Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Регуляция функций нейрофильных гранулоцитов пептидами костномозгового происхождения в эксперименте

Министерство здравоохранения Российской Федерации Кубанская государственная медицинская академия

на правах рукописи

СВЕТЛИЧНАЯ Марина Анатольевна

РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕПТИДАМИ КОСТНОМОЗГОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар 1997

Работа выполнена в Кубанской государственной медицинской академии

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Нестерова И.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

1.Доктор медицинских наук, профессор Караулов A.B.

2.Доктор медицинских наук, профессор Сизякина Л.П.

Ведущая организация - Государственный научный центр, институт Иммунологии МЗ России.

Защита состоится «2£> сентября 1997 года в часов на заседании диссертационного совета К084.06.03. в Кубанской государственной медицинской академии (350063), Краснодар, ул.Седина,4)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке медицинской академии

Автореферат разослан 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Н.Г.Соболева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность темы. Недостаточность функционирования нейтрофиль-ных гранулоцитов (НГ) рассматривается как фактор риска для развития многих патологических процессов, о чем свидетельствует опыт изуче-нияНГздоровых и больных субъектов (Бережная Н.М.,1988;Нестерова И. В., 1989,1996;Sawyer Daniel.et.al., 1989).

Нарушения в системе НГ встречающиеся в виде изолированных и комбинированных повреждений наблюдаются значительно чаще, чем предполагалось ранее и оказывают негативное влияние на характер и исход различных патологических процессов (Нестерова И.В. и др.,1980,1986,1987,1992,1994,1996; Дзержинская И.И.,1982;Бережная Н.М.,1987;Тараканов B.A.,1987;Hill H.R. et.al.,1984;Benestad H.B.et.al.,1989;Parker Charles W.,1991).В связи с этим новую актуальность приобретает поиск средств, корригирующих уровень функционирования НГ.

Широкое распространение в исследовательской работе получило изучение эффективности активной иммунорегуляции модуляторами направленного действия Исследования в этой области свидетельствуют о широких возможностях таких препаратов по причине конкретной направленности их воздействия на различные звенья иммунитета (Арион В.Д., Ива-нушкин Е.Ф.1984;Самсыгина Г.А. и др.,1982; Жегулевцева A.B. и др.1984;Ефимова Н.В. и др..1986; Карлов В.А.1986;Яцык Г.В.и др.,1987;Нестерова И.В.,1992,1996;Вольф В.Е. и flp.,1992;Stoppa А.,1993).Предлагаемые на сегодня методы иммунокоррекции связаны, в основном, с восстановлением Т-клеточного и гуморального иммунитета и в гораздо меньшей степени, с нормализацией функций поврежденных ней-трофилов (Нестерова И.В.,1992,1996).

В последние годы особого внимания заслуживают иммуномодуляторы эндогенного происхождения,особенно, низкомолекулярные соединения пептидной природы., в частности, миелопептиды, как потенциальные лекарственные средства «нового поколения» (Петров Р.В. и

др.,1997).Миелопептиды были впервые обнаружены российскими иммунологами (Петров Р.В., Михайлова А.А.,1978), они обладают различными биологическими, активностями (Стрелков Л.А.. Михайлова А.А.,1987; Де-ревянченко И.Т. и,др.,1986;Запп 8.е1.а1.,1988;Петров Р.В. и др.,1990; Стрелков Л.А. и др.,1994,1995) и составляют основу отечественного иммуномоду-лятора миелопида, имеющего широкий-.спектр клинического применения. В 90-е годы были выделены индивидуальные биологически активные молекулы и определена последовательность аминокислот для 6 пептидов, входящих в состав миелопида. Первые 2 пептида были синтезированы и это позволило наиболее полно изучить их биологические активности. Ранее, при изучении влияния миелопида на функции НГ в клинике и в экспериментах была установлена возможность пептидной регуляции функционирования нейтрофильного звена (Нестерова И.В., Тараканов В.А. и др.,1992;Тараканова В.А., Нестерова И.В. и др., 1992).

В связи с изложенным, очевидна необходимость изучения влияния гекса-пегггидов миелопептид-1 (МП-1) и миелопептид-2 (МП-2) и сравнение их действия с воздействием миелопида (МП), с точки зрения поиска новых регуляторов функций клеток гранулоцитарного ряда.

цель работы: На экспериментальных моделях иммунодефицитных состояний (ИДС), оценить особенности влияния миелопида и входящих в его состав миелопептида-1 и миелопептида-2 на функции интактных и поврежденных нейтрофильных гранулоцитов циркулирующего пула.

основные задачи1.Подобрать адекватные модели ИДС по системе НГ, позволяющие иметь различные композиции комбинированных дефектов НГ для оценки действия МП, МП-1 и МП-2.

2.0ценить иммунотропные эффекты воздействия МП, МП-1 и МП-2 на функции интактных НГ и нейтрофилов при различных ИДС: при гепарин-индуцированной депрессии; при иммунодепрессии, индуцированной при помощи циклофосфамида, при острой кровопотере.

3.Оценить протективные свойства МП, МП-1,и МП-2 при экспериментальном ИДС по системе НГ. 4

4.Провести сравнительный и сопоставительный анализ влияний МП, МП-1 и МП-2 на различные нарушения функций НГ в условиях различных экспериментальных моделей ИДС.

5.Дать обоснование новым перспективным методам коррекции иммуноде-фицитных состояний по системе нейтрофильных гранулоцитов. новизна результатов Впервые обнаружены иммунотропные эффекты стимулирующего и модулирующего характера со стороны МП, МП-1 и МП-2 относительно интактных и поврежденных НГ, находящихся в циркуляции. Изучено влияние гексапептидов МП-1 и МП-2, а также миелопида, в состав которого они входят, на основные функции интактных и поврежденных в различных моделях ИДС, НГ: при гепарин-индуцированной депрессии, при ИДС, вызванном при помощи циклофосфамида.при острой крово-потере. На модели гепарин-индуцированной депрессии установлен иммуно-протективный эффект МП, МП-1 и МП-2. Обнаружена прямая зависимость силы выраженности иммунотропных эффектов и точек приложения воздействий МП, МП-1 и МП-2 от вида иммуносупрессивных воздействий.

научно-практическая значимость работы Полученные новые сведения о костномозговой регуляции нейтрофильных гранулоцитов позволяют расширить и углубить фундаментальные знания о нейтрофилах и способах регуляции их функций ,что позволит выявлять более широкий спектр иммунотропных влияний препаратов.

При проведении изучения свойств новых иммунотропных препаратов следует учитывать полученные нами данные о необходимости использования разных по этиологии моделей ИДС, о различных вариантах иммунотропных эффектов препаратов, что дает возможность к их практическому применению в клинике при ИДС по системе НГ, сопровождающихся различными по этиологии и клинике синдромами.

Результаты работы доложены на 1 Международном конгрессе по имму-

нореабилитации (Дагомыс, 1994), на Всероссийской конферен-

ции«Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммуно-

реабилитация» (Москва, 1995), на конференции «СПИД, рак и родственные

5

проблемы» в Санкт-Петербурге (1996), на Международной конференции «Иммунодиагностика и иммунотерапия»в г.Витебске (1996).

Данные о костномозговой регуляции нейтрофильных гранулоцитов используются в лекционном материале кафедры клинической иммунологии и лабораторного дела ФППВ КГМА, кафедры клинической иммунологии и аллергологии КГМА, кафедры детской хирургии КГМА. структура работы Диссертация написана на'вЯпраницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, 4 глав с изложением полученных фактов, обсуждением результатов исследования, заключения, выводов, списка и литературы и приложений. Библиография включает в себя 348 источников, из них - 236 - на русском языке. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 18 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для создания новых способов коррекции дисфункций по системе НГ были поставлены серии экспериментов in vivo. Характеристика экспериментальных исследований представлена в таблице 1

Таблица 1

Характеристика экспериментальных исследований в системе in vivo

№ Название эксперимента Вид лабораторных животных количество

1. Изучение действия МП, МП-1 и МП-2на функции нейтрофи-лов интактных животных линейные мыши П (СВАх С57ВЦ 72

2. Исследование влияния МП,МП-1 и МП-2 на функции НГ при гепарин-индуцированной депрессии линейные мыши П (СВА х С57В1,) 80

3. Изучение воздействия МП, МП-1 и МП-2 на функции НГ, поврежденных циклофосфа-мидом линейные мыши Р1 (СВА х С57ВЬ) 50

4. Действие МП, МП-1 и МП-2 на нейтрофилы животных с острой кровопотерей (СВА х С57ВЬ) 40

ИТОГО: 242

В работе был использован комплекс методов, тестирующих состояние системы НГ у человека и животных, разработанный в нашей лаборатории (Нестерова И.В. и др.,1996).

Полученные данные были подвергнуты адекватной статистической обработке с использованием методов А.М. Меркова (1970),с расчетом средних величин (М), ошибок средних величин (ш) средних квадратических отклонений (±5). Достоверность определяли с помощью критерия Стьюдента, Величины, выходящие за пределы границ ] ,58 зоны мы рассматривали как отклоняющиеся от нормальных, выходящие за нижнюю границу 25 - как проявление иммунодефицита.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Основой исследовательской работы явилось изучение действия на ней-трофильное звено миелопида и входящих в его состав гексапептидов мие-лопептид-1 и миелопептид-2.Исследуемые препараты вводились в одинаковые сроки и в одной дозе -120мкг/кг.

Впервые установлен факт существования прямой быстрореагирующей системной костномозговой регуляции НГ, находящихся в циркуляции. Так, введение миелопида уже через 60 минут приводит к значительному приросту интактных нейтрофилов здоровых животных (Р<0,001),более, чем в 2 раза активируется рецепторный аппарат НГ (Р<0,001),умеренно увеличи-. вается количество активно «работающих» НГ, повышаются функции захвата, киллинга и переваривания бактериального антигена (БАГ), в целом; значительно усиливается бактерицидность НГ. При этом препарат избирательно влияет на микробицидную систему НГ - не меняя активность кисло-родзависимых систем клеток, увеличивает содержание катионных белков (КБ) НГ(Табл.2).В свою очередь, введение миелопептида-1 интактным животным , вызывает менее выраженный прирост количества НГ; незначительно увеличивается число «работающих» НГ, умеренно, но в меньшей степени, чем под влиянием МП, повышаются процессы захвата, переваривания и киллинга БАГ.МП-1 также избирательно влияет на микробицидные системы НГ - в отличие от МП вызывает активацию оксидазных процессов, но только в покоящихся нейтрофилах, не меняя уровень КБ в интактных НГ (Р>0,05) .значительно стимулирует процессы реализации КБ

(Р<0,001 )(Табл.2).Однократное введение МП-2 приводит к наиболее выра-

7

Таблица 2. Сравнительное влияние миелопида, миелопептида-1 и миелопептида-2 на основные функции нейтрофильных гранулоцитов интактных животных___

Гру Содер Рецепторные Фагоцитарные функции Функции микробицидных систем

ппы жание функции ИВТ-тест тест реализации КБ

рЕ- пЕ- ЕАС- % ФИ И ФЧ ип ИППА сци КМ СЦИ КР

НГ РОН РОН РОН ФАГ СП ст ст/с п СП ст сп/ст

Фон 1721,47 ±129,69 778,27± 97,41 721,76± 52,96 673,61 + 58,42 64,00 ±1,20 2,65 ± 0,14 4,12 ± 0,20 1,99± 0,09 88,72± 6,47 0,06 ±0,003 0,16 ±0,014 1,28 ± ' 0,53 0,12 ± 0,01 0,15 ±0,0 1 0,69 ±0,17

МП 3244,32 ±401,11 * 1743,71 ±260,68 1688,6± 235,5* 1348,7 ±158,8 * 76,93 ±1,94 * 3,85 ±* 0,16 4,63 ± 0,19 2,97± 0,15* 194,14 ± 18,73* 0,06± 0,02 0,17+ 0,02 1,33 ± 0,71 0,21 ±* 0,01 0,17 ±0,0 2 1,81± 0,48*

МП-1 2540,69 ±219,04 * 854,70± 154,68 942,81± 160,4 747,41± 142,6 75,51 ±2,12 3,69 ±* 0,22 4,71 ± 0,19 2,82± 0,10* 138,09 ± 17,57 0,17± 0,01* 0,12± 0,02 . 0,90 ± 0,64 0,14 ± 0,02 0,04 ±0,0 6* 4,49+ 0,89*

МП- 2 3380,06 ±388,35 * 699,17± 93,18 588,38± 93,97 639,53± 103,5 75,65 ±2,68 * 3,77 ± * 0,30 4,90 ± 0,30 2,78± 0,21* 179,39 ± 24,40* 0,14± 0,01* 0,30± 0,02* 4,88 ±* 1,11 0,11 ± 0,03 0,14 ±0,0 2 0,91± 0,35

Условные обозначения : * - различия достоверны по сравнению с фоновым контролем.

женному количественному приросту НГ (Р<0,001). Данный гексапептид в отличие от МП, но также как МП-I, не влияет на экспрессию исследуемых рецепторов поверхностной цитоплазматической мембраны НГ, имеет сходные с МП и МП-1 эффекты влияний на фагоцитарную функцию НГ, отлично от МП и МП-1 воздействует на микробицидные системы интактных НГ: введение препарата не влияет на систему КБ, в то же время проявляется самый значительный эффект относительно кислородзависимых микробицид-ных систем : значительно повышается активность не только покоящихся, но и стимулированных в нагрузочных тестах in vitro НГ (Табл.2).

В успешном решении вопросов, связанных с диагностикой и эффективностью иммунокорригирующей терапии, большая роль отводится правильно подобранным экспериментальным моделям.

Устойчивое и длительное повреждение функционирования нейтрофиль-ного звена было получено при трехкратном (через каждые 24 часа) введении циклофосфамида (ЦФ) в дозе 60 мг/кг (Нестерова И.В. и др.,1996). Оно проявилось в количественной депрессии - нейтропении, резкой депрессии ре-цепторного аппарата НГ, в недостаточности количества активно фагоцитирующих нейтрофилов, в подавлении процессов захвата и переваривания БАГ, в угнетении кислородзависимых микробицидных систем НГ, извращении ответа в функциональных нагрузочных тестах in vitro (Рис. 1).

Говоря о механизмах действия циклофосфамида, следует отметить, что ЦФ - алкилирующее соединение, его супрессивное действие реализуется непосредственно в НГ, где препарат распадается под влиянием фосфатаз с образованием активных метаболитов, обладающих алкилирующими свойствами, что ведет к денатурации ДНК (Кисляк М.С., 1972), повреждению клеточных мембран, нарушению функционирования и преждевременной гибели НГ. Наблюдаемая депрессия количества НГ и их основных функций вызвана повреждением ЦФ пула циркулирующих в периферической крови НГ. При этом эффект депрессии усиливается за счет новых инъекций препарата и накопления продуктов его метаболизма. Возможно было бы предположить, что трехкратное введение препарата направлено на

9

Введение гепарина

Рисунок!

Фоновый контроль

МОДЕЛИ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ

ип

НВТсп ИППА

сци

Введение циклофосфамида

Фоновый контроль

ЕАС-РОН %ФАГ ФИИ

ИВТст СЦИ КВТсп СЦИ

ип

ИППА

пЕ-РОН рЕ-РОН

Острая кровопотеря

костномозговые предшественники НГ, что объясняет стойкую депрессию и глубокие повреждения глубокие повреждения всех изучаемых свойств НГ.

Миелопид, введенный в дозе 120 мкг/кг через час после последней инъекции ЦФ, спустя 60 минут проявляет иммуномодулирующие • эффекты,восстанавливая частично или полностью поврежденные функции НГ: наблюдается достоверный выход из нейтропении (Р<0,001), восстановление поврежденной рецепторной и фагоцитарной функции, восстановление с превышением фоновых значений кислородного метаболизма в покоящихся и активированных НГ, интенсификация мобилизационных процессов в клетках-коэффициент мобилизации (КМ) с 0 - в группе с введением ЦФ достигает 2,17+0,51 против фона - 1,10± 0,21 (Р<0,001)(Табл.З). МП-1, также как и МП-2 не восстанавливает количество НГ, в меньшей степени, чем МП, проявляет модулирующую активность в отношении рецепторного аппарата, аналогично МП полностью восстанавливает фагоцитарную функцию и оказывает более значительное, чем МП и МП-2 положительное влияние на кислородзависимые микробицидные системы НГ(Табл.З). МП-2 в отличие от МП не приводит к восстановлению количества НГ и экспрессии рецепторов к эритроцитам барана(ЭБ), но демонстрирует более выраженное по некоторым параметрам (процессы захвата БАГ) влияние, на фагоцитарную функцию и менее выражено, чем МП-1, а по некоторым параметрам - МП, воздействие на активность кислородзависимых микробицид-ных систем НГ (Табл.3).

Можно предположить, что при повреждении НГ циклофосфамйдом, восстановление количества НГ под влиянием МП происходит не за счет гекса-пептидов МП-1 и МП-2 ; восстановление работы рецепторного аппарата обусловлено частично за счет МП-1, иммуномодулирующие эффекты МП относительно фагоцитарной функции обеспечивают МП-1 и МП-2, а относительно кислородзависимых микробицидных систем - МП-1 и МП-2, но в большей степени - МП-1.

Острая кровопотеря (ОК), вызванная взятием у животных 0,5 мл крови из ретро орбитального синуса (Ñecas Е., Nenwirt Т.,1970), через 24 часа

Таблица 3.Воздействие МП, МП-1 и МП-2 на поврежденные и не поврежденные функции НГ при ___циклофосфамид-индуцированной депрессии _

Группы Содержа ние НГ Рецепторные функции Фагоцитарные функции Функции кислородзависимых микробицидных систем МЗТ-тест

рЕ-РОН пЕ-РОН %Ф АГ ФИ И ФЧ %П И п ипп А СЦИ % ФПК К м

СП ст СП ст

введение циклофос фамида(ЦФ) 42 ¿3 4-3,4 4, 1,3 1,7 1 1,3 Ф 1,7 4-2,3 4- 3 42 4-до 0 4-1,6 4- до 0

введение МП на фоне ЦФ (+) N (+) N N N Ф N N Т 2,1 Т 1,2 Т2 N Т 1,9

введение МП1 на фоне ЦФ (-) (+) (+) N N N Ф N (-) Т 3,5 Т 1,8 Т 4,7 1* 1,7 Ф 1,5

введение МПйна фоне ЦФ (-) (-) (-) N Т 1,3 Т 1,2 Ф Т 1,2 (-) Т 2,5 (+) Т2,8 (-) (-)

Условные обозначения: Т- повышение по сравнению с фоновым контролем; 4- - понижение по сравнению с фоном; Ф - сохранение функциональной активности на уровне фоновых значений; N - восстановление сниженного показателя до уровня фона; (-) - отсутствует восстановление поврежденных функций; (+) -достоверное восстановление поврежденных функций НГ без достижения фоновых значений

влияет на функции НГ иначе, чем выше описанное НДС. Механизмы повреждающего действия острой кровопотери на систему НГ, связанные с острой гипоксией, ведут, в конечном итоге, к избирательному депрессиро-ванию фагоцитарной функции НГ и выражаются в количественном дефиците фагоцитирующих клеток, нарушениях процессов захвата, киллинга и переваривания БАГ, одновременно резко снижается содержание одного из компонентов микробицидной системы НГ - катионных белков, нарушаются процессы реализации КБ в нагрузочном тесте in vitro (Рис.1).

Так как для реализации эффекторного потенциала нейтрофильных гра-нулоцитов необходимы ферменты азурофильных и специфических гранул НГ (Нагоев Б.С., 1982), повреждение интралейкоцитарной микробицидной системы сказывается на процессах фагоцитоза (Ухаль М.И. и др., 1981). Резкое снижение содержания КБ нейтрофилов свидетельствует о напряженности защитных механизмов организма и, в свою очередь, влечет за собой угнетение фагоцитарной функции нейтрофилов.

Введение миелопида животным через 24 часа после острой кровопотери в . дозе 120 мкг/кг приводит к восстановлению с превышением фоновых значений количества «работающих» НГ с 48,12±1,72 (ОК) до 74,83±2,12 (МП) против фона - 64,75±2,12 (Р1 <0,001 ;Р2<0,001), к нормализации процессов захвата, киллинга и переваривания БАГ. Под влиянием МП происходит достоверное увеличение содержания КБ в покоящихся НГ, полное восстановление депрессированных процессов реализации КБ (Р<0,001)(Табл.4). МП-1, введенный животным с острой кровопотерей восстанавливает до нормы только количество «работающих» НГ - %ФАГ в этом случае составил 64,30± 2,65 ,и их бактерицидный потенциал. Данный гексапептид проявляет сходные с МП эффекты позитивных влияний на микробицидные системы НГ, но не столь значительные, как при введении миелопида(Табл.4). МП-2, в свою очередь, проявляет как позитивные, так и негативные влияния на функциональную активность НГ. Препарат оказывает выраженное супрессивное влияние на розеткообразующую функцию НГ, экспрессию комплементарных рецепторов, практически не влияет на депрессированную фаго-

13

Таблица 4.Влияние МП, МП-1 и МП-2 на поврежденные и неповрежденные функции НГ у животных с ___ острой кровопотерей__

Груп Соде Р Рецепторные функции Фагоцитарные функции Тест реализации КБ

пы жани е рЕ- пЕ- ЕАС- % сци

НГ РОН РОН РОН ФАГ ФИ И ФЧ %п ип ипп А СП ст К м

острая кровопот еря (ОК) Ф Ф ф Ф 4-1,3 1,6 4-1,2 4 1,2 42 4-1,4 4-24 42 4 6,1

введение МП на фоне ОК Ф Ф ф Ф Т1,1 N N 4-1,2 N N (+) N N

введение МП-1 на фоне ОК Ф Ф ф Ф N (-) (-) 4-1,4 (-) N (+) N (+)

введение МП-2 на фоне ОК Ф Ф 4-1,6 4-1,8 (-) (-) (-) 4-1,2 (-) (-) N (+) т 2,9

Условные обозначения : Т- повышение по сравнению с фоном; 4 - понижение по сравнению с фоном; Ф -сохранение функциональной активности на уровне фоновых значений;Ы- восстановление сниженного показателя до уровня фона;(-) - отсутствует восстановление поврежденных функций ; (+) -достоверное восстановление поврежденных функций НГ без достижения фоновых значений

цитарную функцию НГ, проявляя, при этом, выраженные позитивные влияния на КБ НГ. МП-2. полностью восстанавливает содержание КБ в покоящихся клетках, достоверно повышает - в активированных НГ и не только восстанавливает, но и активирует процессы реализации КБ - коэффициент реализации (КР) КБ при введении МП-2 составляет 2,06±0,53 при 0,01±0,01 в группе с острой кровопотерей и 0,69±0,53 - в фоновом контроле (Р1<0,001; Р2<0,001).

Таким образом, действие миелопида на депрессированную при острой кровопотере систему НГ, неоднозначно. С одной стороны, МП не проявляет стимулирующих влияний на количество НГ и рецепторный аппарат клеток, обнаруживаемый на интактных НГ. Это явление связано, по-видимому, с повреждением клеток на фоне острой гипоксии. С другой стороны, МП проявляет эффекты иммуномодулятора относительно депрессированной фагоцитарной и микробицидной функций. По всей видимости, восстановление активности микробицидных систем КБ происходит за счет МП-1 и, особенно, МП-2. Восстановительные эффекты МП относительно поврежденной фагоцитарной функции на фоне острой кровопотери происходят за счет неизвестных пептидных фрагментов, возможно, иммуноактивных по эритропоэтину.

Для создания НДС по системе НГ была использована гепарин-индуцированная депрессия (Колесникова Н.В. и соавт., 1992). Исследованиями показано, что однократное введение гепарина в дозе 100 мг/кг уже через 60 минут приводит к депрессии основных функций НГ животных : ре-цепторной функции - способности к спонтанному раннему и позднему ро-зеткообразованию НГ с ЭБ и с ЕАС-комплексом (Рис.1). Выявленная депрессия рецепторной функции НГ, вероятно, обусловлена способностью гепарина взаимодействовать с наружной мембраной иммунокомпетентных клеток (Козлов В.А., и соавт.,1977), с блокадой рецепторов к ЭБ. Известно также, что снижение рецепторной функции НГ и лимфоцитов в системе in vitro при добавлении в культуральную средугепарина, связано со способностью сульфатированных гликоамингликанов связываться с ионами Са в

15

\

цитоплазме (Петрова И.В. и соавт.,1983). Достоверное угнетение функции розеткообразования при введении гепарина мышам предполагает наличие подобных механизмов гедарининдуцированной депрессии рецепторного аппарата НГ в системе in vivo. Отмечено также, что после введения гепарина наблюдается снижение количества «работающих» НГ, угнетение процессов захвата и переваривания бактериального антигена, снижение бактери-цидности НГ, наблюдается депрессия активности кислородзависимой мик-робицидной системы НГ, подавление процесса мобилизации in vitro.

При введении миелопида на фоне развившейся депрессии системы НГ, наблюдаются ярко выраженные иммуномодулирующие свойства препарата, в ряде случаев носящие характер «модуляции со стимуляцией».Введение МП через 60 минут после гепарина в дозе 120 мкг/кг привело к значительному приросту количества циркулирующих НГ с 37,50+2,16 (у фонового контроля) и 38,10±2,20 (в группе с введением гепарина) до 59,30±2,80 (Р<0,001).МП восстановил поврежденный гепарином рецепторный аппарат НГ, нормализовал с превышением фонового контроля все параметры, характеризующие фагоцитарную реакцию, продемонстрировал позитивные влияния на глубоко депрессированную кислородзависимую микробицид-ную систему НГ(Табл.5). Введение МП-1 на фоне гепарин-индуцированной депрессии продемонстрировало различные по выраженности позитивные эффекты препарата .Так, восстанавливается до уровня фона количество ранних Е-РОН (Р>0,05), восстанавливается со значительным превышением фонового контроля количество пЕ-РОН (Р>0,001), но количество ЕАС-РОН, так и остается депрессированным под влиянием гепарина. В то же время, «восстановление со стимуляцией» отмечено при анализе количества «работающих» НГ, процессов захвата и переваривания БАГ. МП-1 проявил сходные по выраженности и силе с МП, эффекты позитивных влияний на активность кислородзависимых оксидазных систем в покоящихся и активированных НГ. МП-2, в свою очередь, проявил только модулирующий эффект относительно рецепторного аппарата НГ, сходные с МП и МП-1 эффекты влияния на фагоцитарную функцию НГ, оказал позитивное влия-

16

ние на поврежденные гепарином кислородзависимые микробицидные системы НГ(Табл.5).

Иммунотропные эффекты миелопида, таким образом, обеспечиваются сочетанием позитивных влияний его фрагментов - МП-1 и МП-2 на поврежденные при сформированной гепарин-индуцированной депрессии функции НГ. В ряде случаев может идти речь о суммировании эффектов МП-1 и МП-2 - активность кислородзависимых микробицидных систем покоящихся НГ.

Чтобы оценить, имеется или не имеется возможность с помощью МП, МП-1 и МП-2 предотвратить развитие гепарин-индуцированной депрессии было произведено изучение влияния предварительного (за час до гепарина) введения изучаемых препаратов.

Выявлено, что миелопид обладает выраженным протективным эффектом - предохраняет НГ от повреждающего иммуносупрессирующего влияния гепарина. При этом в ряде случаев обнаруживается сохранение исследуемых функций в пределах фонового контроля - это относится к рецепторному аппарату, к состоянию кислородзависимых микробицидных систем покоящихся НГ, их мобилизационной способности. В отношении фагоцитарной функции НГ - количество активно «работающих» клеток, процессы захвата, киллинга и переваривания БАГ имеет место эффект стимуляции.МП-1 и МП-2, обладая протективным действием, имеют некоторые сходства и различия в проявлении протекции относительно супрессирующих эффектов ге-парина(Табл.5). Введение МП-1 не влияет, в отличие от МП-2, на количественное содержание НГ и не предотвращает негативных влияний гепарина на рецепторный аппарат, но защищает от влияния гепарина и активирует некоторые процессы, характерные для фагоцитарной функции НГ. Введение изучаемого гексапептида оказывает полный протективный эффект относительно кислородзависимых микробицидных систем в покоящихся НГ,-сохраняется на уровне фоновых значений мобилизационная способность НГ. Введение МП-2 приводит, в отличие от МП и МП-1 к приросту НГ, несмотря на последующее -введение гепарина. Препарат проявляет частичный

17

Таблица 5.Действие МП, МП-1 и МП-2 на поврежденные и неповрежденные функции нейтрофилов при

уело пре соде Рецепторные функции Фагоцитарные функции Функции кислородзависимых микробицидных систем (NBT)

ВИЯ пара ржа РЕ- пЕ- ЕАС % ФИ ФЧ %n ИП ИП СП ст км

введе ты ние НГ РО Н РО Н РО Н ФА Г и ПА сц И % ФП К сц И % ФП к

ния препа ратов Гепа рин Ф 4-2 4-1,7 42 41,3 41,4 ф Ф 41,4 4i,3 4б 4 до 0 43,2 42,8 4до 0

на МП Í2 Í2,3 N N 1X1 ti,5 ti,2 1X1 ti,6 t2,4 t3,8 t6,2 N N N

фоне МП 1 Ф N t2 44 Ti,2 ti,5 tl,3 tl,l ti,7 N t3,3 t5,3 N N N

НДС МП 2 Ф N N N 1X1 ti,2 Ф tl,l tl,3 N N t2,2 ti,4 N N

пе- МП Ф Ф Ф Ф 1X1 ti,6 ti,4 Ф ti,6 Ф t2,3 Ф и 44 Ф

ред МП 1 Ф 44 44 ф tl,3 tl,l tl,l ti,4 Ф Ф Ф U 44 Ф

ИД С МП 2 ti,4 и Ф Ф 1X1 ti,6 ti,4 Ф ti,7 ti,5 Ф Ф и 44 Ф

Условные обозначения :Т- повышение по сравнению с фоном; 4- понижение по сравнению с фоном; Ф -сохранение функциональной активности на уровне фоновых значений; П -проявление депрессии достоверно меньше, чем при введении только гепарина; 4-4- - проявления депрессии аналогичны гепарин-индуцированным;Ы -восстановление сниженного показателя до уровня фона.

протективный эффект относительно рецепторного аппарата НГ (пЕ-РОН, ЕАС-РОН).При введении МП-2 наблюдаются сходные по направленности и С1ше выраженности эффекты протективного влияния, в основном, с элементами стимуляции, на фагоцитарную функцию НГ, на кислородзависимые микробицидные системы НГ.

Таким образом, протективные, с элементами стимуляции эффекты МП относительно фагоцитарной функции НГ и активности кислородзависимых микробицидных систем НГ обеспечиваются влиянием его исследуемых фрагментов МП-1 и МП-2, проявляющих сходные эффекты воздействий. В то же время, выраженное влияние МП на рецепторный аппарат НГ только частично обеспечивается МП-2, но не МП-1; при этом не исключается и влияние неизвестных компонентов, входящих в структуру МП.

Таким образом, на основании проведенной работы можно сформулировать следующие выводы:

ВЫВОДЫ

1.Установлен факт существования прямой быстрореагирующей системной костномозговой регуляции НГ, находящихся в циркуляции.

2.Анализ полученных данных свидетельствует об адекватности использованных экспериментальных моделей(гепарин-индуцированная депрессия,циклофосфамид-индуцированная депрессия,острая кровопотеря), позволивших иметь различные композиции комбинированных дефектов в си-стемеНГ:нейтропению,повреждение рецепторного аппарата-фагоцитарной функции, с. различными проявлениями нарушений, - снижение количества активно «работающих»клеток, дефекты процессов захвата,киллинга и элиминации БАГ,разнообразные нарушения микробицидных систем,инвертированные ответы в нагрузочных тестах in vitro.

3.Синтетические аналоги фрагментов миелопида - МП-1 и МП-2 также как и сам миелопид обладают различными иммунотропными эффектами относительно поврежденной и неповрежденной системы НГ, носящими протективный, модулирующий, стимулирующий характер. 1 g

4.Направленность влияний МП, МП-1 и МП-2 распространялась на количественное содержание НГ, например, отмена нейтропении, активность ре-цепторного аппарата НГ, фагоцитарную функцию клеток: количество активно «работающих» НГ, интенсивность процессов захвата, киллинга и элиминации БАГ, активность кислородзависимых микробицидных систем и микробицидных систем катионных белков, мобилизационную способность клеток. При этом имели место различные комбинации выявляемых позитивных эффектов МП, МП-1 и МП-2.

5.Полноценное выявление всего спектра свойств МП и аналогов его синтетических фрагментов - МП-1 и МП-2 : различные и сходные точки приложения влияний, дифференцированность силы выраженности иммунотроп-ных эффектов, разнообразие композиций позитивных эффектов относительно поврежденных НГ, стало возможным при использовании нескольких моделей ИДС по системе НГ, в формировании которых задействованы разные механизмы клеточных повреждений. Показано, что сила выраженности, характер иммунотропных воздействий МП, МП-1 и МП-2, а также точки приложения их влияний относительно того или иного экспериментального дефекта или комбинации дефектов, тесным образом связаны с видом иммуносупрессирующих воздействий и следовательно, с патогенетическими механизмами, лежащими в основе формирования каждой экспериментальной модели ИДС по системе НГ.

6.Иммунорегуляторные эффекты МП, в основном, складываются из изолированных или суммарных влияний его фрагментов - МП-1 и МП-2; при этом, зависимости от времени введения пептидов (до или после формирования ИДС) и вида супрессорных влияний, композиция иммунотропных эффектов, проявляемая МП и его фрагментами, варьирует. В ряде случаев эффекты МП не воспроизводятся МП-1 и МП-2 или воспроизводятся только одним гексапептидом. Эти факты могут свидетельствовать либо о присутствии в МП ряда неизвестных компонентов, обеспечивающих эффекты, не воспроизводимые МП-1 и МП-2, либо о каскадном включении цитоки-новой регуляц.щ, например ИЛр.

7.МП-1 и МП-2 являются перспективными иммунотропными пептидами, проявившими возможности комплексных, различных по композиционному спектру и «точечным» эффектам воздействия на интактные и поврежденные в экспериментальных моделях НГ и открывают новые возможности направленной регуляции функционирования НГ в клинической практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Нестерова И.В., Слынько Л.И., Чудилова Г.А., Пехова В.А., Петросян Т.П., Рожкова Г.Г., Фомичева Е.В., Луняка А.Н., Светличная М.А. Иммунодефицита по системе нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте и клинике //Матер юбилейной научн. сессии.-1990.-с.95-97. 2.Svetlichnaya М.А., Kolesnikova N.V., Chudilova G.A., Mikhailova A.A., Fomi-cyova E.V. The effects <x-,ß- peptides on the neutrophilic granulocytes system in experiment //Abstr. of the 1 Inter. Congress of immunorehabilitation.-Dagomys.-1994.-p.343.

3.Колесникова H.B., Светличная M.A., Чудилова Г.А. Изучение влияния миелопептида-1 и миелопептида-2 в модели острой иммунодепрессии нейтрофильных" гранулоцитов //Матер, конф. молодых ученых КГМА, поев, юбилею академии,-1995.-е.321 -323.

4.Светличная М.А., Чудилова Г.А. Эффекты влияния миелопида, миелопеп-тида-1 и миелопептида-2 на рецепторную функцию нейтрофильных гранулоцитов //Тез.докл. всерос.конф.«Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация».-Москва.,1995.-с.178.

5.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Пылева Т.А., Светличная М.А., Кокова Л.Н., Зацаринная С.К., Славинский A.A. Вторичные иммунодефицитные состояния в эксперименте и клинике .'проблемы моделирования, диагностики и реабилитации //Кубанский научный медицинский вестник,-1995.-№5-6 (12-13) .-с.57-61.

6.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Светличная М.А., Чудилова Г.А. Ре-гуляторное влияние миелопида, синтетических гексапептидов MPI и МР2

на дисфункции нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте //Тез.докл. конф. «СПИД, рак и родственные проблемы».-Санкт-Петербург.-1996-с. 112.

7.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Светличная М.А., Чудилова Г.А. Влияние миелопептидов, миелопептида-1 и миелопептнща-2 на функции нейтрофильных гранулоцитов в модели острой иммунодепрессии //Тез 1 Междунар. Конф. «Иммунодиагностика и иммунотерапия».-Витебск.,1996,-с.218-219.

8.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Светличная М.А., Чудилова Г.А. Им-мунотропные эффекты миелопида и входящих в его состав гексапептидов МП-1 и МП-2 при экспериментальном ИДС по системе нейтрофильных гранулоцитов //Иммунология,-М:Медицина. 1997.-№1 .-с.37-39.