Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка методических подходов к оценке иммунологических свойств пестицидов и коррекции их действия

РГБ ОД

г- гс и , российская академия медицинских наук

^ нлуч!о-й£Й!Едователъский институт вакцин и сьюороток имени И. И. мечникова

На правах рукописи УЖ 57. 044: 57. 083. 3

ЖАМСАРАНОВА Сэсэгма Дашиевна

разработка методических подходов к оценке иммунотоксикологических свойств пестицидов и коррекции их действия

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1991

работа выполнена в Проблемной научно-исследовательской лаборатории иммунохимия пестицидов Восточно-Сибирского технологического института

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Л.И.Краснопрошина. доктор биологических наук, профессор

А.А.Михайлова, доктор медицинских наук М.А.Стенина

Ведущее учреждение, дающее отзыв: Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова

Ракита диссертации состоится 1994 г.

в "^у часов на заседании специализированного Совета (И 001.38.01.) при Научйсг-исследавательском институте вакцин и сывороток им.' И. И. Мечникова РАМН по адресу: 503064, г.Москва, пер. Мечникова, д.§а

С диссертацией можно ознакомиться 'в библиотеке Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Автореферат разослан " " г.

Учадл! секретарь Сийцичлиуцдамнного Совета

И. Г\ Кулрянцеьа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

■„. Широкое распространение иммунопатологических состояний, в частности, иммунодефицитов среда населения, ставит исследователей перед необходимостью разработки специальной методологии раннего выявления заболеваний иммунной системы организма с целью их профилактики и своевременной коррекции болезни (Ко-вальчук Л.В.; Чередеев А.Н.. 1990; Петров Р.В. и др.. 1992).

По данным органов здравоохранения, выявлена взаимосвязь уровней заболеваемости населения с экологической ситуацией в регионах, особое внимание обращается на возникновение вторичных иммунодефицитных состояний в условиях длительного контакта с пестицидами.(Материалы МЗ СССР, подготовленные для Комитета Верховного Совета СССР по вопросам экологии и рационального использования природных ресурсов, по мерам защиты населения СССР от неблагоприятного воздействия нитратов и пестицидов при использовании их в сельском хозяйстве. 199р г.).

- За последнее десятилетие накоплены данные, свидетельствующие о том. что пестициды, загрязняющие окружающую среду,способны нарушать функциональную целостность иммунной системы (Кенигсберг Э.Я., 1981; РузьгСакиев P.M., 1986).

Возникла новая область науки - иммунотоксикология. объектом изучения которой является кгмуниая система как "мишень" воздействия ксенобиотиков.

Эксперты ВОЗ при Формировании в 1989 г. в Лондоне "Международной программы сотрудничества в области иммунотоксиколо-гяи" (1С1Р1 в рамках "Международной программы по безопасности химических веществ" (IPCS) признали актуальность и необходимость исследований по следующим основным направлениям.'

а) исследование иммунологических' характеристик организма при воздействии пестицидов, включая резистентность организма хозяина;

б) изучение аутоиммунных реакций организма;

в) поиски иммунохимических методов защиты от отравлений и иммунокоррекщш состояния организма, подвергнутого воздействию ксенобиотика;

г) внедрение-- аналитических иммунохимических методов в практику токсикологических исследований .

Возрастающий обьем внедрения пестицидов в сельское хозяйство, изменение ассортимента npenapa.jb требуют определения уровней безопасного и эффективного их применения. При этом ост- 3 -

ро поднимается вопрос о критериях и методологии оценки нммуно-токсичности пестицидов и применения принципов иммунобиотехноло-> гич в организации массовых анализов остаточных количеств химиопрепаратоз.

Цель и задачи исследования.

Целью наших исследований явилось исследование иммунотокси-кологических характеристик пестицидов, определение степени специфичности изменений функций иммунной системы, а также поиски путей и способов специфической защиты и иммунокоррекции организма.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- изучение функционального состояния звеньев иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов;

- разработка схемы иммунотоксикологического скрининга пестицидов;

- количественная оценка безопасных уровней воздействия пестицидов на иммунную систему организма;

- поиски иммунохимических способов завщты жгвотных от отравлений и коррекции иммунодефицит« состояний, вызываемых воздействием пестицидов;

- разработка иммунохимических методов определения пестицидов. . .

Научная новизна.

1. Экспериментально изучено Юшнией.4-дахлорфеноксиук-сусной киедпгы и карбофоса на функциональные показатели иммунной системы организма. Показано, что воздействие данных пестицидов на организм животных вызывает иммунодефицитное состояние. .

Исследование иммунотоксикологических свойств пестицидов позволило разработать схему скрининга, •1 использование которой сможет исключить применение в сельском хозяйстве пестицидов, токсичных для иммунной системы организма.

Предложенная в работе математическая модель позволяет оп-рзделить .безопасные для функционирования иммунной системы организма уровни используемых пестицидов.

2. Впервые экспериментально доказана возможность образования аномальных антигеноз пестицид-белок и антител к ним. Выделены и очищены белки печени, связывающие п». тицид. Показана .возможность использования искусственных антигенов пестицид-белок для раннего доклинического выявлений изменений, вызываемых пестицидами.

3. Впервые установлена возможность защиты организма от острых отравлений пестицидами F(ab)' - фрагментами антител протай искусственных антигенов пестицид-белок. Экспериментально показана возможность иммунокоррекции организма, подверженного воздействию пестицидов, такими иммуностимуляторами как Т-акти-вин. миелолид, спледин. лезамизол.

4. Разраиотаны твердофазные иммуноферментные методы определения пестицидов. . в частности 2.4-Д и производных карбофоса, в биологических жидкостях.

Приоритетность разработок подтверждена авторскими свидетельствами на изобретения:

, N 1345399 "Способ иммунизации кроликов против сибирской язвы" от 15. 06.87 г.

N 1356288 "Способ иммунизации крупного рогатого скота против сибирской язвы" от 01.08.87 г.

N 1501724 "Способ иммобилизации гаптенов" от 15.04.89 г.

И 1545350 "Способ защиты организма от отравления гербицидом" от 22. 09.89 г.

К 1670608 "Способ полпения антигенов карбофоса" от 15.04.

91 г.

Практическая значимость работы.

Разработанные подходы я методы, а также результаты исследований по лммуяотоксикологическ.-'му скринингу пестицидов использованы 'для подготовки и издания методического руководства "Иммукотоксикологическая оценка' пестицидов", Улан-Удэ, 1993. 103с.. утвержденного секцией "Экспериментальная патология химической этиолепш" Проблемной комиссии АМН СССР "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических

4ясс".

По результатам работы подготовлены и изданы методические эекомендации и руководства:

- "Испольгоьание искусственного антигена карбофос-белок (ля раннего выявления воздействия карбофоса пр. иммунологическую «активность организма", Улан-Удэ, 1984г., 15с., утвержденные МЗ СФСР;

- "Иммуноферментный метод определени. производных карбофо-а".Улан-Удэ, 1989р.. 13с.,-утвержденные Ученым Советом Инсти-ута биохимии им. А. н. Баха АН СССР.

Разработанный иммуноферментный анализ 2,4-Д позволяет оп-эделить не только свободную, но и стланную ферму препарата, эторая, по нашим данным, обладает определенным токсическим эФ- 5 -

фекгоы.

Иммуноферментный метод определения производных карбофоса" позволяет выявить основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных - ):оно -. днмалатионовые кислоты.

Предлагаемые методы анализа существенно дополняют используемые в настоящее время методы определения пестицидов и способствуют получению новой информации о биологической активности пестицидов.

- 'Практикум по иммунологическим методам исследования". Улан-Удэ. \987г. ,80с.

- "Иммунотоксиколэтическая оценка пестицидов":Методическое руководство. Улан-Удэ, 1993г.,103с. Руководство утверадено сек- . цией "Экспериментальная патологи? химической этиологии Проблемной комиссии АМН СССР "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс".

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Анализ иммунотоксикологических свойств пестицидов;

- установлено влияние пестицидов на функционирование иммунной системы организма;

- разработана система скрининга токсичных для иммунной системы организма пестицидов;

- показана возможность использования иммунологических критериев для расчета безопасных уровней пестицидов.

2. Продемонстрирована способность пестицидов связываться с белками органов и тканей и изменять их антигенную структуру. Изменение антигенной структуры индуцирует процесс алтителообра-зования к ачомальньм антигенам.

3. Предложен новый метод иммунохимической защита организма -от острых Отравлений пестицидами, отличающийся высокой специфичностью. Доказана возможность коррекции иммунодефицитного состояния, вызванного пестицидами.

4. Разработан иммуноферментный метод определения пестицидов и их производных, в частности связанные и свободные формы 2, 4-Д и основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных.

."Апробация результатов работы.

Ма7ериалы диссертации были доложены и обсуждены на

- 6, 7, 8 Всесоюзных научных, конференциях " Современные вопросы токсикологии и гигиены применения пестицидов и полимерных материалов", Киев,1981г.,1985г.,1990г.;

- 3, 4, 5 Республиканских научно-практических конференциях врачей Бурятии. Улан-Удэ, 1934г.,1987г.. 1989г.;

- 6 -

- 1, 2 Региональных научных конференциях " Вклад молодых биологов Сибири в решение Продовольственной программы и охраны окружающей среды". Улан-Удэ, 1984г., 1987г.;

- Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефицита и иммунокоррекция", Владивосток, 1987 г.; •

- Всесок.^ной научной конференции "Иммунология на Востоке страны", Красноярск. 1388г.:

- Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология",Вильнюс, 1988г.;

- Всесоюзной научно-технической конференции "Проблемы зко-чопш в ветеринарной медицине", Москва. 1989г.;

- Всесоюзном симпозиума "Иммукоферментный анализ регуляторов роста растений: применение в Физиологии растений и эколо-чш",Уфа, 1990г.;

- 3 Международной научной конференции "Экологическая пато-гогия и ее фармакокоррекция",Чита, 1991г.;,

--1 съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992г.;

- Межгосударственной научной конференции "Комплексная пе-еработка пищевого сырья и основные направления расширения ас-ортимента продуктов питания", Владивосток, 3993г.;

- итоговых конференциях научных работ профессорско-препо-авательского состава Восточно-Сибирского технологического инс-итута.

Публикации. ' . •

Основные результаты исследований опубликована в 48 печатях работах..Зарегистрировано 5 авторских свидетельств.'

СОДЕРЖАНИЕ РАБиТЫ 1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, Исследования выполнены на мышах икбредных линий , крысах кроликах, а также на сыворотках крови рабочих, занятых на ;оизводстве инсектицида карбофоса.

В работе использованы мыши линий СБА, C^Bl^.F,, (С*51/ 1А). крысы линий Вистар , кролики порода Шиншилла весом (3-3,5) ', полученные из питомника лабораторных животных "Столбовая".

Состояние иммунной системы организ'1 оценивали по числу титзлообразувдих клеток (АОК), определяемых методом локально-гемолиза в геле по Jerne и Nordln (1963) и в полунидкой еде no Cunningham (1965) ,а также по титру гемагглютининов, раженности локальной лимфоуздовой . еакции "трансплантат отиз хозяина" и гиперчувствительности замедленного типа , ак-

- 7 -

тизности Т-специфпческнх супрессоров. Для индукции и изучения Т -супрессоров иммунного ответа мышей in vitro использовали мо-_; дель адаптивного перекоса по R.Z. Whlsler и J.D. Stodo(1Э73).

Анализ функций макрофагов проводили по фагоцитозу латекса, тестируемому по фагоцитарному показатели (процент фагоцитирующих клеток из общего числа подсчитанных клеток) и фагоцитарному числу (среднее количество частиц латекса,поглощенных одной клеткой); включению акридинового оранжевого, спонтанной миграции.

Естественная цитотоксичность оценивалась по активности естественных меток-киллеров в отношении опухолевых клеток-мишеней УАС-1 (Mantovanl A.et.al., 1978). А устойчивость к инфекции-при заражении зшзотных сибиреязвенной культурой.Функциональную активность иммунокомпетентных клеток In vitrc оценивали по индукции АОК в суспензия спленоцитов, хемилшмнесценции макрофагов, розеткообразущей способности макрофагов, фагоцитоза макрофагов.

В работе были использованы гербицид-2,4-Д (2,4-дахлорфено-оксиуксусная кислота) и инсектицид-карбофос (0,0-диметил-с-(1,2 -бис-дакарбоэгоксиэтил) дитиофосфат) в дозах 1/20, 1/50 1/100. LQgy что составило для 2,4-Д-4; 8; 20мг/кг веса, а для карбофоса-5; 10;,25мг/кг. ,

Иммунитоксикологкческйе"свойства метаболитов пестицидов изучали при предварительном введении индукторов монооксигеназ-ной системы In vivo или после предварительной инкубации препарата с s-Э.

Наличие аномальных комплексов пестицид-белок и антител к ним определяли с помощью реакции пассивной гемагглютинации по • Бойдену и связывания комплемента, реакции иммуноэлектрофореза.

Выделение белков печени, связывающих гербицид, проводили методами ионообменной хроматографии, .гель-фильтрации, и диск-электрофореза в полиакриламидном геле.

Синтез коныогата карбофос - человечий сывороточный альбумин проводили по методу Е. R. Centeno et al. (1970) через ангидрид карбофоса. Коньюгат 2,4-Д-белок. получали связыванием хлорангидрида 2,4-Д с человечьим сывороточным альбумином. Концентрацию белка определяли по O.Lovry (1951), а число молекул гаптена, связавшихся с одной молекулой белка, по разнице свободных аминогрупп в исходном белке и коныогате гаптен-белок, определяемых с помощь» 2,4,6- тршштробензодсульфокислоты по А. F.ftibeen (1966).

Антисыворотки к искусственным антигенам получали путем иммунизации кроликов породы Шиншилла. С целью увеличения акгив-кбсти иммунных сывороток проводили предварительную иммунизацию 'белком-носителем .

При выделении антител к карбофосу и 2.4-Д использовали им-муносорбент.Для этого аминоцеллюлозу, полученную по А,Е.Гурвич и др. (1961). связывали с ангидридом карбофоса чли хлорангидридом 2.4-Д , очищали от непрсреагировавшего соединения и полученным иммуносорбентом набивали колонку (20*1.5см).

F(ab'фрагменты получали гидролизом иммуноглобулинов пепсином (И. Брок,1979). Супернатант пропускали через колонку с иммуносорбентом. Фракции fe F(ab') - фрагментами объединяли , рН доводили до 7.4 и концентрировали полиэтиленгликолем до концентрации 5МГ/мл.

В каждой экспериментальной группе было не менее 10 животных.

Статистическую обработку проводили с заданной надеж-' ностькг (достоверностью) р<0,05 по разработанным программам (Дьяконов В.П.,1986). Вычисляли среднеарифметическое значение И и стандартную ошибку среднего значения в выборке-га. Оценку значимости показателей по сравнению с показателями, принятыми за норму , производили с помощью критерия Стыодента и' Уилкоксо-на-Манна-Уитни.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.Влияние пестицидов на показатели различных' звеньев иммунитета.

2.1Л-. Оценка действия пестицидов на гуморальный иммунный ответ.

По мнению многих исследователей , наиболее информативным юказателем функциональной активности В-системы иммунитета является определение титров антител в сыворотке крови и числа АОК з селезлнке (Петров Р.В. и др. ,1984).

Определение АОК при действии пестицидов проводили мето-jom локального гемолиза в геле (Jerne К.К., Hordin А.А., 1963) i в полужидкой среде (Cunningham А.I., 1965). Результаты по (лиянию 2.4-Д на изучаемые показатели редставлены на рис. I. (слученные данные-• свидетельствуют о достоверной дозозависимой супрессии, обусловленной введением 2.4-Д. Метод Cunningham юзволяет определять в 2 раза больше АОК , чем метод Jerne. Для ■пределения чувствительности покоящихся клеток предшественников нтителогенеза, клеток индуктивной и продуктивной фаз гумораль-

' - 9 -

О)

го

О)

о

я

0 н

1

5,

500

400

о1 £

О

5 £

300

200 •

100

контроль

8 20

2.4"Л(МГ/КГ)

Рис. Митры гемагглютининоз сыворотки крови (----) и

число АОК (по СшШпзПага Н и Легпе | |) на 10 кариоцитов селезенки мышей, подвергнутых 5-кратному воздействию 2,4-Я с последующей иммунизацией-эритроцитами барана, кого иммунного ответа к действию гербицида 2,4-Д последний вводили соответственно:

а) до антигенного стимула (5-дневная оральная обработка мышей в дозах 1/20; 1/50; 1/100 затем иммунизация эритроцитами барана);

б) введение антигена в середине обработки (2-дневное введение мышам 2,4-Д. на 3-й сутки - иммунизация'сритроцитами барана , затем 3-дневная обработка 2,4-Д);

в) после введения антигена (сначала иммунизация эритроцитами барана, ; затем 5-дневная оральная обработка животных 2,4-Д указанными дозами).

Результаты представлены в табл. 1 ,2. Анализ данных показывает. что в наибольшей степени супрессия проявлялась в период, когда предшественники антителообраэующих клеток находились в состоянии покоя .

Данные по влияний разных доз карбофоса на количество АОК и титры гймогглютининоь представлены на табл. з. Результаты, полу- 10 -

Количество АОК (по Сипп1пяИат АЛ. Хна 10 кариоцитов) селезенки мышей (С^В], «СБА) .подвергнутых воздействию разных доз

2.4-Д (М+т).

Нратность введения

Доза (—-г-

2.4-Д 15 (до'йммуниза (мг/кг)|ции) П*=60 I

-|5 (после иммуни-|2(до иммуниз;+ |зации) п=60 |3(после иммуни-| • (зации) п=60

20

Контр. 1401.96412.15 (0.102+0.0043 1143. 5+6.037

I

1202.31+7, 08*** |0, 104+0.0038 1138,5+5.095

I

1231.49+9, 87*" |0. 110+0.0065 1151.0+9.922 I

1288.24+8.71**" 10, 124+0.0053*'

1401,96+12,15 10.102+0.0042" 1143, 5+6. 037

I

1227.65+13,86* 10.104+0,0048 1146, 0+6, 517 I

I311.71+12.30* I0.115+0,0045 1150,5+4,406

1401,96+12, 15 10, 102+0,0043 1143,5+6,037"

I

1275,79+17. З.ч* 10. 097+0,0080 1146.1+7,277 I

1330,51+25, 38* 10, 092+0.0098 1131,0+12,541

1299,05+17,96 1310,61+24,72'

1168.0+б. 488 * |150, 0+7.495

10.106+0,0057 |0. 099+0.0064

1133.89+4. 125

веса делезенок (в г) 10*/.

спленоцитов; и коллчест-

Примечание: в числителе - количество АОК на 10 в знаменателе

во клеток на селезенку /на * - р<0,05. ** - р<0.01. »** - р<0.001.

ченные по анализу АОК и титров-гемагглютининоз,свидетельствуют о дозозависииом влиянии пестицидов . Доза 1/20 , Ь0И вызывала угнетение показателей гуморального звеьа иммунитета . А доза 1/ 100 ыу?, 4-Д не всегда оказывала достоверный иммунодепрессивный эффект, эта же доза карбофоса увеличивала количество АОК и титр гемагглютининов. Наиболее чувс,твител'~"чми к действию пестицидов оказались предшественники антителопродуцентов. находящиеся в состоянии покоя.

- 1

Гитрц гемагглютининов сывороток крови мышей F, (СВА*С?*В1<,). подвергнутых воздействию разных доз 2,4-Д (1/титр).

№ |гр.

Кратность введения -г~

Доза I—--1-

2.4-Д |5(до иммуниза- |5Спосле иммуни- |2(до иммуниз.)+

(ьг/кг) |ции) п=60 |зацш) n=60 13(после икмуниза

| | |ции) п=60

I 1 I 2 I 3

! 1

Кслтр. 1704,0+125,69

20 1288,0+52,73*'

9 1416.0 + 104,74*

4 1588.8+101,33

__I_

|704. 0+125,69 1392. 0+62.19" 1448, 0+103,20 1438, 86+118, 15*

1704, 0+125, 69 1232.0+63,93 1409.6+84.91* 1384.0+53,95**

Примечание: * - р<0.05, ** - р<0,01, *** - р<0,001.

Таблица 3

Влияние разных доз карбофоса на титр гемагглютининов сывороток крови и число АОК (по Erne N.K.,Nordlr A.A.) на селезенку мышей F, »(СВА*^^).

1 - ■ - - - 1 Доза I I |Кол-во живот- Число АОК на 1 1 ! ' Титр |

I прзпарат; ных в экспе- * -- селезенку 1 гемагглютининов|

1 (мг/кг) 1 I рименте

1 I Контроль 1 1 19 14816+624 1 I : ИЗ. 22 I

! 25 1 18 10899+659*" I . I : 45.86* |

1 10 1 18 16190+577 1 1 : 236.16 I

1 5 1 1 18 . | | . 21747+359* 1 I : 281,90* I 1 1

* - Изменения статистически достоверны р<0,05.

2.1.2. Эффект, оказываемый пестицидами на показатели клеточного иммунитета.

Реакция " трансплантат против хозяина " является одпг .и Феноменов клеточного иммунитета.

Результаты влияния разных доз карбофоса и 2,4-Д на разви-вие локальной РТПХ , выражаемой индексом увеличения лимфоузлов, представлены в таблице 4. Карбофос и 2,4-Д вь- мвали дозозависи-мое угнетение РТПХ .Наибольший э£>фект оказывала доза 1/20

Выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа также отражает состояние клеточного иммунитета организма .

- 12 -

- Влияние разных доз карбофосе и 2,4-Д на развитие локальной РТЛХ у мышей Г, (СВА*С*В]«) при введении клеток селезенки мышей СБА.

1 1 |Н 1 _)--------... ( I Индекс увеличения 1 ..............1

|гр| Доза препарата I лимфоузлов 1 1 | Р 1

1 1 И 1 1 1 Контроль 2,4-Д 1 1 I 2,37+0,12 I 1 1

12 1 1/20 1Ьда .! 1,78+0.16- I р<0,001 |

13, 1 1/50 | 2.12+0,19 I р<0.01 |

14 I 1 1 1/100 1Л)„ Карбофос I ?., 19+0.15 I 1 1 р<0,01 |

15 I 1/20 1 1.56+0,14 I р<0,001 |

16 I 1/50 I {,69+0.10 I р<0.001 |

17-11 1 1/100 Ь0Л I 1.82+0,16 ' I J . ....... 1 р<0,001 | ......•. ,1

Нами изучалось влияние разных доз карбофоса и 2,4-Д на развитие реакции ГЗТ. Результата представлены на рис 2.

6 5 4

р.

В 2

О

1/100 1/50 1/20 1Л)50 Доза

препарата

Рис.2. Выраженность реакции ГЗТ у животных, получавших пестициды 2.4-Д и карбофос (первый столбец - индекс реакции, определяемый по объему лапок; втсрг' столбец - индекс реакции, определяемый по весу лапок).

Примечание: I I - 2,4-Д , Н - карбсфо-.

- 13 -

Важная роль в регуляции иммунного ответа отводится Т-оупрвссорам. По мнении многих авторов (Loose L.D.,1982; Clark -D.A. et.al, 1Э81; Hambacti A. et.al., 1963), иммуносупрессия. обусловленная химическими факторами окружающей среды (дильдрин, гек-сахлорбензен , 2, 3, 7, 8-тетрахлордиОенэо-р-диоксин. свинец ), вызвана индукцией Т-супрессорных клеток .

Нами изучалась активность Т-специфических супрессороз в системе адаптивного переноса. Для этого Т-супрессоры, индуцированные большой дозой антигена, переносили сингатым реципиентам. которых стимулировали оптимальной дозой того же антигена. Функциональную активность специфических Т-супрессоров оценивали по степени подавления антителообразования у реципиентов при воздейс гвии разных доз пестицидов в 2 вариантах;

а¡введение донорам гипердозы эритроцитов Сарана и через 4 суток пероральная обработка пестицидами в течение 5 дней : б)5-дневное введение донорам пестицидов и через 4 суток антигенная стимуляция .

Результаты опытов .представленные в таблице 5. показали, что карбофос и 2,4-Д повышали активность попучяции Т-супрес-соров, тестируемых в системе адоптивного переноса по степени специфического ингибирования гуморального ответа.

Малые дозы карбофоса, введенные до индукции Т-супрес-сорных клеток, и исследуемЫГдозы ,, введенное на стадии иммуногенеза , оказывали стимулирующее влияние на выработку кле-ток-супрессоров. Потенциирующлй эффект малой дозы препарата, возможно, объясняется селективным действием его на предшественники Т-клеток таким образом, что при последующем введении антигена усиливается образование сулрессоров .При обработке мы-, шей гербицидом 2,4-Д до антигенной стимуляции наблюдалось достоверное увеличение сулресссрной актавнойти клеток на 35% при введении 8мг/кг и на 60Я при дозе 20мг/кг. А доза 4мг/кг не оказывала влияние на формирование Т-супрессоров , индуцированных зритрцитами барана . Гербицид, ' вводимый после корпускулярного антигена .значительно повышал супрессивный эффект донорских клеток , что способствовало снижению числа АОК у реципиентов на 80-90% в зависимости от концентрации вещества.

Таким образом, результаты опытов свидетельствуют о том, что карбофос и 2,4-Д повышают генерацию клетс.. в селезенке,способных при переносе сингенньм реципиентам оказывать супресси^ -ной действие.

Ими'уносупрегссивный эффект был более выраженным и дозо-- 14 -

.¿''Иммунный ответ у реципиентов при трансплантации клеток селезенки сингенных доноров, обработанных разными дозами пестицидов до (числитель) и.после (знаменатель) введения антигена-индуктора,

1 г Вводимые . 1 # 1 Число АОК на 10 спле-1 ............1 Индекс I

Жпп| препараты, мг/кг ноцитов (X к контро-| ло' ответа) | 1 супрессии I

1 1 1 0.8555-ньй раствор ИаС1 (контроль иммунного ответа) Карбофос 1 100 / | 1 0 1

1 2 | О (контроль супрессии) 37. 0+4,0 | 0,63 |

1 з | 5 18,0+5,0*" | 0,82 |

31.0+5,0"** | 0,69 |

1 4 1 ю 32.0+6,0"' | 23.0+6,0*** | 0.68 |

0.77 |

1 5 I 25 . 2.4-Д . 35.0+9,0 ' | 13.0+2,0*" | 1 0,57 | 0.87 |

1 6 I 0 (контроль супрессии) .. 49.0+11.0 . | 0.50 |

1 7 1 4 58, 0+14, 0 | 10,0+1,0*** | 0.43 | 0,90 |

1 8 I 8 34. 0+5. 0*** | 0.-66 |

. 6,0+1.0"* | 19.0+3,0*"* I 4.0+1.0*** | | ' 0,94 |

1 9 | | " 20 0,80 | 0,96 ! 1

Примечание: *»» - р<0,001. 'зависимым, если препараты вводили после антигенного стимула . По-видимому, в данном случае пестициды повышали интенсивность образования супрессорных клеток в результате непосредственного влияния на иммунную систему . А усиление иммуносупрессии на фоне предварительной интоксикации, которое не носило строгого до-! зозависимого характера, обусловлено, по-видимому, действием на иммунные реакции через нейроэндокринные системы. Так. в работах, в. Р.Саза1е е1.а1. (1983), В.Т1е1епЬасЬ е1 а1. (1983) показана .

- 15 -

связь'между холинергической стимуляцией и иммуносупрессией, индуцированной такими антихолинэстеразными агентами, как паратион , малатион, ДДВФ. фосфамид. хлорофос.

2.1.3. Влияние пестицидов на функциональную активность макрофагов

Функциональная активность макрофатов - способность к миграции. захвату , переработке и уничтожению антигенного материала оценивается в реакции спонтанной миграции, фагоцитарной активности, определения состояния лизосомалыюго аппарата и др.

Нами изучаюсь влияние разных доз пестицидов на фагоцитоз латекса (фагоцитарный показатель, фагоцитарное число), спонтанную миграцию и прижизненное окрашивание лизосом макрофагов акридиновым оранжевым. Результата представлены в таблицах 6. 7, и рис.3.

Таблица 6

Фагоцитоз латекса перитонеального'макрофагами мышей, подвергнутых воздействию 2. 4-Д и карбофоса (М+т,п=70)

I—г

т--1

Фагоцитарное число

1Н I

|пп| Препарат

Доза препарата, мг/кг

Фагоцитарный показатель

И 12 ¡3,

14

15 16. 17

Контроль 2. 4-Д

Карбофос

О

4 8

20

5 10 25

97,3+1, 1, -"86, 7+2, 4* 78, 3+1,8" 59,1+4,8* 85,7+3,1* 79,6+2,4* 60,9+2,9*'

19,5+0,6 15.8+0,5* 13, 9+0,3' 11.2+0.4* 16, 0+0.6*

14,1+0,7 11.8+0,6"

Примечание: * - р<0,05. ** - р<0,01, *** - р<0.001.

Введение карбофоса и 2,4-Д снижало миграционную, фагоцитарную активность макрофагов , ингибировало включение в лизосоыр макрофагов г пюоресцирущгго' вещества-акридинового оранжевого. ИьмуиосупрессиЕный эффект был дозозависимым. Наибольшее действие окагнвала доза 1/20 Ц)^,.

2.1.4. Активность естественных киллерных клеток селезенки мышей при обработке их пестицидами.

Роль'естественных, киллерных клеток (ЕКК) поддержании иммунного гомеостаза чрезвычайно важна.ЕКК обеспечивают не толыи противоопухолевую зтциту, .но и выполняют регуляторную функцию.

Нами изучалось состояние естественной цитотоксичности при - 16 -

Спонтанная миграция перитонеальных макрофагов мышей, подвергнутых воздействию пестицидов (М+т).

Мпп

Препарат

Доза препарата (мг/кг)

Радиус спонтанной! миграции | (п>т) . I

I :

Контроль 2.4-1 (П-40)

1.;

О 4

8

20

0.128+0,018 0. 098+0,014

0.045+0,01 ; 0,027+0.012*

' р<0, 01 р<0, 001

Контроль Карбофос (п-40)

О 5

10 25

0.119+0, 014 0,118+0,015

0,059+0, 013 0,041+0,013

I

I р<0,05 I р<0,05

Р

контроль 1/100 1/50 1/20

Доза пестицидов Рис. з.Включение акридинового оранжевого в лизосомы дери- 17 - • •

тонеальных макрофагов мышей, подвергнутых воздействию разных доз 2.4-Д (Н) и карбофоса (| |). воздействии разных доз пестицидов.

Известно, что одну мишень могут лизировать одновременно несколько эффекторов и что сдан эффектор взаимодействует с несколькими мишенями, мигрируя от одной к другой . Следовательно, необходимо было подобрать оптимальное соотношение эффектор: мишень, чтибы определить изменение активности ЕКК.

Наш: были использованы соотношения ЕКК: клетки мишени, равные 300:1, 200:1, 100:1, 50:1. и получены соответствующие значения цитотоксического индекса (ЦТИ, в 35). В дальнейших экспериментах было ~ использовано соотношение ЕКК:клетки мишени, равное 200:1. Данные по влиянию 2,4-Д и карбофоса представлены на рис. 4, 5.

1.0

о *

ф

и

ф

¡У

к

о *

о

е< □

0.5

V

\

Ч

\

/у

С-л

У-

О 13 7 14

, Дни эксперимента

Рис.4.Естественная киллерная активность клеток селезенки мышей, подвергнутых воздействию карбофосом в дозах: 5мг/кг

(----), 10мг/кг (-----), 25мг/кг(—г«-) и контрольных (--)

при соотношении КЗ: КМ 200:1.

Активность ЕКК изучалась в динамике: на 1-, 3-, 7- и 14-е сутки. Все три исследуемые дозы пестицидов снижали естественную цитотоксичность клеток селезенки мышей. Наибольшее снижение ци-тотоксического индекса наблюдалось на 3-й и 7 е сутки эксперимента. Если на 14-й день эксперимента цитотоксическая активность клеток мышей под влиянием доз 1/100 и 1/50 Ю^ карбофоса была близка к контролю, то для 2.4-Д ЦГИ при воздействии 1/100

- 18 -

1,0

u ы

о)

5 0.5

<d

о w о к

о

\

"V' т \

1

0 1 3 7 14 .

Дни эксперимента

Рис.5. Естественная киллерная активность клеток селезенки мышей, подвергнутых воздействию 2.4-Д в дозах: 4 мг/кг

(----).8мг/кг(-----).20мг/кг (—-«-) и контрольных (--)

при соотношении КЗ: КМ 200:1. и особенно 1/20 значительно отличалась от контроля , что, по-видимому . связано со способностью части количества 2,4-Д , попавшего в организм , кунулироваться в органах.

Чтобы.более точно и дифференцировано установить характер и степень нарушения активности естественных киллеров на 3-й и 7-е сутки эксперимента после воздействия пестицидов, мы проанализировали показатели ЦТИ при разных соотношениях КЗ:КМ, . равных 200:1, 100: "l, 50:1. Данные представлены на рис. 6 и 7.

Как видно из рисунков, подавление цитотоксической активности ( р<0.05 ) наблюдалось и при использовании соотношений КЭ:КМ. равных 100:1 и 50:1, при введении 2,4-Д, а карбофос в дозах 1/100, 1 LDjpHe снижал ЦТИ на 3-й сутки опыта при данных соотношениях клеток.

Таким образом, введение пестицидов карбофоса и 2,4-Д подавляло естественную цитотоксическую активность клеток мышей. Наибольший иммунодепрессивннй эффект окаяала доза 1/20 LD^. Угнетение функциональной активности естественных киллеров, вызванное введением гербицида 2.4-Д, было выраженным в большей степени, чем при обработке инсектоакарицидом карбофоса^..

Суммируя данные по действию гербиг'да 2,4-Д и инсектоака-рицида- карбофоса на организм лабораторных животных в опытах 1п vivo, можно заключи :ь, что данные препараты угнетали показатели

. - 19 -

о te о

9

я

о

ф

£

о »

о н о н

20 h

10

50:1

ЮС: 1 200:1

соотношение КЭ:КИ

с м

О

г

S

о

m

sa о н о

20

юь

50:1

100:1

200:1 соотношение эффекторы: мишени. Рис.6.Естественная киллерная активность клеток селезенки

мышей, подвергнутых воздействию 2,4-Д в дозах: 4мг/кг(----),

8мг/кг(-----), 20мг/кг(—-«-) и контрольных (-) на 3-й

(А) и 7-е (в) сутки эксперимента при разном соотношении КЭ:КМ.

20 Ь

и к)

О

и

9 10

И

о н

о

к

-------------------1

50:1

100:1 200:1

соотношение КЭ:КМ

30

о м

О)

и <и

И

о &

с*

£

•20

50:1 100:1 " 200:1

соотношение эффекторы: мишени-Рис.7.Естественная киллерная активность клеток селезенки мышей , подвергнутых воздействию карбофоса в дозах: 5 мг/кг

(-----).10мг/кг (-----), 25мг/кг (-*-«-) и контрольных (--•)

на 3-й (А) и 7-е (Б) сутки эксперимента при разном соотношении КЭ: КМ.

клеточного и гуморального иммунитета, функциональную активность макрофагов и естественную цитотоксичность клеток. Эффект носил ; дозозависнмый характер.

Однако, по данным ряда авторов ( Szot R. I.. Murphy S.D.. 1970; Casale G. P. et.al., 1933), иммунодепрессивное действие пестицидов может быть обусловлено глюкокортикоидами, выделяющимися в ответ на токсикохимический стресс. Хотя авторы не исключают возможности прямого действия пестицидов (в частности, фосфорор-ганических) на иммунную систему.

Для изучения прямого действия пестицидов на иммунокомпе-тентные клетки были проведены исследования в системе In vitro.

2.1.5. Оценка иммуномоделирущегс действия пестицидов в опытах In vitro-

Наши и литературные данные (Esa А.Н., et.al., 1988) свидетельствуют о том. что функции моноцитов наиболее чувствительны, в частности, к воздействию фосфорорганических соединений, чем лимфоциты. Были поставлены следующие тесты . характеризующие функциональную активность макрофагов: розеткообразующая способность, фагоцитоз эритроцитов барана и хемиломинесценция макрофагов. Результаты представлены в таблице 8 .

Таблица 8

Влияние разных доз 2.4-Д и карбофо? in vitro на реакции розеткообр?.зования и фагоцитоз опсонизированных эритроцитов барана перитонеальными' макрофагами мышей (М+гс)

т 1-1

I Фагоцитарный |Фагоцитарное I показатель I число I n=80 1 " п=80

Ч-1--—

183.57+1:84 16.50+0.084 174,7+1.46***^ 15. 04+0, 233* * * 169,44+1,23*" 14.65+0, 106*** 158,78+1. 43*" |3, 5Э+0,110***

Nnn

препарат

Доза I % розетко-npenapj образования мкг/мл| п=80 ,

2.4-Д

0 188.63+1,19

1 187,33+1.35 10 186,0+2,02

100 173.67+2.56*

н-

188, 63+1,19 190,5+1.29 186,87+1,25 180,0+2,35'

Карбофос

0

1

10

100

180,78+0,77 16,60+0,118 177, 4+1, Ю* 14,89+0,104*** 170, 56+1, 00*" 14. 48+0, 070*** 157. 4+1, 83*** 12,82+0.100***

Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, **» - р<0, 001. 2.4-Л и карбофос в дозах 1,10мкг/мл незначительно угнетали - 22 -

процесс розеткообразования, лишь доза 100мкг/мл вызывала достоверное снижение реакции образования розеток с эритроцита™ ба-- ''■рана. Оба препарата в исследуемых дозах оказывали достоверное ■ ■, депрессивное действие на фагоцитоз эритроцитов, снижая как фагоцитарный показатель, так и фагоцитарное число.

Характер спонтанной хемилюминесценции клеток в присутствии люминала пр добавлении разных доз карбофоса (0,0003-30 мкг/мл) и 2,4*Д (0,0018-18 Мкг/мл) указывает на то. что оба препарата в исследуемых дозах Не подавляли образование.активных форм кислорода макрофагами.

Для изучения гуморального иммунного.ответа In vitro широко используется система культивирования клеток селезенки, предло-' Генная в 1960 году Мишеллом и Даттоном. В культуре клеток селезенки под влиянием антигена- чаще acero эритроциты барана - появляются антителообразующие клетки, количество' и время появления которых примерно такие же, как и при ответе in vivo , / Генерация антител на.эритроциты барана In vitro представляет ' собой систему, зависимую от взаимодействия В-, Т-клеток и макрофагов (Masler D.E. et.al.. 1968).

Результаты экспериментов по влияние пестицидов в разных дозах на индукцию антителооСразующих клеток in vitro представлены н?\ рис.8.Карбофос в дозах 10; ЮСмкг/мл вызывал достоверное

18,

* 16

3 14

0

3 12

» -10

<в

1 в

2 О

Рио.8.Влияние пестицидов на индукцию клеток, образующих -антитела в суспензии спленоцитов in vitro. |—| - карбофос, I I - 2.4-Д. ■

1*1 dfc i 4| ; Й íj

контроль i 0 .00 .мкг/мл

угнетение образования АОК селезенки In vitro. А внесение в культуральную среду 2.4-Д в дозах 1; 10; 100мкг/мл достоверно' снижало количество антателообразующих клзток в суспензии спле-ноцитов In vitro.Гербицид 2.4-Д обладал более выраженным токсическим действием, чем карбофос, поскольку доза, равная 1 мкг/мл, вызывала значимое угнетение образования АОК в культуральной среде.

Таким образом, результаты исследований, проведенных lti vitro, свидетельствуют о непосредственном влиянии пестицидов на функции иммунокомпетентных клеток.. Иммуногоксичность карбофоса и 2,4-Д In vitro, по-видимому, обусловлена влиянием на процессы узнавания антигена , а также активации, пролиферации и диффе- . ренциации лимфоцитов в суспензии клеток . Так. по мнению К.E.Rodgers et.al. (1986). иммунодепрессивный эффект in vitro тримегилфосфоротиоата (примесь малатиона) и циклодиенового инсектицида хлордана связан с ингибированием мемфоцитарной пролиферации.

2.1.6. Влияние карбофоса на формирование поствакцинального иммунитета

Существующая практика борьбы с эктопаразитами - переносчиками инфекций с помощью инсектицидов часто сочетается с проведением массовых вакцинаций.в ветеринарной и медицинской практике. В этой связи представляет интерес -изучение процесса формирования поствакцинального иммунитета в условиях сочетанно-го влияния вакцины и инсектицида на организм.

Нами изучалось развитие поствакцинального противосибиреяз-венного иммунитета у кроликов, иммунизированных вакциной СТИ и обработанных накожно 0,5%-ной водной эмульсией карбофоса в раз- ' личных сочетаниях.

Уровень изменений титров антител, определяемый в РИГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом, в течение всего эксперимента у животных представлен в таблице 9. Динамика антите-лообразования у иммунизированных животных характеризовалась однофазным пиком. Предварительная обработка животных карбофосом подавляла гуморальный иммунный ответ на вакцину. ■Иной эффект наблюдался, когда животных после вакцинации обрабатывали карбофосом - отмечалось повышение антителообразования.

Анализ превентивных свойств сывороток криви, иммунизированных и обработанных инсектицидом животных на 90-й день эксперимента, свидетельствует об идентичных изменениях, в иммунном отгсте организма (таблица 10).

- 24 -

\ Та0.пица 9

Результаты определения антител в сыворотках крови кроликов, вакцинированных СТИ и обработанных карбофосом, з РИГА

1 1 ! | Группы Дни исследования ... . ,

| | животных

1

1 1 1 1 • О 8 15 30 45 60 ■ * 75 90 I

г 1 11|Карбофос+2дня+СТИ 1: 1.00+0.23 1:3.00+ 1 37.3+14.1 0 о - 1: 8.00 + 0 1 10.60+1

ii 3.26 5,66 3.121

|2|Карбофос+7дней+ 1: 4.0+1.1 0 1 28+12 "о 0 0 0 1 5.30+ |

| | СТИ 4.37|

|3¡Карбофос и СТИ 1: 4.40+1.26 1 32.0+ 1 96.0+40.5 1:24.00+ 1:12,00+ 1: 8,00+ 1:5,30+ 1 8,00+ |

1 I (одновременно) 1 27,7 11.78 5,89 3,27 4.37 5.66 1

1 ., 141СТИ+2дня- .^арбофос 1: 5.20+2.55 1 136,0 1 284,0+ 1:256.0+ 1:160+ 1: 130+ 1: 128.00+ 1 128,0+1

1 1 118.9 246.9 104.5 102 102 5,66 110,91

5|СТИ+7дн.+карбофос 1: 4,40+0.98 1 76+60 1 176,0+ 1:272+240 1:15,3+ 1: 21.30+ 1: 18.8+ 1 15.6+ I

ii-'. 114.3 8.3 17.43 10.6 8.8|

|6|Карбофос • 1: 6.60+1.33 0 ' 0 0 0 0 0 0 !

IТ|СТИ 1: 2.6+2.2 1 26.6+ 1 53.30+3.17 1:32,00+ 1:5,30+ 0 1: 16.00+ 1 8,0+ |

ii : . 15.9 . 13.06 4.37 11.31 5.6|

|8|Интактные | | о .' 0 ■ 0 0 0 0 0 0 1

Превентивные свойства сывороток крови кроликов на 90-й день эксперимента.

II I | Сыворотки I I крови животньх 1 I Доза сыв-ки I в разв. 1:5мл 1 1 Доза заражения! СТИ (спор) | 1 1 8 1 защиты 1

I 1 -'■■- 111Интактные 1 1 100*10" 1 0 1

|2|СТИ 1 0.5 100*10' | 60 I

13IКарбофос+2дня+СТИ 1 0.5 100*10* 1 о 1

|4|Карбофос+4дня+СТЙ 1 0,5 100*10* 1 20 |

|5|Нарбофос и СТИ 1 0,5 100*10* 1 40 |

t 1(одновременно) 1 1

16|СТИ+2дня+карбофос 1 0,5 100*10* | 60 |

171 СТИ+7дней+карбофос II . .. ..... .. ., 1 0.5 L......- „ 100*10® | 1 80 | .........1

Полученные результаты отражают иммуномодулирующий эффект карбофоса на напряженность поствакцинального иммунитета.

■ , 2.1.7. Схема иммунотоксикологического скрининга пестицидов v и определение безопасных для организма концентраций пестицидов

Анализ данных ло влиянию перорального введения карбофоса и >' 2,4-Д в дозах 1/20,1/50. и 1/100 ц^на показатели иммунной системы организма указывает на' иммуносупрессивный характер воздействия препаратов. Наблюдалось угнетение как клеточного, так и гуморального иммунитета у зшвотных. Понижалась функциональная активность макрофагов, естественных киллеров. Исследования In

■ vitro свидетельствуют о прямом, непосредственном влиянии пестицидов на иммунокомпетентные клетки. Одним из механизмов действия ■ пестицидов (карбофос,2,4-Д) является влияние их на индукцию ан~ тигенспецифических Т-супрессоров.

Стратегия иммунологического скрининга химических веществ предусматривает поэтапную оценку иммунотоксикологических свойств, постепенно подводящу» к выявлению наиболее чувствительных мишеней и определению его минимальной действующей дозы.

К тестам 1 уровня, позволяющим выявить потенциальный имму-нотоксичный пестицид, относятся классические токсикологические показатели: вес тела и органов иммунной системы, гематологические показатели крови, гистоморфологические цуказатели органов иммунной системы (табл.11).

Проведенные нами экспериментальные тесты предложены в ка-честа тнл'оь 2-гк уровня при оценке иммунотоксикологических

- 26 -

Таблицу 11,

Схема иммунотоксикологического скрининга пестицида , 1

i—г H I зт|

Цель

этапа

H--

1,1 Выявление имнунотрошшх ¡пестицидов.

2,|Анализ имнунотоксиколо-|гических свойств lin vivo:

|а)оценка гуморального I звена иммунной системы |б)изучение клеточного I звена иммунной системы

Методы

оценки

II-

I

Iв)анализ функции макрофа I гов I

1")оценка естественной Iцитотоксичности |д)определение устойчивости к инфекции 1 In vitro:

Iе)оценка функциональной I активности иммунокомпетентных клеток

Iж)анализ аутоиммунных I изменений в организме |з)оценка иммунотоксико-I логических свойств метаболитов пестицидов tin vivo I

lin vitro I

Вес тела и органов иммунной системы. гек-гологические показатели кроьл, гистоморфологические показатели органов иммунной система

Подсчет количества АОК. титры ге-ыагглютининов,

РТПХ(реакция "трансплантат против хозяина")

ГЗПгиперчувсгвительность замедленного типа)'

Активность специфических Т-суп-рессоров

Фагоцитоз латекса, включение акридинового оранжевого..спонтанная миграция.

Активность естественных киллеров

Заражение патогенными культурами микроорганизмов

Индукция АОК в суспензии сплено-цигов. хемилюминесценция макрофагов, определение розеткообразую-цей способности макрофагов, фагоцитоз эритроцитов барана. Определение аномальных антигенов и антител к ним.

Введение индукторов монооксиге-назной системы и определение АОК Предварительная инкубация пестиг цидов с Б-9 и определение Ж в суспензии спленоцитов.

свойств пестицидов, позволяющих выявить наиболее чувствительное • звено иммунной систст.

Гакик образом,нами экспериментально апробирована ступенчатая, яаухуропнееая система иммунотоксикологического скрининга ' пестицидов.использование которой предотвратит использование наиболее токсичных для иммунной системы организма препаратов.

Состоят, иммунной системы организма при воздействии пестицидов может служить одним из критериев дифференциации их порогового и токсического действия.

При определении пороговых доз воздействия пестицидов на состояние иммунной системы организма использовано соотношение, связш.апяое цозу ц эффект. А в качестве результирующего показа- • теля реакци.. организма был выбран статистический критерий Сть-юдента.

Зависимость дозч-эФСект описывалась экспоненциальной Функ-иней: t-1«. i 1 -е Г, где х- внесенная доза пестицида(мг/кг) ; t-критерий Стыадента; too -предельное значение t при х-»00 : а -параутр модели, выражающий скорость процесса, крутизну функции.

v- результате обработка опытных данных были получены следующие уравнения связи -qu**. для карбофоса: t-17.74(l-e _ ): для 2.4-Д ; t»8.1В( i-o~a'"x ).

& ор статистического показателя пгй исследовании пороговой дозы позволяет, вследствие его безразмерноети.расширить вы- • борочную совокупность для определения Функций. При этом за пороговую дозу принималась доза.выливающая достоверное изменение.

При з.ланном уровне надежности определяли критическое значение распределения Стьюдента с учетом числа степени свободу . Используя эмпирические формулы, оценивали критическое значение . дозы х* для обоих пестицидов,

В качестве порога действия фактора использовали правый конец овернтелького интервала.то есть минимальное значение, которое, в соответствии с определением в гигиене, приводит к появлению статистически значимого эффекта.

Нами были проведены эксперименты для проверки расчетных : данных, которые доказали справедливость предлагаемого метода. . Дозы.равные 0,33(0.56-0.23) мг/кг карбофоса и 0,94(1.57--0,63)мг/кг 2,4-Д.не вызывали достоверны- изменений показателей А при воздействии карбофоса в дозе 0.79мг/кг(0,56+0.23) и 2. А-Д в дозе 2,2 мг/кг (1,57+- 0,63) наблюдалось достоверное отличие от контрольных значений.Таким образом.экспериментальная провер-S - ?.Е -

ка по математической модели "дсза-эИект" в г сотвстотвии с изложенным методом доказала справедливость предлагаемого иетсяа.

Резюмируя полученные результаты, следует отметить, что ьиа-лиз ими:, нной сис-.емы организма при возаейстьии 2.4-Л и кар бою-са позволил разработать методологические подходы ч систииу 'ни-мунотоксикологического скрининга пестицидов, а также ползал возможность использования иммунологических критериев при оценке пороговых доз воздействия пестицидов.

2.2.Образование аномальных антигенов и антител к (¡им в органах крыс, подвергнутых воздействию пестицидов

В последние годы появляется все больше данных. свидетепь- . ствующих в пользу предположения о том . что химические вещества являются этиологическими йакторами аутоиммунных заболеваний.

Известно.что низкомолекулярные химические соединения . в частности, пестициды, приобретают, антигенность при коиплексирова-¡:ии с белками организма. Большая роль в образовании комплексов принадлежит монооксигеназной системе, способствующей образованию высокореактивных метаболитов.связывающихся с белками. Появление аномальных комплексов инаудирует иммунный ответ организма в виде образования гуморальных противокомплексных антитеч.

В связи с этим особую задачу исследования представляло выявление аномальных антигенов, образовавшихся при длительном поступлении малых доз пестицидов в организм, и изучение антите-лооС. азования к ним.

Исследование антигенной структуры печени крыс . подвергнутых воздействию гербицида 2,4тДА в дозе 1/100 показало наличие аномальных комплексов, обнаруживаемых на 15-,90- и 120-е сутки введения препарата (табл.12).

Антигенные комплексы по своей электрофоретической подвижности находились в области <£-,/>-. глобулинов.

Положительная реакция экстрактов.печени крыс с антителами против искусственного антигена 2,4-Д-ЧСА указывает на присутствие в аномальных комплексах гербицида.

Образующиеся аномальные антигены органоспецифичны для печени. Лишь при действии 2.4-ДА в течете 15 дней в печени крыс выявлялся аномальный антиген.характерный и для других органов, . который в последующие сроки не обнаруживался . Мы попытались выделить и очистить белок , связывающий гербицид 2,4-Д. Для этого была использована методика КеМегег(1972) с модификациями. Идентификацию фракции, содержащей белок, связывавши" гербицид. осуществляли на, всех этапах выделения и очистки методом '

- 29 -

* Таблица 12

Результаты реакции иммунсэлектрофореза экстрактов органов крыс, получавших 2,4-ДА , с антисывороткаки к различным аятигенаи.

-г

Иммунная ивсротка кройк кроликов

А.Иммунизированных экстрак том печени ^рыс.получавших 2,4-ДА в определенные экспериментом сроки.

Б.Против экстрактов печени крыс, получавших 2,4-ДА.ис то«ц..лая экстрактом печени контрольных крыс.

Экстракты органов крыс

-Г--1-

печень -!-

опыт |контр

* ! +(-) I

во все

1

/Чна| 15.901 120дн|

почки

—I—

опыт

сроки опыта

«ь-(на 15

день

контр

легкие

—I-

опыт

контр

+-

В.Прот з искусственного антигена 2,4-Д-ЧСА.

+ I ♦ \L-.pA ММ

на 15|

дя Л-1 }- на| 90. | 120днI

+

+

+-

^

+

+

имму 1преципитации с антисывороткой к искусственному коньсгату 2,4-Д-ЧСА. •

Методом ионообменной хроматографии и гель-фильтрации выде-" лили и очистили оелки печени крыс, связывающие гербицид. ¡Диск-электрофорез в полиакриламидном геле выявил две узкие интенсивные полосы, которые соответствуют двум видам белков (фо-'"^01 ■)'.:, Полученные фракши Селкоп, по-вигмому. аналогичны белькам, которые "специфически связывают вещества эндогенного и •экзогенного происхождения в процессе метаболизма.

V. ч ' - зо -

а

Фото 1. Лион-электрофорез белков печени крыс, связцвайшх 2.4-Д.

Таким образом, выявленное коны-ирование 2.4-Л с белками печени ln vivo подтверждает наличие процессов образования комплексов при метаболизме 2.4-Д в организме животных и возможность включения иммунологического механизма детоксикации гербицида.

Одним из проявлений индукции иммунной системы организма на хроническое введение гербицида 2,4-Д является образование про-тивокомплексных, противооргачных антител.

Нами изучалось образование противотканевых антител к органам и тканям животных, получавших в течение 130 дней 2.4-ДА в дозе 1/100 LDjp.

Данные реакции связывания комплемента и реакции пассивной гемагглютинации свидетельствуют об иммунологической реакции всех органов и на протяжении всего эксперимента. Наибольшее увеличение титров противотканевых антител отмечено на 15-24 дни эксперимента для всех органов пс опытных крыс. Следует отметить, что для антигенов печени характерно также повышение титров антител к 90 дню эксперимента ■. выявляемое как в реакции сеязьсЭния комплемента, так и в реакции пассивной гемагглютинации (рис. 9). Уровень циркулирующих прогивопочечных и иротаволе-гочных антител оставался без изменений на 30 и последующие сроки опыта, включая восстановительный период (до 210 дня).

Изменения титров антител в органах и тканях контрольных животных на протяжении всего эксперимента объясняются наличием 2.4-Д в кормах (овес содержал 0,162+0,010мг/кг.комбикорм -0,062+ 0,004мг/кг).

Для установления специфичности выявленных аномальных комплексов и антител к пим были получены искусственные антигены 2,4-Д-белок и антисыворотки к ним. Наиболее активные иммуносыво-ротки были получены при (5, иммунизации кроликов коньюгатом 2,4-Д-ЧСА, ' содержащим в своей структуре 6 молекул препарата на тздну молекулу белка-носителя.

В результате постановки реакций пассивной гемагглютинации и связывания комплемента экстрактов органов крыс с иммуносыво--роткой против коньюгата 2,4-Д-ЧСА получены положитель. .з результаты во все сроки эксперимента. Наибольшая активность

- 31 -

А

3 1:60-

стадии опыта (дни)

в

стадии опыта (дни)

Рис. 9. Динамика изменений средних титров противотканев'нх . антител к антигенам печени подопытных крыс, получавших 2,4-ДА в течение 180 дней:

-- опыт А - результаты РПГА

----- - контроль В - результаты РСК

экстрактов была обнаружена на 90-й день п.отупления препарата и -характеризовалась увеличением частоты положительных реакций и уровня титров антител. Следует отметить, что чаще иммунная сы-

- 32 -

воротка реагировала с антигенами тканей печени (И случаев из 12) и легких (11 из 12) подопытных крыс, получавших гербицид.

Поскольку нами выявлено комплексообразование ("елкой тканей печени, почек и легких с 2,4-Д при хроническом его потугльнии в организм , была предпринята попытка выявления циркулирующих антител к ним в сыворотках крови крыс. Сыворотки крови крыс анализировались в РПГА с искусственна антигеном 2.4-Д-ЧСЛ и белком-носителем ЧСА. Положительная реакция сывороток крови контрольных и опытных крыс с коньюгатом наблюдалась на 90-Я день эксперимента. При этом следуют отметить, что титры антител к тест-антигенам были в 2 раза выше, чем к белку-носителю, взятому для конъюгации.

2.3. Клинические испытания искусственного антигена при анализе иммунологической реактивности организма

Отсутствие специфических иммунологических критериев оценки влияния пестицидов на организм побудило нас к использованию искусственного антигена для анализа иммунологической реактивности организма людей, имеювдх прсизвсдственный контакт с пестицидами.

Были проанализированы сыворотки крови рабочих, заня~ых на производстве карбофоса, в объединег'и "Куйбышевфосфор".

Технологический процесс производства карбофоса условно состоит из пяти стадий: 1) получение диэтилового эфира малеино-вой <.»1 слоты (ДЭМК). 2) синтез диметилдитиофосфорной кислота (ДДФК), 3) получение карбофоса-сырца в результате взаимодействия МФК с ДЗИК, 4)получение препарата карбофоса в результате смешения карбофоса-сырца с эмульгатором и 5) розлив карбофоса.

Все стадии процесса изолированы, за исключением розлива готовой продукции, который ведется вручную - шлангом.

Образцы крови анализировались в реакции связывания комплемента с рядом комплексов, которые содержали в качестве гаптена карбофос, а белков-носителей : ЧСА. БСА, белки куриной сыворотки и белки печени крыс, подвергнутых воздействию карбофоса.

В качестве контрольных . образцов использовали сыворотки крови доноров, не имевших контакт с пестицидами.

Сыворотки крови рабочих положительно реагировали с полученными коньюгатами. Средние титры антител колебались от 1:165 до 1:386. тогда как титры антител в контрольной группе были на уровне 1:10 и ниже. Наибольшей активностью взаимодеГ тьия с комплексами обладали сыворотки крови рабочих, занятых на розли-.

- 33 -

ве готовой продукции. 4 и 2 стадиях технологического процесса.

Результаты согласуются с данными, полученными сотрудни;сами КуйСыисоского научно-исследовательского института гигиены о превышении ПЛК кярбофоса в воздухе рабочей зоны 4 стадии технологического процесса и стадии розлива готовой продукции. Высокая активность сывороток крови аппаратчиков 2 стадии технологического пропс, а и&ъясияется. по-видимому, тем, что специфичность антител к карбофосу обусловлена детерммнантой-диметилди-тиофос^рной группой, которая присуща и карбофосу, и ДД1>К.

Положительная реакши сывороток крови работающих с искусственными антигенами, содержащими карбофос, упзывает на то . что организм контактирующих сенсибилизирован препаратом. Степень сет—^илизации. по-видимому, зависит от уровня контакта с карбофосом.

В дальнейшем мы попытались изучить влияние производственного стаха рабочих в данном цехе на активность сывороток крови. Наибольшие показатели комплеиентосвязивающей способности сывороток крови рабочих отмечены при стаже работы 5 лет. Различный уровел^ антител в кропи рабочих с разным стажем работы в данном •цехе, по-видимому, можно объяснить наличием того или иного феномена иммунологической реакции организма . а именно явлениями сенсибилизации, толерантности и гипосенсябилизация.

С : льо определения циркулирующих комплексов карбофос-белок в сыворотке крови рабочих ми использовали иммунную кроличью сыворотку против коныогата к-ВСА. Сыворотки крови рабочих, занятых на производстве карбофоса.дали положительную реакцию с иммуносывор п:ой. Титр антител в реакции связывания комплемента колебался от 1:40 до 1:160. Средний титр антител сывороток крови доноров при взаимодействии с иммуносывороткой равнялся 1:22+Ь.в. Достоверное увеличение титра антител сывороток крови рабочих при взаимодействии с иммуносывороткой указывает на цир-кулягчо в креви рабочих комплексов карбофос-белок.

По-видимому, выявленные комплексы карбофос-белок в крови рабочих, а также циркулирующие антитела к ним являются одним из факторов возникновения иммунопатологического процесса.

Использованный метод с применением искусственных антигенов 'озволил определить уровень антителообразованкя организма людей, занятых на производстве карбофоса, в зависимости от длительности и интенсивности его воздействия при отсутствии клинических признаков интоксикации . Все это свидетельствует о возможности использования данного метода для ранней, доклинической

- 34 -

диагностики вредного воздействия карбофоса на организм.

По результатам работы подготовлены методические рекомендации ■"Использование искусственного антигена кар'офос-белок для раннего выявления воздействия карбофоса на иммунологическую реактивность организма", которые утверядены МЗ России и рекомендованы для специалистов профпатологическях и аллергологи-ческих больниц и клиник научно-исследорательских инстатутов гигиены труда и профзаболеваний.

2.4.Способы коррекции иммунодефицитных состояний и специфической защиты организма от острых отравлений , вызванных воздействием пестицидов

2.4.1. Влияние иммуностимуляторов на показатели, иммунной системы.организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов

Выявленные изменения иммунологической реактивности организма. развивапщиеся под влиянием разных доз пестицидов, харак-|еризуются как вторичные икмунодефицитные состояния. С целы) коррекции показателей иммунной системы животных, .подвергнутых воздействию пестицидов, были использованы следующие иммуностимуляторы: левамизол. спленин, Т-активин, миелопид. Эффективность иммуностимуляторов оценивала rio следующим показателям: количество антителообразуюдо клеток селезенки шлеп, иммунизированных эритроцитами барана, индекс увеличения лимфоузлов в локальной РТПХ, фагоцитарное число и фагоцитарный показатель in. vivo и In vitro при фагоцитозе Staph, aureus.

Как следует из данных, все исследуемые иммунологические показатели животных, отравленных 2.4-Д , коррегировались при введении миелопида, Г-активина. левамизола. А инъекция спленина животным, получавшим 2,4-Д, нормализовала показатели, характеризующие функции антителообразования и фагоцитоза макрофагов.

У животных . отравленных карбофосом , вредение миелопида восстанавливало все показатели иммунной системы организма,

; а при коррекции Т-акт:шиноч, спленином и левамизолом нормализовались показатели функциональной активности макрофагов In vivo и in vitro и количество АОК.,

. Таким образом, использованные иммуностимуляторы при отравлениях пестицидами отличались по степени иммунокорригирутацей активности. Наиболее эффективным средством.• восстанавливающим все показатели иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию 2,4-Д и карбофоса, оказался миелопид (""-бл. 13). По-видимому , эффективность того или иного иммунокорректора за- 35 -

Результаты анализа нкмунокорригирувзей активности

ТаОлш 13

киедоиида у жипстаых. ;:злучав5гх пестицид*

I

Ш1

Группы ■

животных

контроль(даст.вода)

2.4-Д

m viv0-1/20ld : m VltrO-ЮОМКГ/ИЛ. 2.4-Д+миелопид In vivo-ЮОмкг/киь однократно -по so мкг/мыпь трех!фатно in vi tro-o. 1МКГ/КЛ -1МКГ/НЛ

-Ююсг/мл Карбофос in V1VO-1/20LD ; In -иго-ЮОмиг/ил. Карбофос+миелопид in vlvo-ЮОмкг/'мыаь однокгатнэ -по еэмкг-на кызь трехкратно In Vltro-O.1МКГ/МЛ -1 wer/мл -Юмкг/мл

Количество АОК 4 абс.крл. «10 / на 1СГЯД 'сод.

555

35554.06+621S.52

-2Ж

116974,

àtloàfi^ièil 72

.661.76+8В 05

87471.95+9742.62

вь

РТПХ ИУЛ ГО неточности)

2.89+0. il 1.82+0.24"

2.10+0.16* 2.44+0.26

2.13+0.32 2.04+0.22 г, 96+0.23

Показатели фагоцитоза

In vivo

m vitro

•m

90.2+1. 50.6+3.

33.4+3. 93.1+1.

47.0+2, 49.0*4. 71.5+5.

21 7593

01 • •

8

94

94

38.8+1.45 28.4+2.39*

33.7+2.97 34.2+1.82

30.5+1.68 33.2+2.57 37.1+2.19

Cil

87.8+1.77 74.5+3.15*

87.3*1.50 91.0+1.24 83.5+2.62

73.5+2.38

85.4+2.10 86.4+2,23 55.2+1.6"

44

10.4+0.35 7.26+0.40*

9.37+0.46.. 14.4+0.66" 6.37+0.55"

4.98+0.35

6.9+0.48.6.7+0.25 5.08+0.35

N

- p<0.05 . •• - p<0.01 . »•• - p<0.001

висит от механизма иммунопатологического действия пестицидов и механизма иммунокоррекции стимуляторов. - • ¡, '¡'

2.4.2.Защита организма от отравления гербицидом

При отравлении организма гербицидами группа 2,4-Д ,рекомендуется проводить симптоматическое лечение . налрадтшое на восстановление деятельности центральной нервной и сордоч-но-сосудистой систем . обмена вещестг. Специфических методов лечения и антидотов при отравлении гербицидами данной группы не имеется.

Мы попытались использовать специфические ПаЬ'^~ Фрагменты антител к 2.4-Д для защиты организма при остром отравлении данным гербицидом.

Для экспериментов была выбрана доза 2,4-Д, равная 800мг/кг, вызывающая ЮОЗЕ-ную гибель животных в течение 14 часов. Схема получения ГСаЬ*),- Фрагментов антител к гаптену ; состояла из 4 этапов:

- 1) синтез коньюгата 2,4-Д-ЧСА;

2) получение иммунных сывороток;

3) получение иммуносорбента;

4) выделение антител к гаптенам и ПаЬ)4- Фрагментов этих антител.

Оптимальная эпитопная плотность коныогатов 2,4-Д-ЧСА, использующихся для иммунизации и получения активных иммуносыво-роток, составляла (10-12)молекул гаптена на одну молекулу белка-носителя.

Для получения антисывороток с высоким титром антител к гаптену и ' коньюгату использовалось предварительное введете кроликам белка-носителя ЧСА в разных дозах: О, 01; 0,1; 1,0; 10 мг/кг веса, а затем последующее введение конъюгата в дозе 5 мг/кг веса.

Предварительное введение белка-носителя усиливало последующую антигаптеновую реакцию животных, иммунизированных гап-тен-белковыми конь'югатакй. Эффект предварительной иммунизации зависел от дозы белка. Наиболее активной была концентрация ЧСА, равная 0,1 мг/кг. Усиление иммунного ответа к гаптену было наиболее выражено у кроликов, подвергнутых реиммунизации конъюгатом 2,4-Д-Село к (рис.10).

В таблице 14 представлены данные по реакции торможения пассивной гемагглютинации с 2.4-Д и 2,4-Д-моноэтаноламийом, свидетельствующие о том. что получены антисыворотки. Со! дащие . антитела как к связанному, так и свободному 2,4-Д.

- 37 -

доза предиммунизирующего антигена ЧСА (нг/кг)

Нис.10. Влияние предиимунизации белком-носителем на активность сывороток крови кроликов, реимиунизированных конъю-гатои 2.4-Л-ЧСА:

1 - результаты РИГА сывороток крови кроликов с конъюга-ток 2.4-..-ЧСА;

2 - результаты РПГА сывороток крови кроликов с ЧСА;

3 - результаты РТПГА с 2,4-Д в концентрации 4 иг/ил:

4 - результаты РТПГА с 2.4-Л-МЭА в концентрации 4 мг/мл:

5 - результаты РТПГА с ЧСА в концентрации 4 мг/мл.

Полученные иммунные сыворотки были использованы для выполнения чистых фракций антител, а затем и их Г(аЬ\- Фрагментов.

Г (аС), - фрагменты вводили внутривенно одновременно и через (25-30)кинут после введения, гербицида. Данные представлены в табл. ,е 15.

Введение ГОЬ^-фрашенгов способствовало вшиванию «квотных при ЮОХ-ной гибели в контрольной группе. Наибольший про, цент заздты наблюдался при дозе 1.5 мг Т(аЬ'^-Фрагментов на мышь (70*).При одновременном введении Г(аЬ\-фрагментов с затравкой яшотиых гербицидом протективный эффект достигал 83,335.

При введении ПаЬ'^-Фрагментов антител к 2,4-Д степень вы, деления 2,4-Д с мочой значительно увеличилась. Чем больше доза введенных Р(аь\-фрагментов, +ем больше 2,4-Д выводилось. Каждое животное получило 14.4мг 2,4-Д и за 10 часов из организма с мо"> - 38 -

Таблица 14

Влияние разных концентрация 2.4-Д и 2. '-Д-МЭА на РТПГА при анализе сывороток крови кроликов,

реиммунизированных конъюгатом 2,4-Д-ЧСА

1 -т 1 1 РТПГА 1

1 1 РПГА с

1 1 1

1 1 2,4-Д-ЧСА 1 2,4-Д в дозах (мг/кг) • I 2.4-Д-МЗА в дозах (КГ/КГ) |

1 1 ( 1/титр

1 1 1 I 1 1 1

1 1 1 1 антител) 1 0,04 0.4 1 4.0 1 0.04 0.4 1 4.0 1

1 1 1 1 11-1 48.0+9,8 I 46.4+14.1 39.2+10.5 I 1 29.6+9,9 | 44.8+11.8 37.6+11,1 1 1 1 { I 28.0+9.9 I

1 1 [2- | 144,0+31,2 | 131,2+33,7 33.2+19,2**1 1 43,2+12,8** | 104,0+25,0* 70, 4+15. ! 1 1 ! 36.3+11.7* 1

I I 13. | 614,4+173,0 I 320,0+81,0 201,4+58,5*! 1 99, 2+26. 3* I 268.8+71,3* 134. 4+35. 6* 1 38.4+10.9* !

1 1 14 | 96,0+20,2** ! 92.8+22.9* 80,0+21.5* I 1 40.0+10.7 | 92. 8+22.9** 67.2+17.8* 1 ) 1 30.4*9.6* I

1 1 I. 1 57.6+6,4** I 51.2+7.8 Л— 44, 8+7. 8 I .......... , 1 1 38,4+6.4** I 51.2+7.8 44.8+7.8 ! ! 1 33.6+0.9* 1 1______ .. .1

Примечание: * - р<0.05 , «» -

р<0.01.

Таблица 15

Защитное действие Г(аЬ)4' -фрагментов антител к 2.4-Д. введенных одновременно и через (20-25) минут после введения животным гербицида 2.4-Д

| КI Кол-во | Д^а |Доза F(ab'^ 1 [животныхI ¿.н-Д Iфрагментов! I (в группе! (мг/кг)|мг/на мниь! Н--1-Н---h

Схема опыта

i-1

Процент защиты

111 10 | 800 1 ! о

121 10 1 еоо 0. 375 Ийрез 20-25 мин.пос: 1 205!

í 1 |введ.«ивотн. 2.4-Д 1

гэ; 10 i еоо 0,750 I —"—"- 1 ЗОХ

14! 10 ! 800 1,5 I —••—••- 1 70%

ISI 1 1 I..1,. 10 ! 800 ! i 1.5 |одновр. с введением |животн.гербицида i I 83. ЗЯ 1 1. . .

чоП "чделилось: у животных 1- й группы, получавших 2.4-Д, 5.83мг/миаь: 2 Я группы, которые получали 2.4-Д. а затем 0,875мг f (ab'),-Фрагментов. 7,12мг/мшь: 3-й группы, получавших 2.4-Д и 0,750мг F (nb' ^-Фрагментов. 7. Э5мг/ышь; 4- й группы, которым вводили сначала 2.4-Д. а затем 1.5мг F(аЬ'^-Фрагментов антитш.. 10,84мг/мывь. что составило 40.5: 49.4; 55.2; 75,335 соответственно (р<0.01) от общего введенного количества 2.4-Д.

Таким образом. приведенные результаты указывает на перспективность использования ИаЫг-Фрагментов антител при острых отравлениях пестицидами, приоритетность которого подтверждена авторским спидетельством Н1645350.

2.5. Разработка кммуноферментных методов определения 2.4-Д и карбофоса.

Обнаружение и количественное определение пестицидов и их меи олитов е биологических жидкостях и образцах объектов внешней среды в основном проводится физико-химическими методами, такими как масс-спектрометрия и газожидкостная хроматография. Эти методы чувствительны, но требуют больших затрат времени, квалифицированного персонала, дорогого оборудования.

В последние годы начали разрабатывать иммунохимические. в частности, иммуиоферментиые методы опред чения пестицидов.

Внедрение иммунохимичесжого анализа в эту область вызг ано необходимость« упрощения и удешевления определения пестицидов и их метаболитов, а также увеличения их чувствительности и специфичности.

Нами разработан твердофазный иммунсферментшя метод определения 2,4-Д и метаболитов карбофоса.

Использованный в расоте метол И1А основан на определении инсектищ..,а к ко;.ыогату пестицид-ЧСА. Оставшиеся cf ^одьдаи центры связывания антнтел взаимодействуют с адсорЛирсеакным :в лунках полистироловых планшетоь конънгатом пестицид-Ш. Образовавшийся комплекс выявляется меченным ыороксидазоЯ анпаидо-выми антителами, регистрируемая оптиче.кая плотность Ф»ри*нта-тивной реакции в данном методе, обратно пропорциональна начальной концентрации пестицида и служит характеристикой его содержания в образце.

Схема метода:

1. Ар +П«А^ +Ат1-Л

2. СИТ-П+АТ,, » á - СИТ-П-AT^

3. |- СИТ-П-Ата+Ат4Пх= Ц - СИТ-П-AT,-АТг Пх

41| - СЙТ-П-АТ4 -ATj Пх+S* FV

где П - пестицид; Ат£- антитела к пестициду; - СИГ-П - адсорбированный коньвгат пестицид-соевый ингибитор трипсина ; АтгПх - антитела против Igfl кролика, меченые пероксидазой:8 -субстрат; Р - продукт ферментативной реакции.

Разработанный метод иммунофепчентиого анализа водорастворимых производных карбофоса поззольет определять малатионовые кислоты в диапазоне концентраций (0,3-150) нг/мл. Время анализа -3 час . Средняя ошибка определения - +5-10Я. При визуальной оценке результатов ИФА производные инсектицида детектировались, при концентрации б пробе 50 нг/мл и выше.

Кривые титрования малатионовых кислот в органах и тканях мышей, получивших перорально' 1/? О Щ^карбофоса, показали, что их определяемость в. гомогенатах составила 50-60% относительно модельных растворов. Понижение определяемое™ обусловлено, по-видимому, высокой вязкостью гомогенатов. Определяешь.-;, минимум малатионовых кислот в гомогенатах составлял (1-2) нг/мл.

По результатам работы изданы методические рекомендации "Иммуноферментный метод определения производных карбофоса".

Полученные антисывороткй против конъюгата 2,4-Д-ЧСА позволяли определять как связанную, так и свободную форму 2,4-Д. Интервал определяемых концентраций связанной 2.4-Д составил (15-1000) нг/мл в пересчете на свободный препарат.

Для определения гербицида в органах и тканях животных мышам перорально вводили 0, 5 мл водного раствора натриевой соли 2,4-Д в дозе 0,1 LDJr Для анализа отбирали почки, печеьо, лег- 41 -

кие. Результаты определения 214-Д методом ИФА приведены в таблице 16. .

Таблица 16

Сод ¡ржание 2.4-Д в органах мышей (мкг/мл)

1 | Органы —1 ............. - 1 "1 1 I I Контроль | 1 1 Опит -1.........- 1 I После экстракции | I хлороформом 1 1 |

| Печень 1 1 1 0.63 I е.з 1 1 I 6.15 I

| Почки 1 0.5 I 5.7 1 5.50 I

| Легкие 1 2,53 I 4.5 1 4. '5 1

1____ . . ,i_ .. __________ 1 1 . . ... |

Примечите; Погрешность определения составила +10%.

Наличие гербшша в контрольных пробах связано, по-видимо-иу, с содержанием его в кормах. Поскольку содержание препарата и гоногенато до и после экстракции хлороформом практически не менялось, гербицид обнаруживается в органах и тканях животных в связ?-'чом виде.

извисгно, что 2,4-Д обратино связывается с белками плазмы крови при поступлении в организм тавотных. Отмечалось образование кончзгатов с компонентами растений, главным образом, с аминокислотами. белками, сахарами, липидами. Однако образование коньвга.ш порождает проблемы, связанные с отбором проб, экстракцией и и:< очисткой.

Данный метол позволяет определить конъюгированные Формы препарата и не требует экстракция и очистки проб.

Интенсивное развитие иммунологии обеспечивает практических врачей новыми методами, необходимыми для ранней диагностики, обоснованной терапии и профилактики отравлений пестицидами.

Анализ экспериментальных данных по изучению иммунотоксич-ИОСТ1. лестиаидон привел нас к убежденно, что организм использует иммунологические механизмы для сохранения гомеостаза гораздо шире, чем это представлялось до настоящего времени.

Разработанные и экспериментально обоснованные методические подходы иммунотоксикологического скрининга пестицидов могут быть залояены в научную практику предупредительного санитарного надзора наряду с изучением безопасности > .мических веществ по показателям репродуктивной функции, мутагенного бластогенног, и аллергенного действия и т.д.

Поскольку, связи между звеньями иммунной системы настоль- 42 -

ко лабильны, что элементы системы улавливают воздействие пестицидов с большей чувствительностью, нежели Еншеуказзняыб подходы, то это позволяет использовать данное качество как индикатор состояни. организм^. Так. показатели иммунной систсш организма могут быть использованы для длфференцнашп пороговой и токсической дозы воздействия пестиш-дов.

Выявление чувствительного звена iw/HHoft системы организма в условиях воздействия пестгцнгов способствует разработке системы эффективной иммунокоррекции.

Изменение антигенной структуры органов и тканей жньотннх, появление аномальных комплексов, содержащих в своей структуре молекулу пестицида,является доказательством образования реак'ц-снноспособных метаболитоз, ковалеитно связывающихся с макромолекулами и индуцирующих специфическую 1шмунологическ\ю реакцию организма. Увеличение антигенной нагрузки на иммунную систему, связанное с экологическим загрязнением окру^юиеЯ среды, способствует появлению различных форм иммунопатологии.

Синтез искусственных антигенов песташд-белок и получение антител к пестицидам позволили разработать метод специфической защиты организма от отравления гербицидом. При разработке данного подхода были созданы предпосыг-и для использования иммуно-химических методов при анализе микроколичеств пестицидов и антител к ним в биологических жидкостях и объектах окружающей среды Иммунохимические методы определения пестицидов являются новым методологическим решением в аналитической химии средств защиты растений и животных.

ВЫВОДЫ

1. Разработана и экспериментально апробирована двухуровневая система иммунотоксикологического скрининга пестицидов, представляющая собой комплекс методов, позволяющих поэтапно выявить наиболее чувствительное звено иммунной системы.

2. Пестициды - карбофос и 2.4-Д оказывают выраженный дозо-зависимый икмуносупрессивный эффект на показатели клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также функции перито-неальнкх макрофагов.

3. Подавление функций перитонеальных макрофагов мышей, подверженных воздействию пестицидов. In vivo коррелирует с данными, полученными In vitro. Экспериментальные данные позволяют рекомендовать анализ функций макрофагов In vitro для предварительной оценки иммунотоксичности пестицидов, а также для предварительного отбора и подбора доз иммунокорригирующих средств.

.- 43 -

Однако это не исключает необходимости анализа функций иммуно-конпетентных клетск в условиях ln vivo.

4. функциональные нзрунения иммунной системы могут быть использованы в качестве критерия вредности при оценке пороговых доз пестицидов. Предложена математическая модель. использующая иммунологические показатели для расчета пороговых доз воздействия песп ,it . на иммунную систему организма. Экспериментальная проверка показала справедливость данного подхода.

5. Выявлены аномгльные комплексы пестицид-белок в органах и тканях ятотных. подвергнутых воздействие пестицидов, которые вызывает индукцию антител к ним. Изучена динамика образования аномальных антигенов и антител к ним. Выделены и очищены белки печоии. связывавшие 2.4-Л.

6. Разработан и внедрен метод искусственных антигенов и антисывороток к ним для выявления раннего доклинического воздействия карбофоса на иммунологическую реактивность организма людей, имеющих профессиональный контакт с пестицидом.

7. Еычвлен защитный эффект F(ab')t- Фрагментов, специфичных к ::.4-Д. при остром отравлении гербицидом.

8. Эксшфймектально установлена коррекция Т-активином. ми-елог.ндом. сплокином, левамизолои иммунодефицитного состояния организма кшотних. подвергнутых воздействию пестицидов. Наибольшим орригирующим эффектом обладал миелопид. который восстанавливал Функциональные показатели всех звеньев иммунной системы организма.

9. Разработаны твердофазные иммуноферментные методы определения 2,4 Д и производных карбофоса и антител к. ним.

Интервал определяемых концентраций связанного 2,4-Д составил (15-1000) нг/мл. производных карбофоса -(0.3-1501 нг/мл.

Методы апробированы при анализе препаратов в органах и тканях юшотных. стравленных пестицидами, для определения не .треб: тся экстракция и очистка проб.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Специфическая иммунологическая реакция организма крыс при хроническом воздействии гербицида аю.нной соли 2.4-Д //

• Проблемы гигиены и токсикологии пестицидов :Тезисы докладов 8- Всесоюзной научной конференции.-Киев, 1981,- С. 160. (Соавт. Бадмаева Д.Б.. Бодиев Р.-Д.Д., Сперанская Т.Д.).

2. Иммунологическое изучение сывороток крови рабочих, занятых на производстве карбофоса// 'Проблемы гигиены и токсикологии пестицидов •:Тезисы докладов 6 Всесоюзной научной кон- 44 -

ференции.- Киев. 1981.-с. 234 (Соавт.Будаева P.A.. Бодиев- Р.-Д.Д.. Бадмаева Д.Б..Сперанская Т.Д.).

3. Изучение иммунологической реакции организма рабочих при профессиональном воздействии карбофоса //Гигиена трудч н проф. заболеваний,- 1983,- J.I.- С. 19-20. (Соавт. Вудчс-ва Р.Д.. Бодиев Р.-Д.Д. .Сперанская Т.Д.).

4. Действие гербицида 2,4-Д (амшпой соли) на иммунологическую реактивность животных в эксперименте //Ветеринария. -1983.- N И,- С.20. - N 274-83 ДЕП.(Соавт. Бодиев Р.-Д.Д., Кадна-ева Д. Б.. Сперанская Т.Д.).

5. О выявлении аномальных антигенов в печени крыс, подвергнувшихся воздействию гербицида - аминной соли 2.4-Д //ветеринария.- 1983. - Н И. - С.20. - Н 275-83 ДЕП (Соавт, Бадма-ева Д.Б.. Сперанская Т.Д.). ' "

6. Действие гербицида 2.4-Д (аминной соли) на иммунологическую реактивность кивогннх //Гигиена и санитария. - 1983. -Nj.- С.73-74 (Соавт. Бадмаева Д.Б..Сперанская Т.Д.).

7. Использование реакции пассгвноЯ гемагглог;;нации при анализе сызороток крови рабочих, занятых на производстве карбофоса // Материалы 4 Республиканской научно-практической г.онфе-ренции врачей Бурятии. - Улан-Удэ. *^84. - С. 171-172 (Соавт. Бу--даева F. А. .Сперанская Т.Д.).

8. Получение антасыворотки. содержащей антитела к карбофосу . / Еклад молодых биологов Сибири в решение вопросов Продовольственной программы и охраны окружающей среды1' : Тезисы докладов Региональной научной конференции. - Улан-Удэ. 1984. -С. 139-140 (Соавт. Лебедева С.Н.).

9. Использование искусственного антигена карбофос-белок для раннего выявления воздействия карбофоса на иммунологическую реактивность организма :Методические рекомендации. Улан-Удэ. 1984. - 15с. (Соавг. Будаева P.A., Сперанская Т.Д.).

10. Получение и анализ иммунных сывороток к пестицидам // Современные вопросы токсикологии и гигиены применения пестицидов и полимерных материалов1': Тезисы докладов 7 Всесоюзной научной конференции. - Киев,1985. - С. 81 (Соавт. Лебедева С. Н.).

11. Имкунохимическая_ид_ентификация белков, связывающихся с 2,4-Д (аминная соль) //. " Гигиена применения, токсикология пестицидов и полимерных масс'-. - Киев, 1986. - Вып. 16. - С. 86-88 (Соавт. Тумуров Г.Л.).

12. Планирование эксперимента при оценке воздействия пестицидов на иммунологическую реактивность организма //»

- 45 -

• ймхл молодых биологов Сибири в решение Продовольственной программы и охраны окружавшей среды . : Тезисы докладов Региональной научной конференции. - Улан-Удэ. 1987. -С. 110-111.. (Соазт. Атутовя Н.А.).

13. Имм/нотсксикологический скрининг биологически активных' веществ // Лекарственные растения в традиционной медицина} - Улан-Удэ &8Т. - с.64-66. (Соавт. Лебедева С.П.).

IЛ. Иммунодепрессивные эффекты, вызываемые гербицидом 2.4- Л в оргаыпке иывеЯ //Гигиена и санитария. - 1987. - 115. - С. 80 -81 (Соадт. Лебедева С.Н. .Ляшенко В. А.).

15. Имиунстоксикологический анализ пестицидов //Тезисы докладов 26 научной конференции Восточно-Сибирского 1ехнологи-ческою инстн/ута. - Улан-Удэ. 1907. - с.29.

16. Популяции лимфоцитов периферической крови больны;! хроническим лнкфолсйкозом //Материалы 4 Республиканской научно-практической конференции прачей Бурятии.- - 1987. - С.76-78. (Соавт. Боллоиора 3.А.,Иамсараева Ь Г. .Хардаев Э.К.).

17. Влияние карбофоса на индукцию иммунного ответа у мышей // 'Гигиена применения, токсикология пестицидов и полимерных материалов .-Киев, 1987.-Вып.I7.-С.76-78(Соавт.Будаева Р.А., Ляше:1ко В. А.).

18. Опенка состояния иммунной системы организма при отравлении пг тииидамн //'Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефицита и имкуиокоррекиия ' :Тезисы Всесоюзной научной конференции.- Владивосток. 1987.- С.£0.(Соавт. Лебедева С.Н.).

19. Математическая формализация результатов реакции Уанье//Инфо, шшюнное сообщение ИДТИ.-Улан-Удэ. 1987.-Н 69-87. (Соавт. Атутова Н. А., Цыдыпов В.Ц.).

20. Лабораторная диагностика сибирской язвы : Методические указания. - Улан-Удэ,1937. - 31с.(Соавт. Цыдыпов В.Ц..Сперанский В. В., Атутова Н. Л,).

"1. Практикум по иммунологическим методам исследования. -Улан-Удэ,1987. -80с. (Соавт. Баглаев Т.Н..Лебедева С.Н..Коау-лина 3. Д.).

22. Оценка Функциональной активности макрофагов при воз-деЯствии карбофоса и 2,4-Д.// Гигиена применения, токсикология пестицидов и полимерных материалов. ' - Ки-

«ев,1988.-Вып. 18.-С. 143-147(Соавт. Лебедева С.Н. .Ляшенко В. А.).

23. Определение производных карбофосы иммуноферментным методом // Инженерная энзимология ;Материалы 6 Всесоюзного симпозиума. - Вильнюс, 1988.-С.45.(Соавт.Тумуров Г. Л., Дзантиев Б.Б..

- 44 -

Егоров А. М.).

24. Использование показателей иммунной системы организм гивотных при оценке порогов!« доз пестицидов // Иммунология на Востоке страны : Материалы Всесоюзной научной конференции. -Красноярск. 1983. - С.40. (Соавт. Лебедева С.Н. .Будает Р. А. .Миронова Э. С., Сергеева 3. Д.).

25. Некоторые показатели иммукногг статуса доноров Бурятки //"Иммунология на Востоке страны : Материалы Всесоюзной научной конференции. - Красноярск. 1988. - с. 76. (Ссавт. ХребтсЕский М. А., Ангархаева Н.А.,Дандарова Д.Н., Иринчинова Л.В. .Баглаев-. Т.Н.).

26. Использование нуклеината натрия для игмуноксрригируо-щей терапии тепличниц //'Иммунология на Востохе страны •: Материалы Всесовзной научноЛ конференции. - Красноярск,1988. -с. 187. (Соавт. Хребтовский М. А.,Лебедева С.Н. .Баглаез Т.Н.).

27. Еммуиоферментный анализ гербицида 2,4-Д //Тезисы докладов 27 научной конференции.- Улан-Удэ,1988.-С.26.(Сиавт. Ту-муров Г.Л. .Нултаева И.Г.,Дзантиев Б. Б.).

28. Использование мэтода последнагельных предпочтений для интерпретации рззультатов реакции Уанье //Ветеринария. - 1989. - N3. - с. 39-40. (Соавт. Атутова Н. А., Иыдыпов В.Ц.).

29. Влияние производственных 'жторов на показатели иммунного статуса у работниц тепличного хозяйства //Материалы 5 Республиканской научно-практической конференции врачей Бурятии. -Улаь-Удэ. 1989,- С.67-69. (Соавт.Хребтовский И. А.. Козулина З.Д., Лебедева С.Н..Баглаев Т.Н.).

30. Содержание сывороточных иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов у доноров крови населения Бурятской АССР // Материалы 5 Республиканской научно-практической конференции врачей Бурятии.-Улан-Удэ.1989.- с.76-78. (Соавт. Хребтовский М. А., Ангархаева Н. А.. Дандарова Д. Н. .Баглаев Т. Н.).

31. Активность ангигенспецифических клеток-супрессоров при действии пестицидов //Тезисы 28 научной конференции Восточно-Сибирского технологического института. - Улан-Удэ, 1989. -б. И. (Соавт. Банаева С. А. .Баглаев Т.Н.).

32. Иммуноферментный метод определения производных карбофоса: Методические рекомендации.-Улан-Удэ, 1989.-13с.(Соавт. Ту-муров Г.Л.,Дульбеева И. Г..Дзантиев Б.Б.).

33. Иммуноферментный метод определения пестицидов в биологических жидкостях //Тезисы 28 научной конференции Восточно-Си-, бирского технологического института. - Улан-Удэ, 1989. С. 12.-(Соавт. Дульбеева И.Г..Тумуров Г.Л.). . •

- 47 -

34. Идаунотоксическое действие пестицидов // Проблемы экологии в ветеринарной медицине : Тезисы докладов Всесогз-иой научно-технической конференции. - Москва. 1989. -с.48-49. (Соавт. Лебедева С.Н..Багласв Т.Н.).

35. Йкмуноф^риентныП метод определения гербицида 2,4-Д // 'Актуальные вопросы токсикологии, гигиены применения пестицидов и п и у. ,лш материалов в народном хозяйстве -.Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции. - Киев, 1990. - С.85. (Соаят. Тумуров Г.Л., Дучьбеева И. Г..Дзантиев Б.Б.).

30. Аппроксимация зависимости "доза-эффект" при расчетах пороговых концентраций воздействия пестицидов на организм //Тезисы ¿9 научной конференции Восточно-Сибирского технологического института. - Улан-Удэ,1ЭЭ0.-с.9. (Соавт.Миронова Э.С.. Сергеева 3. Д., Лебедева С.Н.;.

37. Влияние пестицидов на формирование антигеиспецифн-ческих клеток-сулрессоров кь'чей //Пшена и санитария. - 1990.-КЗ. - С. 72-74. (Соавт. Банаева С.А..Баглзев Т.Н.).

ЗЯ. Использование показателей иммунной системы организма хивоть_л при оценке пороговых доз пестицидов //Гигиена и санитария, -1990.-W2. -С. 75-76. (Соавт. Миронова Э. С.. Сергеева З.Д.. Ле-, бедеаа С.Н, .Будаева Р.А.)

39. Определение 2,4-лихлорфенокеиуксусноП кислоты иммунс-фермектн I методом // Икмунофермадтиый анализ регуляторов роста растений: применение в Физиологии растений и экологии . -Уфа.1990. - с. 136-143. (Соавт. Тумуров Г.Л.,Дульбеева И.Г.,Лзан-тиевБ.Б.).

40. Им-.,ноферментный анализ производных карбофоса //Биотехнология. -1990. -1)5. -С. 82-84(Соавт.Тумуров Г.Л.,Дзантиев Б.Б.; Егоров Л.«.).

41. Особенности действия пестицидов на естественную цито-токсичность клеток селезенки мышей в зависимости от возраста живот « //Гигиена и санитария.-1991. - 118. - С. 59-G0 (Соавт. Аю-шинова P.A. .Баглаев Т.Н.).

42. О возможности восстановления функции перитонеальных макрофагов кьшея. отравленных пестицидам.!. // : Экологи-чес;сая патология и ее фариэкокоррвкция : Тезисы докладов 3 Международной научной конференции. - Чита. 1991.- С. 132, (Соавт. Лебедева С.Н.).

43. Влияние пестицидов на антителообразование в суспензии спленоцитов //Тезисы докладов. 1 съезд иммунологов России. 23-25ИВНЯ 1992. -Новосибирск, 1992. -С. 61. (Соавт. Бужинэева Е.М.,

- 4t? -

Баглаев Т.Н.).

44. Подходы к выявлению кммунотоксикологлческих евойста пестицидов //Тезисы докладов. 1 съезд иммунологов Госсии. 23-25 июня 1952,- Новосибирск. 1992. - С. 160-161. (Соавт. Лебедева С.Н.1.

45. Иммунохимические системы контроля содержания пестицидов //Тезисы докладов. 1 съезд иимун логов России. 23-25 ишд

1992.-Новосибирск, 1992. -С. 163.(Ссав".Яердев A.B. .Дзантиев Б.Е., Еремин С. А. .Морева И.С.. Сорокина Н. В.. Романенко 0. Г.).

46. Оценка функций иммунокомпетентных клеток организма животных. подвергнутых воздействию пестицидов (2,4-Д, карбофос) //Тезисы докладов научной конференции Бссточно-Сибирскс технологического института. - Улан-Удэ. 1992. - С. 34-35.

47. Интегрированный подход к контроля качества пищевых продуктов с учетом связанных форм пестицидов //В сб.:"Кокп-

-- - л^ксная переработка пищевого сырья и основные направления расширения ассортимента продуктов питания: Тезисы докладов межгосударственной научной конференции.- ' Владивосток,1993.-0.106-103 (Соавт. Сперанский В.В..Сперанская Т.Н.).

48. Иммунотоксикологическая оценка пестицидов. -Улан-1'дэ,

1993.-103с. (СоаЕТ. Сперанский 3. В., Л эдева С. Н., Дульбеева И. Г.. Олейникова И.И., Баглаев Т.Н..Миронова Э.С..Сергеева 3.Д.. Чя-митова С.С.).

список сокращений

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации.

РТПГА - реакция торможения пассивной гемагглютинации.

"CA - человечий сыгороточний альбумин.

МЭА - нон! та, ламин.

АOK - аитителообразуюдае клетки.

ГЗТ - гиперчувстви-елыюсть замедленного типа.

PTRX - реакция "трансп.гзитат против хозяина".

БСА - Сичнй сывороточный ачьбумин. •

ПДК - предельно допустимая концентрация.

ПУЛ - нкд'жс увеличения лимфоузлов.

4П - Фагоцитарний показатель.

54 - фагоцитарное число.

РШ'А - реакция непрямой гемагглютинации.

CifT - соевый ингибитор трипсина.