Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Регуляция иммуногенеза гормонами околощитовидных желез

11 § \ \ % ¿м

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

САЯДЯН ХАЧИК САРКИСОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНОГЕНЕЗА ГОРМОНАМИ ОКОЛОЩИТОВИДНЫХ ЖЕЛЕЗ

14-00-36 аллергология и иммунология

Автореферат

диссертационной работы на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА 1991

и: ■ работа выполнена в Ереванском государственном медицинском """Институте им. М.Гераци, Токийском Императорском универси тете и Институте иммунологии МЗ СССР.

Официальные оппоненты: член-корреспондект АМН СССР,

профессор Е.А.Корнева

член-корреспондент Российской Академии Естественных Наук, профессор А.А.Ярилин

доктор биологических наук, профессор А.А.Иванов

Ведущее учреждение: 2-й Московский государственный

медицинский институт

Защита состоится "_"_1991г.

в_часов на заседания Специализированного Совета

Д 074.09.01 Институт! иммунологии МЗ СССР

Адрес: 115478, г.Москва, Каширское шоссе, 24, к.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии МЗ СССР

Ученый секретарь^ доктор биологических

Специализированного Совета , наук А.В.Колобов

В последнее десятилетие стало формироваться представление о целостной автономной многокомпонентной системе, обеспечивающей гомеостаз кальция в организме. Центральным регуляторным органом этой системы являются пар"•китовидные железы.

Большинство авторов придерживается того мнения, что эффекты кальцийрегулирующих гормонов на многие интегративные процессы, и в первую очередь, на иммунные механизмы, опосредуются исключительно через кальциевый механизм. Имеется обширная литература о роли Са++ в иммунных процессах. Показана его важная роль в активации комплемента (Hadden, 1979), нейтрофилов (Hume, Gordon, 1983; Naccache, 1983; Ochs, 1983; Sheram, e.a., 1983), в инициации Т-лимфоцитар ных реакций (Gearing e.a., 1985), в мито-генной активации лимфоцитов (Blitstein, Diamanstein, 1978; Desaymard, e.a., 1980), в синтез." иммуноглобулинов (Brawn, 1970; Bolis, 1971), дифференцировке клегок (Green, e.a., 1976), в распознавании по типу "рецептор - лиглнд' (Lichtman, 1983), и тах далее. Вместе с тем имеются единичные сведишя, согласно которым функция кальцийрегулирующих гормонов, и l частности паратиреоидного гормона и кальцитонина, далеко не все i да ревизуется через кальциевые механизмы. Их не следует рассматривать только в качестве медиаторов, оказывающих сугубо разрешающее действие на отдельные органы-мишени, а в более широком плане - в качестве секретор-но-активных веществ общебиологического спектра действия. С этой точки зрения наиболее актуальным является изучение взаимосвязи между кальцийрегулирующими гормонами и иммунной системой. Имеется ряд данных, указывающих на наличие тесных реципрокных взаимоотношений между центральным органом иммуногенеза - тимусом и паращитовидн'ыми железами (Perris, e.a., 1967; 1970; Perry, e.a., 1984;). Изучение взаимодействия гормонального комплекса, обеспечивающего гомеостаз кальция, с иммунной системой, является необходимым для понимания многих сторон процесса реализации тех или иных иммунных функций. К сожалению, проведенные в этой области исследования носят фрагментарный характер и не позволяют получить достаточного представления об уровне взаимодействия. Имеющиеся в литературе сведения поэтому вопросу немногочислен-

ны и затрагивают лишь отдельные звенья сложной многогранной системы клеточного и гуморального иммунитета. Так, известно, что паратгормон стимулирует, а кальцитоиин тормозитмитотическое деление незрелых лимфоидных клеток в тимусе (Whitfield, е.а., 1970; Potts, Deffos, 1974). Выявлены высокоаффинные рецепторы к пара-тиреоидному гормону на различных субпопуляциях лимфоцитов (Perry, е.а., 1984; Bialasievich, е.а., 1979; Yamamoto, е.а., 1983). Имеются отдельные сведения, косвенно свидетельствующие в пользу модулирующей роли медиаторов тимуса на секреторные процессы в околощитовидной и щитовидной железах. Из тимуса удалось выделить фактор, обладающий способностью, снижать подобно кальцито-нину уровень кальция в крови (Potop, 1966; Milcu, е.а., 1973). Кемелевой с сотрудниками (Кемелева, 1984) было показано, что удаление тимуса приводит к стойкому резкому повышению уровня паратиреоидного гормона в крови. Наличие функциональной связи в известной мере подтверждается и единым эмбриональным происхождением околощитовидных желез и тимуса: показано, что они оба развиваются из одной и той же группы клеток 3-ьего жаберного кармана (Gümor, 1937; Aria, е.а., 1983).

Таким образом, литературные данные свидетельствуют о важной роли кальцийрегулиру ющих гормонов в реализации реакций клеточного и гуморального иммунитета, однако судить о конкретных механизмах взаиморегуляции и зависимости между околощитовидными железами и органами иммуногенеза на сегодняшний день не представляется возможным.

В настоящей работе предпринята попытка выявить рол» пептидных гормонов, регулирующих кальциевый гомеостаз, в функционировании клеток иммунной системы.

Цель исследования состояла в изучение роли паращитовидных желез в регуляции иммунного гомеостаза, а также изучение взаимоотношений между иммунной и кальцийрегулирующей системами.

Основные задачи исследования.

1. Изучить in vitro влияние кальцийрегулиру ющих пептидных гормонов на интенсивность синтеза белка в лимфоидных клетках из иммунокомпетентных органов человека и животных.

2. Изучить in vitro пролиферативную активность иммунокомпе-тентных клеток при воздействии кальцийрегулирувдщих гормонов.

3. Выявить возможность утилизации паратгормона и кальцитони-на лимфоидными клетками.

4. Провести хроматографический анализ экстрактов паращито-видных желез.

5. Провести анализ иммуномодуляторной активности различных фракций, полученных при хроматографическом разделении экстрактов паращитовидных желез.

6. Изучить морфофункциональное состояние паращитовидных желез в условиях акцидентальной инволюции тимуса.

7. Провести анализ возможных путей развития Са-регулирующей и иммунной систем в процессе эволюции жизни на Земле.

Новизна исследования

Впервые получены новые сведения, указывающие на тесную взаимосвязь между функциональным состоянием иммунной системы и гормонами, регулирующими гомеостаз кальция во внеклеточной среде. Возможно, это открывает перспективы выявления совершенно новых функций паращитовидных желез.

Прослежены взаимообусловленные изменения функциональной активности паращитовидных желез и лимфоидных органов при изменениях функционального состояния одного из них. 'Создана модель реципрокного взаимодействия между паращито видными железами, тимусом и лимфойдными клетками. Эта модель может явиться базисом для дальнейших исследований в этом направлении.

Было также показано, что паратиреоидный гормон и экстракт из паращитовидных желез, способны изменять митотическую активность иммунокомпетентных клеток в 10 и более раз, что говорит с высокоспецифическом типе взаимодействия. Кроме того, было показано, что кальцийрегулирующие пептиды, и в частности, паратиреоидный гормон, могут связываться с митогенными рецепторами лимфоцитов, а в определенных условиях также модулировать митотическую активность конканавалина А и фитогемагглюгинина. Показано так же, что ряд иммунокомпетентных клеток содержит (и вероятнее всего, секретирует) белковые соединения, имеющие антигенную структуру, идентичную таковой у паратиреоидного гормона

и кальцитонина. Концентрация этих соединений в лимфоцитах из различных иммунокомпетентных органов отличается друг от друга.

Проведен хроматографический анализ экстрактов паращитовид-ных желез. Изучена иммуномодуляторная активность различных фракций (паратгормонсодержащих и паратгормон не содержащих). Впервые показано, что иммуномодуляторную активность кроме па-ратиреоидного гормона имеют и другие продукты паратиреоидных желез.

Дан морфофункциональный анализ паращитовидных желез в условиях акцидентальной инволюции тимуса.

Отдельной частью представлены теоретические исследования. По -казаны возможные пути развития внутриклеточной системы обеспечения гомеостаза кальция в процессе развития одноклеточных в докембрии (архее). Дано теоретическое обоснование развития физиологических механизмов различных видов таксиса и возможных причин перехода одноклеточных организмов в многоклеточные на. верхней границе кембрия. Приведены вероятные пути совместного развития иммунной системы, обеспечивающей гомеостаз кальция в организме.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты позволили доказать существование непосредственных взаимосвязей между/ системами, обеспечивающими иммунный и кальциевый гомеостаз. Осуществлена теоретическая разработка в области эволюционной биологии и получены практические результаты, подтверждающие ее. Эти результаты являются основой для развития нового направления исследований в области системных взаимосвязей в организме.

Эти результаты позволяют научно обосновать существование большого количества иммунодефицитных состояний при эндокринных патологиях, сопровождающихся нарушениями в кальцийрегули-рукяцей системе. Лечение подобных патологических состояний необходимо проводить в комплексе с коррекцией иммунных нарушений. На основе количественного определения антигенных детерминант кальцийрегулирующих гормонов в структурах лимфоидных клеток разработаны диагностические критерии оценки состояния функциональной взаимосвязи между кальцийрегулирующей и иммунной системами.

Значение полученных данных весьма велико с учетом изменения функциональной активности паращитовидных желез при самых различных патологиях. В частности, при сердечно-сосудистых заболеваниях описаны весьма сложные по характеру изменения уровня секреции кальцийрегулируюгцих гормонов, а это может рассматриваться как одна из причин иммунологических нарушений при карди-оваскулярной патологии. Важность последних, не вызывает сомнений, а выявление их роли в патогенезе атеросклероза является одной из острейших проблем современной медицины.

Апробация работы ..

Материалы диссертационной работы доложены на III Всесоюзном симпозиуме "Регуляция иммунного гомеостаза" (Ленинград, 1982), на II Всесоюзном съезде патофизиологов (Тбилиси, 1982), на конференциях молодых ученых (Ереван 1981-1985 гг.), III съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ереван, 1983), VI Закавказской конференции патофизиологов (Ереван, 1985), II Конференции по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии в медицине (Ереван, 1986), IV Всесоюзном симпозиуме "Регуляция иммунного гомеостаза" (Суздаль, 1986), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), на японо-американских двусторонних иммунологических конференциях (Киото, 1988, Токио 1989), Всемирной конференции WASIID (Фурусато, 1989), семинарах по иммунологии НИЦ Ермединститута.

Структура работы

Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературных данных, главы с описанием материалов и методов исследований, 5-ти глав с описанием результатов исследований обсуждения, выводов и литературного каталога. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками. Библиография состоит из 412 источников.

МАТЕРИАЛЫ-И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы клетки тимуса и селезенки мышей-самцов линии С-ЗН и крыс-самцов линии Spraque-Dawley. Для пол-

учения поликлональных антисывороток иммунизировали кроликов породы Шиншилла. Животные были получены из питомника АМН СССР "Столбовая", из питомника "Светлые горы", из питомника "Арзни" АН Армянской республики а также из питомника Токийского Императорского Университета в Токио.

Использовали следующие коммерческие препараты: паратирео-идная субстанция (Sigma, USA, Cat.n Р4410), паратиреоидин (Московский эндокринный завод), N-концевой синтетический фрагмент ПТГ1 -34 (Peptide Institute Inc, Osaca, Japan, Lot.370407), С-концевой фрагмент ПТГ 39-84 (Peptide Institute Inc, Osaca, Japan, Lot. 370407), кальципар (кальцитонин) (Rorer, Espania), антисыворотка k N-koh-цевому фрагменту 1-34 ПТ (Scantibodies Laboratory Inc, USA).

Реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) ставили по модифицированному методу (ШютгХ., 1987). В качестве митогенов использов&та конканавалин А (КонА) (SIGMA, США) ифитогемаг-глютинин (ФГА) (GIBCO, США).'

Инкубацию клеток при РБТЛ проводили в течении 72 часов. За 16 часов до конца инкубации в каждую лунку добавляли меченый зН-гТииидин (AMERSHAM, США или PRAHA, ЧССР) с конечной активностью I мк СИ/мл. Подсчет активности проводили на сцинтил-ляционном двухканальном'фотометре RAC-BETA 2101 (LKB, Швеция). Обработка конечных результатов проводилась на компьютерах "GAMMA COMP", "IBM PS/2 50Z" и "APPLE Не".

Клетки человеческой селезенки и лимфатических узлов выделяли из соответствующих лимфоидных органов при патанатомическом вскрытии людей, погибших в автомобильной катастрофе или от инфаркта миокарда и доставленных в Институт хирургии им. Склифо-совского.' Их возраст не превышал .50 лет. Материал забирался не позже 4 часов после констатации смерти и обрабатывался непосредственно в лаборатории, размещенной в больнице.

В работе использовался ацетоновый экстракт из тканей околощитовидных желез. Для ее получения на московском мясокомбинате N 1 км. А. И. Микояна во время забоя скота осуществляли забор желез у быков. Для получения ацетонового экстракта заливали полученную пудру холодным ацетоном (-20° С) в соотношении веса к объему 1:5, перемешивали в течение 20 минут, при 4° С, затем центрифугировали при 3000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость, сливали, а к осадку приливали этиловый эфир в соотношении 1:2.-Проводили

20-минутную инкубацию в холодных условиях при постоянном помешивании, затем надосадочную жидкость сливали, а процедуру с эфиром повторяли 2 раза. Полученный осадок высушивали в вакуумной камере и растирали в 0,01 М TRIS-HC1 буфере рН 7,3 с добавлением 0,001 М ЭДТА и 0,2 М NaCl. Экстракцию проводили в течение 16-24-х часов при 4° С при непрерывном помешивании.

Для получения фосфатных экстрактов пудру после растирания в жидком азоте заливали 0,1 М Na-Na фосфатным буфером рН 7,4 с добавлением 0,2 М NaCl и 0,001 М ЭДТА. Экстракцию проводили 24 часа при 4° С. После экстракции об разцы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 40 минут; разливали аликвоты во флаконы и хранили при температуре не ниже -20° С. Перед употреблением экстракт пропускали через ацетатцеллюлозные фильтры фирмы Millipore марки GS или НА с диаметром пор 0,22 или 0,45 ммк для освобождения от нерастворимых частиц.

Хроматографическое разделение экстрактов проводили при помощи гелей TOYO PEARL HW-55( TOYO-SODA, Япония). Для хроматографии использовали комплекс аппаратов фирмы LKB (Швеция), состоящий из холодильного шкафа, насоса, спектрофотометра.

Паратгормон и кальцитонин определяли радиоиммунологическим методом (Reuter, е.а., 1976), используя наборы фирмы Вук Mallinckrodt (ФРГ), рассчитанные на 100 определений. Образцы хранили до проведения анализа при -20° С.

Полученные результаты обрабатывались при помощи критериев СТЮДЕНТ, а т^же программ для обработки радиоиммунологиче7 ских данных, предложенных ВОЗ в 1984 г. "PR Edwards, department of molecular endocrinology" A6 и "Джон Аткинс" 1981 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Околощитовидные железы при акцидентальной инволюции тимуса. Была предпринята попытка изучения функциональной активности секреторного аппарата околощитовидных желез в условиях гипофункции (гипоплазии) вилочковой железы.

Иммобилизационный стресс вызывали по методике, разработанной в Институте экспериментальной эндокринологии Словацкой

Академии наук (Кл^пепзку, М1ки1ауй, 1970). Эксперимент проводился на лабораторных белых крысах - самцах.

Модель инфекционного стресса была воспроизведена у крыс посредством однократного внутрибрюшинного введения больших доз микоплазмы Гешепшш (Каган Г.Я. исоав. 1981).

Через 24 часа после 5-часовой иммобилизации в вилочковой железе четко прослеживались процессы акцидентальной инволюции. Происходило значительное уменьшение относительного веса органа (1,02±0,05 против 1,55+0,06 в контроле), сужение границ коркового слоя на всем его протяжении. Компактная ориентация лимфоцитов нарушалась. Клетки лимфоидного ряда были представлены исключительно малыми лимфоцитами. Повсеместно прослеживались процессы пикноза и рексиса ядер без усиления их митотической активности.

В участках гибели лимфоцитов обнаруживались довольно крупные клетки* с пенистой, резко вакуолизированной цитоплазмой, в которой выявлялся глыбчатый или мелкозернистый, интенсивно ба-зофилышй материал (признаки аутофагии остатков ядер лимфоцитов). Встречались рчаги полного опустошения кортикального слоя лимфоидными элементами.

Дистрофические процессы наблюдались и в мозговом слое, который также выглядел разрыхленным, оптически светлым. Различные этапы внутриклеточной белковой дистрофии наблюдались в эпители-оидных клетках, эндотелиоцитах кровеносных и лимфатических микрососудов. Обнаруживались отдельные мелкие овальные структуры, напоминающие тельца Гассаля.

Через 12 суток от начала 12-часовой иммобилизации архитектоника вилочковой железы практически не отличалась от таковой у интактных животных.

Через сутки после 5-часовой экспозиции, наблюдался компактный тип развития желез с наличием преимущественно главных "светлых" секреторных элементов. Как видно из таблицы 1, увеличение числа "светлых" клеток происходило за счет достоверно снижения числа темных и ацидофильных клеток. Последние были немногочисленны и локализовались преимущественно в субкапсулярных отделах железы.

Таблица 1

Морфометрический анализ секреторных клеток околощитовидных желез крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу.

секреторные клетки Группы _

светлые переходные темные

Контрольная 267,7+27,5 273,2+17,2 459,2+39,9

24 часа после 488,9±6,4 325,3+26,6 219,8±16,8

иммобилизации. 1=7,8 1=1,6 1=5,5

12 дней после 273,8±15,2 266,9±14,2 459,3±13,5

иммобилизации 1=0,2 1=0,3

Как показали результаты радиоиммунологического анализа сыворотки крови крыс, через 24 часа после иммобилизации имело место достоверное повышение уровня ПТГ (24,3±1,2 пг/мл против 15,2±0;4 пг/мл в контроле). Через 12 суток после 5-часовой иммобилизации в ОЩЖ также наблюдался компактный тип развития секреторного аппарата. В целом, архитектоника железы восстанавливалась. Среди секреторных клеток вновь начинали доминировать темные клетки, которые формировали характерные клеточные тяжи как в центральных, так и в субкапсулярных отделах железы. В крови крыс опытной группы в этот период наблюдения происходила нормализация уровня ПТГ (16,3+1,0 пг/мл).

Через 12 часов после однократного внутрибрюшинного введения М.ГегтепТапБ в тимусе крыс наблюдались структурные изменения,свидетельствующие о возникновении акцидентальной инволюции. Корковый слой выглядел резко суженным, с признаками массивного распада клеток лимфоидного ряда, в результате чего в ретикулярной строме обнаруживались продукты распада клеточных ядер. В участках клеточного распада выявлялись скопления макро-фагальных клеток, цитоплазма которых была вакуолизирована и

переполнена мелкогранулярным Фельгак - положительным материалом. Предварительная инкубация срезов в растворе ДНК-азы приводила к резкому ослаблению, а местами и к полному исчезновению вышеописанной зернистости. Наряду с этим, в корковом слое встречались обширные оптически светлые очаги - поля опустошения лим-фоидными элементами. Признаки митоза не обнаруживались. Мозговой слой был разрыхлен, можно было видеть лишь единичные мелкие тельца Гассаля и ретикулярных клеток. Строма вокруг синусов и кровеносных капилляров была умеренно отечна и инфильтрирована клетками гистиоцитарного типа. Эндотелий микрососудов мозгового вещества выглядел либо резко набухшим, либо сморщенным.

Антиген М.Геппе^апБ в реакции иммунофлюоресценции на территории тимуса обнаруживался в течение всего эксперимента, начиная с 12-ых суток наблюдения. Он выявлялся в виде мелких, интенсивно флюоресцирующих гранул в строме обоих слоев органа. Типичной была локализация антигена на поверхности "сохранившихся" лимфоцитов и ретикулярных клеток. Следует отметить, что на протяжении первой недели очаги персистенции микоплазм обнаруживались, как правило, в участках дистрофии и распада клеток лимфоидного ряда в корковом слое. В последующие сроки наблюдения, начиная со второй недели, антиген М.Гепяетапз выявлялся в виде единичных гранул в основном на поверхности лимфоцитов, а также в стенках кровеносных капилляров.

В конце первой недели в тимусе инфицированных крыс прослеживалась тенденция, направленная на восстановление архитектоники органа. В этот период наблюдения четко контурировался корковый слой, который выглядел расширенным; в участках бывшего распада и опустошения вновь возникали скопления лимфоидных клеток, срезы которых весьма часто обнаруживались средние и большие лимфоциты. В последующий период наблюдения (через 3 и 6 недель после заражения) границы коркового слоя выглядели резко расширенными; заметно нарастало в нем содержание малых лимфоцитов. Ни в одном случае признаков акцидентальной инволюции обнаружить не удалось. Наоборот, данный этап развития экспериментального ми-коплазменного процесса характеризовался структурными сдвигами в корковом и мозговом веществе, что свидетельствовало в пользу развития гиперпластических процессов. Структурная перестройка кор-

кового слоя тимуса инфицированных М.Геппег^аш крыс, именно в этот период наблюдения, сопровождалась активацией реакций клеточного и гуморального иммунитета (Вульфович Ю.В. и соавт. 1985).

Как показали результаты проведенного радиоиммунного анализа, через 12 часов и на 4-ые сутки после заражения крыс М^егтегиапв имело место достоверное повышение содержания паратиреоидного гормона. Так, показатели паратиреоидина в указанные сроки наблюдения в крови составляли соответственно (24,5±1,6 пг/мл и 23,1±1,3 пг/мл).

Начиная со второй недели четко прослеживалась тенденция к нормализации, а на 3-ьей неделе после заражения уровень паратире-одного гормона не отличался от такового у контрольных животных.

При морфологическом анализе, через 12 часов, на 4-е и 7-е сутки после заражения в околощитовидных железах иаблю дался процесс "светлоклеточной" гиперплазии. Увеличение содержания светлых клеток, так же как и предыдущем случае (иммобилизационный стресс) происходило за счет достоверного понижения числа "ацидофильных" клеток. Встречались так же эпителиальные клетки с относительно крупными гипохромными пузырьковидными ядрами и вакуолизированной цитоплазмой (дегенерирующие главные клетки). Микрососуды стромы были с признаками гиперемии, повышенной проницаемости для плазменных белков. В субкапсулярных зонах наблюдался умеренный отек стромы. В относительно более поздние сроки наблюдения признаков активации секреторного аппарата околощитовидных желез не отмечалось. Повсеместно, вновь начинали доминировать темные "ацидофильные" паратиреоциты (табл. 2).

Одновременно с этим, начиная со второй недели, на фоне упорядочения структуры (компактный тип развития железы с преобладанием темных секреторных клеток) наблюдалась активация стромальных элементов, выражающаяся в пролиферации фибробла-стов, эндотелиоцитов и адвентициальных клеток. В отдельных участках ацидофильные клетки принимали сплющенную веретенообразную форму, и местами подвергались атрофии. В краевых отделах железы появлялись полости, выстланные однородным кубическим эпителием и неравномерно заполненные' гомогенной эозинофильной массой - признаки застоя секрета и формирования ретенционных кист.

2. Антигенные детерминанты кальцийрегулирующих пептидных гормонов в лимфоидных клетках.

На первом этапе эксперимента основная зад!ча заключалась в обнаружении свободного гормона (паратиреоидина) в с/иернатанте после долгосрочной культивации лимфоидных клеток||>1>; ло показано, что содержание паратиреоидного гормона в среде культивирования лимфоцитов тимуса крыс в течении инкубации возрастало. Было выдвинуто предположение, согласно которому тимоциты при культивировании выбрасывают в среду некие продукты, имеющие антигенные детерминанты аналогичные таковым у паратгормона.

Как показали результаты исследований в цитозоле тимоцитов (шмогенат клеток, лизированных Тритоном Х-100) концентрация паратиреоидного гормона составлял -1,33±0,23 нг/мл, с учетом того, что в I мл суспензии до лизирования содержалось ЗЛО тимоцитов.

Таблица 2

Морфометрический анализ секреторных клеток ОЩЖ крыс, зараженных М.Гегшеп1ап5.

секреторные клетки

Группы ————————--—--

главные переходные ацидофильные

Контроль 267,7+27,5 273,2+17,2 459,2+39,9

Через 12 часов

после заражения 513,3±44,2 325,б±29,4 161,1+18,7

1=4,7 1=1,5 1=6,7

На 4-е сутки 493,2+26,3 334,5±20,8 172,3±22,1

после заражения 1=5,9 1=2,3 1=6,2

На 7-е сутки 462,7+39,1 313,7±19,4 223,7+38

после заражения 1=4,1 1=1,5 1=4,7

На 14-е сутки 338,6+17,8 296,6+19,8 364,6+28,4

после заражения 1=2,1 1=0,8 1=1,9

Показатели радиоиммунного анализа на предмет выявления пара-тиреоиднрго гормона приведены в таблице 3.

Таблица 3

Содержание антигенных детерминант паратгормона в клетках.

лимфоидная ткань плотность клеток (г/мл) количество гормона в нг/мл

костный мозг 1,077 4,88

1,077 0,41

тимус 1,077 0,53

1,077 0,63

лимфат.узлы 1,077 0,58

1,077 ниже чувст.наб.

селезенка 1,077 0,64

1,077 ниже чувст,наб.

почки 1,077 2,39

1,077 ниже чувст.наб.

печень 1,077 1,04

1,077 ниже чувст.наб.

3. Особенности локализации антигенных детерминант парати-реоидного гормона и кальцитонина

При люминесцентно-мшсросколическом изучении свежезамороженных срезов тимуса, после их последовательной обработки специфическими антисыворотками против паратиреоидного гормона и кальцитонина, четко контурировалась граница между слоями. Спе-цифическоесвечение носило диффузный характер и обнаруживалось преимущественно в клетках лимфоидного ряда коркового слоя. Как правило, в малых и средних лимфоцитах отмечалась интенсивная гомогенная флюоресценция по-всему периметру клетки, при этом ядра почти не контурировались. Выявлялись такие малые лимфоциты

с характерным циркулярным мелкогранулярным и гомогенным свечением только на поверхности клетки.

Интенсивное специфическое свечение было обнаружено и в отдельных клетках мозгового слоя вилочковой железы, которые при последующей их окраске пиронином по Браше были отнесены к эпителиоидным элементам. Следует отметить, что люминесценция возникала не во веек клетках указанного типа, а именно в тех эпите-лиоидных клетках, которые обнаруживались в непосредственной близости от капсулы.

В обнаруженных единичных тельцах Гассаля флюоресценция отсутствовала.

В лимфатических узлах, которые были подвергнуты иммунофлю-оресцентному анализу также четко контурировались отдельные слои и зоны в силу того обстоятельства, что специфическая флюоресценция наблюдалась преимущественно в кортикальном слое и паракор-тикальной зоне на всем их протяжении. Наличие меченных антител, реагирующих сС-концом паратиреоидного гормона было обнаружено как на поверхности, так и в цитоплазме клеток лимфоидного ряда: малых и средних лимфоцитов.

В отличии от тимоцитов, в лимфоцитах коркового слоя и паракор-тикальной зоны лимфатических узлов и красной пульпы селезенки свечение было менее интенсивным и носило исключительно мелкогранулярный характер. В указанных клетках флюоресцирующая метка обнаруживалась, в основном, интрацеллюлярно в виде циркулярной перинуклеарной каемки; ядра четко контурировались.

В центральных отделах фолликулов (реактивные центры) селезенки и лимфатических узлов флюоресценция отсутствовала. Специфическое свечение в фолликулах выявилось лишь на их периферии, в так называемых Т-зависимых зонах. Положительная реакция им-мунофлюоресценции, в виде интрацеллюлярного гомогенного свечения, была зарегистрирована и в цитоплазме отдельных эндотелиоцитов кровеносных и лимфатических микрососудов. В мозговом слое, помимо эндотелиоцитов и малых лимфоцитов специфическим мелкогранулезным и гомогенным свечением обладали также клетки макрофагального типа.

В печени, также как и в органах иммуногенеза, удалось обнаружить присутствие антигенной детерминанты к С-концу паратиреоидного гормона, которая характеризовалась очаговой флюоресценцией

гепатоцитов отдельных долек. Свечение выявилось в цитоплазме и на поверхности гепатоцитов, локализованных в непосредственной близости от центральных вен. В периферических отделах долек очаги специфической флюоресценции отсутствовали. Свечение удалось обнаружить также и в цитоплазме большинства береговых клеток межбалочных синусов и отдельных малых лимфоцитов.

В отличие от печени, в почках присутствие антигенной детерминанты обнаружено в корковом слое повсеместно. Несмотря на диффузный характер распространения метки, интенсивность специфического свечения сильно уступала таковой в печени и органах иммуногенеза. Люминесценция выявилась исключительно в ка-нальцевом аппарате и стенках микрососудов стромы. Свечением обладали все отделы канальцевого аппарата: оно носило мелкогранулярный и гомогенный характер и обнаруживалось как в цитоплазме, так и на поверхности канальцевого эпителия проксимальных и дис-тальных отделов.

4. Характеристика экстрактов околощитовидных желез.

Нашей задачей явилось изучение не связанных с паратиреоидпо-добной активностью белков, поэтому мы применяли более щадящие методы получения и очистки гомогената, чем это описано в литературе. Вследствие этого профиль элюции, полученный нами после гельильтрации на сефадексе G-100 fine (колонка размером 85x2, элюирующий буфер - 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,2 М NaCl pH 7,4, скорость элюции 30 мл/час, несколько отличается от описанного в литературе (Auerbach G.D. and Potts, 1964).

Нами получено 7 белковых пиков. Наибольшее количество пара-териоидного гормона - 46,5% от общего содержания гормона - содержалось в первых двух пиках (фракции 11-15). Четвертый пик (фракции 27-31) содержал в два раза меньше гормона - 25,5% от общего содержания гормона, а третий пик (фракции 19-21) -7,8% от общего содержания ПТГ. В шестом пике (фракции 57-58) содержание гормона было незначительным - 0,56 мг/мл. (рис. 1)

Кальцитонин содержался во всех фракциях. Наибольшее его количество выходило в пятом пике, а наименьшее - в третьем пике. Однако, количество кальцитонина было на два порядка меньше, кем ПТГ.

I

I

Л

А!

'I

I."

и

г-

I

V

I Ог\

I?

и I

I

| А

'•Ы

и

1:1-:'

\

1

■в

Рисунок 1. Профиль элюции экстракта околощитовидных желез на колонке с гелем сефадекс в-100. Размер колонки - 100 х 1,6 см; Скорость элю при - 36 мл/час;

Элюирующй раствор - 0,01 М фосфатный буфер с 0,2 М МаС1. а - концентрация белка в элюенте. Ь - концентрация паратиреоидного гормона, с - концентрация кальцитонина.

Применение геля ТО YO PEARL HW-55 фирмы SODA (Япония), обладающего той же пропускной способностью, что и сефадекс G-100, дало нам возможность не только получать лучшее разрешение при фракционировании экстракта ОЩЖ, но и получать фракции экстракта, свободные от присутствия вышеупомянутых гормонов. Элюцию проводили 0,01 М фосфатным буфером, содержащим 0,2 М NaCl, pH 7,4, скорость элюции 30 мл/час. Фракционирование дает 4 четко отделенных друг от друга пика. Определение кальцитонина проводили при помощи наборов фирмы Byg Mallinckrodt, а ПТГ -наборов фирмы Sorin, которые дают слабый перекрест с бычьей сывороткой, поэтому общее количество ПТГ по сравнению с предыдущим исследованием было ниже. В первом пике (фракции 15-20) содержалось около 12% всего Г1ТГ, третий и четвертый пики были свободны от присутствия гормона, и наибольшее количество ПТГ содержалось в четвертом пике (фракции 40-44) - 86,5"% от общего количества гормона. Кальцитонин содержался во всех фракциях. Наименьшее его количество содержалось в первой фракции - 5% от общего содержания гормона. Наибольшее количество кальцитонина содержалось во втором и третьем пиках - 25,8% и 67,4% соответственно. В четвертом пике содержание гормона было незначительным - 0,74 % от общего содержания кальцитонина (рис.2).

Присутствие паратиреоидного гормона и кальцитонина в небольших количествах почти во всех пиках можно объяснить высокой агрегационной способностью этих гормонов, а также наличием в экстракте фрагментов ПТГ, имеющих антигенную детерминанту 6484 (Brown Е.М., 1982), которая определяется используемыми наборами.

5. Влияние фракций экстрктов околощитовидных желез на синтез ДНК в иммунокомпетентных клеток.

В качестве модулирующих агентов использовали фракции фосфатного экстракта ОЩЖ, полученного после гель-фильтрации с использованием гелей ТОУО-РЕАЯЬ.

Рисунок 2. Профиль злющи) экстракта околощитовидных желез на колонке с гелем Т0\'0-РЕЛЙЬ Н\У-55. Размер колонки -100 х 1,6 см; скорость элюцли - 36 мл/час; элюирующй расг,:ор - 0,01 М фосфатный буфер с 0,2 М МаС1. а - концентрация белка в элюенте. б - концентрация паратиреоидного гормона, в- концентрация кальцитонина.

Начиная с 17-ой фракции и до 27-ой наблюдалась стимуляция включения меченного тимидина в ДНК, причем наиболее активной оказалась фракция - 23-я (стимуляция в 2,4 раза по сравнению с контрольным уровнем). Фракции 30-31 не обладали модулирующим действием на синтез ДНК. 34 - 40 фракции подавляли синтез ДНК в 1,5 раза, фракции 44-47 - в 3,5 раза (рис.3).

При введении подпороговой дозы конканавалина А (0,08 мг/мл или 0,004 мг на. лунку) в среду культивирования фракции 17-21 и 24-27 практически не влияли на синтез ДНК (фракции 17-21 понижали в 1,2 раза включение меченного тимидина в ДНК, а фракции 24-27 повышали его во столько же раз). Начиная с фракций 30-31 синтез ДНК увеличивался (в 2,4 раза), фракции 39-40 увеличивали включение меченного тимидина в ДНК в 8,5 раз, а фракции 39-40 -в 21 раз. Затем, уровень включения тимидина резко падал: фракции 44-47 подавляли включение тимидина в ДНК почти в 2 раза. 50-ая фракция не изменяла уровень включения меченного тимидина в ДНК (рис.4).

6. влияние препаратов паращитовидных желез на интенсивность синтеза ДНК в лимфоидных клетках.

Экс -ерименты проводили на лимфоидных клетках человека. Их получа I не позже, чем через 2-3 часа после смерти в патанатомиче-ском отделении НИИ скорой помощи им. Склифоссофского. Стерильно забирали аортальные и легочные лимфоузлы, селезенку, тимус. Весь материар обрабатывали тут же и готовили стерильные лимф -эные суспензии, которые отмывали два раза средой 199, центрифугировали при 1200 об/мин 10 мин, затем наслаивали на градиент фиколла 1,077 г/мл и центрифугировали при комнатной температуре от 25 до 30 мин. В контрольных экспериментах в полученной фракции с плотностью меньше ! ,077 г/мл в основном обнаруживались лимфоциты (более 95%) и в небольших количествах моноциты. Полученные лимфоциты разводили до концентрации клеток - 2x10 в 1 мл и культивировали по методике, описанной в главе "Материалы и методы".

Рисунок 3. Иммуномодуляторная активность фракций ОЩЖ. Элюция экстракта ОЩЖ на колонке с гелем TOYO PEARL HW-55. Размер колонки 100 х 1,6 см,скорость элюции - 36 мл/час, элю-ирующй раствор - 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,2 М NaCl. а - кривая включения меченного тимидина в синтез ДНК. b - профиль элюции.

Рисунок 4. Характеристика иммуномодуляторной активности фракций, -полученных после гель-фильтрации на колонке с гелем TOYO PEARL.

а- активность белковых фракций

Ь-совместная активность белковых фракций и конканавалина А.

Во время получения суспензии лимфоузлов приходилось неоднократно отмывать клетки от смолистых веществ и угольной пыли, в большом количестве присутствующей в этой ткани. Отмывали клетки столько раз, чтобы первоначальный серый цвет суспензии сменился на бледно-розовый. В некоторых случаях остатки эритроцитов лизи-ровали при помощи раствора хлористого аммония с бикарбонатом калия и натриевой солью ЭДТА.

В качестве модулирующего агента использовался экстракт ПЩЖ, получаемый нами из паращитовидных желез половозрелых коров и быков.

Введение полученного нами грубого экстраркта ПЩЖ в культу-ральную среду, содержащую спленоциты в дозе 0,01 мг/мл, вызывало небольшое (в 1,4 раза) увеличение включения меченного тимидина в ДНК, увеличение дозы до 0,04 мг/мл приводило к снижению синтеза ДНК в 1,2 раза, 10-кратное увеличение первоначальной дозы вызывало снижение синтеза ДНК приблизительно в 2 раза.

В тимоцитах доза препарата 0,01 мг/мл практически не влияла на синтез ДНК, 4-кратное увеличение дозы снижало синтез в 1,5 раза, а 10-кратное - увеличивало включение меченного тимидина в 1,4 раза.

В лимфоцитах, выделенных из лимфоузлов, 0,01 мг/мл препарата не влияло на включение меченного тимидина в ДНК, а дозы 14 препарата в 0,04 и 0,1 мг/мл вызывали увеличение включения меченного тимидина в ДНК в 1,6 и 1,5 раза соответственно.

Эти данные свидетельствуют о том, что препарат обла дает имму-номодуляторной активностью и способен изменять пролифератив-ную активность лимфоцитов из различных иммунокомпетентных органов человека.

Для выявления возможности конкурирования исследуемых гормонов за митогенные рецепторы нами был использован конканавалин А.

Добавление в культуральную среду, содержащую спленоциты человека, конканавалин А в дозе 0,08 мг/мл или 0,004 мг на лунку не приводило к изменению синтеза ДНК при дозе экстракта 0,01 мг/мл. Увеличение дозы препарата в 4 раза приводило к увеличению синтеза ДНК в 1,3 раза, а 10-кратное увеличение дозы - к 2-кратному увеличению включения меченного тимидина в ДНК.

В тимусе добавление конканавалина А уменьшало включение меченного тимидина в ДНК при дозах препарата в 0,01 мг/мл и 0,04

мг/мл в 2 и 1,6 раза соответственно, а в дозе 0,1 мг/мл не влияло на синтез ДНК.

В лимфоцитах, выделенных из лимфоузлов, в присутствии конка-навалина А препарат в дозе 0,01 мг/мл снижал количество включенного радиоактивносго тимидика в ДНК в 1,4 раза. При дозах в 0,04 мг/мл и 0,1 мг/мл аналогичный показатель снижался в 1,4 и 1,7 раза соответственно.

Эти результаты позволяют предположить, что не существует конкуренции за митогенные рецепторы между грубым экстрактом и кон-канавалином А в лимфоцитах из всех трех исследуемых органов.

Известно, что кофеин потенцирует действие гормонов, оказывающих свое воздействие опосредованно через активацию цАМФ (Robinson G.F. et.al 1968). Было показано, что паратериоидный гормон стимулирует пролиферацию лимфоцитов, причем кофеин потенцирует его действие (F.Witfield et.al 1970). Для проверки возможности действия исследуемых гормонов через циклазную систему нами был использован кофеин в концентрации 0,3 мМ/мл.

Добавление кофеина в культуральную жидкость, содержащую спленоциты практически не вызывало изменений в синтезе ДНК при тестировке препаратов ОЩЖ.

В тимоцитах введение кофеина приводило к уменьшению включения меченного тимидина в ДНК во всех трех дозах: в дозе 0,01 мг/мл - в 2 раза, в дозе 0,04 мг/мл и 0,1 мг/мл - приблизительно в 1,7 раза .

Добавление кофеина в культуральную среду, содержащую лимфоциты из лимфоузлов увеличивало синтез ДНК в 2 раза при дозе 0,01 мг/мл, в 2,4 раза при дозе 0,04 мг/мл и в 1,2 раза при дозе 0,1 мг/мл.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что изучаемый нами препарат не обладает ярко выраженной модулирущей активностью по отношению к синтезу ДНК в лимфоидных клетках тимуса, селезнки и лимфатических узлов человека.

В последующей серии эксперименитов нами была изучена активность паратиреоидной субстанции (Sigma, USA, Cat.n Р4410) и пара-тиреоидина (Московский эндокринный завод).

В таблице 4 показано влияние паратиреоидной субстанции на интенсивность синтеза ДНК в тимических лимфоцитах крыс линии Август при воздейсгвии субоптимальных доз конканавалина А.

Таблица 4

Влияние паратиреоидной субстанции на интенсивность синтеза ДНК в тимических лимфоцитах крыс линии Август.

ПТГ Кон А V ПТГ+ Кон А

контроль 409+62 8900+290 -

1,2 ЕД/мл • 373±95 - 48641±13576

0,12 ЕД/мл 234+23 - 19410+1638

0,012 ЕД/мл 253+11 - 7106+1180

0,0012 ЕД/мл 315+111 - 4398+173

Как видно из полученнных результатов, ПТГ (патариреоидный гормон) обладает мощным потенцирующим действием по отношению к митогенному эффекту конканавалина А.

При изучении селезеночных клеток было показано (табл.5), что помимо потенцирующиего действие ПТГ обладает также и самостоятельным митогенным воздействием.

Таблица 5

Влияние паратиреоидной субстанции на интенсивность синтеза ДНК в селезеночных лимфоцитах крыс линии Август.

- ПТГ . Кон А ПТГ+КонА

контроль . 979+259 43053±2216 -

1,2 ЕД/мл 26074Ц606 - 168880±16888

0,12 ЕД/мл 4879±435 - 107165+17302

0,012 ЕД/мл 1554151 - 59911+5749

0,0012 ЕД/мл 1292+431 - 6560Ц7606

Аналогичным, но более слабым действием обладал препарат Московского эндокринного завода "паратиреоидин".

Таким образом, нам удалось показать мощное стимулирующее действие продуктов паращитовидной железы на синтетические процессы, вызываемые митогенной стимуляцией. По отношению к селезеночным клеткам изучаемые, препараты обладали также и самостоятельными митогенными потенциями.

7. Возможные пути развития кальцийрегулирующей и иммунной систем в процессе эволюции.

Предложена гипотеза о многоэтапном развитии системы, обеспечивающей внутриклеточный кальциевый гомеостаз в процессе эволюции.

Сделано, предположение о том, что резкое повышение Са++ в мировом океане могло быть важным фактором, требующим реконструкции флоры и фауны. На основании анализа имеющихся данных выдвинуты для доказательства следующие положения: •

1) Экстремальные условия приводят к образованию многоклеточных организмов (адаптация путем пролиферации).

2) Межклеточный прямой обмен является адаптивным механизмом для изменения ионного состава во внеклеточной среде.

3) Изменение внеклеточной концентрации Са++ является фактором, требующим адаптации путем создания многоклеточных организмов с межклеточными многофункциональными контактами.

На основании анализа процессов жизнедеятельности Вк1уоз1е1шт (одноклеточные амебы), почвенных микобактерий, морских губок, а также развития и функционирования эмбрионов млекопитающих показано, что внеклеточная концентрация Са++ является критическим фактором не только для примитивных многоклеточных, но и для высших животных.

Создание внутреннего стабильного ионного гомеостаза подразумевало эволюционное развитие ионных контактов между клетками. Появились клетки, способные уничтожать те единицы клеточного содружества,, которые не способны поддерживать ионное взаимодействие. Видимо они и стали прародителями иммунных клеток.

Исходя из наших представлений о развитии многоклеточных сделано предположение о том, что появление иммунной системы в процессе эволюции было вызвано необходимостью элиминации несовместимых для создания ионных контактов клеток. Механизм элиминации развился из механизма создания межклеточных контактов для обмена ионами и малыми молекулами. Возникла следующая растянутая во времени цепь событий:

изменение ионного баланса во внешней среде

адаптивная пролиферация клеток

появление клеточных клонов

___

селекция ионно сопряженных клеточных клонов

В "суперсемейство" иммуноглобулинов входит множество разнообразных белков, включая Т-клеточные рецепторы, антигены главного локуса гистосовместимости, ассоциированные с бетта-2-микроглообулином антигены, Т-маркеры (CD2, CD4, CD8), ассоциированные с мозговой тканью лимфоидные антигены, рецепторы к иммуноглобулинам, ассоциированные с нейронами антигены, рецепторы к гормону роста, вырабатываемому тромбоцитами фактору роста и др. (Barclay A. N., е.а., 1988; Lai е.а., 1987; Coussens е.а., 1986; McCughane.a., 1987а; I987bi Gold е.а., 1987 а; 1987 b). Все они имеют характерные особенности:

1. Иммуноглобулины или иммуноглобулин несущие домены не проявляют энзиматической активности.

2. Большинство из известных структур находятся на поверхности клеточных мембран.

3. Известные функции большинства молекул заключаются в связывании с другими молекулами (Barclay A.N., е.а., 1988).

Можно предположить, что эти белки являются производными структур межклеточных контактов (GJ). Видимо, механизмы активации иммунокомпетентных клеток развились из механизмов образования GJ. Наиболее вероятной кандидатурой на роль МНС-рестриктатора является структура GJ, которая в случае неполноценного соединения приводит к активации иммунокомпетентных клеток.

Достаточно строго было показано, что активация Т-клеток в то же самое время является модуляцией Са-Н- транспорта. Только в началь-

ной фазе активации Т-клеточные рецепторы опосредуют повышение Са++ за счет реализации его из внутриклеточного депо. Антигенной активация должна приводить к активации транспортеров Са++ или открывать кальциевые каналы в плазматической мембране (Weiss, 1986). Показано существование Ca каналов, отличных от потенциал-зависимых Са-н-каналов (Kuno е.а., 1986; Imboden, 1988).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования позволили выявить ряд неизвестных фактов, указывающих на существование тесных взаимосвязей между кальцийрегулирующей и иммунной системами. Было показано, что секреты паращитовидных желез, и в том числе паратиреоид-ный гормон, обладают способностью изменять митотическую активность клеток селезенки и тимуса как у крыс, так и у мышей. При этом основные эффекты, видимо, осуществляются не только через аденилатциклазную систему (поскольку при добавлении в культу-ральную среду известного стимулятора аденилатциклазы - кофеина, не происходило стимулирования эффекта препаратов околощитовидных желез).

Удалось также обнаружить чрезвычайно интересный феномен существования в лимфоидных клетках антигенных детерминант пептидных кальцийрегулирующих гормонов. Было показано, что в клетках из различных лимфоидных органов (тимуса, селезенки) радиоиммунологическим методом удается обнару жить антигенные детерминанты как кальцитонина, так и паратиреоидного гормона. Более того, при разделении клеточных взвесей из этих органов на субфракции с плотностью больше или меньше 1,077 г/мл основное содержание гормонов определялось в лимфоцитарной популяции. Проведенный иммуноморфологический анализ подтвердил наличие антигенных детерминант С-конца паратгормона в лимфоидных клетках из различных органов.

Полученные результаты указывают не только на существование взаимосвязи между гормональной системой, обеспечивающей кальциевый гомеостаз, и иммунокомпетентными клетками но и на воз-

можность реципрокных взаимоотношений между тимусом, лимфоид-ными клетками и паращитовидными железами.

Существование в лимфоидных элементах антигенных детерминант С-концевого участка паратиреоидного гормона в различных концентрациях говорит о возможности существования общих эволюционных предков, о чем свидетельствует также наличие высокой гомологии между "пептидом Н" из паращитовидных желез и тимиче-скнм убиквитином, а также сопряженное развитие тимуса и паращитовидных желез из одной и той же группы клеток у эмбриона. Возможно, что существование детерминант кальцийрегулирующих гормонов также указывает на важную роль участие лимфоцитов в регуляции минерального обмена. На это указывают и данные полученные М.Милку и И.Потопом, а также А.Начшка, которые выявили антагонизм между тимусными экстрактами и паратиреоидными гормонами.

Полученные нами данные указывают на несомненно важную роль гормонов паращитовидных желез в регуляции функций центрального органа иммуногенеза - -тимуса и участие лимфоцитов в такой жизненно важной функции организма, как регуляция кальциевого гомеоста-за. - ■

ВЫВОДЫ

1. Между гормональной системой, обеспечивающей гомеостаз кальция, и иммунной системой существует тесная функциональная и анатомо-физиологическая связь.

2. Существование реципрокных взаимоотношений между тимусом и паращитовидными железами подтверждается повышенной секрецией паратиреоидного гормона в условиях иммобилизационного стресса на фоне инволюции тимуса.

3. В цитозоле иммунокомп.етентных клеток из различных органов морфологически характеризуемых как малые и средние лимфоциты, имеющие плотность меньше чем 1,077 г/мл, содержаться антигенные детерминанты, аналогичные таковым у кальцирегулирующих пептидных гормонов.

4. Содержание антигенных детерминант кальцирегулирующих гормонов в цитоплазме лймфоидных клеток, полученных из тимуса, костного мозга, селезенки, лимфоузлов варирует в широких пределах, что, возможно связано с их функциональными различиями. Последние выявляются преимущественно на поверхности клеток лимфоидного ряда коркового слоя тимуса,,а в лимфатических узлах и в селезенке - в клетках лимфоцитарного ряда и гистиоцитах Т-за-висимых зон.

5. Экстракт паращитовидных желез является модулятором интенсивности синтеза ДНК и белка в спленоцитах и в тимоцитах, а синтетический аналор паратиреоидного гормона обладает выраженным иммуностимулирующим действием на тимические лимфоциты и спленоциты.

В экстрактах ОЩЖ присутствуют соединения, обладающие разнонаправленными иммуномодуляторными свойствами и отличные по своим антигенным и хроматографическим характеристикам от паратиреоидного гормона и кальцитонина.

7. В процессе эволюции происходит растянутая во времени цепь изменений в системе обеспечения гомеостаза кальция со следующей последовательностью:

а) модуляция ионного баланса в экстрацеллюлярной среде

б) адоптивная пролиферация клеток и появление первых многоклеточных (1-й этап адаптации многоклеточных)

в) появление ионно сопряженных клеточных клонов (2-й этап адаптации многоклеточлых)

г) появление механизмов (специализированных клеток), специализирующихся на элиминации единиц сообщества, не способных войти в ионную кооперацию.

8. Внеклеточная концентрация Са++ является адаптогенным фактором, индуцирующим морфофункциональные и пролиферативные изменения клеток.

9. Оптимальная концентрация внеклеточного Са++является необходимой для кооперативного функционирования клеток.

10. Изменение концентрации Са-н- в первичном океане в докембрии могло стать одним из важнейших факторов, приведших к образованию многоклеточных организмов с дальнейшей дифференцнровкой клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Саядян Х.С., Шекоян В.А., Худавердян Д.Н. Влияние гормона 1^ращитовидных желез на миграцию стволовых кроветворных клеток и их взаимодействие с Т-лимфоцитами. В кн. "Регуляция иммунного гомеостаза". Материалы докл. III Всесоюзного симпозиумаЛенинград .1982, стр 89-90.

2. Шекоян В.А., Саядян Х.С. Влияние гормона околощитовидных желез на способность Т-лимфоцитов взаимодействовать со стволовыми кроветворными клетками. В кн. "Повреждение и регуляторные процессы организма". Тезисы докладов III Всесоюзного съезда патофизиологов. Москва.; 1982, стр. 96-97.

3. Саядян Х.С., Шекоян В.А., Худавердян Д.Н. Влияние паращи-товидных желез на способность Т-лимфоцитов изменить направление дифференцировки стволовых кроветворных клеток. В кн. "Физиология и патология околощитовидных желез". Изд. "Айастан". Ереван. 1983, стр. 84-88.

4. Манько В.М., Поверенный A.M., Батырбеков A.A., Саядян Х.С.., Семина O.A., Семенец Т.Н., Хаитов P.M. Изменение направления дифференцировки стволовых клеток костного мозга при удалении Т-лимфоцитов антимозговой сывороткой. Иммунология N 4,1983, стр 32-34.

5. Х.С.Саядян, К.М.Кочарян. Изучение фракций иммуноглобулина G при экспериментальном гипопаратиреозе. В кн. Вопросы моле-кулярно-клеточной биологии (Матер, науч. конференции). Изд. АН АрмССР, Ереван 1983, стр 38. I '

6. Х.С.Саядян, В.А.Шекоян, Д.Н.Худавердян. О роли околощитовидных желез в регуляции процессов иммуногенеза. Тезисы докл. III республиканского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Ереван, 1983, стр. 101-103

7. Т.М.Ншанян, Х.С.Саядян. Метод получения длительной гипо-кальциемии в эксперименте. В кн. "Вопросы экспериментальной и клинической медицины". Ереван, 1983, стр 6-7.

8. Х.С.Саядян, Л.С.Григорян. Экспрессия рецептора к эритроцитам барана на лимфоцитах при экспериментальном гипопаратиреозе. Тезисы конференции по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии в медицине. Ереван, 1984, стр.52.

9. Зильфяя А.В., Саядян Х.С., Худавердян Д.Н. ОЩЖ и индукция толерантности при экспериментальной микоплазмен ной инфекции. Материалы всесоюзного симпозиума, посвященного 60-ти летию Тбилисского НИИВиС "Актуальные вопросы бактериофагии и прикладной иммунологии"'. Тбилиси, 1984, стр. 56-57.

10. Х.С.Саядян, Г.А.Никогосян,. Г.С.Мхнтарян, В.А.Глазачев. Взаимосвязь уровней Са-н-, К+ и №а+ и паратиреоидного гормона у крыс после удаления околощитовидных желез. Тезисы VI Закавказской конференции патофизиологов "Современные проблемы патологической физиологии". Ереван, 1985,стр. 154-155.

11. А.В.Зильфян, Х.С.Саядян. Индукция толерантности при экспериментальной микоплазменой инфекции. Журнал экспериментальной и клинической медицины. 1985,N 3, стр. 220-226.

12. Х.С.Саядян, Р.А.Саакян. Действие препаратов, полученных из околощитовидных желез на тимоциты крыс. Тезисы докладов II ^'oн-ференции по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии в медицине. Ереван, 1986, стр. 54.

13. Х.С.Саядян. Иммуномодуляторное действие препаратов, полученных из околощитовидных желез. Тезисы IV всесоюзного симпозиума "Регуляция иммунного гомеостаза", Ленинград, 1986, стр. 63-64.

14. А.В.Зильфян, Д.Н.Худавердян, Х.С.Саядян. Процессы антите-логенеза при недостаточности функции околощитовидных желез. Там же, стр. 40-41.

15. Манько В.М., Саядян Х.С., Геворкян М.И. Субпопуляции Т-лимфоцитов, контролирующих дифференцировку сгволовых кроветворных клеток ¡.Характеристика Т-лимфоцитов, ингибирующих феномен гибридной резисгентности. Журнал экспериментальной и клинической медицины, N 4, 1984, стр. 331-335.

16. С.В.Агабабов, Х.С.Саядян, Г.Р.Габриелян, А.В.Зильфян, М.С.Клтчян, Г.С.Мхнтарян. Изучение кальшшрегулируюшей системы при ревматоидном артрите. Журнал экспериментальной и клинической медицины, N 6, 1987,стр. 573-577.

17. Л.Г.Горина, А.В.Зильфян. Х.С.Саядян, С.Л.Гончарова, А.В.Вартанян. Цитотоксическое действие отдельных компонентов мембран М.аггЬп'^сНз и М.Гегтепгапз на лимфоциты крыс. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1988, N 2, стр. 82-87.

18. Х.С.Саядян. Влияние кальцийрегулирующих гормонов на сосудистый тонус. Тезисы конференции "Актуальные пробле мы профилактики, диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний". Москва, 1987, стр. 4.

19. А.А.Иванов-Смоленски, Ч.А.Безвершенко, Н.С.Филякина, М.Т.Бойко, Х.С.Саядян. Выделение и частичная очистка тимозино-подобного фактора, продуцируемого стромальными фибробластами тимуса. Журнал экспериментальной и клинической медицины, т. XXVIII, N 5, 1988, стр. 490-496.

20. СаядянХ.С., Геворкян М.И., Сааякян Р.И., Мубояджян И.В., Мнацаканян Л.К. Влияние кальций регулирующих пептидных гормонов на секрецию гемолизинов на пике первичного иммунного ответа. Журнал экспериментальной и клинической медицины N 6, 1988, т XXVIII, стр 604-607.

21. Р.А.Саакян, Х.С.Саядян, А.А.Чарчоглян. Хроматографиче-ское разделение экстрактов паращитовидных желез. Доклады Академии Наук Арм.ССР том LXXXVI, 1988, N 3, стр 127-131.

22. Х.С.Саядян, А.В.Зильфян, Р.А.Саякян, М.И.Геворкян, Г.Г.Геворкян. Влияние экстракта паращитовидных желез на синтез ДНК в лимфоцитах тимуса и селезенки лабораторных животных. Доклад АН Арм.ССР 1988, том LXXXVI, N4, стр 181-186.

23. Х.С. Саядян, А.В. Зильфян. Эволюция механизмов, обеспечивающих Са++ гомеостаз I. Эволюция Са-регулируюшей системы клерки. Доклад АН Арм.ССР, т 88, N4, стр 181-184.

24. Х.С.Саядян, И.Д.Мубояджян, Л.К.Мнацаканян. Влияние Са-регулирующих пептидных гормонов на секрецию гемолизинов на пике первичного иммунного ответа. Сборник трудов молодых ученных и специалистов ЕрМИ. В сборнике: Современные вопросы общей и частной патологии. Ереван, 1988, стр.46.

25. Х.С.Саядян. Эффекты эксгракта паращитовидных желез и паратиреоидного гормона в лимфоцитах мышей линии СВА в норме и при введении митогенов. Там же, стр. 47

26. Х.С.Саядян, Р.А.Саакян. Влияние экстракта паращитовидных желез на синтез ДНК в тимоцитах и спленоцитах крыс в норме и при митогенной стимуляции. Там же, стр. 48

27. Х.С.Саядя]-, А.В.Зильфян. Шейное эндокринное кольцо. Тезисы 68 отчетной научной сессии ЕрМИ. Ереван, 1989, стр. 111.

28. Saiadian Kh.S. Hormonal requalation of immuneresponce. WACIID - 1989, Nagara Furasoto, p.46.

29. А.В.Зильфян, Х.С.Саядян, В.Г.Хачатрян, М.С.ГГетросян. Гель-фильтрационная характеристика белковых продук тов жизнедеятельности лимфоцитов тимуса. Доклады АН Арм.ССР N1, 1990.

30. В.Н.Тертов, Х.С.Саядян, Р.А.Саакян, А.Н.Орехов, А.В.Зильфян. Влияние экстракта паращитовидных желез на синтез ДНК в лимфоцитах из различных иммунокомпетентных органов человека. Доклады АН Арм. ССР г XXXVII, N1, 1988.'

31. А.В.Зильфян, Х.С.Саядян, В.Г.Хачатрян, М.С.Петросян, М.И.Геворкян, С.Г.Арутюнян. Влияние продуктов жизнедеятельности лимфоцитов на некоторые структурные и функциональных показателей микро^иркуляции. Журнал экспериментальной и клинической медицины. 1989, N 4, стр.34-40.

32. Х.С.Саядян, М.И.Геворкян, С.А.Байбуртян, Л.С.Григорян, С.А. Оганесян. Влияние продуктов жизнедеятельности лимфоцитов на некоторые факторы неспецифической защиты организма. Журнал экспериментальной и клинической медицины. 1990, N 1, стр.64-66.