Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сопоставление биологических эффектов туморнекротизирующего фактора альфа и синтетических олигопептидов, соответствующих отдельным фрагментам его молекулы

р г од 2 9 ЛПР 1396

На правах рукописи

КОНЯЕВ Игорь ГрШ'орьеъич

СОПОСТАВЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ Э1ФЕКТОВ ШЮРНЕКРОТИЗИРУШЕГО ФАКТОРА АЛЬФА И СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОПЕПТИДОВ. СООТВЕТСТВУЩИХ ОТЛЕЛЬНШ ФРАГМЕНТАМ ЕГО МОЛЕКУЛЫ.

14.00.36 - АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИШУНОЛОГИЛ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте зксне-риментальмой медицины Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель лектор медицинских наук, профессор И.С.Фрейдлин

Официальные оппоненты доктор медицинских наук В.С.Смирнов докгор медицинских наук А.С.Сиыбирцев

Ведущее учрелдение - Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера.

Защита диссертации состоится "20" ЛЮсЦ*. 1996 г. в /3° часов на заседании Диссертациинно1'о совета Д.001.23.02 но ващите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Научно-исследовательском институте зкенериментальной медицины РАМН ( 197376. Санкт-Петербург, ул.Академика Павлова 12)

С диссертацией милно оанакимитьсн в научний библиотеке НИИЗМ РАМН.

Автореферат разослан " " лл / Л 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета диктор медицинских наук

Л.А.Бурова

ВВЕДЕНИЕ

В последние гиды большая часть экспериментальных исследований в иммунологии сфокусироьана на иаучении цитокиновой регулиторной сети.

Цитокиновая регуляторная сеть привлекает особое внимание. так как она обеспечивает ьааимодействие иммунокомпе-тентныл и других клеток органнама, опосредованное секретиру-еыыми ими продуктами - молекулами цитоклнов. Каждый на многочисленных цитокинов сннвыьается со своим специфическим рецептором на поверхности клетки-мишени. От рецептора по мутим внутриклеточной трансдукции цитокиновый сигнал актинации передается к ндру клетки и реалиауется. как правило, аалуоком экспрессии какого-то гена или группы генов. Цнтокины причастии к регуляции таких ваднейших физиологических функций как гемипоэа, воспаление. иммунный ответ.

Актуальность.

Особое внимание среди цитокинов привлекает туморнекро-тиаирушии (Ьактир альфа - ТМ>. продуцируемой активированными моноцитами/макрофагами. Для этого полииотентного фактора рецепторы имеются на поверхности большинства клеток органнама. Действуя на различные клетки-мишени, TH<i выаывает раанооб-рааные биологические аффекты. Ив всего многиобрааия биологических эффектов TIIX> модно выделить основные: характерное дли него цитотоксические действие и активирующее действие на фагоцитирующие клетки, в том числе на сами моноциты/макрофа-ги(аутокринная регуляции функций).

Бее многообразие свойств иписано для целой полипептидной молекулы ТНФ, состоящей иа 157 аминокислот. Можно предположить , что конкретные пептидные фрагменты ответственны аа отдельные биологические эффекты молекулы цитокина. Такие короткие пептидные фрагменты могут появляться в органиьме в реаультате ограниченного иротеолиаа молекулы Т1№. Не исключено, что отдельные эффекты ТНФ могут быть опосредованы рааными ei'o пептидными фрагментами. В ивяэи с этим, актуальной аадачей является сравнительное иаучение биолигичес-кил аффектов ТНФ и синтетичеишх олигопептидив, соответствующих отдельным Фрагментам нолипептидной цени молекулы ТИФ.

Пии утим открывается воамилность Проецировать отдельные биологические аффекты ТНФ на структуру его молекулы для уточнении ее структурно-функциональных характеристик.

Цель исследования.

Принести сравнительное иаучение рааличных биологических эффектов рекомбинантного ТНФ и синтетических пептидов, соответствующих отдельным фрагментам его молекулы, с последующим аналиаом структурно-функциональных сопоставлений.

Задачи исследования.

1. Раиоабитать экспериментальные мидели ДЛИ сравнительной иаучения влияния ТНФ и синтетических пептидов на функции мононуклеарных фагоцитов.

2. Провести сравнительное научение влияния ТНФ и синтетических пентидоь, соответствующих отдельным фрагментам ej'o молекулы, на функциональную и метаболическую активность мо-иоиуклеарных Фагоцитов.

3. Провести сравнительнеое иаучение цитотоксического действия ТНФ и тех ле синтетических пептидов На модели стандартных ТНФ-чуьствительных клеток-мишеней.

4. Провести аналиа структурно-функциональных сопоставлений.

Осноьные положения диссертации, ьыносимые на ващиту.

1. Частично перекрывающиеся синтетические Пептиды, соответствующие фрагментам милекулы ТНФ 123-131 и 126-136. мимикрируют маых-'фаг-активируышие уф1>екты рекомбинантного ТНФ.

2. После преинкубации макрофагоподобных клеток P388D1 с синтетическими пептидами 123-131 и 126-136 снилается их чувствительность к актиьирующему действию ТНФ.

3. Синтетические пептиды 123-131 и 126-136. проявляющие макрофаг-активиру»хдее действие, лишены цнтотоксичности, присущей целой молекуле ТНФ.

Научная новиана работы.

Вперьые научена биологическая активность оригинальных синтетических пептидов, соответствующих отдельным фрагментам молекулы ТНФ.

Впервые покааана воамолностъ селекции пептидов иа состава ТНФ, мимикрируыаих его отдельные биологические аффекты. В чгютиисти, eio активирующее действие на минонуклеарные Фа-

1'ОЦИ'ГЫ. И лишенных ЦИТОТОКСИЧНОСТИ, Присущей ЦеЛОЙ МОЛеКуЛе ТНФ.

Впервые селекционированы частично перекрывающиеся синтетические пептиды, соответствующие фрагментам молекулы ТНФ 123-131 и 126-136. которые способны мимикрироьать макро-фаг-актинирующие ¡эффекты ТНФ. будучи иснольаонаны в аквимо-лярных о ТНФ концентрациях. На модели активации макрофагопо-доОных клеток P388D1 под влиянием ТНФ эти пептиды проявляют также свойства антагонистов по отношению к ТНФ. В то ле время у пептидов 123-131 и 126-136 не было выявлено цитотикси-чеокий активности при тестировании на стандартных клетках-мишенях L929.

Таким обрааом. впервые селекционированы частично перекрывающиеся синтетические пептиды, являющиеся агонистамн и антагонистами макрифаг-активирующего действия исходной молекулы цитокина ТНФ и при атом лишенные цитотоксического действия. характерного для ТНФ.

Теоретические и практическое «значение результатов исследования .

Покааана воаможность селекции пептидов иа состава ТНФ. мимикрирующих его отдельные биологические эффекты. в частности. его активирующее действие на мононуклеарные фагоциты, и лишенных цитотоксичности. присущей целой молекуле ТНФ.

Синтетические пептиды, мимикрирующие макрофаг-активирующее действие ТНФ Gea сопутствующих повреждающих аффектов, могут рассматриваться в качестве перспективных иммуномодуля-торов.

Апробации работы. Материалы диссертации дололены на аа-седаиии Санкт-Петербургского общества иммунологов(1994г.); на конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при рааличных Фиэиологических и патологических состояниях "(Челябинск, 1995г.); на I Всерсюсииской конференции молодых фиаиологоь и биохимиков "Биохимические и биофизические механиамы фиаиологических функций"(Санкт-Петербург. 1995г.); на Всероссийским симноаиуме "Биологин клетки ь культуре" (Санкт-Петербург, 1995г.).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 3 октября 1995 гида.

Публикации.

Пи материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации.

Работа состоит из вьедения, главы "Обзор литературы", главы "Материала и методы". главы "Результаты исследований", главы "Обсуждение полученных результатов" и выводив. Объем работы составляет 136 страниц машинописного текста, включая 21 таблицу, 10 рисунков и 1 схему. Список литературы вклыча-ет 181 наименование, из них 34 работы принадлежат отечественным авторам и 147 - зарубежным.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве макрофагов ь экспериментах использовали клетки мышиной макрофагоподобной перевиваемой ллнии Р38801.

Б цитотоксическим тесте в качестве клеток-мишеней использовали перевиваемую линии мышиных фибробластоь Ь929.

Клетки культивировали в среде Г?РШ 1640, с 10Х эмбриональной телячьей сывороткой, 0,03% Ь-глютаыина, 100 мк1'/мл гентамицина.

В качестве рекимбинантного человеческиго Т№ использовали стандартный (коммерческий препарат "Рефнолин'Ч'О^ерментас. Вилышс).

Синтетические пептиды, соответствующие определенным фрагментам молекулы ТН&. синтезированы твердофазным методом с помощью автоматизированного пептидного синтезатора с последующей очисткой методами гель-фильтрации и НР!_С. Аминокислотный состав каждого пептида проверился с помощью автоматического аминокислотного анализатора. БыСор нептидоь осуществлялся на основании даниых ренттеноструктурного анализа м(.>-лекулы ТИФ, согласно которому, пептиды, соответствующие фрагментам молекулы ТНФ: 1-12, 123-131 и 126-136 экспонированы на поверхности молекулы Т№. Б качестве контрольного фрагмента молекулы ТНФ. который, по данным рентгеноструктур-ного анализа, не экспонирован на поверхности молекулы ТНФ. был синтезирован пептид ЮЗ-113. Синтетические пептиды были нам любеуно нредостчшлены Институтом иммунологии Министерства медицинской и микробиологической промышленности (директор

В.П.Завьилон), аа что ыы приносим глубокую благодарность.

Формулы пептидов:

1. Поитнд 1-12

Val - Ai >г- Ser-S«i - Sel - Al к- Т1 и'- Р» Stíi top- Ly a- Pí t)

2. Пеитид 103-113

Aiy-Glu-Tlir-Piv-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lyb-Pio

3. Пептид 123-131

Val - Pi ie- Gl 11- Leu- G1 u - Ly ь- G1 у- Asp- Ai к

4. Пептид 126-13в

Leu-Glu-Lys-Gly-Aüp-Aitf-Ltíu-Sei -AlarGlu-lie

Уровень экспрессии Fo-гаша-рецепторов на поверхности макрофагон определяли по уровни FcR-опосредованного Фагоцитоза арнтроцитов баранов. сенсибшшаиронанных антителами класса IkG [Фрейдлин И.С. 1986].

Уроиень экспрессии CRl-реципторон на поверхности макрофагов определяли по уровню CRl-опосредонанного фагоцитоаа частиц апмоаана, споониаированного оведей человеческий сывороткой [Фрейдлин И.С. 1986].

Уровень акснр^ии MF-рецепторов на поверхности макрофагом определяли ни уровню MFR-огюсредованного фагоцитоаа дроядей Saccliaiomyces ceievlalae (Wild Туре штамм 15В-П4 нрототроф) [Blanco С., Pylowükl В. 19811.

При ивучении фагоцитарной активности макрофагов, после окончания срока инкубации макрифаги отмывали от неаахвачен-ных объектов фагоцитоаа. 0|фашнвали отекла по Май-Грынваль-ду-Романовскому-Гимае. Высушенные стекла прикрепляли к предметным стеклам с иимощыи канадского бальнама. Учет результатов проводили с помощью иммерсионной микроскопии.

Уровень фагоцитоаа оценивали по трем показателям:

- фагоцитарному показателе (ФП) - процент (слеток монослоя. участвующих ь фагоцитозе;

- фагоцитарниму числу (ФЧ) - количество поглощенных объектов фагоцитоаа на 1 клетку монослоя:

- интегральному фагоцитарному показатели (ИФП) - который расчитывали но формуле:

ФП х ФЧ

ИФП ~---------

100

Придукшш супероксид-анииноь макросами, спонтанную и индуцированнцю ли11оиолиоахаридом(ЛПС клеточной стенки Е. со' 11). оценивали микроскопически в стандартном НСТ-теете ГВиксман М.Е.. Маянский А.Н. 19773, вы-шслии процент макрофагов. содерлащих гранулы фирмаэана - процент НСТ-нолили-тельных клеток.

Индексы изменения показателей(ИИП) фагоцитоза и НОТ-теста под влиянием ТИФ или пептидов расчитывали по отношению к показателям контрольных проб в каждом отдельном опыте. принятым за 1.00.

Цитотоксическую активность ТНФ и пептидов определяли ь стандартном цитотикснческом тесте ÎFllck D.A.. Gilfoitl G.E. 1990].

Для определения продукции цитотоксическоги фактора(ТНЮ макрофагами под влиянием пептидов из состава ТИФ макрефаги в обычной культуральной среде культивировали с пептидами в течении суток. Затем изучали цитотоксическую активность суиер-натантов с Помощью описанного выше стандартного цитотокии-ческого теста.

Для изучения влияния преинкубации макрофагов с пептидами на последующую чувствительность макрофагов к действии ТИФ, иа нреинкубииовали с пептидами в течении 2-х часов, а затем. в течении 24-х часов ннкубировачи с ТЮ.

Для статистической ибработки полученных данных применяли следующие статистические методы: вычисление средних, квадратичного отклонения, доверительных интервалов. Сравнение выборок производили с помощью I критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительное научение влияния Т№ и пептидов. соответствующих отдельным его фрагментам, на поверхностный фенотип макрофагов включало изучение изменений экспрессии FcR. CRI и MFR. Экспрессию рецепторов оценивали ни интенсивности фагоцитоза соответствующих объектов, несущих ли1'анды для этих рецепторов.

Бри изучении влияния • ТНФ на фагоцитоз сенсибилизирован-

ных антителами эритроцитов клетками Р288Ш наблюдали доьааа-висиное стимулирующее действие (Табл.1). ТНФ максимально ио-выдал уровень Ро[?-опосредован кого фагоцитоза в концентрациях 0.1 и 1,0 иМ. В дальнейшем мы научали влияние пептидов иа состава ТИФ на Рс1?--опооредоаанный фагоцитоз в концентрациях, эквимолнрных этим концентрациям ТНФ.

Иа четыиех наученных нами пептидов, только пептид 123-131 достоверно стимулировал Рс!?-опосредованный фагоцитов макрифагииодобньош клетками кри использовании его в концентрациях, эквишлнрных обеим стимулирующим концентрациям ТНФ (Та0л.2). При этом, стимулирующие эффекты пептида 123-131 были даде выше, чем соответствующие эффекты ЮТ.

Пептиды 1-12 и 126-136 усиливали Рс1?-опосредованный фагоцитоз только и одной иа использованных концентраций.

Пептид 103-113 ие оказывал влияние на РсР-опосредованный фагоцитов клетками Р38801.

Так как пептид 123-131 обладал наиболее выраженным стимулирующим действием в отношении РоЯ-опосредованного фагоци-тоаа. мы исследовали расширенный диаиовон его концентраций: от 0,0001 до 10.0 ИМ. Пептид 123-131 окааывал доаазависимое влияние на Рс{?-опосредованныи фагоцитоз клетками Р38801: в низких концентрациях достоверно ингибировал Рс1?-опосредованный фагоцитоз, с повышением концентрации приобретал стимулирующее действие, а при дальнейшем увеличении концентрации утрачивал его. Кодоколообрааная криван доаазависимости эффектов пептида 123-131 на Ро1?-оиооредованный фагоцитов сходна с аналогичной кривой доаааависимости эФ1кзктов ТИФ. Способность этого пептида мимикрировать эффекты ТНФ позволила нам предположить, что его действие опосредовано взаимодействием с ТНФ-рецепторами.

Для проверки этого предположения мы изучали влияние ТНФ на Рс!?-опосредованный фагоцитоз клетками Р38801 после их преинкубации с пептидами. ТНФ использовали в максимально стимулирующих РсИ-опосредованный фагоцитоз концентрациях. Пептиды использовали в более широком диалавони концентраций, включая концентрации, превосходящие концентрации ТНФ в 10 и 100 раз. Преинкубация клеток Р38801 с пептидами 1-12 и 103-113 не отражалась на чувствительности клеток к последую-

- а -

Таблица 1. Влияние ТИФ на FoR-, CRI- и MFR- опосредованный

фагоцитоа иак^юфагоподобными клетками лини» P388D1.

Концентрации Т№ (ИМ) Интегральный фагоцитарный показатель ( M ± ш )

FcR CRI MFR

0,0001 12.82 ± 0,90 4.92 ± 0.49* 13.98 ± 2.73

0,001 8,73 * 2.31 3.97 i 0.51* 14.60 ± 1.97

0.01 9.37 ± 3.86 7.18 i 0,36* 12.46 ± 2.02*

0.1 23.37 t 6.54" 19.15 i 2.25* 10.71 ± 2.74"

1.0 27.86 ± 5.65* 26.75 * 4.55* 7.03 ± 1.46*

10.0 21.70 ± 4.75* 26.02 ± 4,42* 9.78 ± 1.02*

Контроль 12,84 t 3.98 13,74 ± 2.04 16.57 ± 0.68

* р <■ 0,05 достоверность отличии от уровня контроля

Таблица 2. Влияние пептидов ни состава ТНФ на Гей-. С1?1-и МП?-опосредованный фагоцитов ыакрофагоподибшши клетками линии Р388С1.

Концентрация пептидов ТНФ (пМ) Интегральный фагоцитарный показатель С М ± ш )

Рс1? С!?1 КГР

Пептид 1-12 0.01 0.1 12.45 ± 3.34 18.76 ± 1.82* 16.96 ± 1,69 19.10 ± 1.91" 14,88 ± 2,38 11,06 ± 0,99"

Пептид 103-113 0.01 0.1 12,09 ± 1,80 14,07 ± 3,47 13.08 ± 2,22 15.90 ± 1,75 15,53 ± 0,77 14,73 ± 1,98

Пептид 123-131 0.01 0,1 25,93 ± 4,76* 34.79 ± 9.25" 25.44 ± 5,85* 18,21 ± 2,28* 4,99 4 0,10" 11,06 ± 0,88*

Пептид 126-136 0.01 0.1 18.10 ± 1.80* 12.07 ± 3.21 17.60 ± 1,61* 20,65 ± 3,71* 10,93 к 0,76* 8,07 ± 0,64*

Контроль 12.84 ± 3.98 13,74 ± 2,04 16,57 ± 0,68

* р 0,05 достоверность отличия от уровня контроля

щему стимулирующему действии ТНФ на РоК-оносредованный йш1'и-цитиь. После преинкубации макрофагоподобных клеток с пептидом 123-131 их чувствительность к стимулирующему действию ТНФ на Рс!?-опосредованный фагоцитоз снижалась. При 100-кратном преобладании концентрации пептида над концентрацией ТНФ наблюдали наиболее ьыражепное снижение стимулирующего эффекта ТНФ (Рис.1). После нреинкубации с пептидом 126-136 только в случае 100-кратного преобладания его концентрации наблюдали ослабление стимулирующих эффектоь ТНФ.

При изучении влиянии ТНФ на С1?1-опосредованный (фагоцитов наблюдали выраженную дозазависимисть е]'о эффектов: Ь ниаких концентрациях ТНФ понижал, а в более высоких Повышал уровень С1?1-опосредованного фагоцитоза (Табл.1).

Пептиды ив состава ТКФ оказывали различное влияние на СК1-опосредованный фагоцитоз. Пептид 123-131 оказывал наиболее ьыраженное стимулирующее влияние на уровень С!?1-опосредованного фагоцитоза (ТаОл.2). Пептиды 126-136 и 1-12 окааывали менее выраженное стимулирующее действие на С1?1-опосре-дованный фагоцитоа. Стимулирующее влияние пептида 1-12 проявлялись только в случае использования балее высокой его концентрации. Пептид 103-113 не оказывал влияния на СР1-опосредованный фагоцитоз макрофагоподобными клетками линии Р38801.

Ивучая действие пептида 123-131 в расширенном диапояоне концентраций, мы также наблюдали выраженную доаазависимость его эффектов. При этом, в более низких и в более нысоких концентрациях пептид 123-131 не влиял на СР1-опосредованный фагоцитоа. но стимулировал его в концентрациях, эквимолнрных стимулирующим СТ!1-опосредованный фагоцитоз концентрациям ТНФ.

Преинкубации клеток Р38801 с пептидами 1-12 и 103-113 не оказывала влияние на последующий стимулирующий эффект ТНФ в отношении СИ-опосредованного фагоцитоаа. Преинкубации макрофагоподобных клеток с пептидами 123-131 (Рис.1) и 126-136 приьодила к снижению стимулирующего влияния ТНФ на С1?1-опосредованный фагоцитоз. В случае преинкубации клеток со 100-кратным избытком пептида 123-131 последующая инкубация их в присутствии стимулирующей концеп грации ТНФ ЬЫЯВИЛа

Индексы

«вменения

показателей

2,00

1,60

1.00

0,50

0.00

□ И

FcR CRI MFR

Эффекг ТЮ &ез преинкубации клеток с пептидом Эффект THI после преннкуОааии клеток в присутствии:

10-кратного избытка пептида 123-131

0100-кратного избытка пептида 123-131

р < 0,05 достоверность отличия от уровня эффекта одного Т1+1>

Рисунок 1. Влияние ТНФ на FcR-, CRI- и MFR-опосредованный фагоцитов макрофагоподобными клетками линии P388D1 после их преинкубации с пептидом 123-131 иь состава ТИФ.

к

M

и

и

к

»

uaiiiyiu утрату чувствительности клеток к действию ТНФ.

При изучении влиянии ТНФ на MFR-опосредованныи фагоцитоз наблюдали дозааавниииое снижение уровня фагоцитоаа Дролле й макрофагоподобными клетками P388D1 (Табл.1). Наиболее выраженный ингибирующий эффект ТНФ отмечен при его концентрации 1,0 nU, как и в случаях с FcR- и CR1-опосредованным фагоцитозом.

Сходная с ТНФ способность ингибировать фагоцитоз дрожжей была выявлена у пептидов 123-131, 126-136 и. в меньшей степени - у пептида 1-12 (Табл.2). а пептид 103-113 не оказывал влияние на MFR-опосредованный фагоцитов. При научении влиянии пептида 123-131 на MFR-опосредованный фагоцитоз ь широкой ьоне концентраций, мы установили, что пептид 123-131 достоверно иш'ибировал MFR-опосредованный фагоцитов во всех использованных нами концентрациях. Наиболее выраженное инги-бирующее влияние пептида отмечено при его испольаовании ь эквииолярной с ТНФ концентрации. При атом, ингибирующие эффекты пептида 123-131 были более выражены, чем соответствующие эффекты целой молекулы цитокина.

Преинкубацин клеток P388D1 с пептидами 1-12 и 103-113 не отражалась на результатах последующей инкубации их с ТНФ.

Преинкубацин макрофагоподобных клеток с пептидом 123-131 приводила к снижению их чувствительности к ингибиру-ющему действию ТНФ на фагоцитов дрожжей. Преинкубацин клеток со 100-кратным избытком Концентрации пептида в наибшьшей степени отражалась на степени ингибирующего аффекта цитокина (Рис.1).

Преинкубацин макрофагоподобных клеток линии P388D1 с пептидом 126-136 h концентрации, десятикратно превышающей концентрацию ТНФ. приводила к усилению последующего ингибирующего действия ТНФ. Преинкубацин клеток с тем же пептидом в концентрации. 100-кратно превышающей концентрацию ТНФ. приводила к снижению чувствительности клеток к действию ТНФ.

Таким обрааом, нами покааано, что ТНФ и некоторые пептиды иа еги состава оказывают влияние на фагоцитарную активность клеток, опосредованную Fo-, CRI- и MF-рецепторами.

Лишь два частично перекрывающихся пептида иа состава ТНФ: 123-131 и 126-136 способны мимикрировать стимулирующий

и ингибирующий эффекты ТНФ а отношении фагоцитарной активности макрофагоиидобных клеток линии P388D1. Наиболее вываленной сиоиобностыи мимикрировать эффекты ТНФ обладает пептид 123-131. Пептид 12В-136 несколько устуиает пептиду 123-131 по выраженности ;4№еКтов.

При изучении изменений продукции суоероксид-ьннонов макро^ий'оподобными плетками линии P388D1 под влиянием TIW, было покавано. что цитокин во всех использованных нами концентрациях достоверно стимулировал спонтанную продукции) активных радикалов кислорода, судя цо нарастанию доли HCT-положительных клеток. Эффект был довавависимым в широкой зоне концентраций ТНФ: от 0,0001 до 1,0 iiM. Нарастание доли HCT-положительных клеток было более выраженным но сравнению с нарастанием фагоцитарных показателей иод влиянием одной и той Ае концентрации ТНФ.

Менее выраженным было стимулирующее действие ТНФ на продукцию суиероксидных радикалов, индуцированную JIIIC. В атом случае отмечали не более, чем двукратное на<)астание доли HCT-положительных клеток по сравнению с контрольным урон-нем. н то время как при стимуляции теми же концентрациями ТНФ спонтанной продукции суиероксидных радикалов нарастание доли HCT-положительных клеток было трех- и пятикратным. Очевидно. для макрофагоиодобных клеток P388D1 ТНФ является более эффективным индуктором окислительного внрыва по сравнению с ЛИС. однако на фоне преинкубации клеток с ЛПС его стимулирующее действие было менее выраженным.

Все изученные нами пептиды достоверно стимулировали спонтанную продукцию макрофагоиодобными клетками сунерок-сид-анионов. Однако только два пептида 123-131 и 126-136 ио выраженности стимулирующего действии приближались к эффектам зквимолярных концентраций ТНФ. вызывай трех-четырехкратный прирост доли HCT-положительных клеток. Стимулирующее действие тех же пептидов на продукцию суиероксидных радикалов, индуцированную ЛПС. было значительно менее выраженным.

Прицельное изучение влияния одного из пептидов 123-131 на окислительный взрыв в более широком диалоаоне концентраций подтвердило ранее выявленные закономерности. Пептид вызывал статистически достоверный прирост доли НСТ-положитель-

них клеток при влиянии на спонтанную продукцию суперокоидных радикалов но всех использовании* концентрациях. Стимулирующий эффект пептида 123-131 х&рактериауетси доаавависимоотью. Влияние этого же пептида на продукцию супероксидных радикалов. индуцированную ЛПС, вначительио менее выражено. По выраженности стимулирующих ¿»¡пактов . в этом тесте пептид 123-131 несколько уступает эффектам эквимияирных концентраций ТНФ. Вместе с тем, пептиды 123-131 и 126-136. как и ТНФ проявили себя более аффективными индукторами окислительного варыва макрофагоподоОных клеток Р38801 но сравнению о ЛПС. Индукция окислительного варыва под влиянием ЛПС проявляется увеличением доли ИСТ-положительных клеток в 1.77 раэа, а ТНФ и пептиды 123-131 и 126-136 вывивают при стимуляции спонтанной продукции супероксидных радикалов 3-5-кратное увеличение доли НСТ-положительных клеток.

ПреинкуОацин ыакрофаголодобных клеток линии Р388В1 с цептидами 1-12 и 103-113 в концентрациях. 10- и 100-кратно превышающих стимулирующую концентрацию ТНФ, не оказывала влияния на последующее стимулирующее действие цитокина в отношении продукции суиероксид-анионов.

ПреинкуОацин макрофагоиодобных клеток о 10- и 100-кратным избытком пептидов 123-131 и 126-136 выаывала снижение чувствительности клеток к стимулирующеыу действию ТНФ. Пептид 123-131 отличался наиболее выраженной способностью сни-лать чувствительность макрофагов к стимулирующему влиянию ТНФ на продукцию супероксид-анионов.

Способность частично перекрывающихся Пептидов 123-131 и 126-136 выступать в качестве антагонистов ТНФ при условии преинкубации макрофагов со стократным иабытком пептидов перед инкубацией о ааведомо стимулирующими концентрациями ТНФ может косвенно свидетельствовать о их евнаывании с ТНФ-ре-цеиторами. Результатом такого свиаывания может быть материализации или шеддироьание лиганд-рецепторных комплексов, что влечет аа собой снижение экспрессии ТНФ-рецепторов и. соответственно, снижение чувствительности клеток к стимулирующему действию ТНФ, опосредованному черев ТНФ-рецепторы.

При сопоставлении влияния ТНФ и пептидов ив его состава на продукцию макрофагоподобными клетками линии Р388Б1 суве-

роксид-анионов были покааано, что ТНФ достоверно усиливает метаболическую активность клеток. поьышая доли НСТ-положи-тельных клеток более чем в 5 раа.

Два частично перекрывающихся нентида ив состава ТНФ: 123-131 и 126-136 способны мимикрировать стимулирующий аффект ТНФ в отношении метаболической активности макрофагопо-добных клеток. Наиболее вьграденний активностью обладал пептид 123-131. Почти не отличалсн от него но степени активации продукции активных радикалов кислорода макрофагами пептид 126-136.

Вышеиалоленные экспериментальные данные, свидетельствующие о способности двух частично перекрывающихся пептидов ив состава ТНФ: 123-131 и 126-136 активировать макрофагоподоб-ные клетки Р38801. индуцировать в них окислительный вврыв, позволили нам предположить. что эти пептиды могут индуцировать продукцию и секрецию теми же клетками цитотоксического фактора(ТНФ).

Однако, проведенное исследование показало. что ни однн ив наученных нами пептидов в исиольаованных концентрациях не индуцировал продукции цитотоксического фактора макрофагопо-добными клетками линии Р38301. Инкубации клеток Р38801 с пептидами не сопровождалась приростом цитотоксичности супер-натантии культур, суди по результатам стандартно1'о цитоток-оическиго теста. В отличие от зтого, стандартный индуктор синтеаа ЮТ - липополисаларид, в тех *е условиях инкубации клеток Р388Ш ьыаывал существенный прирост цитотоксичности супеонатаятов культур по сравнению с низким уровнем спонтанной продукции цитотоксического фактора клетками Р388Ш.

Выявленная нами способность двух частично перекрывающихся пептидов иь состава ТНФ 123-131 и 126-136 МИМИКрИро-ьать активирующее действие ТНФ на макрофагонодобные клетки побудила нас перейти к сравнительному иауЧению других сторон биологической активности ТНФ и пептидов иа его состава.

ТНФ. как и следовало ожидать, проявлял достоверное ци-тотоксическое действие на клетки-мишени. С увеличением концентрации цитокина, его цитотоксическаи активность увеличивалась (Рис.2).

Иа четырех изученных нами пептидов ин состава ТНФ. ни

Индекс

штсгоксичности

m

ICO

70

Г~1 Г~1 ГН ГН Г~]

п

гп Г~1

0.1 1.0 0.01 0.1 0.01 0.1 0.01 0.1 0.01 0.1 1-12 103-113 123-131 126-135 ТНФ пептиды

U <■ 0.05 достоверность отличия иг уроьий контроля

<г

ТНФ

Иабыток пептида: jTJ 10-кратный jTJ 100-кратный

О

Рисунок 2. Цитсгоксическая активность ТНФ и пептидов иа его состава и цнтотоюсичеекая активность ТКФ после преинкубации клеток-ыншенек L929 с пептидом 123-131.

один ни проявлял цитотоксический активности ь использованных концентрациях, эквимолмрных цитотоксическим концентрациям ТНФ (Рис.2).

При исследовании влияния иреинкубчции клеток-мишеней 1-929 с изучаемыми неитидами 1-12. 103-113, 123-131, 126-130 из состава ТНФ на их чувствительность к цитотоксическому действии ТНФ нами установлено, что (Iреинкубации клеток-мишеней Ь929 о пептидами при 10- и 100-кратных ивбытках пептидов не влияла на выраженность последующего цитотоксического эффекта ТНФ. В качестве примера приведен эффект пептида 123-131 (Рис.2).

Таким образом, сравнительное изучение цитотоксической активности ТНФ и пептидов иь его состава показало, что ни один иа изученных нептидоь не способен мимикрировать цитотоксический эффект ТНФ или снижать чувствительность клеток-мишеней к цитотоксическому действию ТНФ.

Проведенное углубленное сраннительное изучение различных биологических эффектов ТНФ и синтетических нептидон, соответствующих его отдельным фрагментам, позволило селекционировать два частично перекрывающихся пептида - 123-131 и 126-136, способных выполнять Лункции ш'онистоь ТНФ при активации макрофагов и, вместе с тем. лишенных цитотоксического действия, присущего целой молекуле ТНФ.

ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантный человеческий ТНФ ь сравнительно низких концентрациях (от 0,1 до 1.0 iiM) оказывает прямое доза-з&ьисимие активирующее дейстьие на мононуклеарные фагоциты, судя по изменениям поверхностного фенотипа (FcR. CRI. MFR) и метаболической активности макрофагоподобных клеток P388D1.

2. Синтетические пептиды, соответствующие отдельным фрагментам молекулы ТНФ, различаются по способности ьывывать изменении iicBepXHocTHOi'o фенотипа и метаболизма макрофагов. По выраженности их активирующего действия на макрофаги, пептиды составили следующий ряд: 123-131 > 126-136 > 1-12 > 103-113.

3. Частично перекрывающиеся синтетические пептиды иа состава ТНФ 123-131 и 126-136 оказывают активирующее действие на макрофаги в концентрациях, зквимолярных стимулирующим концентрациям целой молекулы ТНФ, но не индуцируют синтеза ТНФ макрофагами.

4. После преиикуОации макрофагов с пептидами из состава ТНФ 123-131 и 126-136. взятыми в концентрациях, стократно превышающих концентрацию ТНФ, чувствительность клеток к последующему активирующему действию ТНФ снижается.

5. Синтетические пептиды ив состава ТНФ в концентрациях, эквимолярных цитотоксическиы концентрациям ТНФ. не оказывают цитотоксического действия на чувствительные к ТНФ клетки-мишени L929.

6. Преинкубацин клеток L929 с синтетическими пептидами из состава ТНФ, взятыми в концентрациях, стократно превышающих цитотоксичеокую концентрацию ТНФ. не изменяет их чувствительности к последующему цитотоксическому действию ТНФ.

7. Частично перекрывающиеся пептиды из состава ТНФ 123-131 и 126-136, обладающие активирующим действием на макрофаги, лишены цитотоксического действия на фибробласты, присущего целой молекуле ТНФ.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Freldlln I.S.. Konyaev I.G.. Mayorov V.A. Comparative studying on the biological activity of synthetic peptides* fragments of tumor necrosis factor alplta.// Abstracts of 12th European 1тш1ию1ок1са1 Meeting. Euiopian sociaty of lm-Hiuiiolotfists, Barcelona. - 1994.- P. 153.

2. Коняев И.Г. TNFa и его пептиды влияют на уровень MFR-зависимого фагоцитоза дроллей макрофагами.// Тезисы III международного микологического симпозиума, Санкт-Петербург. 22-24 октября. - 1995.- С. 67.

3. Freidlln I.S.. Konyaev I.G.. Mayorov V.A. Human tumor necrosis factor a (TNFa ) peptide witli selective capacity for macropliaues activation.// 9Ui Intern. congress of liii-шшкЛоку, Saii Fi aiicisco, California, July 23-29.- 1995.- P. 297.

4. Киняев И.Г.. Майоров В.А.. Фрейдлин И.С. Пептиды TNFa способны мимикрировать и блокировать некоторые аффекты целой молекулы цитокина./У XII конференция "Факторы клеточ. и гумор.иммунитета при раалич.физиол. и патологич. состонни-нх". Челябинск, 1-2 июня.- 1995.- С. 89.

5. Коняев И.Г. Зависимость проявления макрофаг-активи-рующей активности пептиден из состава TNFct от их аминокислотной последовательности и свойств аминокислот.//' CO.: Био-химич. и биофизич. механизмы физиологических функций. СПбУ.-1995,- С. 58.

6. Коняев И.Г. Иммуномодулирующее влияние TNFa и его синтетических пептидов на фагоцитарную функцию макрофагов.// Сб.: Проблемы оптимизации образа лизни и здоровья человека. СПб.- 1995.- С. 92.

7. Фрейдлин И.С.. Коняев И.Г. Роль туморнекротизирующе-го фактора альфа и его пептидных фрагментов в регуляции функций макрофагов./'/ "Цитология".- 1995.- N 12.- С. 56-57.

/ил, StUlU Не Ci, зак.{ЗЧ.т-У5'. -ïD/iï-gb