurstonB-íí,S.,1962). С цельи изучения функционального состояния системы циклических нук-леощцов и обмена арахидоновой кислоты определяли динамику^ уровня цШФ, цГНФ, простагландиноа группы Е2 и лейкотриенов группы В4 на рецепторном этапе фагоцитоза иммунных комплексов и натив^шх липопрптеидоз низкой плотности, и sлияние на нее вета-агониста изопротзренола и Са-ннзнтагонистп карди- ' ла* Для этого к првшкубчрованнн?$ в .течение часа при теыпе-

■ ратуре 3?°С в среде Игла С 20 Ш HEPES« бнчкй сывороточный-

■ апьбршн (1 мгЛш), 200 миг/мл стрептомицина, 100 ед./мл ' пенициллина Э моноцитам добавляли изобутаяметияксзнтин С Iii

Ю - ингибитор фосфодиэстеразы, изопротеренол CÍO" M)t ли-попротеиды низкой плотности (100 мкг/ыл), иммунные комплексы С80 мкг холестерина/млкардил (10 У) и останавливали реакцию через различные щшезутки времени, добавляя в инкубационную, среду Í0% трюшоруксуснр кислоту. Суперштанга промывали 2 раза водонасщбшшк дизтюгавыы гфиром» экстракты упаривали досуха при 55-бО"С, Циклические нуклеотадн количественно определяли, используя наборы для радиоизотопного тестирования фщш Chesapol (Чехословакия), Для определения лейкотриенов группы Б4 и простаглзндинов группы Е2 использовали наборы для радиоизотопного тестирования фирмы flmerscham (йгглия). Автор благодарит гл\ научного сотрудни-

. - 12 -

ка лаборатории экспериментального атеросклероза, к.б.н. Г'альчинскуш В J. за пошць в освоении методик радиоизотопного тестирования и в постановке экспериментов.

С цельи изученщ влияния функционального состояния системы циюшческж нуклерщоз ш обмена арахидоновой кислоты на интенсивность щюцессрв накопления липидов в клет-' как, ыонощш шкубмроващ в течение 1В часов в ^присутствии иммунных комплексов,, кардшш и изопротеренола и определяли базадьшй уровень цЙМФ» цГМФ* простагландинов Е2 и лейкот-риенов- В4, а такше содержание различных фракций о бирс липидов. Яишдн экстрагировали смесьш эшсроформ-мэтаноя СКейтс М.Д9753. Общие лшщцы разделяли на фракции на силуфоловых пластинках СЬешаро! (Чехословакия)5 используй стандартнр систему растворителей-СКирхнер Ш.Д981). Количественное определение фракций липидов проводили по методу Кабара Сцит. по Кучеренко Н.Е. и др.Д985). Оптическуш плотность определяли на многоканальном спектрофотометре Flow при длине волны 400 нм.

Для разделений моноцитов на субпоодляцми клетки разводили до концентрацш 10x7 клеток/ш и наслаивали на ступенчатый градиент перколла (Elias 3.fi. et al.f 1985). Полученные субпопуляции фиксировали ОДК глштаровым альдегидом (pH 7,2) и обрабатывали коныгатом протеин fl-коллоидное золото С Baschong К. et ah* 1985моноклональныш антителами к альфа-цегш сЗЫ-рецептора и иммуноглобулинами класса G. Клеточные суспензии фиксировали 0Д% 0s04, обезвоживали в спиртах, заливали в эпон-аралдит и изготавливали ультратонкие срезы (Reynolds E.R.Д963). На микрофотографиях подсчитывать количество частиц золота на участках плазмалеммы

- 13 -

длиной 1000 нм. Характер распределения частиц золота на поверхности моноцитов определяли, используя критерий неоднородности Пуассона Р (Хомутовский О.А. и др., 1986) :

Р = 1 + СБ - М)/М, где М - среднее арифметическое, С - среднеквадратичное отклонение. Распределение считалось равномерным,, если Р<1* В случае 1<Р<1,5 распределение расценивалось как неравномерное. Для кластерного распределения принималось, что Р>1*

Площадь поверхности моноцитов определяли по формуле Корна С Выгодский МЛ., 1982 ).

1д5 = 1д (г0&2 (еГ + сШ/Е агсзш Е)* Объем элипсоида вращений -определяли от формуле :

1д1т = 1ц 1/8пкйс12П где Е -71 - (с!/П )г-- эксцентриситет г ¡1 - малый диаметр; О - большой диаметру к - масштаб (1 шм':2 мм)* Статистическая обработка, полученных результатов быт проведена с использованием критерия Сгьшдента, Цифровые данные•обрабатывались на персональном компьатере.

1 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСЩЕНИЕ.

МОРФОФШЩО.вНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СТЕНКИ СОСУДОВ И ОСОБЕННОСТИ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МОНОЦИТАМИ. Основное развитие- атеросклеротических. повреждений происходит в рубэндотелиальном пространстве интимы сосуда«, где в конечном' счете формируется атеросклвротичесная бляака (Орехов А.Н. и др., 1989), Первые фиброзные бляшки наблюдается в возрасте старше 20 лет (контрольная груша), лакали-

зуясь нрешущественно в бршшрм отделе аорта, что связано с анатомией сосудов и факторами гемодинамики CYoji Y. et ah, 1930; Spring P.M. et al. Д989). Площадь липвдных пятен в • контрольной группе невелика и составляет для грудного отдела аорта 18,8+2,17. и 20,2+3,5У. для бршшого 'отдела. В аортах лщдей, погибших от осложнений атеросклероза, средняя площадь суданофильных участков достигает 61,0+4,2%..

В прйцессе атеросклеротического поражения шшечный слой интиш мало изменяется и имеет одинаковую толщину в бляшке - и лежащее рядом непораженных участках интимы, в то время как пршщкинапьшй слой значительно утолщается. В нем обнаруживается лимфоциты, секреторные, макрофаги и пенистые клетки коноцитарного и гладкоыдаечного происхождения. Миг, рация моноцитов в еубэндотелиаяьное пространство осуществляется через межклеточные контакты зндотелия над формирующимися лигащными полосами, что свидетельствует об изменении функционального состояния эндотелия в этих зонах, . В субэн-дотелиальном пространстве определенный тип моноцитов (специфическая субпопуляция ?)'созревает в скавендщз-макрофа-ги, которые вклшчавтея в ювфенс липопротеидов, проникших в интиму из крови, и превращается в пенистые клетки. В цитоплазме пенистьк клеток содерштся многочисленные, злектрон-нопрозрачные вакуоли (места локализации липидшх капель), не иыещие собственной бислойной мембраны, остаточные тельца и ыиелиноподобные структуры. Наблшдаеыые различные стадии перехода пенистых клеток, из субзвдотешшйн-'го пространства через межклеточные контакты зщогвлш - в просвет сосуда, позволяют предположить, чт пенистые-клетки заносят "в' себе" избыток якшшротеидов из -штан' в з'фс?. ъ 0i?s~

ко, по всей видимости, большинство моноцитов-макрофагов после трансформации в пенистые клетки обездвиживается и накапливается в интиме, способствуя развитии липидного пятна -в атеросклеротическуш бляшку» Кроме того, в некоторых пенистых клетках наблвданггся признаки структурной дезорганизации, которая впоследствие приведет к их гибели. 'Останки погибших клеток являштся потенциальным источником хемоатт-рактантов, которые будут инициировать новую волну инфильтрации интимы;моноцитами С$1са А» еЬ аи,1990).

Секреторные макрофаги интимы, вероятно, происходят от субпопуляции моноцитов, отличной от той, которая дает начало скавенджер-макрофагам СНагорнев В.А. и др.,1988). Секреторные макрофаги не содержат липидных вакуолей. Для. этого типа макрофагов характерны хорошо выраженные перинуклеарныв. профили аппарата Голь дай, гипертрофированная зернистая эн-доплазматическая сеть с расширенными цистернами и присутствие в цитоплазме множества! мелких оптически плотных секреторных гранул-, что свидетельствует о высокой синтетической, и секреторной активности этих клеток.

Присутствие в субэндотелиальном пространстве лимфоци-. тов свидетельствует о тесных, функциональных связях между , макрофагами и лимфоцитами в зонах атеросклеротических повреждений. Зто . позволяет предположить, что определенный вклад в развитие атеросклеротической. бляшки' могут вносить, иммунологические реакции СНагорнев В. А. и цр. ,1991).

СТРУКТУРНО-НЕТАБОШЧЕСКЙИ АНАЛИЗ ПОГШЛВД МОНОЩ^ TOS КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ИБС.

- 16 - .

Моноцита периферической крови проявляют значительную гетерогенность по размерам клеток, форме ядра, активности ■ эсгеразы и перогащазы, степени экспрессии и характеру распределения поверхностных рецепторов. Основными субпопуляциями являются малые моноциты С 11=229+28 мкм5). и средние моноциты (и=335+32 мкм5). Большие и маьрофагоподобные моноциты (11=398+28 мкм3, и=408±35 мкм5, соответственно)-минорные популяции .. Увеличение размеров клеток сопровождается. изменением формы ядра ( от овального к полиморфному), повыиением активности пероксидазы и эстеразы,7 усложнением рельефа плазмалеммы, обогащением цитоплазмы органеллами и . мелкими вакуолями, хзвеличением степени развития эндоплазма-тической сети и комплекса Гольдки. Эти изменения отражают этапы созревания моноцитов в сосудистом русле и свидетельствуй? о повышении секреторной и синтетической активности -клеток в процессе созревания. ■ •

Не вызывает сомнений, что функциональная и морфологическая гетерогенность моноцитов тесно связаны друг с другом. ¡Известно, что в некоторой степени "зеркалом" функцио-шпьной активности клеток является антигенный спектр : степень экспрессии и характер распределения рецепторов'. Малке* моноците характеризуйте? самой высокой степенью экспрессии Рсз1-рецепторов. Возможно, что основной вклад в клеточнуи цитотоксичность вносит именно" эта субпопуляций малых нонсцитое (Иогшап 5.3. в1 а1.,18853,. Незначительное количество Тез1-рецепторов на плазмалекме макрофзгоподобных .шноцитов свидетельствует об ослаблении 1рпт> токсичности в' процессе созревания и повышении фагоцитарной^активности (высокая активность.зстердзы). .. Степень экспрессии сЗМ--ре-

цепторов на плазмалемме субпопуляций моноцитсщ 8 шок нише, чем для Fcjl-рецепторов. Некоторые разлив, в "степени зкспрессш сЗЫ-рецепторов свщтельствщх с неодинаковой способности субпопуляций моноцятов адгезировс!-№с$? на зндсн телии сосудов.СFreyer D.R, et al., "1988; Petty H.R., efc ah ,1987).

Таким образом, морфологическая и функциональная гетерогенность моноцитов периферической крови ■ отражает непрерывность созревай« и связана с тем, что некоторые функции моноцитов могут реализовываться щ определенных этапах созревания и имеют относительно короткий по времени период.

Функциональная гетерогенность моноцитов крови находит отражение в их различной способности к адгезии и фагоцитозу, Динамика адгезии моноцитов здоровых доноров к пластику в первичной культуре в бессывороточной среде носит двухфазный характер : в течение первых 2,5 часов (1 фаза) коли- : чество адгезированных клеток возрастает, достигая 36 'А, затем происходит вторичная ретракция и через 16 часов количество адгезированных клеток уменьшается до Двухфазный характер адгезии, вероятно, связан с различной сте- ' пенью зрелости циркулирущих моноцитов (1 фаза) и с изменением функционального состояния рецепторов адгезии в процессе созревания, моноцитов в макрофаги. CFogelian A.M. et al.,1981; Elliott MX et al.-,1990). '

Кинетика адгезии в культуре моноцитов больных ИБС отличается or таковой для моноцитов здоровых доноров. В процессе культивирования »количество адгезированных; клеток за 2,5 часа достигает 48,52 и через 16 .часов достоверно не изменяется. Возможно, в условиях гиперхолестеролемии плазмы

: -.18- . крови у большое ЙБС изменяется адгезивность моноцитов.

Имнуншз ковшекей^ Деленные из крови больных ИБС . несколько сишаШ йгёзШо'сть моноцитов здоровых доноров :. через 2,5 часа квитирования количество адгезйрованшх клеток достигает 22,8%. Количество адгезированных клеток в культуре моноцитов больных ЙБС достоверно не отличается от контроля, но значительно вше (54,77J по сравнении с моноцитам здоровых доноров.

Са-н-антагонист кардил и бета-агонист изопротеренол значительно стшапт адгезивность моноцитов как здоровых доноров, так и больных ЙБС. Ингибирущее влияние изопротере-нола на адгезию сеязэно с цШ-зависимым фосфорилированием цитоскелетных белков и нарушением структурных перестроек цитоскелета, необходимых для адгезии клеток (Petty K.R. et al. Д989). .

Снижение адгезивности моноцитов к подложке способствует межклеточной агрегации : в культуре пошляются небольше агрегаты из 3-4 клеток.

3#ект кардила обусловлен блокированием меренных Са-н-каналов и ингибированием повышения внутриклеточной концентрации Са++. • - -

•В результате 16-часовой инкубации коно^ггов здоровых доноров ж больных ИБС с иммунными кошлексами появляются ■липид-нагруженные-макрофаги, которые по морфологии сходны с пенистыми клетками атеросклеротических бляшек. В-цитоплазме липид-нзгрренных макрофагов наблюдаются эдентроы^розрач-ные вакуоли (места локализации липидных* капель), не имещие собственной бислойной мембраны, зл9кгроккопло-ш.з остаточные тельца, содррзащие непереваренные продукту кат£йо.шзш-

иммунных комплексов во вторичных лизосонах, обрывки мемб- ' ран. многочисленные ииелиноподобнке структуры - транспортные формы незстерифицированного холестерина. Трансформация моноцитов в липид-нагрузенные макрофаги в результате фагоцитоза иммунных 'комплексов связана с нарушением дшашки . внутриклеточного уровня .цШФ и активацией циклооксигеназно-го пути метаболизма арахидоновой кислоты на ранних этапах реализации процессов фагоцитоза модифицированных липопроте-идов низкой плотности в составе аутоиммунных комплексов. Для нативных лишпротездов низкой плотности характерны активация дипооксигеназнего пути метаболизма арахидоновой кислоты и двухступенчатое повышение внутриклеточной концентрации цйМФ на ранних этапах рецепции. Начальная фаза повышения цйМФ (рецептор-зависимая) является существенным этапом активации клетки, запускащш механизм реализации рецептор-зависимого фагоцитоза. Вторичное повышение цАМФ формирует ингибиторный сигнал, двсенситизирущий клетку и предохраняющий ее зффекторные системы от липидной перегрузки. Частьш десенситизирущего механизм является, активация липооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты и уверение продукции лейкотриексв группы В4. -

В случае с иммунными комплексами подъем концентрации цАМФ на 1 минуте сменяется падением ниже базального значения и начинает восстанавливаться только через 2. часа. Таким образом, .начальные этапы реализации фагоцитоза происходят на фоне сниженного содершания цАМФ и сопровождается активацией обмена арахидоновой кислота по циклооксигеназному пути (продукция простагландиков группы Е2). Отсутствие второго десенситизирушщего клетку подъема цАМФ приводит е ненасыща-

екому, неконтролируемому фагоцитозу ишушых комплексов и жщщий перегрузке клеток в .результате пролонгированной инкубации- с иммунными комплексами. Уровень внутриклеточных эфиров холестерина возрастает в 5 раз. Одновременно на фоне сниженного содержания цйМФ и активации циклооксигеназного пути- метаболизма арахидоновой кислоты нзрразтся процессы обратного транспорта избытка холестерина (ретроэндоцитоз): скорость транспорта ыиьлиноподобных структур ео внеклеточ-нр среду .уменьшается к они накаппиваится в цитоплазме, не спасая клетку от липидной перегрузки.

Мзопротеренол и кардил значительно шгибирушт трансформирующую активность иммунных комплексов. Лигощ-нагружен-ные макрофаги 'при этом не наблццанггся ■ или их количество незначительно. Внутриклеточное содержание зфироз холестерина не отличается от контроля. Защитный эффект изопрогерено-ла связан с повышением концентрации цАМФ и блокированием фагоцитоза. Кардил препятствует липцдной трансформации моноцитов, стимулируя обратный транспорт незстеришицировакно-го холестерина : в- цитоплазме {меток наблвдазтся мультиве^ зикрярше тельца, из которых формируатся окрукенные -мембранами ламеллярные структуры, транспортируете тлеете-' рий кз рулетки. Активация ретрозкдощтоза, вбшштьо, опосредована через регуляцию уровня внутриклеточного цШ-Ф Сикгк-бирование фосфодизстеразы , цАМФ) С Huí К.К, et ai.,1988; Haish М.Р. et aí., 1988; Феоктистов, tí.fi, я PP.,19903.

Црожшпщшванное воздействие кардил? а^ггльно изнс-няет норфологиш клеток : ош округвЕтга, иол-

ностьз теряя отростки и выросты на поверхности ташш&ш, В цитоплазме, шещей характерную зернхстсс-ь; ыол&гз?е£

двёлинённыв митохондрии» расширенные цистерны неззрййстой ' зндоплазматической сети и комплекса Гольдми.

Таким образом, патогенность липопротеидов низкой плотности» подвергшихся аутоиммунной модификации, связана с изменениями в системе циклических нуклеотидов, нарушениями в соотношении между продуктами липооксигеназн и цишгаоксиге-назы» снижении активности ретрозндоцитоза. Целенаправленная ■коррекция динамики- цйМФ, ингибирование циклооксигеназы/ стимуляция ретроэнд'овдтоза открывашт возможность регуляции структурно-функциональных процессов трансформации моноцитов в. пенистые клетки в стенке сосуда, с чем связан один из прикладных- аспектов ингибирования развития атеросклероги-ческих повреждений сосуда и их регрессии. '

■ У В HB ОД Ы

1». Pä^iB -всего возрастные атеросклеротическив изменения штиш обнарриватт в брюшной аорте в виде липиднюг пятен ■

и полос;

2.В зонах лигощгах полос происходит проникновение лимфоци-. тов и моноцитов в интиму сосудов, .

3. В субэндотелщпьном пространстве наблюдается 2 типа макрофагов ». моноцитарного происхождения : секреторные макрофаги и пенистые клетки. '

4. ЦиркулируЕще : монощш крови представлены гетерогенной популяцией клеток, различащихся по морфологии» активности ферментов и характеру распределения рецепторов на плазма-лемме; • ;

5. Аутоиммунная модификация липопротеидов способствует на-

'копленш липидов в щтоплазаё'монощтов и их превращении в какршраги, морфологически сходные с пенистыми клетками,

6. йорфофункциональнэя перестройка моноцитое в ^процессе накопления липидов связана с наррениями в система^дикличес-ких нукяеотщов. "

7. Тормошение накопления липидов в* цитоплазме .^щщр свшано с ингабщшваиием нерегулируемого фагоцитоза' ' ^щрз-ных комплексов Дизопротеренол) ■ и активацией ' обцгщ^о: транспорта холестерина (кардил). . '• . ..

8. Развитие атеросршзротшасшк изменений в стенке.,сосщев определяется равновесием между продуктами . липооксигешзы и циклооксигеназы..

9. Блокирование развития атеросклеротических изменений 'и терапию сосудистой стенки поено осуществлять через актива-цинз обратного транспорта холестерина (ретроэндрцитозаЭ с поыощьш антагонистов кальция«

работ, опубликовавших по теме"диссертации

1. The peripheral blood monocyte subpopulation'; in normal subjects and patients with aigina pectoris' ,7, Mol, Cell. Cardiology,. 1989, U. 21, P. Ш, /в соавтор./.

2. Ультраструктурные щошлвнйя - коррекции механизма монощ-таркого шшренса .лшшдов тагтютш : гаяьщш g больна* атеросклерозом. "Актуальные вопросы штолипяеской екал* ши". Харьков, 1990. С. Î21-128-, /в соавтор./,

3. Морфов 1рмчэскйй подход в оцгже ;:орап'ерг. р&сир?делеш поверхностных рецеидаз моноцитов Щ)oûil Bcc-cdédh, . кошз.

- 23 -

"Новые приложения морфоыетрии'и математическое моделирование в медико-биологических исследованиях". Харьков, 1990. С. 138, /в соавтор./.

4. Влияние иммунных комплексов на морфологические характеристики моноцитов крови человека. Всесошзн. конф. " Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии". Харьков, 1991. С.. 165, /в соавтор./.

5. The comparison of peripheral blood monocytes in healthy subjects and patients with unstable angina. Proc. 9 th Int. Spp. on Atherosclerosis. N.Y.,1991. P. 212, /в соавтор./. 8. Усовершенствованный способ выделения моноцитов крови» 1."Клиническая и лабораторная диагностика". 1992, /в соавтор./.

7. 1ыунш комплекси в процес! атерогенезу. Тез. XIII сьезд. Терапевтов Украины. Киев, 1992. С. 125, /в соавтор./.

8. Влияние липопротеидов низкой плотности и иммунных комплексов на содержание цпМФ в моноцитах крови человека и их трансформации в пенистые клетки. Я."Доклады Болгарской-академии наук", 1991, /в соавтор./.

9. • Трансформирующая активность аутоиммунных комплексов ли-попротеид низкой плотноста-антитело в первичной культуре моноцитов; Научно-практическая конференция "Фундаментальные и прикладные аспекты нетрадиционной медицины". Харьков, 1992. С. 128.

10. Адгезия моноцитов в первичной культуре irr vitro. Tan se. С.129, /в соавтор./.

И. Трансформация моноцитов в липид-нагруненнке макрофаги. Взаимосвязь с реактивностью дценилатциклазной системы. Тан

vse. С. 130, /в соавтор./.

12. Шпуляционная кинетика моноцитов крови в норме й у больныхпиемической болезнью сердца, й."Архив .патологии", 1992, /в соавтор./.

13. Role of cyclic ^nucleotides and arachidonic acid derivates inionocyte transformation into foam cells. Proc. 8 th Int. Conference on Second Messengers and Phosphoprote-ins. Glasgow, 1992. P. 180, /в соавтор./.

14-. Foam cell 'formation in monocyte-macrophages resulting from uptake of low density lipoprotein-antibody complex. Atherosclerosis : Advanses in Treatment.. Boston, 1992. P. 231, /в соавтор./.

15. Ca-h-channel blocker cardil and beta-agonist isoproterenol prevente cholesteryl ester accumulation in monocyte-macrophages. (Ultrastructural studies). Proc. 9 th European Anatomical congress. Cracow, 1992. P. 123, /в соавтор./.

16. Влияние антиангинальной и эфферентной терапии на мета-■ болизы форменных элементов крови,у больных ИБС. В сб.: Актуальные проблемы' современной терапии. Харьков, 1992. С. 37 -48, /в соавтор./.