Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль оксида азота в регуляции клеточных механизмов эритродиереза в норме и при острой нитритной интоксикации у белых крыс

На правах рукописи

МЯСОЕДОВА ЕЛЕНА ЕВГЕНЬЕВНА

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ ЭРИТРОДИЕРЕЗА В НОРМЕ И ПРИ ОСТРОЙ НИТРИТНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У БЕЛЫХ КРЫС

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2005

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии, физики, математики и информатики Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия Минздрава Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор С.Б. Назаров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г.А. Дроздова

доктор биологических наук, профессор Е.Б. Манухина

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится " 2005 года в 14 часов на

заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при ГУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Автореферат разослан ". ^ " С^уе&^ии&Я 2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

4/422

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение механизмов функционирования висцеральных систем и их ^моральной регуляции является одним из основных направлений современной физиологии (Судаков К.В., 2001). Исключительной особенностью крови является то, что она интегрирует работу многих физиологических систем. Эритроцитарное равновесие как важнейший показатель качества работы эритрона поддерживается благодаря непрерывной динамической взаимосвязи процессов эритропоэза и эритродиереза (Судаков К.В., Захаров Ю.М., 2000).

Ведущим механизмом эритродиереза является внутриклеточный гемолиз (Бриллиант М.Д., 1985). Фиксированные макрофаги селезенки, печени и костного мозга участвуют в секвестрации и разрушении нежизнеспособных эритроцитов (Карр Я., 1978). Изучены морфофункциональные характеристики эритроцитов, подвергающихся деструкции (Sambrano G.R. et al., 1997), и реакция макрофагов на эритроциты с измененными свойствами (Beppu М. et al., 1994; Bratosin D. et al., 1997; Bratosin D. et al., 1998; Mantovani В., 1987). Однако регуляция процесса эритродиереза как одного из механизмов обеспечения эритроцитарного равновесия в связи с элиминацией нежизнеспособных эритроцитов из кровеносного русла изучена недостаточно.

Начиная с 1987 года, в результате интенсивных научных исследований была доказана важная роль оксида азота (N0) в регуляции основных систем организма: сердечно-сосудистой, иммунной, нервной, дыхательной и др., что позволило предположить универсальное значение NO для биосистем (Palmer R.M.J. et al., 1987; Wennmalm A. et al., 1992). Вместе с тем, несмотря на большое количество работ, посвященных оксиду азота, пока не удалось определить все "точки приложения" N0; мало разработаны медикаментозные механизмы воздействия на продукцию оксида азота в условиях патологии Так, недостаточно разработан вопрос о роли оксида азота в регуляции состояния эритроцитарной системы в целом и механизмах регуляции эритродиереза в частности. Поэтому актуальным представляется исследование роли оксида азота как одного из потенциальных регуляторов процесса деструкции эритроцитов.

Широкое использование донаторов оксида азота в качестве пищевых добавок и консервантов, использование высоких доз NO-содержащих фармакологических препаратов в критических состояниях (острый инфаркт мио-

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА Петербург

карда, кардиогенный отек легких, гипертонический криз) делают актуальной проблему острой нитритной интоксикации, а также профилактики повреждений клеточных мембран и коррекции последствий оксидантного стресса, вызванного интоксикацией нитропрепаратами (Ольбинская Л.И., Лазебник Л.Б , 1998; Рекомендации по профилактике, диагностике и лечению артериальной гипертензии, 2002; Gibson G.R. et al., 1982).

Одним из наиболее доступных препаратов с антиоксидантной активностью является альфа-токоферол. Содержание витамина Е в эритроцитарной мембране представляет весьма лабильный, чувствительный к оксидантным воздействиям пул токоферола в организме (Кудрин A.B. и др., 2000; Микае-лян Э.М. и др., 1983). Поэтому эритроцит является универсальной и в данном случае наглядной моделью для исследования влияния экологических и фармакологических факторов на клеточном уровне.

Несмотря на доступность исследования и значимость данной проблемы, влияние оксида азота на эритрон в целом, механизмы элиминации нежизнеспособных эритроцитов из кровеносного русла после воздействия оксида азота, а также возможности антиоксидантной профилактики и коррекции последствий острой нитритной интоксикации изучены недостаточно. В литературе встречается характеристика изменений отдельных звеньев эри-трона, преимущественно, периферической крови после воздейсгвия донаторов NO. Основная масса работ посвящена, главным образом, постинтоксикационной метгемоглобинемии, ее механизмам, способам коррекции, а также изменениям ферментною cneKipa крови после острой нитритной интоксикации (Гоженко А.И. и др., 1989; 1996; Середенко М.М. и др., 1987; Chioidi Н., Möhler J.G., 1987; May J.M. et al., 2000; Shugalei I.V. et al., 1992a; Shugalei I.V. et al., 1992b).

Следовательно, комплексное исследование состояния эритроцитарной системы в норме и при острой нитритной интоксикации позволит дать системную характеристику влияния NO на эритрон в целом, изучить механизмы регуляции элиминации нежизнеспособных эритроцитов из кровеносного русла в физиологических условиях и после воздействия донаторов оксида азота, а также позволит рассмотреть возможности антиоксидантной профилактики и коррекции последствий острой нитритной интоксикации.

Цель исследования - установшь закономерности NO-зависимой регуляции состояния эритрона и клеточных механизмов эритродиереза в норме, при острой нитритной интоксикации и ее аитиоксидантной коррекции у белых крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить механизмы регуляции процессов внутриклеточной деструкции эритроцитов на фоне влияния донаторов оксида азота (нитропруссида натрия, нитрита натрия) и L-аргинина in vitro.

2. Выявить эффекты действия оксида азота на процесс эритродиереза при изолированном и сочетанием воздействии экзогенного NO на эритроциты и макрофаги.

3. Определить закономерности изменений функционального состояния эритроцитарной системы и процесса эритрофагоцитоза при острой интоксикации нитритом натрия у крыс.

4. Исследовать эффект альфа-токоферола при острой нитритной интоксикации по показателям состояния эритрона и эритрофагочитоза.

Научная новизна. На основании проведенных нами исследований обнаружена способной ь оксида азота дозозависимо стимулировать эритродие-рез in vitro. Впервые установлены закономерности влияния донаторов оксида азота (нитропруссида натрия, нитрит нагрия) и L-api инина на процесс эритрофагоцитоза in vitro: активация эритрофагоцитоза в пределах определенного диапазона концентраций с дальнейшим неизменным уровнем активности пе-ритонеальных макрофагов на фоне увеличения концентрации донатора NO или L-аргинина в культуральной среде. Дана комплексная оценка системного ответа эритрона на острую интоксикацию, вызванную введением нитрита натрия у крыс in vivo. Доказана эффективность аитиоксидантной профилакшки изменений периферической крови и состояния эритродиереза при острой нитритной интоксикации у крыс.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней установлены закономерности участия оксида азота в регуляции эритрофагоцитоза, проведена оценка системного ответа эритрона на острую нитритную интоксикацию, изучены возможности ее коррекции с помощью альфа-токоферола.

Практическое значение работы. На основании установленных N0-опосредованных закономерностей регуляции состояния эритрона и эритродиереза предложены новые способы оценки состояния эритроцитарной системы (рац. предложение №2319 от 08.04.2002 "Способ оценки функциональ-

ного состояния перитонеальных макрофагов"; рац. предложение №2351 от 17.06.2003 "Способ оценки состояния эритрона в норме, при острой нитрит-ной интоксикации и ее антиоксидантной коррекции"; №2375 от 30.03.2004 "Способ профилактики гемической гипоксии, индуцированной нитритом натрия").

Результаты работы внедрены в учебный процесс (лекционный курс) на кафедрах нормальной физиологии, физики, математики и информатики (Акт о внедрении предложения "Новые сведения об участии оксида азота в рефляции эритрофагоцитоза" от 17.09.2001) и патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО ИвГМА Минздрава России (Акт о внедрении предложения "Роль оксида азот в регуляции клеточных механизмов эритродиереза в норме, при острой нитритной интоксикации и ее антиоксидантоной профилактике" от 05.11.2004); в практику работы ГУ "Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава России" (Акт о внедрении предложения "Способ оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов" от 05.11.2004).

Положения, выносимые на защиту:

1. Оксид азота участвует в регуляции процесса эритрофагоцитоза у крыс, дозозависимо активируя фагоцитоз аутологичных эритроцитов перитонеаль-ными макрофагами.

2. Острая нитритная интоксикация вызывает острую гемолитическую анемию, метгемоглобинемию, относительный и абсолютный ретикулоцитоз на фоне активации внутриклеточных механизмов эритродиереза. Возникающие нарушения поддаются коррекции с помощью альфа-токоферола.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, сентябрь 2001 г.); ХГХ Съезде физиологического общества им И.П. Павлова (Екатеринбург, сентябрь 2004 г.); Международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения А.И.Уголева (Санкт-Петербург, 2001 г.); Конференции в рамках открытого конкурса на лучщую научную работу студентов в ВУЗах РФ по разделу «Медицинские науки» (Москва, ММА им. И.М. Сеченова, 2002 г.); X Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" в МГУ им М.В. Ломоносова (Москва, 2002 г); II Российской конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2001 г.); 66-й Республиканской

конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2001 г.); Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы естествознания» (Владимир, 2001 г.); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука XXI веку» (Иваново,2001 г.); II научной конференции студентов и молодых ученых «Роль оксида азота в физиологии и патологии» (Иваново, 2000 г.); Конференции, посвященной 70-летию Ивановской медицинской академии «Современные направления научных исследований студентов и молодых ученых ИГМА» (Иваново, 2000 г.); Всероссийской конференции-фестивале студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодая наука в классическом университете. Актуальные проблемы современного естествознания"; Международной конференции по гемореоло-гии и микроциркуляции (Ярославль, 2003 г.); III Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения, посвященной 250-летию МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2004 г.); Итоговых конференциях научного общества студентов и молодых ученых ИГМА в рамках Недели науки - 2000, 2001, 2002, 2003, 2004.

По теме диссертации опубликованы 24 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы. Библиографический указатель включает 216 источников: 57 отечественных и 159 зарубежных. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 8 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 115 белых крысах-самках массой 180-220 г. 55 интактных животных послужили источником клеток (перитоне-альных макрофагов и эритроцитов) для проведения исследований in vitro. В экспериментах по изучению механизмов острой нитритной интоксикации использованы 60 крыс, в том числе 10 контрольных.

Животные содержались в условиях вивария на сбалансированном рационе питания с соблюдением основных зоогигиенических требований, имели свободный доступ к воде.

Основные серии экспериментов проведены в соответствии с задачами исследования:

Серия № 1: Исследование особенностей и механизмов влияния донаторов оксида азота на фагоцитоз эритроцитов перитонеальными макрофагами.

Серия №2: Комплексная оценка реакции эритроцитарной системы крыс на острую нитритную интоксикацию.

Серия №3: Изучение возможности использования антиоксидантов для профилактики острой нитритной интоксикации.

С целью исследования процессов внутриклеточного гемолиза изучалось взаимодействие перитонеальных макрофагов с аутологичными эритроцитами in vitro в краткосрочных культурах клеток (Mantovani В., 1987). В первой серии исследования воспроизводили несколько режимов взаимодействия клеток с донаторами оксида азота (нитропруссид натрия в концентрации 10, 100 и 1000 мкМоль/л, нитрит натрия - 20 и 100 мкМоль/л) и L-аргинином (100, 400 и 800 мкМоль/л):

1. Осуществляли одновременное воздействие предшественников оксида азота на перитонеальные макрофаги и аутологичные эритроциты.

2. Проводили дифференцированное воздействие донатора NO - нитро-пруссида натрия на перитонеальные макрофаги или на аутологичные эритроциты.

3. Осуществляли воздействие раствора нитропруссида натрия, лишенного нитрогруппы, на культуру клеток для доказательства специфичности эффекта этого вещества.

В эксперименте с L-аргинином исследовали особенности и характер гуморальной регуляции эритрофагоцитоза:

1. Выясняли наличие нитрергической регуляции процесса эритрофагоцитоза с помощью определения прироста концентрации нитрат-ионов в культу-ральной среде после 30 и 60 минут инкубации перитонеальных макрофагов с аутоэритроцитами.

2. Изучали роль объекта фагоцитоза (аутологичных эритроцитов) и субстрата синтеза оксида азота (L-аргинина) в качестве возможных стимуляторов продукции NO перитонеальными макрофагами.

Для контроля общего состояния животных унифицированными методами оценивались параметры периферической крови: концентрация эритроцитов, гемоглобина, гематокрит, содержание ретикулоцитов, концентрация лейкоцитов, лейкоцитарная формула.

Изучение процессов внутриклеточного гемолиза по методике Mantovani В. (1987) проводилось в специализированных боксах для культур

клеток (БП-4-005). Для оценки адгезии в препаратах-мазках дифференцированно подсчитывали количество макрофагов, не образующих розеток и образующих розетки различных типов: с 1-2 (1-го типа), 3-5 (2-го типа), 6-8 (3-го типа), 9 и более эритроцитами (4-го типа). Результат выражали в процентах. Дня цитохимической идентификации и оценки количества макрофагов, фагоцитирующих эритроциты in vitro, использовалась бензидиновая реакция, позволяющая выявить гемоглобин в цитоплазме макрофагов. С учетом процесса внутриклеточной деградации гемоглобина подсчитывали количество макрофагов с фагосомами, представленными эритроцитами и их фрагментами, а также макрофагов с диффузными включениями гемоглобина в цитоплазме. Результат также выражали в процентах.

Определение содержания нитрат-ионов в крови осуществляли методом потенциометрического исследования (Снуг Д., Уэст Д., 1979) с использованием ион-селективного электрода (НИИ химии СГТГУ).

Во второй серии исследования воспроизводили острую нитритпую интоксикацию у крыс путем введением нитрита натрия (10 мг/кг и 50 мг/кг массы тела). Указанные дозы и режим введения препарата использовались рядом авторов (Гоженко А.И. и др., 1996; Реутов В.П. и др., 1997; Овчинников В.В., 1967).

Для опенки состояния эритрона через 1 час после введения нитрита натрия изучали следующий комплекс гематологических показателей:

1. Исследование состава периферической крови унифицированными методами: концентрации эритроцитов, гемоглобина, показателя гематокрита, концентрации лейкоцитов, лейкоцитарной формулы

2. Исследование структурно-функциональных свойств мембраны эритроцитов: поверхностной цитоархитектоники эритроцитарной мембраны методом фазово-контрастной микроскопии с выделением 8 основных форм эритроцитов (Козинец Г.И. и др., 1979), морфометрических индексов эритроцитов (СОЭр., мкм3; ССГЭ, пг; СКГЭ, %), резистентности эритроцитов к гемолитическим воздействиям (кислотной, глицериновой, осмотической)

3. Определение в периферической крови концентрации метгемоглобина цианидным методом и нитрат-ионов потенциометрическим методом.

4. Оценка состояния эритропо.на: содержания ретикулоцитов в периферической крови, содержания эритроидных клеток в кроветворных органах (красный костный мозг, селезенка, печень).

5. Исследование клеточных механизмов эритродиереза по методике Mantovani В. (1987).

В третьей серии исследований проводилось изучение возможности использования антиоксидантов для профилактики острой нитритной интоксикации. Для этого за 1 час до инъекции нитрита натрия (50 мг/кг) крысам опытных групп внутримышечно вводили альфа-токоферол в дозе 50 мг/кг и 500 мг/кг массы. Крысам контрольной группы внутримышечно вводили стерильное растительное масло. Через 1 час после введения нитрита натрия оценивали сходные с предыдущим этапом гематологические показатели эритро-цитарной системы. Указанные дозы и режим введения альфа-токоферола ранее использовались рядом авторов (Микаелян Э.М. и др., 1983; Reis Е. et al., 1997).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами вариационного анализа с помощью ПЭВМ IBM с использованием t-критерия Стьюдента. Рассчитывали среднее арифметическое (X), ошибка средней арифметической (S*); достоверность различий (р) между выборками оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Результаты исследования в тексте и таблицах представлены в виде X±S.-. Для выявления степени взаимосвязи между изучаемыми параметрами использовался коэффициент парной корреляции Пирсона. Для всех видов анализа статистически достоверными считали значения при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования роли оксида азота в регуляции эритродиереза на основании данных о содержании нитрат-ионов в культуральной среде, не содержащей аминокислот (раствор Хенкса), на разных этапах эритрофагоцито-за показано, что оксид азота участвует в регуляции фагоцитоза аутологичных эритроцитов макрофагами перитонеальной полости. Фактором, запускающим метаболизм L-аргинина, является наличие в культуральной среде аутологичных эритроцитов. Присутствие объекта фагоцитоза сопровождается повышением концентрации NO3" -ионов в среде и активацией эритрофагоцитоза. Добавление L-аргинина существенно повышает активность макрофагов и уровень нитрат-ионов в среде. В отсутствие эритроцитов макрофаги не реагируют повышением уровня нитрат-ионов на вносимый в среду субстрат синтеза NO - L-аргинин, т.е. в отсутствие объекта фагоцитоза даже наличие субстра-

та синтеза оксида азота не приводит к повышению концентрации NCV в культуралъной среде.

Установлено, что характер влияния оксида азота на эритрофагоцитоз зависит от концентрации предшественника N0 в культуральной среде и обусловлен видом донатора оксида азота. Как правило, предшественник оксида азота вызывает активацию эритрофагоцитоза в пределах определенного диапазона концентраций, а при дальнейшем увеличении содержания донора NO в культуральной среде активность перитонеальных макрофагов существенно не изменяется (данная зависимость показана in vitro для L-аргинина (до 800 мкМоль/л), нитропруссида натрия (до 1000 мкМоль/л)) или происходит угнетение эритрофагоцитоза (в случае воздействия нитрита натрия (до 100 мкМоль/л)).

При исследовании влияния L-аргинина зависимость от концентрации наиболее отчетливо проявляется в пределах 0-400 мкМоль/л. При воздействии 400 мкМоль/л L-аргинина общее количество макрофагов, адгезирующих эритроциты, возрастает по сравнению с контролем в 2 раза (р<0,01), что достоверно выше (р<0,01) аналогичного показателя для 100 мкМоль/л раствора L-аргинина. Процентное содержание макрофагов с фагосомами и включениями гемоглобина в цитоплазме увеличивается по сравнению с контроль; ными данными в 2,7 раза (р<0,05). Дальнейшее повышение концентрации I аминокислоты не вызывает значимых изменений активности перитонеальных макрофагов in vitro.

Стимулирующее действие естественного предшественника N0 на эритрофагоцитоз, по-видимому, обусловлено наложением поступления внеклеточного L-аргинина - субстрата макрофагальной NO-синтазы, - на ба-зальный синтез оксида азота из внутриклеточного L-аргинина (Меерсон Ф.З. и др., 1994; Ischiropoulos H. et al., 1992; Martin К. Angele et al., 1999).

Показано, что L-аргинин в диапазоне концентраций 100-800 мкМоль/л практически не влияет на способность макрофагов адгезироваться к стеклу. Действительно, L-аргинин как субстрат макрофагальной NO-синтазы сам по себе не может стимулировать активность макрофагов. Но, поступая в фагоцитирующую клетку, он, по-видимому, становится источником синтеза NO, который и обусловливает активацию эритрофагоцитоза.

Дозозависимый характер и особенности влияния NO на эритрофагоцитоз выявлены и для экзогенных донаторов оксида азота: нитропруссида натрия и нитрита натрия.

Нитрит натрия стимулирует преимущественно поздние стадии эритро-фагоцитоза (эндоцитоз) на фоне неизменных показателей розеткообразова-ния. Так, процентное содержание макрофагов с бензидинпозитивным материалом в цитоплазме под влиянием 100 мкМоль/л возрастало по сравнению с контрольными данными в 1,3 раза (р^0,01), что, по-видимому, связано с тем, что нитрит натрия вызывает необратимые изменения мембранной структуры эритроцита с немедленным внутриклеточным разрушением нежизнеспособной клетки (7луос1шк 1.В. е1 а1., 1999). На фоне воздействия большей концентрации донатора N0 отмечается некоторое угнетение способности макрофагов к завершению эритрофагоцитоза: количество макрофагов с включениями гемоглобина в цитоплазме было в 2,1 раза ниже (р<0,05) относительно соответствующих параметров при воздействии 20 мкМоль/л раствора нитрита натрия, что свидетельствует о токсическом действии указанной дозы нитрита натрия на эритрофагоцитоз. Воздействие указанной дозы нитрита натрия проявилось также угнетением способности макрофагов адгезироваться к стеклу в 1,8 раза (р<0,01).

Другой экзогенный донатор N0 - нитропруссид натрия - наиболее выраженный эффект оказывает в концентрации 10 мкМоль/л: она координирование стимулирует все этапы эритрофагоци гоза, вызывая достоверную активацию как адгезивной способности макрофагов, так и эндоцитоза. Это, по-видимому, обусловлено разным соотношением метаболитов цикла окиси азота — N0, N02" и N04", образующихся при воздействии на клеточную систему различных донаторов N0 (Реутов В.П. и др., 1997).

Использование более высоких концентраций нитропруссида натрия сопровождается активацией лишь начальных этапов эритрофагоцитоза. В то же время, показатели, характеризующие эндоцитоз эритроцитов, становятся ниже (р<0,05) соответствующих данных, полученных при воздействии 10 мкМоль/л нитропруссида натрия, и достоверно не отличаются от контрольных значений. Этот факт может свидетельствовать о чисто механическом насыщении рецепторов макрофагов без активации эндоцитоза.

В связи с наличием в структуре нитропруссида двух активных химических групп (цианистой и нитрогрунпы) потребовалось определить долю их влияния на эри фофагоцитоз. Доказано, что эффект нитропруссида натрия в эксперименте обусловлен влиянием нифогруппы и не связан с наличием цианистой группы: нитропруссид натрия, лишенный способности генериро-

вагь NO, не влияет на эритрофагоцитоз. Одновременно был косвенно подтвержден NO-опосредованный характер влияния нитропруссида натрия.

Результаты нашего исследования позволяют сделать вывод об особенностях влияния различных донаторов оксида азота на эритрофагоцитоз с наличием, однако, общей закономерности эффектов в виде активации эритро-фагоцитоза в пределах определенного диапазона концентраций с дальнейшим неизменным уровнем активности перитонеальных макрофагов на фоне увеличения концентрации донатора N0 в кул моральной среде. Таким образом, характер гуморальной регуляции эритрофагоцитоза оксидом азота зависит от концентрации NO в культуральной среде и вида донатора оксида азота.

Стимулирующий эффект нитропруссида натрия на начальные этапы эритрофагоцитоза (адгезия макрофагов к стеклу, адгезия эритроцитов) и эн-доцитоз свидетельствует о том, ч го это вещество, учитывая его NO-опосредованный эффект и отсутствие влияния CN-группы, может служить более адекватным донатором N0 по сравнению с нитритом натрия. Поэтому для выяснения механизма действия и направленности эффектов оксида азота в качестве экзогенного донатора N0 нами был выбран нитропруссид натрия.

Эффект нитропруссида натрия наблюдали и в случае обработки донатором эритроцитов, и после культивирования с нитропруссидом натрия перитонеальных макрофагов.

Преинкубация макрофагов с раствором нитропруссида натрия сопровождалась увеличением по сравнению с контролем числа розеток 1-го типа (р<0,01). Экзогенный оксид азота также стимулировал способность перитонеальных макрофагов ад1-езироваться к стеклу, что проявилось увеличением количества клеток в поле зрения в 1,5 раза после инкубации с раствором нитропруссида натрия (р<0,01). Однако показатели более поздних этапов эритрофагоцитоза существенно не изменялись.

Результатом воздействия N0 на эритроциты явилось снижение количества розетконеобразующих макрофагов (р<0,05), увеличение процента розеток 1-го типа(р<0,01) одновременно с уменьшением числа розеткоподобных структур остальных типов. Показатели, характеризующие внутриклеточный этап реакции, достоверно отличались от контрольных значений. Таким образом, эффект, полученный после обработки нитропруссидом натрия эритроцитов, был значительно более выражен, чем после обработки донатором NO

только перитонеальных макрофагов. Следует отметить, что показатели всех стадий эритрофагоцитоза при воздействии нитропруссида натрия на культуру клеток достоверно отличались от таковых при обработке донатором N0 макрофагов или эритроцитов в отдельности: эндоцитоз эритроцитов достоверно активнее протекает при изолированном воздействии донатора N0 на макрофаги и эритроциты, но способность макрофагов образовывать розетко-подобные структуры более чем с 2 эритроцитами достоверно выше при воздействии донатора N0 на культуру клеток.

Это, возможно, обусловлено тем, что в случае обработки макрофагов нитропруссид натрия оказывает непосредственное стимулирующее влияние на фагоцитарные клетки как химический агент, а при обработке эритроцитов макрофаги получают опосредованный, но естественный стимул в виде клетки с поврежденной структурой. Таким образом, при обработке макрофагов активируются только начальные этапы фагоцитоза, так как отсутствует объект для эндоцитоза. В случае наличия неполноценной клетки фагоцитоз продолжается. При обработке оксидом азота эритроциты получают стойкие изменения мембранной структуры и гемоглобина (Тягука Я. е1 а1., 1997). Аутоло-гичный эритроцит с повреждённой мембранной структурой воспринимается как нежизнеспособная клетка, что ведёт к усилению фагоцитарной активности макрофагов (Мап1:оуаш В., 1987; Касса А. е1 а1., 1999).

Усиление способности перитонеальных макрофагов адгезироваться к стеклу в ответ на воздействие экзогенного оксида азота, возможно, связано с повышением рецепторной чувствительности макрофагов, что наблюдается после инкубации макрофагов в среде, содержащей оксид азота, или обусловлено влиянием N0 на мембранные характеристики фагоцитов, в частности, деформабильность (КоЬауаБЫ Н. е1 а1., 2002).

В ходе системной оценки реакции эритрона крыс на острую нитритную интоксикацию показано, что нитрит натрия вызывает дозозависимые изменения в периферической крови. Сдвиги параметров периферической крови значительно более выраженные у крыс, получавших нитрит натрия в дозе 50 мг/кг. Концентрация эритроцитов у этих животных снижалась в 1,5 раза (р<0,01), а показатель гемоглобина - в 1,15 раза (р<0,01) по сравнению с контрольной группой. Такие изменения красной крови закономерны и связаны с особенностями действия нитросоединений на морфо-функциональные характеристики эритроцитов (Б^еЫапп Е. е1 а1., 1984). Несмотря на достоверно меньшую концентрацию эритроцитов и показатель гематокрита у крыс, пе-

ренесших интоксикацию 50 мг/кг нитрита натрия по сравнению с меньшей дозой нифита натрия, показатели концентрации гемоглобина у животных экспериментальных групп достоверно не отличались между собой. Указанное несоответс1вие изменений показателей концентрации гемоглобина и эритроцитов в сочетании с отсутствием достоверных изменений концентрации нитрат-ионов у животных после интоксикации нитритом натрия может свидетельствовать о внутрисосудистом гемолизе с последующим связыванием нитрит-ионов свободным гемоглобином. В связи с этим изучалась роль свободного гемоглобина внутрисосудисто гемолизированных эритроцитов в регуляции концентрации нитрат-ионов в крови крыс.

Показано, что содержание нитрат-ионов максимально в образце, содержащем только суспензию эритроцитов (2,14 мМоль/л). По мере увеличения доли гемолизата концентроция нитрат-ионов снижается и в чистом гемо-лизаге становится достоверно ниже (1,47±0,1 мМоль/л) (р0,05), чем в суспензии эритроцитов. Таким образом, подтверждена гипотеза о роли свободного гемоглобина как скавенджера нитрит-ионов. Такая функция внеклеточного гемоглобина может уменьшить токсическое действие нитросоединений на ткани-мишени и имеет компенсаторно-приспособительное значение.

При исследовании цитоархитектоники эритроцитов выявлено снижение процентного содержания дискоцитов (в 1,8 раза (р<0,05) в случае введения 50 мг/к[ нитрита натрия) при одновременном достоверном увеличении обратимо трансформированных эритроцитов и дегенеративных форм (р<0,05). Степень этих нарушений в случае интоксикации 10 мг/кг нитрита натрия была менее выражена и возрастала при увеличении дозы вводимого вещества. Тем не менее, тенденция распределения эритроцитов по основным классам была общей для обеих используемых концентраций нитрита натрия (среди деформированных эритроцитов преобладали клетки с одним и множественными выростами мембраны - 2 и 4 класс цитоархитектоники), а соответствующие количественные данные достоверно не отличались в группах опыта между собой.

Концентрация метгемоглобипа при введении 50 мг/кг нигрита натрия возрастала до 34,37% (средняя степень тяжести метгемоглобинемии) по сравнению с 4,36% в случае воздействия меньшей дозы (метгемоглобинемия субклинического типа, бессимптомная) (Волкова Н.В., 1976; 8\у1а1кои^ка А., 1989) и 0,17% в контрольной группе. Известно, что концентрация метгемоглобипа в крови возрастает пропорционально внутриклеточному содержанию

нитрита в эритроците (May J.M. et al., 2000). По мере старения эритроцита вероятность биологически нецелесообразной реакции окисления гемоглобина в метгемоглобин резко возрастает (Гительзон И.И., Терсков И.А., 1967). Эти положения подтверждаются данными нашего исследования.

Наблюдаемая нами реакция на острую интоксикацию со стороны белой крови - лейкоцитолиз (концентрация лейкоцитов дозозависимо снижалась на фоне введения нитрита натрия относительно контроля (р<0,05)) - дополнительно свидетельствует о высокой токсичности нитрита натрия.

В ответ на внутрисосудистый гемолиз наблюдается экстренный реактивный выброс ретикулоцитов из кровяных депо: увеличивается относительная и абсолютная концентрация ретикулоцитов у экспериментальных крыс по сравнению с контрольной группой (р<0,01) и достоверное различие соответствующих данных в группах опыта (р<0,01), что свидетельствует о дозо-зависимой реакции эритрона на введение нитрита натрия. Особенностью изменения концентрации ретикулоцитов стало значительно более выраженное увеличение по сравнению с контролем относительной концентрации, чем аб-ерлютной, что еще раз доказывает наличие выраженной гемолитической реакции крови на острую нитритную интоксикацию, сопровождающуюся лизисом неполноценных эритроцитов и увеличением доли молодых форм эритро- * цитов и ретикулоцитов. Такая динамика смены популяций эритроцитов наглядно изображена на кислотной эритрограмме: введение нитрита натрия в дозе 50 мг/кг сопровождается смещением кривой кислотного гемолиза впра- ' во относительно контроля и появлением дополнительного пика, характеризующего появление новых высокоустойчивых клеток. Появление аналогичного пика меньшей амплитуды без смещения кривой гемолиза относительно контроля отмечается и на глицериновой эритрограмме.

Кратковременность действия нитрита натрия обусловила, по-видимому, отсутствие достоверных изменений клеточного состава кроветворных органов и веса селезенки крыс по сравнению с контролем.

Эффект острой нитритной интоксикации на состояние эритрофагоци-тоза был дозозависимым. Показатели начальных этапов эритрофагоцитоза на этапе розеткообразования в опытных группах не претерпевали достоверных изменений по сравнению с контролем. Однако способность макрофагов адге-зироваться к стеклу при воздействии большей дозы нитрита натрия снижалась в 2 раза (р<0,01). При введении меньшей дозы нитрита натрия обнаруживалась лишь тенденция к снижению числа адгезированных к стеклу мак-

рофагов на единицу поля зрения без достоверных изменений данного показателя по сравнению с контролем.

Острая интоксикация нитритом натрия вызывала заметную активацию поздних этапов фагоцитоза. Достоверно увеличивалось процентное содержание макрофагов с эритрофагосомами и диффузными включениями гемоглобина в цитоплазме. На фоне воздействия 50 мг/кг нитрита натрия процентное содержание макрофагов с включениями гемоглобина в цитоплазме снижалось по сравнению с таковым при интоксикации меньшей дозой нитрита натрия (р<0,05), однако было достоверно выше (р<0,01) контрольных данных. Такой эффект, по-видимому, связан с токсическим влиянием высоких доз нитрита натрия на фагоцитарную активность макрофагов, направлением деструкции эритроцитов по пути внутрисосудистого гемолиза, свойственного в условиях физиологической нормы лишь для 10% разрушающихся эритроцитов (Бриллиант М.Д., 1985).

Учитывая особенности реакции эритроцитарной системы на острую интоксикацию нитритом натрия, обусловленные в основном оксидачтным повреждением мембранных структур клеток с последующим токсическим влиянием на организм в целом, на состояние гомеостаза, ведущим звеном патогенетической терапии таких патологических состояний является применение протекторов биологических мембран - ингибиторов свободнорадикаль-ных процессов окисления (Журавлев А.И., 1975; Иванов И.И. и др., 1975; Chow C.K. et al., 1984; Ranga V., Kleinerman J., 1981). В качестве такого ингибитора - антиоксиданта можно использовать альфа-токоферол (витамин Е), дефицит которою повышает чувствительность к повреждающему действию нитри!а натрия (Chow C.K. et al., 1984). Напротив, предварительное введение альфа-токоферола делает эритроциты более устойчивыми к оксидантным агентам (Chan P.C. et al., 1982; Wang J. et al., 1996; Yang Q., Wang F., 1991 ).

Адекватность использования альфа-токоферола предварительно отражена в нашем исследовании отсутствием влияния на исследуемые показатели инъекции стерильного растительного масла в том же режиме, в котором вводили токоферол (за 1 час до инъекции нитрита натрия). Эффект альфа-токоферола был дозозависимым: введение его в дозе 50 мг/кг за I час до инъекции аналогичной дозы нитрита натрия существенно не повлияло на состояние периферической крови, тогда как эффект 500 мг/кг токоферола в отношении параметров периферической крови характеризовался меньшей степенью внутрисосудистого гемолиза, сохранением популяции циркулирую-

щих эритроцитов с удовлетворительными показателями цитоархитектоники. Содержание дискоцитов практически не отличалось от данных контроля и было достоверно выше (р<0,01), чем после инъекции 50 мг/кг нитрита натрия. Количественные данные, характеризующие процентное содержание основных форм эритроцитов, после инъекции токоферола возвращались к контрольному уровню, а содержание необратимо измененных эритроцитов и дегенеративных форм становилось существенно ниже (р<0,05) контрольных данных. Показатели морфологии эритроцитов свидетельствуют о том, что токоферол в дозе 500 мг/кг повышает обратимость трансформации клеток, приводит к структурной стабилизации клеточной мембраны (Cruz Silva М.М. et al., 2001).

Инъекция 500 мг/кг токоферола позволяла достичь легкой степени тяжести метгемоглобинемии: концентрация метгемоглобина составила 18,45%. Установлена сильная достоверная отрицательная корреляционная связь между уровнем нитратов и содержанием метгемоглобина в крови (г= -0,73; р<0,01).

С помощью введения 500 мг/кг токоферола частично скомпенсирован лейкоцитолиз, развившийся в результате интоксикации (концентрация лейкоцитов становилась достоверно выше (р<0,05), чем после интоксикации без антиоксидантной коррекции), однако достичь исходных (контрольных) показателей не удалось.

При оценке состояния эритропоэза обнаружено, что ретикулоцитоз на фоне введения альфа-токоферола был выражен значительно меньше, чем после острой интоксикации нитритом натрия. Этот факт нашел отражение в динамике кислотного гемолиза эритроцитов: особенностью действия разных доз токоферола было смещение кислотных эритрограмм влево относительно контроля и кривых гемолиза после нитритной интоксикации тем более, чем выше была вводимая доза альфа-токоферола. Такие изменения обусловлены сохранением популяции достаточно полноценных эритроцитов, которые после интоксикации 50 мг/кг нитрита натрия и даже на фоне предварительного введения меньшей дозы альфа-токоферола разрушались внутрисосудисто, выключаясь из циркуляции, и не регистрировались как клеточные элементы (Zamora R. et al., 1991). Наличие популяции эритроцитов с удовлетворительными мембранными характеристиками на фоне сохраняющегося повышенного уровня ретикулоцитов безусловно способствует улучшению кислородо-транспортной функции в условиях интоксикации.

Дозозависимое усиление эндоцитоза на фоне введения альфа-токоферола (количество макрофагов, содержащих эритрофагосомы и включения гемоглобина в цитоплазме, после введения большей дозы токоферола было в 1,5 раза выше аналогичного параметра после инъекции 50 мг/кг токоферола и в 2 раза превышало аналогичный показатель в случае интоксикации без предварительного введения антиоксиданга) свидетельствует, по-видимому, о том, что в условиях моделирования нитритной интоксикации на фоне введения антиоксиданта сохраняется популяция достаточно полноценных эритроцитов, которые в отсутствие антиоксидантной коррекции разрушались внутрисосудисто, выключаясь из циркуляции, и не улавливались в качестве объекта гемолиза клетками системы мононуклеарных фагоцитов. Увеличение количества адгезированных к стеклу макрофагов (в 1,57 раза при воздействии 500 мг/кг альфа-токоферола (р0,01)), характеризующее реактивацию наиболее ранних этапов эритрофагоцитоза, свидетельствует об уменьшении токсического влияния нитрита натрия на фоне предварительного введения токоферола по сравнению с данными, полученными после кит-ритной интоксикации без антиоксидантной коррекции. Установлена сильная достоверная отрицательная корреляционная связь между концентрацией мет-гемоглобина в крови и количеством адгезированных к стеклу макрофагов (г= -0,75; р<0,001). Известно также, что токоферол сам по себе способен стимулировать функциональную активность макрофагов (Кудрин A.B. и др., 2000).

В заключение, анализируя представленные результаты, можно отметить, что оксид азота, безусловно, относится к факторам, регулирующим эритродиерез в физиологических условиях, и вовлекается в регуляцию го-мсостаза эритроцитарной системы при острой нитритной интоксикации у белых крыс. Профилактика токсических эффектов, вызываемых нитритом натрия, возможна с помощью альфа-токоферола.

ВЫВОДЫ

I. Оксид азота участвует в регуляции фагоцитоза аутологичных эритроцитов перитонеальными макрофагами у крыс. Наличие в культуральной среде объекта фагоцитоза - аутологичных эритроцитов, - является фактором, запускающим метаболизм L-аргинина, что сопровождается повышением концентрации NOi'-ионов в среде и активацией эритрофагоцитоза. Добавление L-аргинина существенно повышает активность макрофагов и уровень нитрат-

ионов в среде. В отсутствие эритроцитов макрофаги не реагируют повышением уровня нитрат-ионов на вносимый в среду субстрат синтеза N0 - Ь-аргинин.

2. Характер гуморальной регуляции эритрофагоцитоза оксидом азота зависит от концентрации N0 в культуральной среде и вида донатора оксида азога. Донатор или предшественник оксида азота вызывает активацию эритрофагоцитоза в пределах определенного диапазона концентраций, а при дальнейшем увеличении содержания донатора/предшественника N0 в культуральной среде активность перитонеальных макрофагов существенно не изменяется или происходит угнетение эритрофагоцитоза. Данная зависимость показана т укго для Ь-аргинипа (до 800 мкМоль/л), нитропруссида натрия (до 1000 мкМоль/л) и нитрита натрия (до 100 мкМоль/л).

3. Экзогенный N0 специфически влияет на макрофаги и на эритроциты. Основной мишенью его действия являются эритроциты. Эффект N0 на макрофаги обусловлен как непосредственным влиянием на них, так и изменениями морфо-функциональных характеристик эритроцитов с последующей стимуляцией макрофагальной системы. Выраженность суммарного эффекта экзогенного N0 на культуру клеток не идентична результатам, полученным при обработке макрофагов и эритроцитов в отдельности: эндоцитоз эритроцитов достоверно активнее протекает при изолированном воздействии донатора N0 на макрофаги и эритроциты, но способность макрофагов образовывать розсткоподобные структуры более чем с 2 эритроцитами достоверно выше при воздействии донатора N0 на культуру клеток.

4. Острая нитритная интоксикация оказывает системное дозозависимое влияние на эритрон, вызывая острую гемолитическую анемию на фоне выраженной метгемоглобинемии. Реакция оритроцитарной системы сопровождается активацией системных механизмов компенсации нарушений эритрона в виде ретикулоцитоза; внутрисосудистого гемолиза, который обеспечивает связывание нитрит-ионов, предотвращая их токсическое влияние на органы-мишени; активации фагоцитарной активности макрофагов.

5. Альфа-токоферол, вводимый перед моделированием острой нитритной интоксикации, снижает степень выраженности метгемоглобинемии, существенно уменьшает нарушения цитоархитектоники эритроцитов, предотвращает фазу острой анемизации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мясоедова Е.Е., Голубева Е.К Участие оксида азота в механизме эритро-фагоцитоза у белых крыс in vitro // Материалы 2 научной конференции студентов и молодых ученых "Роль оксида азота в физиологии и патологии". - Иваново, 2000. - С. 10.

2. Голубева Е.К., Мясоедова Е.Е. Роль оксида азота в механизме фагоцитоза эритроцитов перитонеальными макрофагами у белых крыс in vitro // Материалы 2 Российской конференции молодых ученых с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". -М., 2001. -Т.2. - С. 277.

3. Голубева Е.К., Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Оксид азота как стимулятор процесса эритрофагоцитоза // Тезисы докладов международной конференции "Механизмы функционирования висцеральных систем", посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева. - С.-Пб., 2001. - С. 83-84.

4. Мясоедова Е.Е., Голубева Е.К., Назаров С.Б. Физиологическая роль оксида азота в регуляции процесса эритрофагоцитоза у белых крыс in vitro // Тз-зисы докладов XVIII съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. -Казань, 2001.-С. 169.

5. Мясоедова Е.Е. Оценка показателей эритрофагоцитоза у белых крыс in vitro на фоне влияния экзогенного оксида азота // Тезисы докладов 66-й Республиканской конференции студентов и молодых ученых "Вопросы теоретической и практической медицины" - Уфа, 2001. - С. 34.

6. Мясоедова Е.Е. Особенности изменения показателей эритрофагоцитоза у белых крыс in vitro на фоне влияния экзогенного оксида азота // Тезисы докладов международной научной конференции студентов и молодых ученых "Молодая наука-XXI веку". - Иваново, 2001. - С. 40-41.

7. Мясоедова Е.Е. Оценка показателей эритрофа! оцитоза у белых крыс in vitro на фоне влияния экзогенного оксида азота. // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых "Современные проблемы естествознания". - Владимир, 2001. - С. 111-113.

8. Мясоедова Е.Е. Участие оксида азота в регуляции процесса эритрофагоцитоза у белых крыс // Тезисы работ участников открытого Российского конкурса на лучшую научную работу студентов 2001 г. по разделу "Медицинские науки". - М., 2002. - С. 127-128.

9. Мясоедова Е.Е., Голубева Е.К. Особенности изменения показателей эритрофагоцитоза у белых крыс in vitro под влиянием экзогенного оксида азота

11 Вестник Ивановской медицинской академии. - 2001. - Т.6. - № 1-2. - С. 86-87.

10. Мясоедова Е.Е., Голубева Е.К., Пророкова М.В., Пахрова O.A., Назаров С.Б. Оксид азота как фактор регуляции клеточных механизмов эритродие-реза // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2001. - Т.6. - № 3-4. -С. 92.

11. Мясоедова Е.Е., Голубева Е.К., Пророкова М.В., Назаров С.Б. Влияние нитропруссида натрия на процесс фагоцитоза эритроцитов перитонеаль-ными макрофагами у белых крыс // Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2002. - Т. 88. - №1. - С. 32-37.

12. Мясоедова Е.Е., Голубева Е.К., Пророкова М.В., Пахрова O.A. Влияние оксида азота на эритрофагоцитоз у белых крыс in vitro // Здравоохранение Башкортостана. - 2001. - №8. - С. 46-48.

13. Мясоедова Е.Е. Показатели эритрона крыс при острой нитритной интоксикации // Здравоохранение Башкортостана. 2002. - №3. - С. 9! -92.

14. Мясоедова Е.Е. Механизм фагоцитоза аутологичных эритроцитов — участие оксида азота // Материалы конференции "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". - С.-Пб., 2002. - С. 201.

15. Мясоедова Е.Е. Показатели эритрона в условиях острой интоксикации нитритом натрия // Тезисы докладов научных конференций студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодая наука в классическом университете". - Иваново, 2002. - С. 44-45.

16. Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Сравнительная характеристика влияния нитропруссида натрия и нитрита натрия на эритрофагоцитоз у крыс in vitro // Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2003. -Т. 89.-№5.-С. 613-615.

17. Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Применение альфа-токоферола для коррекции нарушений системы красной крови (эритрон) при острой нитритной интоксикации у крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003. - Т.66. - №5. - С. 35-39.

18. Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Опыт использования альфа-токоферола для коррекции нарушений эритрона при острой нитритной интоксикации у крыс // Материалы международной конференции по гемореологии и микроциркуляции. - Ярославль, 2003. - С. 69.

19. Мясоедова Е.Е. Значение внутрисосудистого гемолиза в регуляции гомео-стаза при острой нитритной иитоксикации у крыс // Студенческая меди-

цинская наука 2003: Материалы межрегиональной студенческой научной конференции, посвященной 85-летию ВГМА им. H.H. Бурденко. - Воронеж, 2003. - С. 249-250.

20. Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Реакция эритроцитарной системы взрослых крыс на острую нитритную интоксикацию // Патол. физиол. и эксперим. тер. - 2004. - №2. - С. 16-18.

21. Мясоедова Е.Е., Иванова A.C., Назаров С.Б. Функциональное состояние эритрона крыс при острой и хронической нитритной интоксикации // Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т. 90. -№8.-С. 141-142.

22. Мясоедова Е.Е. Профилактика оксидантнопо стресса альфа-токоферолом в эксперименте и обоснование необходимости включения антиоксидантов в комплексную терапию острых кардиологических состояний // Тезисы докладов III Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения, посвященной 250-летию МГУ им. М.В. Ломоносова. - М„ 2004. - С. 65-66.

23. Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Внутрисосудистый гемолиз как фактор регуляции гомеостаза при острой нитритной интоксикации у крыс // Актуальные проблемы биологии. Сборник научных работ. - Томск, 2004. - Т. 3.

— №1. — С. 150.

24. Голубева Е.К., Мясоедова Е.Е., Назаров С.Б. Пророкова М.В. Оксид азота

- регулятор вну гриклеточных механизмов эритродиереза // Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т. 90. - №8. - С. 144-145.

ШЬ'

/

МЯСОЕДОВА ЕЛЕНА ЕВГЕНЬЕВНА

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ ЭРИТРОДИЕРЕЗА В НОРМЕ И ПРИ ОСТРОЙ НИТРИТНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У БЕЛЫХ КРЫС

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 27 01 2005. Формат 60x84 1/16 Печ. л. 1,5. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз.

ГОУ ВПО ИвГМА Минздрава России. 153462 г. Иваново, пр Ф Энгельса, 8

10 е£3 20№

Актуальность проблемы. Изучение механизмов функционирования висцеральных систем и их гуморальной регуляции является актуальной проблемой современной физиологии. Начиная с 1987 года, в результате интенсивных научных исследований была доказана важная роль оксида азота в регуляции основных систем организма: сердечно-сосудистой, иммунной, нервной, дыхательной и др., что позволило предположить универсальное значение N0 для биосистем (Bachmann S., Mundel P., 1994; Cabrera С., Bohr D., 1995; Charbit M. et al., 1997; Garthwaite J., Boulton C.L., 1995; Lowenstein C.J. et al., 1994; Moncada S., Higgs A., 1993; Nakaki Т., 1994; Palmer R.M.J, et al., 1987; Snyder S.H., 1993; Umans J.G., Levi R., 1995; Zhang J., Snyder S.H., 1995; Wennmalm A. et al., 1992; Реутов В.П., 1995). Вместе с тем, несмотря на большое количество работ, посвященных оксиду азота, пока не удалось определить все "точки приложения" N0; мало изучены медикаментозные механизмы воздействия на продукцию оксида азота в условиях патологии. Так, недостаточно разработан вопрос о роли оксида азота в регуляции состояния эритрона в целом и механизмов регуляции эритродиереза в частности. Поэтому актуальным представляется исследование роли оксида азота как одного из потенциальных регуляторов процесса деструкции эритроцитов.

Активность процесса эритрофагоцитоза определяется как функциональным состоянием системы мононуклеарных фагоцитов, в том числе и их NO-продуцирующей способностью, так и состоянием эритроцитов периферической крови. В связи с этим изучение характеристик эритрона в комплексе с исследованием клеточных механизмов эритродиереза в норме и при воздействии внешних факторов позволяет понять суть регуляции эритрофагоцитоза.

Исключительной особенностью крови как функциональной системы является то, что она интегрирует работу многих физиологических систем организма. Высокая чувствительность крови к различным воздействием позволяет по ее клеточному составу, количеству и структурным особенностям ее форменных элементов судить о характере нарушений, возникших в организме, что делает именно эту систему наиболее адекватной для изучения проблемы гуморальной регуляции в сфере физиологии оксида азота.

После открытия молекулы оксида азота ряд веществ из различных фармакологических групп (нитраты, сиднонимины, нитропруссид натрия, никорандил) были объединены в одну фармгруппу донаторов оксида азота (Ольбинская Л.И., Лазебник Л.Б., 1998). Экстренность использования этих препаратов в терминальных состояниях (острый инфаркт миокарда, кардиогенный отек легких, гипертонический криз) и высокие дозы указанных средств делают актуальной проблему профилактики повреждений клеточных мембран и коррекции последствий оксидантного стресса, вызванного интоксикацией нитропрепаратами (Рекомендации по профилактике, диагностике и лечению артериальной гипертензии, 2002; Gibson G.R. et al., 1982).

Одним из наиболее доступных препаратов с антиоксидантной активностью является альфа-токоферол. Содержание витамина Е в эритроцитарной мембране представляет весьма лабильный, чувствительный к оксидантным воздействиям пул токоферола в организме (Кудрин А.В. и др., 2000; Микаелян Э.М. и др., 1983). С другой стороны эритроцитарная мембрана быстрее других тканей накапливает токоферол после его парентерального введения (Chen, Touyz R.M. et al., 2001). Поэтому эритроцит является универсальной и в данном случае наглядной моделью для исследования влияния экологических факторов на клеточном уровне, а изменения морфофункциональных характеристик эритроцитов наглядно отражают последствия колебаний содержания токоферола в клетке.

Несмотря на доступность исследования и значимость данной проблемы, влияние оксида азота на эритрон в целом, механизмы элиминации нежизнеспособных эритроцитов из кровеносного русла после воздействия оксида азота, а также возможности антиоксидантной профилактики и коррекции последствий острой нитритной интоксикации изучены недостаточно. В литературе встречается характеристика изменений отдельных звеньев эритрона, преимущественно, периферической крови после воздействия донаторов N0. Основная масса работ посвящена в основном постинтоксикационной метгемоглобинемии, ее механизмам, способам коррекции, а также изменениям ферментного спектра крови после острой нитритной интоксикации (Гоженко А.И. и др., 1996; Гоженко А.И. и др., 1989; Середенко М.М. и др., 1987; Chioidi Н., Mohler J.G., 1987; May J.M. et al., 2000; Shugalei I.V. et al., 1992a; Shugalei I.V. et al., 1992b). He удалось найти работы, характеризующие комплексное действие нитрита натрия на систему крови в условиях острой интоксикации, а также системную характеристику возможности использования альфа-токоферола для коррекции нарушений эритрона после оксидантного стресса.

Цель исследования — установить закономерности NO-зависимой регуляции состояния эритрона и клеточных механизмов эритродиереза в норме, при острой нитритной интоксикации и ее антиоксидантной коррекции у белых крыс.

Задачи исследования: 1. Изучить механизмы регуляции процессов внутриклеточной деструкции эритроцитов на фоне влияния донаторов оксида азота (нитропруссида натрия, нитрита натрия) и L-аргинина in vitro.

2. Выявить эффекты действия оксида азота на процесс эритродиереза при изолированном и сочетанном воздействии экзогенного NO на эритроциты и макрофаги.

3. Определить закономерности изменений функционального состояния эритроцитарной системы и процесса эритрофагоцитоза при острой интоксикации нитритом натрия у крыс.

4. Исследовать эффект альфа-токоферола при острой нитритной интоксикации по показателям состояния эритрона и эритрофагоцитоза.

Научная новизна. На основании проведенных нами исследований обнаружена способность оксида азота дозозависимо стимулировать эритродиерез in vitro. Впервые установлены закономерности влияния донаторов оксида азота (нитропруссида натрия, нитрита натрия) и L-аргинина на процесс эритрофагоцитоза in vitro: активация эритрофагоцитоза в пределах определенного диапазона концентраций с дальнейшим неизменным уровнем активности перитонеальных макрофагов на фоне увеличения концентрации донатора NO или L-аргинина в культуральной среде. Дана комплексная оценка системного ответа эритрона на острую интоксикацию, вызванную введением нитрита натрия у крыс in vivo. Доказана эффективность антиоксидантной профилактики изменений периферической крови и состояния эритродиереза при острой нитритной интоксикации у крыс.

Теоретическое значенне работы определяется тем, что в ней установлены закономерности участия оксида азота в регуляции эритрофагоцитоза, проведена оценка системного ответа эритрона на острую нитритную интоксикацию, изучены возможности ее коррекции с помощью альфа-токоферола.

Практическое значение работы. На основании установленных N0-опосредованных закономерностей регуляции состояния эритрона и эритродиереза предложены новые способы оценки состояния эритроцитарной системы (рац. предложение №2319 от 08.04.2002 "Способ оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов"; рац. предложение №2351 от 17.06.2003 "Способ оценки состояния эритрона в норме, при острой нитритной интоксикации и ее антиоксидантной коррекции"; №2375 от 30.03.2004 "Способ профилактики гемической гипоксии, индуцированной нитритом натрия").

Результаты работы внедрены в учебный процесс (лекционный курс) на кафедрах нормальной физиологии, физики, математики и информатики (Акт о внедрении предложения "Новые сведения об участии оксида азота в регуляции эритрофагоцитоза" от 17.09.2001) и патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО ИвГМА Минздрава России (Акт о внедрении предложения "Роль оксида азота в регуляции клеточных механизмов эритродиереза в норме, при острой нитритной интоксикации и ее антиоксидантоной профилактике" от 05.11.2004); в практику работы ГУ "Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава России" (Акт о внедрении предложения "Способ оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов" от 05.11.2004).

Положения, выносимые на защиту:

1. Оксид азота участвует в регуляции процесса эритрофагоцитоза у крыс, дозозависимо активируя фагоцитоз аутологичных эритроцитов перитонеальными макрофагами.

2. Острая нитритная интоксикация вызывает острую гемолитическую анемию, метгемоглобинемию, относительный и абсолютный ретикулоцитоз на фоне активации внутриклеточных механизмов эритродиереза. Возникающие нарушения поддаются коррекции с помощью альфа-токоферола.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, сентябрь 2001г.); XIX Съезде физиологического общества им. И.П.

Павлова (Екатеринбург, сентябрь 2004г.); Международной конференции "Механизмы функционирования висцеральных систем", посвященной 75-летию со дня рождения А.И.Уголева (Санкт-Петербург, 2001 г.); Конференции в рамках открытого конкурса на лучшую научную работу студентов в ВУЗах РФ по разделу «Медицинские науки» (Москва, ММА им. И.М. Сеченова, 2002 г.); X Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" в МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2002 г.); II Российской конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2001 г.); 6б-й Республиканской конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2001 г.); Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы естествознания» (Владимир, 2001 г.); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука XXI веку» (Иваново,2001 г.); II научной конференции студентов и молодых ученых «Роль оксида азота в физиологии и патологии» (Иваново, 2000 г.); Конференции, посвященной 70-летию Ивановской медицинской академии «Современные направления научных исследований студентов и молодых ученых ИГМА» (Иваново, 2000 г.); Всероссийской конференции-фестивале студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодая наука в классическом университете. Актуальные проблемы современного естествознания"; Международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (Ярославль, 2003); III Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения, посвященной 250-летию МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2004); Итоговых конференциях научного общества студентов и молодых ученых ИГМА в рамках Недели науки - 2000, 2001, 2002, 2003, 2004.

По теме диссертации опубликованы 24 научные работы, оформлены 3 рац. предложения. Результаты работы внедрены в учебный процесс (лекционный курс) на кафедре нормальной физиологии с курсом физики, математики и информатики ГОУ ВПО ИвГМА Минздрава России (Акт о внедрении предложения "Новые сведения об участии оксида азота в регуляции эритрофагоцитоза" от 17.09.2001); на кафедре патофизиологии и иммунологии (Акт о внедрении предложения "Роль оксида азота в регуляции клеточных механизмов эритродиереза в норме, при острой нитритной интоксикации и ее антиоксидантной профилактике" от 05.11.2004); в практику работы ГУ "Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава России" (Акт о внедрении предложения "Способ оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов" от 05.11.2004).

ВЫВОДЫ

1. Оксид азота участвует в регуляции фагоцитоза аутологичных эритроцитов перитонеальными макрофагами у крыс. Наличие в культуральной среде объекта фагоцитоза - аутологичных эритроцитов, -является фактором, запускающим метаболизм L-аргинина, что сопровождается повышением концентрации NO3" -ионов в среде и активацией эритрофагоцитоза. Добавление L-аргинина существенно повышает активность макрофагов и уровень нитрат-ионов в среде. В отсутствие эритроцитов макрофаги не реагируют повышением уровня нитрат-ионов на вносимый в среду субстрат синтеза NO - L-аргинин.

2. Характер гуморальной регуляции эритрофагоцитоза оксидом азота зависит от концентрации NO в культуральной среде и вида донатора оксида азота. Донатор или предшественник оксида азота вызывает активацию эритрофагоцитоза в пределах определенного диапазона концентраций, а при дальнейшем увеличении содержания донатора N0 или L-аргинина в культуральной среде активность перитонеальных макрофагов существенно не изменяется или происходит угнетение эритрофагоцитоза. Данная зависимость показана in vitro для L-аргинина (до 800 мкМоль/л), нитропруссида натрия (до 1000 мкМоль/л) и нитрита натрия (до 100 мкМоль/л).

3. Экзогенный NO специфически влияет на макрофаги и на эритроциты. Основной мишенью его действия являются эритроциты. Эффект NO на макрофаги обусловлен как непосредственным влиянием на них, так и (при воздействии на культуру клеток) изменениями морфо-функциональных характеристик эритроцитов с последующей стимуляцией макрофагальной системы. Выраженность суммарного эффекта экзогенного NO на культуру клеток не идентична результатам, полученным при обработке макрофагов и эритроцитов в отдельности: эндоцитоз эритроцитов достоверно активнее протекает при изолированном воздействии донатора NO на макрофаги и эритроциты, но способность макрофагов образовывать розеткоподобные структуры более чем с 2 эритроцитами достоверно выше при воздействии донатора NO на культуру клеток.

4. Острая нитритная интоксикация оказывает системное дозозависимое влияние на эритрон, вызывая острую гемолитическую анемию на фоне выраженной метгемоглобинемии. Реакция эритроцитарной системы сопровождается активацией системных механизмов компенсации нарушений эритрона в виде ретикулоцитоза; внутрисосудистого гемолиза, который обеспечивает связывание нитрит-ионов, предотвращая их токсическое влияние на органы-мишени; активации фагоцитарной активности макрофагов.

5. Альфа-токоферол, вводимый перед моделированием острой нитритной интоксикации, снижает степень выраженности метгемоглобинемии, существенно уменьшает нарушения цитоархитектоники эритроцитов, предотвращает фазу острой анемизации.