Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Разработка подходов к повышению эффективности иммунологической диагностики туберкулеза легких

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ОКТ 2013

Санкт-Петербург 2013

/

005535423

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера».

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

член-корреспондент РАМН, профессор Тотолян Арег Артемович кандидат химических наук Вербов Вячеслав Николаевич

Официальные оппоненты:

Симбирцев Андрей Семенович — доктор медицинских наук, профессор, директор Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства. Краснопрошина Людмила Ивановна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией иммунологических методов исследования Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Ведущая организация: Нижегородский государственный университет им.Н.И. Лобачевского, г. Н. Новгород.

Защита диссертации состоится « 2013 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.02 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « 'и »

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Новикова Лидия Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Туберкулез (ТБ) относят к числу социально-значимых инфекционных заболеваний. Несмотря на то, что согласно данным ФГУ «ЦНИИОИЗ Минздравсоцразвития РФ» заболеваемость ТБ на 100 ООО населения в 2012 г. снизилась до 68,1 с 73,0 в 2011 г., растет распространенность туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя, в т.ч среди ВИЧ-инфицированных.

Точная и быстрая диагностика играет ключевую роль в контроле над заболеванием (Al-Zamel F. Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2009. Vol.7, N 9. P. 1099-1108). В настоящее время в лабораторной диагностике ТБ применяют микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования. Однако каждый из них имеет свои ограничения, связанные с трудоёмкостью, длительностью, а также с невозможностью выявления Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в мокроте, в частности, при латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ). В этих случаях большое значение приобретают иммунологические методы исследования. На протяжении десятилетий с этой целью применяли кожно-аллергические пробы Манту и Пирке. Однако, с момента введения в нашей стране массовой вакцинации новорожденных авирулентным штаммом Mycobacterium bovis (М bovis) BCG в 1949 г., диагностическое значение пробы с туберкулином снизилось из-за перекрестной сенсибилизации организма вакцинным штаммом М. bovis BCG и вирулентными штаммами Mtb при инфицировании (Митинская Л.А. Новые технологии при профилактике, выявлении, диагностике и лечении туберкулеза у детей // Проблемы туберкулеза. 2003. №1. С. 19—25), а также по той причине, что в качестве антигена используют PPD (purified protein derívate) - смесь более 200 антигенов, получаемых из микобактерий-возбудителей туберкулеза человека и крупного рогатого скота (Литвинов В.И. Латентная туберкулезная инфекция -миф или реальность? // Туберкулез и болезни легких. 2011. № 6. С. 3—9). В современных условиях доля ложноположительных реакций Манту составляет от 40 % до 90% (Белушков В.В. Значение диаскинтеста и квантиферонового теста в диагностике туберкулеза у детей // Фундаментальные исследования. 2012. № 7 (часть 1). С. 34-39).

В результате полной расшифровки генома Mtb (Cole S.T. Deciphering the biology of Mycobacterium Tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. 1998. Vol.393, N 6685. P. 537-544) и M. bovis BCG были идентифицированы гены, контролирующие экспрессию белков-антигенов, используемых в недавно разработанных тестах для оценки противотуберкулёзного клеточного иммунного ответа. К их числу следует отнести кожную пробу Диаскинтест® и клеточный тест in vitro QuantiFERON®TB Gold In-Tube. Последний основан на количественном определении специфической продукции интерферона-гамма (IFNyag), индуцированной антигенами ESAT6, CFP10 и ТВ 7.7 (р4). Оба теста показали высокую специфичность выявления туберкулезного инфицирования у здоровых вакцинированных лиц, однако они не позволяют дифференцировать активный туберкулез от латентного (Pai М. Systematic review: T-cell-based assays

for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update // Ann Intern Med. 2008. Vol.149, N 3. P. 177-184). В связи с этим активно ведется поиск новых альтернативных биомаркеров и методов оценки клеточного иммунного ответа у инфицированных и больных ТБ.

Определенные успехи были достигнуты и в разработке тестов для диагностики ТБ на основе оценки гуморального иммунного ответа с использованием различных видоспецифичных антигенов Mtb. Показано, что применение индивидуальных рекомбинантных антигенов для выявления специфических антител повышает специфичность анализа, значительно уменьшая при этом его чувствительность. Для решения этой проблемы предлагается использовать не один антиген, а их комбинацию, что позволяет значительно повысить чувствительность метода при сохранении его высокой специфичности (Wu X. et al. Comparision of antibody responses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis // Clinica Chim Acta. 2010. Vol. 411, Issues 19-20. P. 1520-1528).

Таким образом, в связи с появлением новых методов оценки клеточного и гуморального иммунного ответа при ТБ легких требуется, с одной стороны, углубленное изучение их диагностической значимости, а с другой стороны, их дальнейшее совершенствование в целях повышения эффективности дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ. Цель исследования

Поиск информативных иммунологических биомаркеров и разработка алгоритма, позволяющего дифференцировать активный туберкулез легких от латентной туберкулезной инфекции. Задачи исследования:

1. Оценить информативность определения антиген-индуцированной продукции IFNy в плазме крови при туберкулезе легких у взрослых.

2. Изучить спонтанную и специфическую антиген-индуцированную продукцию EGF, MIP-lß, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-lcc, IFN-a2, TG Fa, TNFa, sIL-2Ra, sCD40L, IP-10 в плазме крови больных ТБ легких, контактных лиц и здоровых доноров.

3. Оценить эффективность использования комбинации биомаркеров активного ТБ легких при исследовании цитокинового профиля с применением технологии хМар.

4. Разработать иммуноферментную тест-систему для определения специфических антител класса IgG к рекомбинантным антигенам CBD-CFP10, CBD-ESAT6, ESAT6-CFP10, CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3 Mtb.

5. Оценить значимость определения неоптерина и специфических антител класса IgG в сыворотке крови для лабораторной диагностики ТБ легких.

6. Разработать алгоритм иммунодиагностики ТБ легких с использованием наиболее информативных биомаркеров.

Научная новизна:

- впервые разработан алгоритм дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ на основе определения комплекса специфической антиген-индуцированной продукции IL-6 и IFNy и спонтанной продукции TGFa;

- доказана эффективность определения специфической антиген-индуцированной продукции IP-10 и IL-2 в плазме крови, в качестве альтернативных цитокину IFNy, для диагностики туберкулезного инфицирования;

- разработана иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса IgG к двум антигенам Mtb - рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3, которая позволяет диагностировать активный ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии;

- впервые разработан двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ, в котором на 1 этапе выявляют туберкулезное инфицирование путем определения специфической антиген-индуцированной продукции IFNy, IP-10 и/или IL-2, а на втором этапе, для диагностики активного ТБ легких проводят количественное определение цитокинов IFNy/TGFa/IL-б, неоптерина и/или специфических антител класса IgG к рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Проведено сравнительное исследование эффективности современных иммунологических методов лабораторной диагностики ТБ легких.

Разработана иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса IgG к двум антигенам Mtb, которая позволяет диагностировать активный ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии.

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики латентной туберкулезной инфекции и активного ТБ легких. Применение разработанного алгоритма иммунологической диагностики туберкулеза позволяет повысить эффективность выявления лиц с ЛТБИ, которые являются «группой риска» по развитию данного заболевания, для диспансерного наблюдения.

Разработанный в рамках настоящего диссертационного исследования алгоритм может быть основой для проведения дальнейших валидационных исследований на различных группах пациентов. Материалы диссертации могут быть включены в учебные программы медицинских высших учебных заведений и факультетов усовершенствования врачей.

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре технологии микробиологического синтеза ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)», а именно, на практических занятиях по учебной дисциплине «Иммунобиотехнология» для магистрантов I курса, обучающихся по направлению 240700.68 — «Биотехнология».

Получено решение о выдаче двух патентов Российской Федерации на изобретения: «Способ диагностики туберкулеза легких» (заявка №2012128311, решение о выдаче патента от 25.07.2013, авторы Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А., Лядова И.В., Никитина И.Ю.) и «Способ диагностики туберкулезного инфицирования» (заявка №2012128312, решение о выдаче патента от 26.07.2013, авторы Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А., Лядова И.В., Никитина И.Ю.).

Методология и методы исследования

Диссертационная работа основана на обследовании 321 пациента с ТБ легких, 68 пациентов с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии, 47 лиц, имеющих профессиональный контакт с больными ТБ и 366 условно здоровых людей. В работе были использованы современные иммунологические и серологические методы исследования с автоматизированным учетом и оценкой результатов. В процессе работы всего было исследовано 797 образцов крови. Полученные данные подвергнуты адекватной статистической обработке.

Положения, выносимые на защиту

1. Биомаркерами, альтернативными №N7, при выявлении туберкулезного инфицирования вне зависимости от активности ТБ легких (бактериовыделения) могут служить 1Р-10 и 1Ь-2, а комбинированное определение трех цитокинов (ТвРа, 1Ь-6 и №N7), по разработанному алгоритму, позволяет дифференцировать активный ТБ легких и ЛТБИ.

2. Разработанная иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса 1§0 к двум антигенам МЛ: рекомбинантному белку СВО-Р38 и лизатному антигену РРОЮ, позволяет выявлять больных активным ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику ТБ с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии.

3. Двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ позволяет на первом этапе выявлять контингент лиц, инфицированных М1Ь, при определении специфической антиген-индуцированной продукции №N7, 1Р-10 и/или 1Ь-2, и на втором этапе проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной туберкулезной инфекции при определении комбинации ГИКу/ТОРа/ГЬ-б, специфических антител класса 1«С и/или неоптерина.

Степень достоверности и апробация результатов

Серологические и иммунологические исследования, систематизация и статистический анализ данных проведены лично автором в лаборатории биопрепаратов ФБУН «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера». Синтез рекомбинантных химерных антигенов проведен в лаборатории генной инженерии НИИ Биохимии СО РАМН. Подбор групп больных ТБ и предоставление информации, в соответствии с протоколом исследования, осуществляли врачи-фтизиатры СПбГУЗ ПТД, СПбПТД №3, ЦНИИТ РАМН, СПБ ГУЗ ГМБ № 2.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 7 в научных журналах и изданиях, которые включены в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (протокол № 6 от 29 мая 2013 года). Основные положения диссертационной работы были представлены на III научной школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011); X конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012); II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург,

2012); научно-практической конференции молодых учёных, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза взрослых и детей» (Москва, 2013); 15 международном конгрессе по иммунологии (Милан, Италия, 2013).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика больных, включенных в исследование. В соответствии с поставленной целью и задачами нами были обследованы пациенты с туберкулезом легких (п=321), проходившие стационарный этап лечения в СПб ГУЗ ПТД, в ЦНИИТ РАМН и обратившиеся в СПб ПТД №3 с целью дифференциальной диагностики с сентября 2011 по май 2012 года, в возрасте от 18 до 76 лет (54 % мужчин, 46 % женщин), средний возраст составил 38 лет (30-для мужчин и 48-для женщин), в соответствии со следующими критериями: возраст от 18 лет и старше; информированное согласие на участие в исследовании; отсутствие специфической противотуберкулезной терапии на момент взятия крови; отсутствие следующих патологических состояний: тяжелый инфекционный процесс, наличие онкологических и аутоиммунных заболеваний.

У 71 % больных имел место инфильтративный ТБ легких, у 14% - фиброзно-кавернозный ТБ. Оставшиеся 15% составили больные казеозной пневмонией, очаговым ТБ, диссеминированным ТБ и туберкулемой. У 86% больных диагноз ТБ был подтвержден микроскопией мокроты или культуральным методом (посев мокроты). 52 % составили больные впервые выявленным ТБ, оставшиеся 48 % - с хроническим ТБ процессом. Также были обследованы больные с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии (H3JI): больные саркоидозом (п=40) и пневмонией (п=28), находившиеся на лечении в СПБ ГУЗ ГМПБ № 2.

Характеристика контактных лиц и здоровых доноров. В качестве контактных лиц в исследование были включены сотрудники противотуберкулезных учреждений (KJ1) со стажем работы более 1 года (п=47), имеющие профессиональный контакт с больными ТБ, не имеющие клинических и радиографических признаков активного ТБ легких, в возрасте от 25 до 73 лет (18 % мужчин, 82 % женщин), средний возраст составил 48 лет (37,5-для мужчин и 57-для женщин). Контрольную группу составили 366 условно здоровых людей (ЗЛ). Все лица, включенные в исследование (п=797) не были инфицированы ВИЧ.

Антигены Mtb. В работе были использованы рекомбинантные химерные антигены «CBD-CFP10», «CBD-ESAT6», «ESAT6-CFP10» и «CBD-P38», полученные в лаборатории генной инженерии ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН (г. Новосибирск). Также в работе был использован природный лизатный антиген PPDN3, который представляет собой ультрафильтрат лизированных культур возбудителей туберкулеза штаммов DTST и Valee и используется в тест-системе «ИФА-анти-ТУБ», выпускаемой ОНТ ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Методика проведения теста QuantiFERONOTB Gold In-Tube (КФТ).

Данный метод основан на определении методом иммуноферментного анализа (ИФА) уровня продукции IFNy клетками периферической крови в ответ

на стимуляцию образцов крови смесью белков ESAT-6, CFP-10 и ТВ7.7 (р4). Образцы цельной периферической крови (1мл), стабилизированной гепарином (50 ед/мл), инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С в присутствии антигенов Mtb (антиген-индуцированная продукция, AG), в нулевой контрольной пробирке (отрицательный контроль, NIL) и в пробирке с митогеном (митоген-индуцированная продукция — положительный контроль, MIT). После окончания инкубации для отделения плазмы образцы центрифугировали в течение 15 мин при скорости 3500 об/мин, отбирали плазму и хранили при температуре (-20°С) до момента постановки. В день постановки ИФА образцы плазмы и реагенты доводили до комнатной температуры в течение 60 мин и выполняли тест в соответствии с протоколом производителя (Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia). Обработку результатов производили с помощью автоматизированной программы «QuantiFERON-TB Gold Analysis Software 2.62». Результаты теста считали положительными, если разность между антиген-индуцированной и спонтанной продукцией IFNy составляла более 0,35 МЕ/мл (14 пг/мл) и разность между митоген-индуцированной и спонтанной продукцией IFNy - более 0,5 МЕ/мл (20 пг/мл).

Методика проведения мультиплексного анализа. Для анализа на мультиплексном aH£LiH3aTope"MagPix" ("Millipore", США), основанном на технологии хМАР компании Luminex (США) с использованием магнитных частиц "Milliplex Mag" , была выбрана панель из 12 аналитов в составе коммерческой тест-системы MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel HCYTOMAG-60K ("Millipore", США). В исследуемую панель входили следующие цитокины: EGF, MIP-lß, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-la, IFN-a2, TGFa, TNFa, а также sIL-2Ra и sCD40L. Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя. При статистической обработке результатов значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимались за значение нижней границы в пг/мл. Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю границу чувствительности, то его концентрацию принимали равной верхней границе.

Методика определения концентрации IP-10 и неоптерииа. Содержание неоптерина (НПТ) и IP-10 определяли иммуноферментным методом с использованием набора реагентов IBL (Гамбург, Германия) и Bender Medsystems (Вена, Австрия) соответственно, согласно инструкциям производителей.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка в лизате клеток E.coîi и в растворах рекомбинантных белков определяли по методу Лоури либо флуоресцентным методом при помощи прибора и набора Qubit® (Invitrogen, USA), согласно инструкции производителя.

Методика определения IgG антител к антигенам Mtb. Для оценки диагностической значимости различных антигенов Mtb использовали модель непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа. Процедуру ИФА проводили с использованием реагентов и по инструкции, прилагаемой к тест-системе иммуноферментной для обнаружения IgG к Mtb («ИФА-анти-ТУБ»), выпускаемой ОНТ ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. Для приготовления специфических иммуносорбентов планшеты сенсибилизировали отдельными рекомбинантными белками. Сорбцию проводили

в сантимолярном карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,5) по общепринятой методике. Для истощения сывороток от антител к антигенам E.coli в раствор для разведения проб при первой инкубации вносили лизат E.coli (BL-21(DE3)), который был получен по методике, используемой в лаборатории генной инженерии ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН.

Статистический анализ. Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета программ MS Excel, SPSS (версия 13.0), Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.), JMP 9.0. Для. описания полученных результатов использовались стандартные методы непараметрической статистики. Полученные количественные данные представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартиля Me [Ql; Q3]. Для сравнения парных количественных значений использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Гипотезы рассматривались, как статистически достоверные, при р<0,05. Для выявления корреляционных связей между двумя количественными параметрами использовали непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену с указанием коэффициента корреляции R и р. Для сравнения двух различных диагностических тестов и выбора значения оптимальной точки разделения проводили анализ кривых операционной характеристики (receiver-operating-characteristic curve-ROC) и вычисляли площадь под кривой операционной характеристики (ППК). Качество диагностических маркеров оценивалось по экспертной шкале для значений ППК. Для определения риска заболевания в случае положительного (или отрицательного) результата теста рассчитывали значение отношения правдоподобия положительного результата (ОПП) и отношение правдоподобия отрицательного результата (ОПО) соответственно. С целью нахождения оптимальной комбинации биомаркеров был применен метод построения классификационных деревьев решений.

Работа выполнялась в рамках отраслевой программы ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в РФ» по научной теме «Разработка препаратов для диагностики инфекционных заболеваний».

Результаты исследований

1. Эффективность применения метода QuantiFERON®TB Gold In-Tube в диагностике туберкулеза легких.

Основной задачей являлось изучение возможностей и ограничений КФТ в диагностике ТБ легких у взрослых. Было обследовано 47 больных (БЛ) впервые выявленным туберкулезом легких до начала специфической терапии, контактные лица (п=30) и 85 условно здоровых доноров станции переливания крови ( п=85). Для суждения о целесообразности выполнения КФТ в динамике у 9 больных ТБ тест был выполнен повторно через 2 месяца после начала лечения.

Графическое представление данных и обнаруженные достоверные различия приведены на рисунке 1 А.

При диагностике ТБ могут решаться следующие задачи: 1. выявление инфицирования ((БЛ+КЛ) vs ЗЛ); 2. выявление больных ТБ (БЛ vs (КЛ+ЗЛ)); 3.

разграничение больных ТБ и лиц инфицированных без органных проявлений специфического процесса (БЛ уб КЛ).

Мы оценили возможность применения КФТ для решения каждой из этих задач. Следует отметить, что оценка чувствительности теста, в отсутствие золотого стандарта для диагностики ЛТБИ, является достаточно сложной задачей. В связи с этим, в исследовании в качестве суррогатного маркера (косвенного признака прогрессирования заболевания) мы использовали активность туберкулезного процесса (подтвержденный микробиологическим методом диагноз ТБ).

25-гО-15105-

0,35 МЕ/мп

через 2 месяца

р<0,05

А Б

Рисунок 1 — Уровень 1РЫу \с,-кп. (МЕ/мл) в группах обследованных (А), в динамике (Б)

Примечания:

1. Диапазонами показана медиана и максимальное / минимальное значение;

2. Пунктирной линией обозначено пороговое значение производителя тест-системы 0,35 МЕ/мл;

3. БЛ - больные ТБ; ЗЛ - здоровые доноры; КЛ - лица, контактные по ТБ;

4. Достоверность различий между группами рассчитывалась с применением критерия Манна-Уитни.

Данные проведенного ROC-анализа (рисунок 2) свидетельствуют о том, что КФТ наиболее информативен для диагностики туберкулезного инфицирования, о чем свидетельствуют показатели сравнения БЛ и KJI с группой ЗЛ (чувствительность 77%; специфичность 86%; ППК 0,85; ОПП 5,5; ОПО 0,27). Диагностические показатели при выявлении больных ТБ несколько ниже (чувствительность 77%; специфичность 71%; ППК 0,81; ОПП 2,66; ОПО 0,33). Специфичность теста при разграничении больных ТБ и лиц инфицированных, без органных проявлений специфического процесса, крайне мала и составляет 27% (чувствительность 75%; ППК 0,63; ОПП 1,03; ОПО 0,93).

Анализ результатов выполнения теста в динамике показал, что у 5 больных с исходно положительным результатом теста уровень IFNyag-nil снизился (р=0,002), что коррелировало с положительной динамикой рентгенологических изменений в

легких. У больных (п=4) с отрицательным результатом теста до начала лечения через 2 месяца уровень [РЫу.Ло-м1в ДВУХ случаях понизился, в двух увеличился, при этом во всех четырех случаях не достигнув порогового значения 0,35 МЕ/мл (рисунок 1Б). Ложноотрицательные результаты теста у 4 больных и отсутствие динамики при измерении содержания 1РКуА0_№ь могут быть связаны с угнетением функции клеток иммунной системы или их функциональным истощением.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования КФТ для лабораторной диагностики туберкулезного инфицирования на ранних этапах наблюдения за пациентами (чувствительность 77%, специфичность 86%) вне зависимости от бактериовыделения. Однако, тест имеет свои ограничения, связанные с тем, что его применение не позволяет разделять больных ТБ и лиц, инфицированных без органных проявлений специфического процесса (чувствительность 75%, специфичность 27 %). Положительные результаты теста (78%) у лиц, имеющих профессиональный контакт с туберкулезной инфекцией, свидетельствуют о высокой частоте инфицирования.

1-специфичность, %

О 25 50 75 100 1-специфичность, %

О 25 50 Г 5 100 1-специфичность, %

Рисунок 2 — ROC-кривые, характеризующие зависимость чувствительности и специфичности КФТ при сравнении следующих групп: А -сопоставление (БЛ+КЛ) и ЗЛ; Б — сопоставление БЛ и (ЗЛ+КЛ); В - сопоставление БЛ и КЛ.

Примечание - ППК - площадь под характеристической ROC-кривой

2. Установление информативных бномаркеров на основании изучения спонтанной и антиген-индуцнрованнон продукции EGF, MIP-ip, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-la, IFN-a2, TGFa, TNFa, sIL-2Ra, sCD40L, IP-10

Ввиду широкого распространения в нашей стране туберкулезного инфицирования, чрезвычайно актуален поиск биомаркеров, применение которых позволит проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и ЛТБИ, так как основным ограничением КФТ является то, что данный метод не позволяет оценивать активность туберкулезного процесса. Кроме того, пороговое значение концентрации IFNy, рекомендуемое производителем, достаточно низкое (0,35 МЕ/мл или 14 пг/мл) и для его количественного обнаружения требуются очень чувствительные и дорогостоящие тест-системы. Также низкое пороговое значение увеличивает количество сомнительных результатов. Так в недавней публикации (Metcalfe J.Z. Test Variability of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube Assay in

Clinical Practice // Am J Respir Crit Care Med. 2013. Vol. 187, N 2. P. 206-211), посвященной применению КФТ, было показано, что существует значительный риск ложноположительных и ложноотрицательных результатов теста.

Для поиска дополнительных молекулярных маркеров туберкулезного инфицирования и активности туберкулезного процесса нами было обследовано 54 больных впервые выявленным преимущественно инфильтративным ТБ легких (БЛ) до начала специфической противотуберкулезной терапии, 47 контактных лиц и 43 донора крови. Всем лицам, включенным в исследование (п=144), был выполнен КФТ. Помимо IFNy, с использованием мультиплексного анализа в полученных супернатантах мы определяли спонтанную и антигениндуцированную продукцию 12 цитокинов и у 48 пациентов определили содержание IP-10.

2.1. Поиск альтернативных биомаркеров для выявления туберкулезного инфицирования

В настоящее время КФТ, основанный на определении lFNyAG-NiL5 является почти единственным методом выявления туберкулезного инфицирования. Наша цель заключалась в выявлении дополнительных биомаркеров, которые также могут использоваться для решения данной клинической задачи. Для этого на первом этапе мы провели корреляционный анализ полученных результатов мультиплексного анализа определения спонтанной и антиген-индуцированной продукции 12 аналитов у 144 обследованных с результатами определения IFNy в КФТ. Наиболее высокая корреляционная связь с IFNyag-nil была отмечена для IL-2 (г=0,79; р<0,0001) и IP-10 (г=0,71; р<0,001). В группе КФТ+, по сравнению с группой КФТ-, выявлены достоверно повышенные уровни IL-2ag-nil (107,8 [36,7; 229,2] против 0,0 [0,0; 3,4] пг/мл, р<0,0001) и IP-10AG-nil (1185 [1108,0; 1795,0] против 283,0 [106,0; 855,5] пг/мл, р<0,001). Для сравнения информативности определения 1P-10ag-nil и IL-2 ag-nil были построены характеристические ROC-кривые (рисунок 3), определены оптимальные пороговые значения IL-2 и IP-10 и рассчитаны основные диагностические показатели: чувствительность и специфичность. Проведенный анализ показал, что тест с IP-10 уступает тесту с IL-2 по ППК (0,84 (ДИ 0,71-0,96) против 0,93 (0,880,97), выбранное пороговое значение 1087 пг/мл для IP-10 обеспечивает чувствительность выявления туберкулезного инфицирования 82 % (ДИ 48-98) и специфичность 81% (ДИ 65-92), в то время как тест с IL-2 при пороговом значении 36 пг/мл имеет сопоставимую чувствительность 77% (ДИ 66-86), но более высокую специфичность 97% (ДИ 91-99). При этом существенным преимуществом IP-10 является больший диапазон измеряемых концентраций по сравнению с IL-2 и IFNy и высокое пороговое значение 1087 пг/мл против 36 пг/мл (IL-2) и 14 пг/мл (0,35 ME/мл) для IFNy.

2.2. Поиск биомаркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и ЛТБИ

Следующая задача заключалась в поиске биомаркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику активного ТБ легких и ЛТБИ. Для этого мы проанализировали результаты определения спонтанной и антигениндуцированной продукции 12 аналитов у больных активным ТБ легких

О 20 40 60 80 100 1-специфичность, %

О 20 40 60 80 100 1-специфичность, %

Рисунок 3 - ЯОС-кривые, характеризующие зависимость чувствительности и специфичности определения 1Ь-2 и 1Р-10, при сравнении КФТ+ и КФТ-

Группа контактных лиц с положительным результатом КФТ и больные активным ТБ различались по концентрации в плазме крови следующих цитокинов: з1Ь2-Яам1Ь, 51Ь2-11аАО, 81Ь2-Кад0_м1ь, №N-"¡40, 1Р^уАо-1М1ь 1Ь-6№ь 1Ь-6АС, ТвРамь, ТСРаА0, №N-0^0, ТОТаАо- Анализ характеристических кривых при фиксированном значении специфичности 81% показал, что все биомаркеры имели чувствительность менее 70%, что исключало возможность их изолированного использования с диагностической целью. В связи с этим мы решили оценить диагностические возможности их комбинированного использования. Для решения поставленной задачи мы применили метод многомерного статистического анализа данных деревьев классификации, предсказывающих принадлежность объектов к тому или иному классу в зависимости от значений признаков характеризующих данный объект. Для практической реализации данного метода была использована программа ШР 9.0. Для выбора наилучшего из всех возможных вариантов ветвления применяли критерий согласия в-квадрат (0Л2). На рисунке 4 представлены значения вЛ2 для биомаркеров на первом этапе "ветвления". Проведенный анализ позволил выбрать комбинацию маркеров, обеспечивающую максимальную дискриминацию между больными ТБ и контактными лицами с ЛТБИ (рисунок 5). В результате были выбраны три наиболее значимых маркера -IFNYag.ni,,. ТОРаы„.. и 1Ь-бао (пороговые значения 256 пг/мл (6,4 МЕ/мл, 17,0 пг/мл и 2039 пг/мл, соответственно) и определены критерии включения лиц в исследуемые группы:

1) критерии отбора для больных активным ТБ: при одновременном определении содержания цитокинов 1РЫуАО-м1ц ТОРа№ и 1Ь-6Ло превышение порогового значения хотя бы одним из показателей;

2) критерии отбора для лиц с ЛТБИ: при одновременном определении содержания цитокинов 1Р^до-№ь ТОР<хщ. и 1Ь-6до значения ниже пороговых по всем трем показателям.

Предложенные количественные критерии содержания цитокинов 1РЫуао-м1ь ТОРанп. и 1Ь-6АО в плазме крови выявляли 96,3% (26 из 27) случаев активного туберкулеза и 80,7% (21 из 26) случаев ЛТБИ (ППК=0,9).

« О0 ^ ^ V ¿Г J- * -V

Рисунок 4 — Значения GA2 на первом шаге построения "деревьев классификации" в программе JMP 9.0 с целью дискриминации больных активным ТБ и контактных лиц с ЛТБИ Примечания:

1. Пунктирной линией обозначено GA2=7, * отмечены аналиты с GA2>7;

2. Каждому биомаркеру соответствует 3 столбца (NIL, AG, AG-NIL);

3. NIL — спонтанная продукция, AG — антиген-индуцированная, AG-NIL —разность между ними, соответственно.

Рисунок 5 — Классификационное дерево решений дискриминации больных активным ТБ легких и контактных лиц с ЛТБИ

3. Сравнительная ценность QuantiFERON®TB Gold In-Tube, неоптерина и специфических противотуберкулезных антител для диагностики туберкулеза легких. Анализ литературных данных позволил предположить, что для быстрой диагностики ТБ, помимо IFNyag-nil (КФТ), могут иметь значение такие биомаркеры, как неоптерин (НПТ) и противотуберкулезные антитела (ПТА).

Лицам, включенным в исследование, был выполнен КФТ и определено содержание НПТ и ПТА в плазме крови. Графическое представление данных и обнаруженные достоверные различия приведены на рисунке б.

Согласно полученным данным, при сравнении БЛ и КЛ с группой ЗЛ (задача 1) выявлены достоверно повышенные уровни НПТ(7,5 [5,3; 11,7] против 3,1 [1,1; 5,3] нмоль/л, р<0,0005) и IFNyag-nil (0,82 [0,08; 3,78] против 0,02 [-0,02; 0,1] МЕ/мл, р<0.0005), при этом по содержанию ПТА группы достоверно не отличались (р=0,071).

Рисунок 6 - Разброс значений НПТ, ПТА и IFNyag-nil (КФТ) в обследуемых

группах

Примечания:

1. Диапазонами показана медиана и максимальное/минимальное значение,

2. Пунктирной линией обозначена верхняя граница нормы,

3. БЛ - больные туберкулезом; ЗЛ - здоровые лица; КЛ - контактные лица,

4. р<0,0005***, р<0,005**, р<0,05*.

БЛ также отличались от группы ЗЛ и КЛ (задача 2) по содержанию НПТ (10,1 [6,8; 17,6] против 4,4 [2,7; 7,0] нмоль/л, р<0.0005), IFNyAG.N1L (1,3 [0,2; 5,8] против 0,09 [0,01; 1,44] ME/мл, р<0,0005 ) и ПТА (0,3 [0,1; 0,7] против 0,06 [0,04; 0,10] o.e., р<0,0005). При сравнении БЛ и КЛ (задача 3) наблюдались существенно более высокие значения НПТ (10,1 [6,8; 17,6] против 5,7 [3,5; 7,8] нмоль/л , р<0,0005), IFNyao-nil (1,3 [0,2; 5,8] против 0,51 [0,1; 2,3] ME/мл, р<0,05) и ПТА (0,3 [0,1; 0,7] против 0,06 [0,04; 0,09] o.e., р<0,0005).Отдельно следует отметить, что у БЛ с бактериовыделением по сравнению с БЛ без бактериовыделения выявлены достоверно более высокие уровни НПТ и ПТА (р=0,011 и р= 0,0001),

при измерении IFNyag.mil различий установлено не было (р=0,066), таким образом, КФТ позволяет выявлять больных лиц независимо от бактериовыделения. Была выявлена положительная корреляционная зависимость между НПТ и содержанием ПТА в плазме крови (г=0,327, р<0,01). Между остальными показателями зависимость отсутствовала (р>0,05). Анализ частоты выявляемое™ патологических результатов при использовании пороговых значений, рекомендуемых производителями использованных тест-систем, представлен в таблице 1.

Таблица 1 — Частота положительных реакций в исследуемых группах при использовании пороговых значений производителей тест-систем

Показатель Группы обследованных

Пороговое БЛ БЛ БЛ КЛ зл

значение МБТ(+) МБТ(-)

согласно (п=63) (п=54) (п=9) (п=49) (п=28)

инструкции

производителя

НПТ 54% 63% 0% 8% 4%

10 нмоль/л (34) (34) (0) (4) (1)

КФТ 68% 65% 89% 57% 11 %

0, 35 МЕ/мл (43) (35) (8) (28) (3)

ПТА 54% 62% 11% 6% 18%

0, 2 o.e. (34) (33) (1) (3) (5)

Примечания:

1. БЛ МБТ (+) - больные ТБ легких с бактериовыделением;

2. БЛ МБТ(-)-больные ТБ легких без бактериовыделения; ЗЛ-здоровые доноры; КЛ-контактные лица.

Данные проведенного ЯОС-анализа свидетельствуют о том, что для выявления туберкулезного инфицирования тест с ПТА обладает наихудшими клинико-диагностическими показателями, включая ОПП (1,83) и ППК (0,61), и значительно уступает как НПТ так и КФТ, которые могут рассматриваться как полезные, так как оба обладают ОПП выше 5 и сопоставимой ППК около 0,8.

Для диагностики активного ТБ также наилучшим тестом является НПТ, поскольку обладает максимальной ОПП (8,5). Тест с определением ПТА также имеет достаточно высокое ОПП (4,5), в то время как КФТ обладает крайне низкой специфичностью (60%) для решения данной клинической задачи.

При дифференциальной диагностике активного ТБ легких и ЛТБИ наибольшей значимостью обладает выявление ПТА (ОПП 9,00), после чего следует НПТ (6,38). Специфичность КФТ для решения этой задачи ничтожна (43%).

4. Изучение диагностических параметров иммуносорбентов на основе антигенов СВО-СГРЮ, СВБ-Е8АТ6, Е8АТ6-СРР10, СВБ-Р38 и PPDNЗ. Мы

исследовали возможность комбинированного использования антигенов МЛ в ИФА, так как известно, что тест-системы, в которых используется комбинация различных антигенов МЛ, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с тест-системами, сконструированными на основе только одного антигена.

Для оптимизации непрямого ИФА с использованием указанных антигенов применяли метод последовательного варьирования компонентов. Во всех образцах сывороток крови (п=729) были определены уровни 1§С-антител против всех антигенов. С целью определения оптимального порогового значения был проведен ЯОС-анализ. На основании полученных данных были построены характеристические ЯОС-кривые, выбраны пороговые значения при фиксированной специфичности 80% и проведен анализ частоты выявляемое™ патологических результатов ( > порогового значения). У 44% здоровых лиц были обнаружены ПТА хотя бы к одному антигену. Из 275 больных ТБ с бактериовыделением лишь у 13,5 % результат ИФА ко всем исследуемым антигенам был отрицательным, в то время как у больных без бактериовыделения процент отрицательных результатов составил 30%. Достоверные различия между БЛ с бактериовыделением и БЛ без бактериовыделения, вне зависимости от стадии туберкулезного процесса, обнаружены при определении ПТА только к РРОЮ, СВО-Р38 и СВО-СРРЮ (р<0,0001). Кроме того, использование РРОЮ позволило достоверно различить группы БЛ и КЛ (р<0,0001). Следовательно РРОЮ может применяться для выявления активного ТБ. Важно отметить, что БЛ по сравнению с КЛ, имеющими высокий риск инфицирования, не отличаются между собой (р>0,05) по содержанию ПТА против ЕБАТб-СРРЮ и СВО-СРРЮ. Для этих антигенов нет значимых различий и при сопоставлении БЛ с бактериовыделением (п=271) и БЛ без бактериовыделения (п=50). Следовательно, ЕБАТб-СРРЮ и СВО-СРРЮ могут использоваться для выявления туберкулезного инфицирования (вне зависимости от наличия клинических проявлений ТБ и наличия бактериовыделения). У лиц с заболеваниями нетуберкулезной этиологии также были обнаружены достоверные различия по сравнению с группой БЛ при определении ПТА к РРОЮ, Е8АТ6-СРРЮ и СВО-СРРЮ (р<0,05).

Проведенные расчеты выявили наличие достоверной положительной корреляции между уровнями антител против всех антигенов (СВО-Р38, ЕБАТб-СРРЮ, СВО-СРРЮ, СВО-Е8АТ6, РРОЮ), которые сравнивались попарно. Во всех случаях коэффициент корреляции Спирмена (Я) не превышал 0,67. Поскольку чувствительность и специфичность связаны между собой обратной связью, то мы не можем вводить бесконечное количество антигенов в композицию, так как после добавления каждого последующего антигена помимо увеличения чувствительности мы наблюдаем уменьшение специфичности. Так, при совместном использовании РРОЮ, СВО-Р38 и ЕБАТб-СРРЮ, чувствительность выявления БЛ, вне зависимости от наличия бактериовыделения, стремилась к 95 %, при этом специфичность составила всего 65%. В ходе проведенного анализа было установлено, что сочетание двух антигенов РРОЮ и СВО-Р38 наименее снижает специфичность выявления ЗЛ (76%), при этом

чувствительность возрастает, достигая 90% в группе БЛ хроническим туберкулезным процессом (МБТ+), 74 % у БЛ впервые выявленным ТБ (МБТ+) и 60 % у БЛ (МБТ-) вне зависимости от стадии заболевания. Графическое изображение полученных результатов представлено на рисунке 7.

ВП ТБ (МБТ+) п-128

10%

Пневмония п=28

4%

ХР ТБ (МБТ+) п-14?

СО/, 10% а'°

ТБ (МБТ-) п=46

7%

Саркоидоз п=40

3% 5%

т сво-рз8

■ СВО-Р38+РРОМ-3 ЕЗ РРОЫ-З

Здоровые п=366

5%

Рисунок 7 — Диагностическая значимость комбинированного использования антигенов МЛ СВО-Р38 и РРОШ в непрямом варианте ИФА Примечания:

1. Отрицательные результаты в каждой группе обозначены белым цветом;

2. ВП — впервые выявленные больные ТБ до начала лечения ХР — больные хроническим ТБ

БК+/- - с наличием/отсутствием бактериовыделения, подтвержденного микроскопией или микробиологическим методом (посев мокроты).

В группе больных пневмонией специфичность остается прежней (96%) и немного уменьшается в группе больных саркоидозом легких, составляя 92%.

Таким образом, белки РРОШ и СЕЮ-Р38 могут найти применение в иммуноферментных тест-системах для выявления лиц с активным туберкулезным процессом и проведения дифференциальной диагностики ТБ с другой легочной патологией. Антигены ЕБАТб-СБРЮ и СВО-СРРЮ могут быть использованы для разработки тестов для выявления туберкулезного инфицирования, однако

необходимо решить вопрос об увеличении специфичности проведения анализа, в том числе и за счет изменения условий синтеза данных белков.

5. Разработка алгоритма иммунодиагностики туберкулеза легких.

Основные области применения тестов, изученных в работе, представлены в таблице 2.

Мы проанализировали диагностическую ценность тестов оценки активности туберкулезного процесса при их последовательном и параллельном использовании. Согласно полученным данным следует, что при определении комбинации №N7, ТОРа и 1Ь-6 и ПТА у лиц, с установленным на 1 этапе туберкулезным инфицированием, повышается специфичность проведения дифференциальной диагностики активного и латентного ТБ (на 21 и 14 %, соответственно). В свою очередь на показатели чувствительности и специфичности определения НПТ не влияет последовательность выполнения тестов.

На основании полученных результатов нами предложен двухступенчатый алгоритм иммунологической диагностики ТБ, в котором на первом этапе предлагается выявлять туберкулезное инфицирование. На втором этапе, для определения активности туберкулезного процесса, нужно применять комбинацию №N7, ТОРа и 11^-6 и/или определять содержание НПТ и ПТА в сыворотке крови. Однако интерпретировать повышенный уровень НПТ в сыворотке крови, свидетельствующий о наличии активного текущего воспалительного процесса, следует с осторожностью ввиду того, что его содержание может быть повышено при ряде других заболеваний.

Таблица 2 - Области применения изученных иммунологических тестов

Тест Диагностика туберкулезного инфицирования Диффере! щиал ьная диагностика активного ТБ и ЛТБИ Пороговое значение

I. IFNyag-nil ( КФТ) + - 0,35 МЕ/мл

2. 1L-2Ag-nil + - 36 пг/мл

3. 1P-10ag-nil + - 1087 пг/мл

4. Неоптерин - + 10 нмоль/л

5. ПТА (PPD+P38) - + OD450: PPD - 0,36 Р38 - 0,5

6. IFNyag-nil TGFa IL-6 - + 6,4 ME/mji 17 пг/мл 2039 пг/мл

И в заключение следует отметить, что во избежание гипердиагностики необходимо понимать каким группам лиц и в каком случае целесообразно проводить иммунологическую диагностику ТБ.

1. Диагностика туберкулезного инфицирования:

- лица с установленным контактом с больным ТБ (семейный контакт);

- сотрудники противотуберкулезных учреждений.

В случае положительного результата целесообразно провести углубленное обследование и провести тест в динамике.

2. Диагностика активного ТБ:

- в дифференциальной диагностике с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии;

- для оценки активности процесса у лиц с установленным туберкулезным инфицированием (дифференциальная диагностика активного ТБ и ЛТБИ);

- при наличии клинических симптомов заболевания для подтверждения активности туберкулезного процесса в короткие сроки, для оценки эффективности проводимой специфической терапии.

Выводы

1. Определение уровня специфической антиген-индуцированной продукции №N7 является информативным тестом для диагностики туберкулезного инфицирования (чувствительность (Ч)=60-77 %, специфичность (С)=81 -86 %) вне зависимости от активности процесса (бактериовыделения) и может использоваться для контроля за эффективностью терапии у лиц с положительным результатом теста до начала лечения

2.1Р-10 и ГЬ-2 являются информативными биомаркерами, альтернативными №N7, для диагностики туберкулезного инфицирования. Определение 1Р-10 и 1Ь-2 позволяет работать в более широком диапазоне концентраций и при более высоких пороговых значениях, что может позволить избежать получения сомнительных результатов и повысить надежность диагностики.

3. Выявлены 6 биомаркеров (51Ь2-Яа, №N7, 1Ь-6, ТвРа, №N-02, ТЫРа) уровень специфической продукции которых достоверно различается у больных активным ТБ и лиц с ЛТБИ, что позволяет применять их для оценки активности ТБ легких.

4. Комбинированное определение специфической антиген-индуцированной продукции 1Ь-6 и №N7 и спонтанной ТвРа в плазме крови, по разработанному алгоритму, позволяет дифференцировать активный ТБ и латентную туберкулезную инфекцию (4=73-96 %, С=80-90 %).

5. Изучение диагностической значимости иммуносорбентов на основе антигенов СВБ-СРРЮ, СВО-ЕБАТб, ЕБАТб-СРРЮ, СВО-Р38 и РРБЮ показало, что конструирование иммуноферментной тест-системы, сочетающей антигены СВО-Р38 и РРБЮ, позволяет выявлять больных активным ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику ТБ с другими легочными патологиями с удовлетворительной чувствительностью и специфичностью анализа.

6. Определение неоптерина и специфических антител класса к рекомбинантному белку СВО-Р38 и лизатному антигену РРБШ информативно при выявлении лиц с активным ТБ легких (4=46-63%, С=92-100 % и 4=74-92 %, С=76-100 % соответственно).

7. Комбинированное определение IFNy/TGFa/IL-6 и оценка специфических антител класса IgG к рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3 у лиц с установленным на 1 этапе инфицированием Mtb, повышается специфичность проведения дифференциальной диагностики активного и латентного ТБ (на 21 и 14 % соответственно). В свою очередь, на показатели чувствительности и специфичности определения НПТ не влияет последовательность выполнения тестов.

8. Разработан двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ, в котором на первом этапе предлагается проводить количественное определение специфической антиген-индуцированной продукции IFNy, IP-10 и/или IL-2 в плазме крови, тем самым выявляя контингент лиц с туберкулезным инфицированием, а на втором этапе предлагается проводить количественное определение комбинации IFNy/TGFa/IL-б, специфических антител класса IgG к рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3 и/или неоптерина для определения активности туберкулеза легких.

Практические рекомендации

1. Определение уровня специфической антиген-индуцированной продукции IFNy рекомендуется для диагностики туберкулезного инфицирования (чувствительность 60-77%, специфичность 81-86%).

2. Для оценки эффективности лечения больных ТБ легких, с исходно положительным результатом определения уровня специфической антиген-индуцированной продукции IFNy в начале лечения, этот тест рекомендуется использовать в динамике после двухмесячного курса проведенной терапии.

3. Для установления туберкулезного инфицирования определение специфической продукции IL-2 (пороговое значение 36 пг/мл) и IP-10 (пороговое значение 1087 пг/мл) может служить альтернативой IFNy.

4. Определение неоптерина, специфических противотуберкулезных антител класса IgG к рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3 в сыворотке крови и/или комбинированное определение специфической антиген-индуцированной продукции IL-6, IFNy и спонтанной TGFa в плазме крови, по разработанному алгоритму, рекомендуется для проведения дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Васильева, Е.В. Использование генно-инженерного белка ESAT-6 в серодиагностике туберкулеза / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: материалы международной конференции // Под ред. А.Б. Жебруна - СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010. - С. 6.

2. Васильева, Е.В. Применение иммуноферментного анализа для оценки гуморального и клеточного иммунного ответа при туберкулезе / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, А.Б. Беклемишев, И.А. Перемолотова, A.A. Тотолян // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора / Под ред. Академика РАМН Г.Г.Онищенко. - Оболенск: -А-ПРИПТ ЗАО, 20И. - С.310-313.

3. Васильева, E.B. Использование теста «QuantiFERON-TB Gold In-Tube» в диагностике туберкулеза легких / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, Арег А. Тотолян // Инфекция и иммунитет. -2012.-т. 2, №1-2.-С. 20-21.

4. Васильева, Е.В. Информативность определения спонтанной и специфической продукции цнгокинов для оценки активности туберкулезного процесса / Е.В. Васильева, B.II. Вербов, II.IO. Никитина, U.E. Любимова, H.A. Арсентьева, A.B. Семенов, II.В. Лядова, Арег А. Тотоляп // Вестник уральской медицинской академической науки. —2012. -№4 (41).-С. 99-100.

5. Васильева, Е.В. Возможность использования различных антигенов М. tuberculosis в серодиагностике туберкулеза легких / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, Арег А. Тотолян, А.Б. Беклемишев, А.Л. Мамаев, А.О. Цырулышков // Медицнискнй академический журнал. -

2012. - №4 (12). — С.24-26.

6. Васильева, Е.В. Применение микобактериапьных антигенов для дифференциальной диагностики и выявления больных активным туберкулезом / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, Арег А. Тотолян, А.Б. Беклемишев, А.Л. Мамаев, А.О. Цырулышков // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: материалы III международной научно-практической конференции / Казань, 2012. -С.313-315.

7. Васильева, Е.В. Применение технологии хМар для поиска информативных биомаркеров активности туберкулезного процесса / Е.В. Васильева // Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей: материалы российской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием, посвященной всемирному дню борьбы с туберкулезом / Москва, 2013. — С. 10-11.

8. Васильева, Е.В. Возможности и ограничения теста QuantiFERON-TB-GoId In-Tube в лабораторной диагностике туберкулеза легких / Е.В. Васильева, М.Н. Паукер, НЛО. Грицай, Е.В. Прибыток, В.Н. Вербов, Арег А. Тотолян // Туберкулез и болезни легких. -

2013. -№2. — С.13-17.

9. Васильева, Е.В. Применение поляризационного флуоресцентного иммуноаналпза с использованием синтетических пептидов ESAT-6 для определения антител в сыворотке крови больных туберкулезом легких / Е.В.Васильева, В.Н. Вербов, С.А.Еремин, H.A. Перемолотова, А.А.Колобов, Арег А. Тотолян // Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций: материалы международной конференции / Инфекция и иммунитет. - 2013. — том 3, № 2 — С. 119-120.

10. Васильева, Е.В. Сравнительная ценность квантиферонового теста, неоптерина и специфических противотуберкулезных антител для клпнико-лабораторнон диагностики туберкулеза легких / Е.В. Васильева, C.B. Лапии, Т.В. Блинова, И.ТО. Никитина, И.В. Лядова, В.Н. Вербов, Арег А. Тотолян // Клиническая лабораторная диагностнка.-2013. — № 5. - С. 21-26.

11. Vasilyeva, E.V. Combined detection of IFNy, TGFa and IL-6 can discriminate between active ТВ disease and latent infection / E.V. Vasilyeva, V.N. Verbov, I.Y. Nikitina, I.V. Lyadova, Areg A. Totolian // Conference Abstract: 15th International Congress of Immunology (ICI) / Front. Immunol. -2013. - doi: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.00030.

12. Васильева, Е.В. Комбинированное определение спонтанной и антигениндуцированнон продукции цитокннов для дифференциальной диагностики активного туберкулеза легких и латентной туберкулезной инфекции / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, В.Б. Ивановский, М.В. Жемкова, И.Ю. Никитина, И.В. Лядова, Арег А.Тотолян // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2013. — JV» 4. — С. 77-85.

13. Васильева, Е.В. Поиск оптимальной комбинации антигенов для серодиагностики туберкулеза / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, А.Б. Беклемишев, А.Л. Мамаев, А.О. Цырулышков, Т.А. Степаненко, В.Б. Ивановский, C.B. Лапин, Арег А.Тотолян // Инфекция и иммунитет. - том 3, № 3 - С. 235-242.

Список сокращений и условных обозначений

БЛ - больные туберкулезом ДИ - доверительный интервал ЗЛ - здоровые лица ИФА - иммуноферментный анализ КЛ - контактные лица

КФТ - квантифероновый тест («QuantiFERON®TB Gold In-Tube») ЛТБИ - латентная туберкулезная инфекция НПТ - неоптерин

ОПО — отношение правдоподобия отрицательного результата теста ОПП - отношение правдоподобия положительного результата теста ППК - площадь под кривой операционной характеристики ПТА - противотуберкулезные антитела ТБ - туберкулез

EGF - эпидермальный ростовой фактор

IFN - интерферон

IL- интерлейкин (interleukin)

IP-10 - IFN-y-inducible protein 10 / CXCL10

MIP-ip - макрофагальный воспалительный протеин - ip

MIT - митоген-индуцированная продукция (положительный контроль)

Mtb - Mycobacterium tuberculosis

NIL - спонтанная продукция

PPDN3 - ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DTST и Valee

ROC- кривая операционной характеристики (Receiver-Operating-Characteristic curve)

sCD40L- растворимая форма лиганда CD40 sIL-2Ra- растворимый рецептор интерлейкина-2-альфа TGFa - трансформирующий ростовой фактор-альфа TNFa - фактор некроза опухоли-альфа VEGF- васкулоэндотелиальный фактор роста хМар - мультиплексный анализ

Подписано в печать 09.10.2013г. Формат 60x84/16 У.п.л. 1,43 Уч.-изд.л 1,43 . Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. Югошье^таП. Зак. № 13485 от 09.10.2013г.