Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка комплексного иммуноферментного теста на основе антигенных препаратов гормонопродуцирующих органов

На правах рукописи

ПОДДУБИКОВ Александр Владимирович

РГЗ од 2 9 ФЕБ 2002

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ТЕСТА НА ОСНОВЕ АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ГОРМОНПРОДУЦИРУЮЩИХ ОРГАНОВ

14.00.36 - аллергология и иммуиолсгия

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им И.И.Мечникова РАМН

Научный руководитель ■

кандидат медицинских наук, Н.Е.ЯСТРЕБОВА

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.И.КРАСН011Р0ШИНА

доктор медицинских наук, профессор Ю.В.НЕСВИЖСКИЙ

Ведущая организация: ГНИИСК им Л.А.Тарасевича

Защита диссертации состоится «21 » февраля 2002 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного Совета Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И.Мечникова РАМН

по адресу: 103064, Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им И.И.Мечникова РАМН

I

Автореферат разослан «/января 2002 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета,

кандидат биологических наук Яковлева И.В.

РУГ^Л^ ! О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время различными эндокринными заболева-ннямц страдает около 7-8% населения страны (М.И.Балаболкин, 1998). Ежегодно отмечается рост заболеваемости практически для всех нозологических форм эндокринной патологии, сопровождающихся pautteii шша.ишшишей и exiepi посты«, а также ipc-бугощнх больших экономических затрат на лечение и заместительную терапию.

В настоящее время признано, что система иммунитета находится в субординационных отношениях с нервной и эидокршшои системами, оказывая на них регуляторно-эффекгорное влияние (Д.С.Саркисов, М.А.Пальиев, Н.К.Хитров, 1')')?, И.Г.Акмаеи, 1999, E.M.Stcnberg, 2001)- Новые достижения в экспериментальной и клинической иммунологии позволили пересмотреть вопросы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения многих эндокринных заболеваний. Окончательно установлена аутоиммунная природа целого ряда эндокринных заболеваний.

Научные исследования последних лет убедительно показали, что иммунная система обладает высокой чувствительносз ыо ко многим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также неблагоприятным факторам физической ирироды, что неизбежно сопровождается снижением резистентности организма к инфекционным агентам н повышением риска ш>шнкновенш1 аутоиммунных состоянии и кшолепашш (Г.И.Сидоренко, М.ПЛахарченко, 1992). Подтверждением этому является тенденция к увеличению распространенности аутоиммунных заболеваний в целом. Так, на фоне общего роста заболеваемости болезнью Аддпеона отмечается прогрессирующее преобладание первичной надиочечннковой недостаточности над болешыо Лддисона туберкулезной этнологии (В.В.Фадеев, И.И.Бузиашвилн, И.И.Дедов, 1998). Отмечается резкое увеличение заболеваемости болезнями щитовидной железы, прежде всего, на территориях, подвергшихся загрязнению радиоактивными веществами в результате аварии на Чернобыльской АЗС, а также на территориях с неудовлетворительным состоянием профилактики йод-дефицитных состояний (В.А.Мншагнн, 1994). Обращает внимание значительное повышение удельного веса аутоиммунного тнрондита среди других форм тирондиой патологии, которые, в свою очередь, также сопровождаются и осложняются аутоиммунными реакциями, как правило, па территориях с высоким уровнем техногенного загрязнения (И.В.Терещенко, 1996).

На современном этапе становится очевидным, что бактериальные, вирусные н паразитарные антигены, имеющие перекрестно-реагирующие детерминанты с антигенами тканей и органов человека, в определенных условиях инициируют и поддерживают аутоиммунные реакции. Концепция о том, что молекулярная мимикрия возбуди-

гелей инфекционных заболеваний и даже нормальной микрофлоры под ткани хозяина может составлять первичную основу в развитии аутоиммунных реакции, продолжает доминировать над многими гипотезами в этой области (S.Nagatacki, 1 '>94, G.H.Ko, 1997, M.C.Honeyman, 2000).

В большом числе случаев аутоиммунная обменно-эндокршшая патология имеет сширомалыюе, полнгландулярное течение. В настоящее время нет единого мнении в отношении классификации аутоиммунных полиглаидулярных синдромов. Достаточно отметить, что компонентами синдромов являются: первичная надиочечннковая недостаточность, аутоиммунный тнроиднт, диффузный токсический зоб, сахарный диабет I типа, пншпаротироз, первичный гипогоиадизм, пернициознан анемия и другие заболевания.

Многообразие и исспецифичность клинических проявлений большей части аутоиммунной обменно-эндокринной патологии служит причиной того, что верифнкання диагноза возможна только на основе лабораторно-инструментальных методов. Особенно важна своевременная диагностика на ранних этапах формирования заболевании, когда еще высока возможность эффективного использования средств вторичной профилактики.

Анализ данных, полученных при изучении аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, в том числе и полигландулнрных синдромов, свидетельств)'« о значительной вариации показателей гуморального аутоиммушпета. Прежде всею это касается активности органоспенифнческих аутоантител, которые рассматриваются как маркеры при данной патологии (И.В. Свирнденко, И.В. Крюкова, Ю.М. Кеда, 1998, 1'. Obermagerstraub, M.F. Manns, 1998, De Сагшо Silvar, 2000). Широкое распространение получили днагноетнкумы на основе антигенов щитовидной железы, индекс информативности которых, по оценкам отдельных авторов, составляет 90-95% (Н.С. Кузьмина, 2000, Д.С. Рафибеков, А.П. Калинин, 1996). В настоящее время большое значение приобретает определение антител в диагностике других эндокринных заболевании аутоиммунного происхождения. Так, основным критерием для начала проведения мероприятий, направленных на профилактику сахарного диабета 1 типа, в ряде стран является определение аутоантител к антигенам поджелудочной железы (R.J.Keller, 1993, C.F. Verge, 1996).

Одним из современных высокочувствительных методов определения антител является иммупоферментный анализ (ИФА). Использование в едином иммунофер-ментном тесте панелн различных препаратов органосиецифнчеекнх антигенов могло бы позволить проводить одновременное сравнение н изучать частоту вовлечения органов эндокринной системы в аутоиммунные процессы, оценивать активность, раенро-

страненность и мрендп'шествснное направление аутоиммунною процесса при некоторых заболеваниях п состояниях органов эндокринной системы. Учитывая высокую чувствительность иммунной и эндокринной систем к действию факторов окружающей среды, использование такой гест -системы позволило бы проводить прескршпшшмо диагностику и определять «неблагополучие» в нммуно-ненроэндокрннпон системе, формировать (руины риска по развитию заболевании органов эндокринной спеимы с последующим мониторингом.

Цель работы- создание комплексной скрннинговой нммуноферментнон тест-системы для определения активности антител к органоспецнфнческпм антигенам органов эндокринной системы.

Задачи исследования:

1. Выделить антигенные препараты из тканей гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, надпочечника, яичника и желудка.

2. 11а основании результатов физико-химического и нммунохимичсского анализа обосновать применение отдельных антигенных препаратов гормоипроду-цирующих органов для создания единого тесга на их основе.

3. Разработать екрншшговую иммунофермснтную тест-систему на основе выделенных антигенных препаратов.

4. Определить с помощью разработанного теста активность антител в сыворотках крови здоровых и больных различными заболеваниями люден.

Научная новизна:

Впервые выделены но единой методике и охарактеризованы но химическим, физика-химическим и иммунохимическим параметрам антигенные препараты н> гор-монпродуниругощих органов: гипофиза, щитовидной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), поджелудочной железы, надпочечника н яичника.

С помощью методов нммунохимичсского анализа (преципитация « геле, пмму-поэлектрофорез, торможение ИФА, иммуноблотннг) установлено наличие в мнкросо-мальиых фракциях перечисленных органов и в составе нитоплазматичсской фракции щитовидной железы органоспецнфических антигенов.

Впервые на основе семи микросомадьных н одной цитоплазмагнческой антигенных фракций разработан комплексный унифицированный скринииговый нммуиофер-ментный тест для определения I<дС антител к антигенам гормонпродунпрующих орт-нов, обладающий высокой специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Разработан метод отбора из состава субклеточных фракций диагностически значимых антигенов, сочетающий в себе гель-фильтрацшо и ИФА.

С помощью разработанного теста впервые оценено с о а оникс гуморального ау-тонммуннтета у доноров крови гг. Москвы и Тулы, пожилых людей, больных различными аутоиммунными заболеваниями. Установлена высока:! частота аутоиммуиных расстройств в отношении антигенов щитовидной железы у доноров г. Тулы, а в отношении антигенов яичника - у допоров крови г. Москвы. Установлена более часта» активность ^С антител к антигенам щитовидной железы в сыворотках лиц пожилого возраста. Выявлена высокая встречаемость полпгландуляриых проявлений у больных с заболеваниями: диффузный токсический зоб (ДТЗ), аутоиммунный тнронднт (АИТ), сахарный диабет 1 тина (СД-1) и диффузными болезнями соединительной > каии (ДБСТ). С помощью иммуноблотинга выявлены перекрестные реакции между антигенными препаратами щитовидно» железы и различными антигенами У.еп/егосоИ/ки.

Практическая значимость

Разработана комплексная иммуноферментная тест система для одновременного определения антител в сыворотках крови к 8 антигенным препаратам гор.моииро-дуцирующих органов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микросомальные фракции гипофиза, щитовидной железы, слизистого п мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, надпочечника н яичника и шпоплазматнче-ской фракции щитовидной железы содержат органоспецифнческпе антигены и могут быть использованы для создания на их основе пммуноферменшой к-сч-снсземы.

2. Разработана унифицированная иммуноферментная тест система, обладающая высокой специфичностью, надежностью. Основной ее особенностью является одновременное выявление антител к антигенным препаратам шести гормоннродуци-руюших органов (гипофиз, щитовидная железа, желудок, поджелудочная железа, надпочечник и япчник).

3. Активность 1«(; антител сывороток к антигенам отдельных гормоипродуцирушщнх органов может зависеть от экологических и эндемических условий проживания людей в геохимических провинциях. Высокая активность антител сывороток больных аутоиммунными заболеваниями в отношении целого ряда органоспецнфи-ческих антигенов свидетельствует о частом вовлечении в аутоиммунный процесс одновременно нескольких органов эндокринной системы.

4. Субклеточные фракции щитовидной железы и антигенные препараты }'.еп1егосо!Шса имеют в своем составе перекрестно-реагирующие ант игены. Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы доложены: на двух

конференциях молодых ученых НИИВС им И.И.Мечникова РАМН (февраль 2000, март 2001); Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллер-

гни, астмы и иммунодефиците»», Тбилиси, Грузии, 23-26 сентября 1999i .; VI Международном конгрессе «Успехи и иммунологии и аллергологии на пороге XXI века», )Ги;и, llipiiui,, 3-6 мая 2000г.; III съезде иммунологов и аллергологов СИГ, Сочи, России, 1620 сентября 2000г.; VII Международном конгрессе «Аллергия, иммунология н глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие», Ныо-Йорк, США, 14-17 апреля 2001г.

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 3 схемами, 10 таблицами и 14 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследований, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 196 источников из них 63 - на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Выделение антигенных препаратов проводили из тканей органов, полученных от лиц (возраст от 20 до 35 лет) с 0(1) группой крови, погибших в результате случайной смерти, без алкогольной н наркотической интоксикации. В соогпетсз вин с поставленной цслыо и задачами исследования на основании Законов РФ «О гране-плантации органов и (или) тканей человека» и «О погребении и похоронном деле» нами получен бноматериал из Бюро судебно-медицинской экспертизы №4 Комитета здравоохранения Москвы. Забор аутопепнного материала проводили в рашше сроки, не позднее 12 часов с момента смерти, при условии полного отсутствия визуальных признаков патологических изменений и аутолиза. Проведено выделение трех серий препаратов из тканей гипофиза, щитовидкой железы, слизистого и мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, падночечннка, янчннка.

При выполнении работы были использованы ткани органов различных лаборатории* животных, отобранные после процедуры получения антисывороток.

В процессе работы получены по две серии антисывороток от дву.х видов животных (морские свинки и мыши линии СВА), иммунизированных антигенными препаратам гормоипродуцпрующнх органов человека.

Для изучения перекрестных реакций между органоспецнфическнми и бактериальными антигенами были использованы кроличьи антпсыворотки к антигенным препаратам S.aureus, E.coii, P.mirabilh, Y.enterocoliüca. Сыворотки были любезно предоставлены сотрудниками различных лабораторий НИИ вакцин и сывороток им И.И. Мечникова РАМН.

При разработке тест-системы, дли определении се специфичности, чувствительности и диагностической значимости, использовали сыворотки здоровых доноров, полученные со станции переливания крови городов Москвы и Тулы (225), сыворотки лиц пожилого и старческого возраста (130), а также взрослых и детей - больных различными заболеваниями, полученные из различных лечебных учреждений г. Москвы (7-12).

В качестве отрицательного контроля использовали пул 100 сывороток крови здоровых доноров станций переливания крови, имевших в рабочем разведении значения оптической плотности (ОП) от 0,1 до 0,3.

Методы исследования. Органоснецифические антигенные фракции получали с использованием метода субклеточного фракционирования (J.C.Hutton, 1982, M.Yoshinari, 1985). Способ включал препаративный отбор материала, отмывку, механическую гомогенизацию, ультразвуковую дезинтеграцию, дифференциальное центрифугирование. В качестве среды выделения использовали буферные растворы: 0,05М Tris НС1 (рН-7,5) и 0,25М раствор сахарозы, содержащий 1мМ ЭДТА (рН-7,4). На различных этапах фракционирования использовали 0,01 M раствор ингибитора протеина! PY1SF. Все процедуры выполняли на холоду, используя охлажденные до 4°С инструменты, контактные части оборудования и среды выделения. Полученные препараты мнкросомальных и цитоплазмагнческнх фракций были охарактеризованы по содержанию к них белка (Lowry 0.11., at al., 1951), углеводов (Спирин А.М.,1958) и нуклеиновых кислот (Dubois M., at al., 1956).

Для характеристики молекулярио-весовой гетерогенности препаратов использовали метод гель-фильтрации на колонке (1,6x100 см) с ультрагслем АсА-34. Полниентнд-нын состав определяли с помощью вертикального SDS-электрофореза в 10% ПААГ.

Иммунохимичсскун) характеристику препаратов осуществляли с помощью методов двойной диффузии в геле, одномерного электрофореза, ИФА, торможения ИФА и нм-муноблотинга.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием автоматических. компьютерных программ Microsoft Excel и БИОСТАТИСТИКА (Primer of Biosta-tistics. Version 4.03 by Stanton A.Glante).

ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Поскольку субклеточные структуры клеток функционально различных органов имеют не только морфологические и цитохимические, по и иммунохимическне отличия, субклеточное фракционирование явилось основой для получения антигенных препаратов гормоннродуцирующпх органов. В исследованиях использовали две суб-

о

клеточные фракции (микросомальную и цптоплазматическую). Данные литературы свидетельствуют о том, что антигены этих фракций наиболее часто вовлекаются в ау тоиммунные процессы и определение аутоантнтсл к ним имеет большое диагностическое значение (У.Н.во^, 1л У., !Ч.К.Мае1агеп, 1996).

Химический анализ выделенных фракций показал, чю в их составе преобладали белки (13,1-18,3%). Количество нуклеиновых кислот (2,5-7,0%) было небольшим, что свидетельствовало об эффективности субклеточного фракционирования. Количество углеводов в составе микросомальных фракций было также незначительным (3,8-9,0%). Вероятно, большая доля в составе препаратов принадлежала лнпидам мембран, кою-рые нами не определялись.

При гель-фильтрацнн препараты субклеточных фракций гормоипродуцирую-щих органов имели выраженную индивидуальную хроматографнческую картину мо-лекулярно-весовото распределения (рнс.1). Поэтому метод гель-фильз рации может быть использован для промежуточной стандартизации и контроля на этапе субклеточного фракционирования.

Результаты 81 ^-электрофореза препаратов в ПААГ позволили установить, чю для всех антигенов характерна выраженная гетерогенность но.тнпентндного состава. Сравнение иолипетндного спектра препаратов различных органов позволило выявить индивидуальные белоксодержащие комнонешы для каждого из исследованных препаратов. Микросомальная фракция гипофиза содержала 2-1 нолпнептндных компонента с мол.м. от 186 до 29 кДа. Дли этой фракции были характерны полипептиды с мол.м. 173, 144 114, 100, 77, 58, 33, 30 кДа, которые отсутствовали в препаратах микросомальиых фракций других органов. Микросомальная фракции щитовидной 'железы содержала 17 полипептидных компонентов с мол.м. от 238 до 29 кДа. Дли этой фракции индивидуальными были полосы с мол.м. 88, 80, 72, 56 и 52 кДа. Микросомальная фракция слизистого слоя желудка содержала четыре нолипептидных компонента с мол.м. от 238 до 29 кДа. В составе микросомальнон фракции мышечного слоя желудка обнаружено 17 полипепгидных компонентов с мол.м. от 238 до 29 кДа. Характерными для этой фракции были полипептиды с мол.м. 161, 122 и 47 кДа. В составе микросомальнон фракции поджелудочной железы выявлено пять белоксодержащих компонентов с мол.м. от 49 до 29 кДа. Причем, пептиды с мол.м. 49 и 46 кДа были характерны только для этой микросомальнон фракции. Микросомальная фракция надпочечника содержала 13 нолипептидных компонентов с мол.м. ог 238 до 29 кДа. При этом компоненты с мол.м. 111, 74 и 63 кДа обнаруживали только в этой микросомальнон фракции. Полинептндный спектр микросомальнон фракции яичника был представлен в

Рисунок !. Гель-фильтрация. Профиль элюцни препаратов субклеточных фракций гормонпродуцируюших органов а-интоплазмэтическая фракция, б-микросомальная фракция

2.1.-гипофиз, 2.2 -щитовидная железа, 2.3.-желудок. 2.4.-поджелудочная железа. 2.5 -надпочечник. 2.6.-яичник

электрофорез 11 компонентами е мол. о г 102 до 29 кДа. Среди эт их компонентов характерными для этой фракции были полипентиды с мол.м. 71 и 53 кДа.

При сравнении полинеп тидных спектров цитоплазматическнх субклеточных фракций эндокринных органов оказалось, что у большинства из них индивидуальные, характерные для них полнпептиды находились в том же диапазоне молекулярных масс, что н в случае анализа мнкросомальных фракций. Исключение составила цпто-плазматнческан щитовидной железы. В этом случае шесть индивидуальных белковых компонентов находились в зоне белков с высокой молекулярной массой от 257 до 173.

Результаты преципитации в геле позволили установить наличие в составе мнкросомальных фракций гипофиза, поджелудочной железы, яичника и микросомалыюп и цнтоплазматической фракций щитовидной железы органоспсцнфических антигенов. При линейном иммуиоэлектрофорезе препараты обладали различным зарядом молекул, что позволяет предположить наличие органоспецифических антигенов в составе каждой из субклеточных фракции. Выраженная органная специфичность препаратов «икросомальных фракции различных органов дала основание для их дальнейшего использования при разработке иммуноферментного теста (Табл.1).

Таблица 1

Результаты реакции перекрестного торможения ИФА (%)

ПРЕПАРАТ *

ГИПОФИЗ ЩИТОВИДНА ЖЕЛЕЗА ЦФ 1! ^ ЖЕЛУДОК СЛИЗИСТЫЙ СЛОЙ 3 ¡<5 О» ЙЭ _ ^ а ч ИОДЖЕЛУДО ПАЯ ЖЕЛЕЗА 1 о ¡5 , й 5

Гипофиз 100 15 19630 10 0 10 15 20

Щитовидная железа ЦФ 10 100 40 20 10 0 10 0

Щитовидная железа !\1Ф 10 30 100 15 10 0 10 0

Желудок слизистый слой 20 10 10 100 20 10 15 10

Желудок мышечный слой 10 15 0 40 100 0 10 10

Поджелудочная железа 20 10 10 20 15 100 0 20

Надпочечник 30 10 15 20 0 20 100 50

Яичник 50 10 10 0 ■ 0 0 45 100

Учитывая различия в антигенном составе цитонлазматнческой н мнкросомаль-ной фракций щитовидной железы, выявленные при анализе згих препаратов с использованием различных методов, а также высокую, но данным литературы, диагностическую значимость определения аутоатитсл к целому ряду антигенов этого органа, использование обеих фракций щитовидной железы при разработке скрининговой тест системы было целесообразно.

С целью подтверждения положения о том, что полученные препараты содержали в своем составе органоспсцифическне антигены, нами совместно с сотрудниками НИИ туберкулеза РАМН было проведено гистоморфологическое исследование органов животных (щитовидная железа, поджелудочная железа, желудок, яичник), подвергшихся многократной иммунизации антигенами различных органов человека. Заключение гнсюморфологического исследования свидетельствует о том, что в соответствующих органах лабораторных животных обнаружены признаки асептического воспаления, аналогичные регистрируемым при соответствующих аутоиммунных заболеваниях.

Разработка скрининговой иммуноферментной тест-системы

Поскольку большинство выделенных препаратов помимо антигенов, обладающих органной специфичностью, имели в своем составе перекрестно-реагирующие антигены необходимо было разработать такие условия ИФА, при которых органная специфичность была наиболее выражена. На этапе разработки иммуноферментной скрининговой тест-системы определяли оптимальные концентрации антигенов для активации нолнетирольных планшетов, оптимальное разведение исследуемых сывороток, а также оптимальное разведение конъюгата антител с ферментом. Следует отмстить, что при разработке тесг-снстемы, включающей в себя одновременно несколько антигенных препаратов, мы преследовали цель добиться как можно большей унификации теста. Одним из параметров унификации тест-системы являлось определение сорбкнон-нондозы для каждого используемого антигенного препарата. В этом случае результаты отрицательного н положительного контролен, помимо максимальных различии (АОП), имели стандартные -значения, характеризовались низкими фоновыми значениями п максимально нивелировали перекрестные реакции. Методика постановки анализа при практическом использовании тест-системы и подходы к оценке результатов анализа являлись едиными для всех антигенов.

Исследование сывороток 101 донора крови Москвы с целью определения точки отсечения отрицательных показателей показало, что около 90% сывороток в рабочем разведении имели разницу оптической плотности от-0,1 до +0,1 (Рис.2). Эти значения в дальнейшем рассматривали как показатели нормы. Значения с величиной ДОП > +0,2 считали положительными. Следует отменит,, что для иммуносорбентов различной специфичности, указанные параметры были общими. Исходя из результатов анализа сывороток доноров, специфичность теста была не ниже 90%.

Доказательством высокой чувствительности теста являлись результаты, полученные при анализе сывороток больных эндокринными заболеваниями (Табл.3)

<-0,2

>+0,2

Рисунок 2. Распределение активности антител к органоспецпфическим антигенам гормонпродуцируюшнх органов в сыворотках крови здоровых доноров Москвы (п=101).

Исследование воспроизводимости результатов при анализе стандартных сыкороток е низким и высоким содержанием 1§С антител показало, что коэффициент вариации результатов для различных антигенов тест-системы не превышал 8,7%. Что свидетельствует о высокой точности и надежности теста. Характеристика параметров скршшш ового теста отражена в таблице 2

Таблица 2

Характеристика скршшш ового теста на основе органоспецифическнх антигенов

ПАРАМЕТРЫ ХАРАКТЕРИСТИКА

Доза антигена Гипофиз- 2,5 мкг/мл, ФСБ Щитовидная жел. цнт. ф-я- 2,5 мкг/мл, ФСБ Щитовидная жел. мик.ф-н- 5 мкг/мл, ФСБ Желудок- слизистый слой -10 мкг/мл, ФСБ Желудок —мышечный слой-7,5 мкг/мл, ФСБ Поджелудочная железа - 15 мкг/мл, ФСБ Надпочечник- 15 мкг/мл, ФСБ Яичник- 2,5 мкг/мл, ФСБ

Время сорбции 2 часа- 37°С, 12 часов - 8°С, хранение 10°С

Разведение сывороток 1:100

Разведение коныогата Максимальная разность ОП между К «+» и К «-»

Субстратная смесь ОФД в ЦФБ с Н;02.рН-5,0

Остановка реакции Через 15-20 мин;2МН2804

К «-» оп<о,5 !

к«-» 011>0,7

Фон (контроль коныогата) оп<о,11

Точка отсечения отрица- доп=+о,1

тельных показателей

Специфичность > 90%

Чувствительность Н/о

1 Надежность > 90%

Использование в тесте мнкросомальных фракций гормонпродуцпрующпх орз а-нов является, на иаш взгляд, правомерным, так как эти препараты содержали в своем составе различные но молекулярной массе дна гностически значимые алии спи. Так сыворотки больных СД-1, обнаружившие в ИФА высокую активность 1«С< антител к исходной микросомальной фракции поджелудочной железы, реагировали по-разному с отдельными фракциями препарата, полученными в результате гель-филы рации. Одна группа сывороток реагировала с высокомолекулярными фракциями (К,„~0-0,25), для другой группы была характерна более интенсивная нммуноферментная реакция с низкомолекулярными фракциями (К,„яО,56-0,7-1).

Таким образом результаты химического, физико-химического и нммунохимпче-ского анализа субклеточных фракций и комплекс исследований, выполненных на эта-

пе разработки теста, позволили создать комплексную унифицированную скрннниговуто тест-систему на основе антигенов мнкросомальных фракции гипофиза, щи говилной ■железы, слизистого и мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, надпочечника, яичника и иитоплаэмагичсской фракции щитовидной железы, обладающую высокой надежностью (> 90%) и специфичностью (» 90%).

Изучение активности ^О антител к антигенам гормониродунирующнх органов в сыворотках здоровых и больных различными заболеваниями людей

С помощью разработанного теста был проведен скрининг сывороток доноров станции переливания крови гг. Москвы и Тулы, пожилых люден (возраст > 65 лет), детей, страдающих диффузными болезнями соединительной ткани (Д15СТ) и больных с обмеипо-эндокршшой патологией. Результаты проведенных исследований представлены п таблице 3.

Сыворотки крови доноров г. Тулы достоверно чате (р<0,05) давали положп-юлькыс реакции с АГ щитовидной железы. При этом общий фон отрицательных показателен в сыворотках доноров т. Тулы смещался в область положительных значении АОП (от 0 до +0,1), тогда как для сывороток крови доноров г. Москвы л и значения смешались в область отрицательных показателей АОП (от 0 до -0,1). Полученные результаты могуз быть обьяснены известной неблагоприятной экологической обстановкой в Тульской области. В научной литературе последних лет отмечается резкое увеличение случаев заболевания щитовидной железы в регионах, в которых произошло практически полное прекращение профилактики йод -дефицитных состоянии и имелось воздействие радиации вследствие аварии на Чернобыльской А ЗС

Поскольку в литературе появились сведения о возможной трпггерной роли У.еШегосоШка в запуске аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, целесообразно было сравнить частоту сочетаний высокой активности А'Г к АГ У.еМегоспШка и АГ щитовидной железы у доноров двух городов. Среди позитивных в отношении У.еШггосоШка сывороток крови доноров г. Москвы только одна сыворот ка давала положительный результат с АГ щитовидной железы (6,7%). Среди аналогичных сывороток доноров г. Гулы таких сочетаний было 78,6%. Полученные результаты свидетельствуют о наличии перекрестнореагирующих эпигопов в составе АГ щитовидной железы и У.еп1егосо1Шса. Эти данные можно рассматривать как подтверждение имеющихся в литературе предположений о возможной роли АГ У.еШегосоШка в лионатогенезе ¡п-болеванни щитовидной железы (МЛУЛУоИ', Т.МЬак), К.ВесЬ, 1991).

Таблиц»3

Частота позитивных реакции с антигенами гормонпродуцируюишх органов сывороток здоровых н больных различными заболева-

ниями людей.

Группы обследованных %, позитивных реакций с антигенами

Число обсл дованиых о U i р; PÍ о i S 0 1 I % 1 " г" , П cJ 1 * р £ в е Z = z J Желудок слизистый слой Желудок мышечный слой >> aj я К ■6 g S Ч S г. © 0> с ч :■€ Надпочечник а 3

Доноры, из них 225 11,5 6,7 8,4 0,4 6,2 2,7 0,9 6,7

Г.Москва 103 9,8±2,9 1,0±1,0 1,9±1,3 - 3,9±1,9 2,9±1,6 1,0±1,0 10,7±3,0*

Г.Гула . 122 13,1 11,5±2,9* 13,9±0,8* 0,8±0,8 8,2±2,5 2,5±1,4 0,8±0,8 3,3±1,6

Пожилые 130 4,6±1,8 12,2±2,9* 9,2±2,5* 1,5±1,1 3,8±1,7 3,8±1,7 9,2±2,5

Первичная гипофизарная недостаточность 17 17.6±9,5 5.9±5,9 5.9±5,9 - - - 5.9±5,9 23.5±10,5

Узловой зоб 68 7,4±3,2 2,9±2,0 5,8±2,8 2,9±2,0 - 1,5±1,5 2,9±2,0 2,9±2,0

Аутоиммунный тироиднт 108 18.5±3,7 40.7±4,7* 46.2±4,8* 33.3±4,5* 17.9±3,7* 25.9±4,2* 10.2±2,9* 3.7±1,8

СД-1 100 6.0±2,4 25.0±4,3* 23.0±4,2* 23.0±4,2* 23.0±4,2* 14.0±3,5* 19.0±3,9* 6.0±2,4

СД-2 112 4.5±2,0 17.9±3,6* 22.3±3,9i 24.1±4,0* 19.6±3,7* 17.9±3,6* 10.7±2,9* 3.6±1,8

Хронический гастрит 65 9.2±3,6 18.4±4,8А 20.0±5,0* 30.8±5,7* 24.6±5,3 6.1 ±3,0* 3.1 ±3,0 4.6±2,6

Первичная хроническая надпочечная недостаточность 12 16.7±11,2 8.3±83 8.3±8,3 16.7±11,2 8.3±83 - 58.3±14,9* 33.3±14,0

Гишн онадизм, бесплодие н ДР, 32 18.7±6,9 3.1±3,1 - 3.1 ±3,1 - - 9.4±5,1 25.0±7,6

A1IC-1 типа 2 - - _ - - - 50.0±50,0 -

АПС-2 типа 13 1 7.7±7,7 69.2±13,3* 30.8±13,3 23.1±12,1 7.7±7,7 23.1±12,1 53.8±14,4* 30.8*13,3"

СКВ 33 18,1±6,7 24,2±7,4 - 18,1 ±6,7* 24,2±7,4 27,2±7,7* 21,2±7,1* 6,0±1,7

ссд 67 3,0±2,1 19,4±4,8* - 7,4±3,2 3,0±2,1 5,9±2,9 7,4±3,2 -

ДМ Г_23 - 4,3-t4,3 - 4,3±4,3 4,3±4,3 4,3±4,3 4,3±4,3 4,3±4,3

'^-различия достоверны но сравнению с группой допоров (р<0.()5)

У пожилых людей, чаше, чем у допоров г. Москвы, регистрировались положительные реакции с антигенами гормонпродуцирутоших органов. Однако только в случае определения антител к антигенам щитовидной железы ли различия носили достоверный характер. Полученные результаты совпадают с результатами зарубежных исследователей, сообщивших о преобладании сывороточных антител к* антигенам щитовидной железы у пожилых люден (Г..Я«1ц Е.Саг(Нп1,1992, 8.1ЧапоН1, Р.8апмт1, 1992).

Одним из важных аспектов характеристики безвредности современных вакцин является вопрос о вероятности развития в процессе вакцинации аутоиммунных реакций. Разработанный скршшнговый тест использовали для изучения динамики аутоан-тител к гормониродуцнрующим органам при вакцинации людей пожилого и старческою возраста. Для пой цели были использованы две вакцины- Грнпнол и иолпком-нонепгная вакцина из условно-патогенных микроорганизмов (ВП-4), которые были применены в данном коллективе для профилактики гриппа и ОР}. Наряду с обнаружением высокой активности 1<;С антител к антигенам ряда гормонпродуцирутоших органов до иммунизации, в исследовании было установлено отсутствие нарастания активности антител после вакцинации обоими препарат ами через один и пять месяцев.

При изучении активности антител у 124 больных диффузными Полстями соединительной ткани (Д15СТ), сочетание которых с эндокринной патологией ряд авторов выделяет в АПС--1 типа, среди больных системной красной волчанкой (СКВ) и системной склеродермией (ССД) довольно часто были выявлены случаи высокой активности антител к антигенам щитовидной железы (24,2-19,4%). Сыворотки больных СКВ характеризовались также высокой частотой позитивных реакций с антигенами других органов - поджелудочной железы (27,2%), желудка (24,2%) и надпочечника (21,2%). Анализ подученных результатов показал, что нередко у одного п того же больного определялись антитела одновременно к антигенам нескольких гормонпродуцнруюшнх органов. Частота таких сочетаний у больных СКВ составила 24%, а при ССД-13,4%. Это позволяет предположить сочетание системных аутоиммунных заболеваний с ЛПС.

Сыворотки больных с обменно-шдокринноп патологией по частоте позитивных реакций с антигенными препаратами гбрмониродуцируюших органов значительно превосходили другие группы. У больных ДТЗ наиболее часто определяли высокую активность антител к антигенам щитовидной, поджелудочной желез и надпочечника. При этом наиболее высокая активность антител была выражена у 27-29% папистов с антигенами щитовидной железы и слизистого слоя желудка. Аналогичную зависимост ь наблюдали в группе больных аутоиммунным шроиднтом, при котором частота выявления высокой активности антител к антигенам щитовидной железы превышала 40%.

В группе больных СД-1 наиболее высокую частоту позитивных реакций регистрировали в отношении антигенов щитовидной железы и желудка (23-25%). В этой группе частота обнаружении антител к антигенам поджелудочной железы не превышала 14%, тогда как в группе больных СД-2 аналогичный показатель был выше и составлял 17,9%. Наличие у значительной части больных СД-1 высокой активности антител не только к антигенам поджелудочной железы, но и к ан тигенам других органов, обнаруженные в отдаленные сроки от манифестации заболевания, является подтверждением аутоиммунной природы СД-1.

У больных хропичеекпм гастритом достоверно чаще обнаруживали позитивные реак-цни к антигенам желудка (24-30%) и щитовидной железы (18-20%). Достоверно чаще, чем у доноров, в сыворотках крови больных первичной хронической надпочеч-никовой недостаточностью была выявлена высокая активность антител к антигенам мнкросомальной фракции надпочечников (58,3%).

Для остальных исследуемых нозологических групп больных регистрировали высокую частоту определения антител к различным антигенам, однако, зги различия не носили достоверного характера, что можно обьяснигь статистически малой численностью исследованных групп.

Поскольку среди сывороток больных обменно-эндокриннон патологией большую долю составляли больные сахарным диабетом и аутоиммунным тирондитом, и н и труппы характеризовались наиболее частыми положительными реакциями с аиписцам/ разных эндокринных органов, нами была определена частота сочетании о них группах активности антител к антигенам нескольких органов. Антитела к антигенам двух органов при СД-1 и СД-2 типов обнаруживали в 11,6-12% случаев. Сочетанпую высокую активность к антигенам трех н более органов регистрировали в 15,8 и 9,3% случаев соответственно. В сыворотках больных АИТ частота указанных сочетаний была достоверно выше и составила к антигенам двух органов 22,8%, а к трем и бо.тес-18,7%. Таким образом, полученные результа ты указывают на сочетанное вовлечение в патологический процесс двух и более органов эндокринной системы и свидетельствует о диагностической ценности комплексного подхода при диагностике аутоиммунных эн-докринопатий.

Перекрестные реакции между антигенами щитовидной железы и У.еШегосоШка

При сопоставлении полученных нами данных определения высокой активности антител к антигенам условнопатогенных бактерий, полученных с помощью скрииип-

говой нммунофермептной тест-системы на основе антигенов условиопатогенных бактерий (УПГ>), выявлена высокая частота положите, и,пых совпадении определения 1<дО антител к антигенам щитовидной железы и 1£М ам ппел к антигенам У.еп1егосо/Шса, ¿.лити, Е.соП, Р.ппгаЫПх. На основании полученных результатов можно предположить наличие в антигенном составе щитовидной железы перекрестно-реагирующих антигенов не только с антигенами У.ешегосо/Шса, но и тремя видами других условиопатогенных бактерий. Это, в свою очередь, может' спндсгтльствовать об их причастности к этиопатогенезу аутоиммунных расстройств. Такое ноиепствне могло быть обусловлено, как серотнповымн или видовыми антигенами бак терий, так и межвидовыми антигенами. Для изучения этого вопроса мы провели изучение перекрестных реакций с использованием нммупоблогинга. Полученные результаты позволили установить, что в составе бактерии Б.аигет, Е.соН, Р.пигаЬИк и Кеп1егпсо1Шса имеются антигены, обладающие межвидовой серологической специфичностью. В составе бактерии У.еШегосо1Н1са имелся более широкий спектр перскрестно-реагнуюшнх антигенов, чем у других исследованных видов бактерии. Более широкий спектр образующихся ангитсл свидетельствует о высокой аитигенносгн У.аиегосоПИси, что, возможно, в слу чае инфицирования этими бактериями, при определенных условиях, может явиться причиной срыва толерантности к антигенам человека.

„I-., -I

200 1-Да 116 кДа 92,5 кДа

66,2 кДа

45 кДа

31 кДа

I 21,5 кДа

ЛВС

Д А В С Д !

Рисунок 3. Иммуноблотипг

Треки: А,В- фракции щнтовплпоП железы, С-даинтеграт Г.сп1егоео1Шса, Д-стандарты

Блоки обработаны: антисыппроткями к: \-Y.enterocolitica, 2- антигенам щитовидно» железы; сыворт-

камп больных ДТЗ-З, АИТ-4,5.

Блок 6- 5РЯ-электрпфорсз в 15%ПААГ. реплики окрашены А»шдо мерным 10В.

При изучении с помощью иммуиоблотинга перекрестных реакции между антигенами КеМегосоШка и антигенами щитовидной железы установлено, что как в составе антигенов щитовидной железы, так и в составе антигенов КеШегосоШка, имеются антигены обладающие перекрестной активностью (Рнс.З). Один из компонентов щитовидной железы с мол.м. 80 кДа, возможно, является апоиротеиповым кором рецептора тироидетнмулируюшего гормона, и в настоящее время рассматривается как нервпчняи антигенная мишень в развитии аутоиммунного гнпертироза (Л.М.!ЧсСге«ог, 1990).

Результаты перекрестного торможения иммуноферментной реакции па основе антигенных препаратов щитовидной железы позволили установить, что не только бе-локсодержащие антигены, но и липополисахарид (ЛПС) О-З серовара КеШегосоГШса содержат перекрестно-реагирующие эпитопы с антигенами щитовидной железы. Так, в дозе 4 мкт/мл ЛПС к микросомальная фракция щитовидной железы вызывали 100% торможение ИФ-реакцни сыворотки больного АИТ с антигенами щитовидной железы.

Таким образом, результаты изучении перекрестных реакции между бактериальными антигенами и антигенами щитовидной железы продемонстрировали, что ¥.еп<егосоШка может быть инициатором в запуске аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. В тоже время высокая антигенность У.еп1егосо1Мса позволяет рассматривать чти микроорганизмы как наиболее вероятный биологический фактор окружающей среды, способный инициировать аутоиммунные расстройства в отношении более широкого спектра органов и тканей.

ВЫВОДЫ

1. Выделены по единой методике препараты антигенов субклеточных фракций гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, желудка (слизистого п мышечного слоев), надпочечника и яичника.

2. На основании результатов иммунохимического анализа доказано наличие в субклеточных микросомальных и цитоплазматических фракциях исследованных органов органоспецнфнческих антигенов.

3. Обоснована возможность использования антигенов микросомальных фракции гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, желудка (слизистого н мышечного слоев), надпочечника и яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы для создания единого комплексного иммуноферментного теста на их основе.

4. Разработана унифицированная иммуноферментная тест-система для одновременного определения антител к восьми антигенным препаратам гормонпродуцп-

рующих органом и сыворотке крови людей.Показана высокая специфичность и надежность теста ( не менее 90%).

5. Впервые показана возможность совместного использовании методов гс.п.-фнльтрацпи и ИФЛ для отбора антигенных фракций для дальнейшего их применения в диагностике заболеваний.

6. Разработанная тест-система впервые применена для скрининга сывороюк крови доноров гг. Москвы и Тулы, лиц пожилого возраста и больных различными заболеваниями.

• Установлена более высокая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы у доноров г. Тула, в 15 раз превышающая лоз показатель для доноров г. Москва.

• При скрининге сывороток крови больных аутоиммунными заболеваниями эндокринной системы и диффузными заболеваниями соединительной ткани, установлена высокая активность IgG антител не только в отношении органов и тканей позологпческн связанных с заболеванием, но и в отношении целого ряда органоспецпфических антигенов, что свидетельствует о частом вовлечении в аутоиммунный процесс одновременно нескольких органов эндокринной сис темы.

7. Установлено наличие перекрестно-реагирующих антигенов в составе субклеточных фракций щитовидной железы и Y.enterocolitica.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Различия в активности IgG антител к антигенам гормонпролуцирующпх органов у мужчин и женщин. А.В.Поддубнков, Н.Е.Ястребова // International Journal on Immunorehabilitation.- 1999,- N.14. P.71

2. Характеристика активности антител к тканевым антигенам гормонпролуцирующпх органов у доноров крови. А.В.Поддубнков, Н.Е.Ястребова, Н.П.Ванеева, Н.Е.Лебедь // Сб. Проблемы инфекционных болезнен. - Моеква-2000, Часть 2, с.-) 1-45

3. Определение антител к Y.entrocolitica в сыворотках крови доноров. Н.Е.Лебедь, Н.Е.Ясзребова, Н.П.Ванеева, А.В.Поддубнков И Сб. Проблемы инфекционных болезнен. - Москва-2000, Часть 2, с.35-38

4. Частота определения антител к антигенам тканей гормонпродуцирукнцих органов у больных с эндокринопатиями. А.В.Поддубнков, Н.Е.Ястребова, Н.П.Ванеева,

М.А.Иолснова, Н.Ю.Логина, Т.А.Серова // International Journal on Immunorehabilitation.- 2000.- Vol.2, N.2. P.128

5. Сравнительный аналш активности IgG антител к антигенам Y.enterocoUtica н орга-поепецифическим антигенам гормонпродуцнруюших органов в сыворотках доноров станций переливания крови Москвы и Тулы. Н.Е.Лсбсдь, А.В.Поддубнков, Н.Е.Ястребова, Н.П.Ванеева // Аллергология и иммунология. - 2000.- Том 1, JY»2. С. 199

6. Изучение диагностических возможностей скринингового иммуноферментного теста для определения антител к условно-патогенным бактериям. Н.Е.Ястребова. Н.П.Ванеева, Н.В.Цветкова, В.Н.Ляшова, А.В.Поддубнков, Л.К.Катосова, Т.В.Спичак, Т.А.Дубровская, С.В.Лебедсв // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - Москва, 2001.- №1. С.138-142

7. Специфические протнвоисрсиниозные антитела классов G и М у здоровых доноров крови и больных пищевой токсикоинфекцпей. Н.Е.Лсбсдь, А.В.Поддубнков, Н.Е.Ястребова, Н.П.Ванеева, Е.А.Богачева, Н.Е.Захарова // Жури. Мпкробнол., 2001.- №2. С.87-89

8. Иммунологические показатели при введении бактериальной полнкомпопенпюй вакцины (ВП-4) лицам пожилого возраста. Л.А.Кузьмина, А.В.Поддубнков, И.М.Грубер // Медицинская иммунология. - 2001, Т.З, №2. С.225-226

9. Изучение специфического гуморального иммунитета у больных с диффузными болезнями соединительной тканн. А.В.Поддубнков, Н.Е.Ястребова, Н.11.Ванеева, Г.В.Васнльева, М.П.Костинов, Г.А.Лыскпна // International Journal on Immunorehabilitation - 2001.- Vol.3, N.l. P.35

10. Исследование влияния гриппола и поликомпонентной вакцины ВП-4 па динамику аутоантигел. Н.Б.Егорова, Н.Е.Ястребова, Б.Ф.Семенов, В.Н.Ефремова, Е.А.Курбатова, А.В.Поддубнков // Аллергология и иммунология. - 2001, Т.2, Л»2. С.22

11. Detection Rate of Antibodies to the Tissue Antigens of Hormoneproducing Organs in En-docrynopathy Patients. A.V.Poddubikov, N.E.Yastrebova, N.P.Vanceva, M.A.Polcnova, N.Yu.Logina, T.A.Serova // International Journal on Immunorehabilitation - 2000.- Vol.2, N.3. P.128

12. Study of Specific Humoral Immunity in Patients with Diffuse Connective Tissue Diseases. A.V.Poddubikov, N.E.Yastrebova, N.P.Vaneeva, G.V.Vasilyeva, M.P.Costinov, G.A.Lyskina // International Journal on Iinmunorchabilitation - 2001.- Vol.3, N.2. P.74

В настоящее время различными эндокринными заболеваниями страдает около 7-8% населения страны. Ежегодно отмечается рост заболеваемости практически для всех нозологических форм эндокринной патологии, сопровождающихся ранней инвалидизаци^й и смертностью, а также требующих больших экономических затрат на лечение и заместительную терапию. Манифестные формы сахарного диабета, по данным обращаемости в поликлинические учреждения, имеет около 1,5% населения страны. По данным эпидемиологических исследований эти показатели в 2-2,5 раза выше [9].

В настоящее время признано, что система иммунитета находится в субординационных отношениях с нервной и эндокринной системами, оказывая на них регуляторно-эффекторное влияние [1,42,181]. Новые достижения в экспериментальной и клинической иммунологии позволили пересмотреть вопросы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения многих эндокринных заболеваний. Окончательно установлена аутоиммунная природа целого ряда эндокринных заболеваний.

Научные исследования последних лет убедительно показали, что иммунная система обладает высокой чувствительностью ко многим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также неблагоприятным факторам физической природы, что неизбежно сопровождается снижением резистентности организма к инфекционным агентам и повышением риска возникновения аутоиммунных состояний и заболеваний [44]. Подтверждением этому является тенденция к увеличению распространенности аутоиммунных заболеваний в целом Так, на фоне общего роста заболеваемости болезнью Аддисона отмечается прогрессирующее преобладание первичной надпочечниковой недостаточности над болезнью Аддисона туберкулезной этиологии [52]. Отмечается резкое увеличение заболеваемости болезнями щитовидной железы, прежде всего, на территориях, подвергшихся загрязнению радиоактивным' i веществами в результате аварии на Чернобыльской АЭС, а также на территориях с неудовлетворительным состоянием профилактики йод дефицитных состояний [30] Обращает внимание значительное повышение удельного веса аутоиммунного тироидита среди других форм тироидной патологии, которые, в свою очередь, также сопровождаются и осложняются аутоиммунными реакциями, как правило, на территориях с высоким уровнем техногенного загрязнения [49]

На современном этапе становится очевидным, что бактериальные, вирусные и паразитарные антигены, имеющие перекрестно-реагирующие детерминанты с антигенами тканей и органов человека, в определенных условиях инициируют и поддерживают аутоиммунные реакции Концепция о том, что молекулярная мимикрия возбудителей инфекционных заболеваний и даже нормальной микрофлоры под ткани хозяина может составлять первичную основу в развитии аутоиммунных реакций, продолжает доминировать над многими гипотезами в этой области [100,116,128,137,151]

В большом числе случаев аутоиммунная обменно-эндокринная патология имеет син-дромальное, полигландулярное течение В настоящее время нет единого мнения в отношении классификации аутоиммунных полигландулярных синдромов Достаточно отметить, что компонентами синдромов являются первичная надпочечниковая недостаточность, аутоиммунный тироидит, диффузный токсический зоб, сахарный диабет 1 типа, гипопаротироз, первичный гипогонадизм, пернициозная анемия и другие заболевания

Многообразие и неспецифичность клинических проявлений большей части аутоиммунной обменно-эндокринной патологии служит причиной того, что верификация диагноза возможна только на основе лабораторно-инструментальных методов Особенно важна своевременная диагностика на ранних этапах формирования заболевания, когда еще высока возможность эффективного использования средств вторичной профилактики

Анализ данных, полученных при изучении аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, в том числе и полигландулярных синдромов, свидетельовует о значительной вариации показателей гуморального аутоиммунитета. Прежде всего это касается активности органоспецифических аутоантител, которые рассматриваются как маркеры при данной патологии [43,90,156]. Широкое распространение получили диагностикумы на основе антигенов щитовидной железы, индекс информативности которых, по оценкам отдельных авторов, составляет 90-95% [23,40]. В настоящее время большое значение приобретает определение антител в диагностике других эндокринных заболеваний аутоиммунного происхождения. Так, основным критерием для начала проведения профилактических мероприятий в ряде стран является определение аутоантител к антигенам поджелудочной железы [111,125,189].

Одним из современных высокочувствительных методов определения антител является иммуноферментный анализ. Использование в едином иммуноферментном тесте панели различных препаратов органоспецифических антигенов могло бы позволить проводить одновременное сравнение и изучать частоту вовлечения органов эндокринной системы в аутоиммунные процессы, оценивать активность, распространенность и преимущественное направление аутоиммунного процесса при некоторых заболеваниях и состояниях органов эндокринной системы. Учитывая высокую чувствительность иммунной и эндокринной систем к действию факторов окружающей среды использование такой тест -системы позволило бы проводить прескриптивную диагностику и определять «неблагополучие» в иммуно-нейроэндокринной системе, формировать группы риска по развитию заболеваний органов эндокринной системы с последующим мониторингом.

Целью настоящего исследования является разработка комплексной скрининговой им-муноферментной тест-системы для определения антител к органоспецифическим антигенам органов эндокринной системы.

Задачи исследования:

1. Выделить антигенные препараты из тканей гипофиза, щитовидной железы, под-желудочнои железы, надпочечника, яичника и желудка.

2. На основании результатов физико-химического и иммунохимического анализа обосновать применение отдельных антигенных препаратов гормонпродуцирую-ших органов для создания единого теста на их основе.

3. Разработать скрининговую иммуноферментную тест-систему на основе выделенных антигенных препаратов.

4. Определить с помощью разработанного теста активность IgG антител в сыворотках крови здоровых и больных различными заболеваниями людей.

Научная и теоретическая новизна работы

Впервые выделены по единой методике и охарактеризованы по химическим, иммунохи-мическим и физико-химическим параметрам антигенные препараты из гормонпродуцирую-щих органов: гипофиза, щитовидной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), поджелудочной железы, надпочечника и яичника.

С помощью методов иммунохимического анализа (преципитация в геле, иммуноэлектро-форез, торможение ИФА) установлено наличие в микросомальных фракциях перечисленных органов и в составе цитоплазматической фракции щитовидной железы органоспецифических антигенов.

Впервые на основе семи микросомальных и одной цитоплазматической антигенных фракций разработан комплексный унифицированный скрининговый иммуноферментный тест для определения IgG антител к антигенам гормонпродуцирующих органов, обладающий высокой специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Разработан метод отбора из состава субклеточных фракций диагностически значимых антигенов, сочетающий в себе гель-фильтрацию и ИФА

С помощью разработанного теста впервые оценено состояние гуморального аутоиммуни-тета у доноров крови гг. Москвы и Тулы, пожилых людей, больных различными аутоиммунными заболеваниями. Установлена высокая частота аутоиммунных расстройств в отношении антигенов щитовидной железы у доноров г. Тулы, а в отношении антигенов яичника - у доноров г.Москвы. Установлена более частая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы в сыворотках лиц пожилого возраста. Выявлена высокая встречаемость полигланду-лярных проявлений у больных с заболеваниями ДТЗ, АИТ, СД-1, ДБСТ.

С помощью иммуноблотта выявлены перекрестнче реакции между антигенами препаратов щитовидной железы и антигенами различной природы Y enterocohtica Практическая ценность

Разработана комплексная иммуноферментная тест система для одновременного определения IgG антител в сыворотках крови к 8 антигеным препарат am гормонпродуцирующих органов.

Основные положения выносимые на защиту

1. Микросомальные фракции гипофиза, щитовидной железы, слизистого и мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, надпочечника и яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы содержат органоспецифические антигены и могут быть использованы для создания на их основе иммуноферментной тест-системы 2 Разработана унифицированная иммуноферментная тест-система, обладающая высокой специфичностью, надежностью Основной ее особенностью является одновременное выявление активности антител к антигенным препаратам шести гормонпродуцирующих органов (гипофиз, щитовидная железа, желудок, поджелудочная железа, надпочечник и яичник)

3. Активность IgG антител сывороток к антигенам отдельных гормонпродуцирующих органов может зависеть от экологических и эндемических условий проживания людей в геохимических провинциях. Высокая активность IgG антител сывороток больных аутоиммунными заболеваниями в отношении целого ряда органоспецифических антигенов свидетельствует о частом вовлечении в аутоиммунный процесс одновременно нескольких органов эндокринной системы.

4. Субклеточные фракции щитовидной железы и антигенные препараты Y enterocolitica имеют в своем составе перекрестно-реагирующие антигены.

Апробация материалов диссертации и публикации. Материалы диссертационной работы доложены: на двух конференциях молодых ученых НИИВС им И.И.Мечникова РАМН (февраль 2000, март 2001); Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов», Тбилиси, Грузия, 23-26 сентября 1999г., VI Международном конгрессе «Успехи в иммунологии и аллергологии на пороге XXI века», Эйлат, Израиль, 3-6 мая 2000г.; Ш съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Сочи, Россия, 16-20 сентября 2000г.; VII Международном конгрессе «Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие», Нью-Йорк, США, 14-17 апреля 2001г.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ,из них 4 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста, иллюстрированы 3 схемами, 10 таблицами и 14 рисунками Список литературы включает 196 источников из них 63 на русском языке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Выделены по единой методике препараты антигенов субклеточных фракций гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), надпочечника и яичника.

2. На основании результатов иммунохимического анализа доказано наличие в субклеточных микросомальных и цитоплазматических фракциях исследованных органов органос-пецифических антигенов.

3. Обоснована возможность использования антигенов микросомальных фракций гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), надпочечника и яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы для создания единого комплексного иммуноферментного теста на их основе.

4. Разработана унифицированная иммуноферментная тест-система для одновременного определения IgG антител к восьми антигенным препаратам гормонпродуцирующих органов в сыворотке крови людей. Показана высокая специфичность и надежность теста ( не менее 90%).

5. Впервые показана возможность совместного использования методов гель-фильтрации и ИФА для отбора антигенных фракций для дальнейшего их применения в диагностике заболеваний.

6. Разработанная тест-система впервые применена для скрининга сывороток крови доноров гг. Москвы и Тулы, лиц пожилого возраста и больных различными заболеваниями

• Установлена более высокая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы у доноров г. Тулы, в 15 раз превышающая этот показатель для доноров г. Москвы.

• При скрининге сывороток крови больных аутоиммунными заболеваниями эндокринной системы и диффузными заболеваниями соединительной ткани, установлена высокая активность IgG антител не только в отношении органов и тканей нозологически связанных с заболеванием, но и в отношении целого ряда органоспецифических антигенов, что свидетельствует о частом вовлечении в аутоиммунный процесс одновременно нескольких органов эндокринной системы. 7. Установлено наличие перекрестно-реагирующих антигенов в составе субклеточных фракций щитовидной железы и Y.enterocolitica.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современный этап развития науки ознаменовался формированием новой области знания* нейроиммуноэндокринологии [1]. В настоящее время признано, что система иммунитета находится в субординационных отношениях с нервной и эндокринной системами, оказывая на них регуляторно-эффекторное влияние [181,42]. Несмотря на то, что имеется большое количество информации относительно деталей иммунопатологии, понимание этиологических и патогенетических механизмов аутоиммунных болезней остается недостаточным. Вместе с тем, научный прогресс в области иммунологии привел к пересмотру вопросов этиологии, патогенеза, диагностики, лечения, а в последнее время и профилактики заболеваний эндокринной системы аутоиммунного генеза с позиций современной иммунологии.

Научные исследования последних лет убедительно показали, что иммунная система обладает высокой чувствительностью ко многим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также неблагоприятным факторам физической природы. Это неизбежно сопровождается снижением резистентности организма к инфекционным агентам и/или повышением риска возникновения аутоиммунных состояний и заболеваний [44] Подтверждением научных исследований в этой области является тенденция к увеличению распространенности аутоиммунных заболеваний в целом. Так на фоне общего роста заболеваемости болезнью Адцисона отмечается прогрессирующее преобладание первичной надпочечниковой недостаточности над болезнью Аддисона туберкулезной этиологии [52] Отмечается резкое увеличение заболеваемости болезнями щитовидной железы, прежде всего на территориях подвергшихся загрязнению радиоактивными веществами в результате аварии на Чернобыльской АЭС, э также на территориях с неудовлетворительным состоянием профилактики йод-дефицитных состояний, связанных с проживанием в геохимических провинциях дефицитных по йоду [30]. Обращает внимание значительное повышение удельного веса аутоиммунного тироидита среди других форм тироидной патологии, которые, в свою очередь, также сопровождаются и осложняются аутоиммунными реакциями, как правило, на территориях с высоким уровнем техногенного загрязнения [49]. В настоящее время, вопрос об оценке биологического действия радиационных факторов связан еще и с оценкой последствий использования обедненного урана в Ираке и Косово. Данное положение указывает на возможность и необходимость использования иммунологических методов как для диагностики донозологи-ческих состояний организма, так и для оценки и прогнозирования отдаленных последствий воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды при отсутствии инструмента их оценки другими методами. Гигиеническая донозологическая диагностика признана ВОЗ концептуальной основой развития гигиены на ближайшую перспективу.

На современном этапе становится очевидным, что бактериальные, вирусные и паразитарные антигены, имеющие перекрестно-реагирующие детерминанты с антигенами тканей и органов человека, в определенных условиях инициируют и поддерживают аутоиммунные реакции. Концепция о том, что молекулярная мимикрия возбудителей инфекционных заболеваний или даже нормальной бактериальной флоры может составлять первичную основу в развитии аутоиммунных реакций, продолжает доминировать над многими гипотезами в этой области. В большом числе случаев аутоиммунная обменно-эндокринная патология имеет синдромальное, полигландулярное течение. В настоящее время нет единого мнения в отношении классификации аутоиммунных полигландулярных синдромов. Достаточно отметить, что компонентами синдромов являются: первичная надпочечниковая недостаточность, аутоиммунный тироидит, диффузный токсический зоб, сахарный диабет 1 типа, гипопаротироз. первичный гипогонадизм, пернициозная анемия и другие заболевания, имеющие большое социально-экономическое значение. Актуальность проблемы объясняет большой интерес исследователей в зарубежных странах к вопросам этиопатогенеза и диагностики, как самостоятельных аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, так и эндокринопатий в составе аутоиммунных полигландулярных синдромов [178, 156]. Следует отметить, что многообразие и неспецифичность клинических проявлений большей части аутоиммунной обмен-^ но-эндокринной патологии, служит причиной того, что верификация диагноза возможна только на основе лабораторно-инструментальных методов, особенно на ранних этапах формирования заболевания, когда еще высока возможность эффективного использования средств вторичной профилактики.

Анализ данных, полученных авторами, при изучении аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, в том числе и полигландулярных синдромов, свидетельствует о значительной вариации показателей гуморального аутоиммунитета. Прежде всего это касается ор-ганоспецифических аутоантител, которые рассматриваются в настоящее время как маркеры при данной патологии [447]. Это обстоятельство свидетельствует о полиморфизме заболеваний и синдромов этой группы, особенностях развития и течения заболеваний, характеризующихся длительным субклиническим течением. А отсутствие единого стандарта применяемых иммунологических тестов детекции аутоантител, затрудняет анализ и сопоставление результатов, полученных исследователями в различных лабораториях. Феномен аутоантител, несмотря на отсутствие единого мнения о патогенетической роли аутоантител в развитии аутоиммунных заболеваний, на сегодняшний день является самым доступным для создания на его основе диагностических систем и перспективным для использования в терапии различных заболеваний и состояний аутоиммунного генеза

Аутоантитела, специфичные для аутоантигенов, обеспечивают важные характеристические свойства аутоиммунных болезней, оказывая действие на определенные органы или ткани. Большое количество ткане- и органоспецифических мембранных рецепторов, ферментов и секретируемых гормонов, являющихся специфичными для повреждаемых клеток при аутоиммунных эндокринопатиях и других ассоциированных болезнях, в настоящее время рассматриваются и идентифицируются как аутоантигены-мишени. В отличие от роли аутоантител против внутриклеточных ферментов, патогенетическая роль аутоантител против некоторых клеточных рецепторов хорошо изучена. Идентификация аутоантигенов позволяет улучшать диагностику аутоиммунных состояний и определять индивидуальную предрасположенность к развитию болезней, что, в конечном счете, должно помочь осуществлению предотвращения болезни посредством разработки терапевтических стратегий.

Несмотря на актуальность, очевидную значимость и широту возможного применения органоспецифических антигенов, в настоящее время в нашей стране объем научных исследований в этой области крайне мал. Имеются лишь единичные работы по изучению антигенной структуры тканей и органов человека, выделению отдельных антигенов и разработке на их основе диагностических систем. Вместе с тем, практически все научные и диагностические исследования по изучению и оценке показателей гуморального аутоиммунитета выполняются с использованием коммерческих тест-систем зарубежного производства. Использование данного вида лабораторной диагностики, признанного основополагающим при аутоиммунной патологии, в практической медицине нашей страны крайне ограничено, прежде всего, высокой стоимостью зарубежных тест-систем, при практически полном отсутствии аналогичных тест-систем отечественного производства. Указанные обстоятельства диктуют необходимость всестороннего изучения органоспецифических антигенов, разработки методов их выделения, характеристики и создания на их основе диагностических тест-систем в нашей стране

Основываясь на знаниях того, что субклеточные структуры клеток функционально различных органов имеют не только морфологические и цитохимические, но и иммунохими-ческие отличия, субклеточное фракционирование (рисунок 1) явилось основой в получении антигенных препаратов гормонпродуцирующих органов. В последующих исследованиях были использованы только две субклеточные фракции (микросомальная и цитоплазматическая) гормонпродуцирующих органов. По данным литературы антигены этих фракций наиболее часто вовлекаются в аутоиммунные процессы и определение аутоантител к ним имеет большое диагностическое значение. Таким образом, нами получены субклеточные фракции следующих органов: гипофиз, щитовидная железа, желудок (слизистый и мышечный слои), поджелудочная желе id, надпочечник и яичник. Химический анализ субклеточных фракций i позволил заключить, что микросомальные фракции обладают достаточно стабильными характеристиками химического состава. Низкий процент содержания нуклеиновых кислот в их составесвидетельствует об эффективности проведенного фракционирования.

Результаты гель-фильтрации свидетельствуют о том, что препараты субклеточных фракций различных гормонпродуцирующих органов имеют выраженную индивидуальную хроматографическую картину, воспроизводимую и сохраняющуюся как при повторных исследованиях, так и при исследовании различных серий препаратов выделенных в разное время с использованием разного секционного материала. Поэтому гель-фильтрация может быть методом промежуточной стандартизации и контроля на этапе субклегочного фракционирования.

Результаты SDS-электрофореза в ПААГ позволили заключить, что анализируемые препараты характеризуются выраженной гетерогенностью полипептидного состава. Сравнение полипептидного спектра позволило выявить индивидуальные белоксодержащие компоненты для каждого из исследованных препаратов.

Заключение гистоморфологического исследования, свидетельствует о том, что в процессе многократной иммунизации антигенными препаратами различных органов человека в соответствующих органах (щитовидная железа, желудок, поджелудочная железа и яичник) лабораторных животных обнаружены признаки асептического воспаления аналогичные регистрируемым при соответствующих аутоиммунных заболеваниях.

Первичный иммунохимический анализ антисывороток, выполненный с использованием метода двойной радиальной диффузии в агарозном геле, позволил отметить резулыатив-ность использованной схемы иммунизации, о которой свидетельствует содержание преципи-тирующих антител к антигенам, использованным при иммунизации. Анализ результатов преципитации позволили установить наличие в составе микросомальных фракций гипофиза, поджелудочной железы, яичника и микросомальной и цитоплазматической фракций щитовидной железы органоспецифических антигенов. Дальнейшая иммунохимическая характеристика полученных препаратов с использованием метода одномерного иммуноэлектрофореза позволила заключить, что анализируемые препараты характеризуются выраженной гетерогенностью по физико-химическим свойствам соответствующих антигенов, в первую очередь, по заряду их молекул Это позволяет предположить наличие органоспецифических антигенов в составе каждой из субклеточных антигенных фракций Выраженная органная специфичность препаратов микросомальных фракций различных органов дала основание для их дальнейшего использования при разработке теста При этом, учитывая выраженные различия в антигенном составе цитоплазматической и микросомальной фракций щитовидной железы, выявленные при анализе этих препаратов с использованием различных методов, а также высокая диагностическая значимость определения аутоантител к целому ряду антигенов этого органа, мы сочли необходимым использование обеих фракций щитовидной железы при разработке скрининговой тест системы

Поскольку большинство препаратов, помимо антигенов обладающих органной специфичностью, имели в своем составе перекрестно-реагирующие антигены, было необходимо разработать такие условия ИФА, при которых органная специфичность была наиболее выражена На этапе разработки иммуноферментной скрининговой тест-системы нами были определены оптимальные концентрации антигенов для активации полистирольных планшетов оптимальное разведение исследуемых сывороток, а также оптимальное разведение коныога-та антител с ферментом Следует отметить, что при разработке тест-системы, включающей в себя одновременно несколько антигенных препаратов, мы преследовали цель добиться как можно большей унификации теста, которая, помимо упрощения и облегчения процесса постановки анализа, в значительной мере является инструментом предотвращения возможных факторных ошибок при выполнения многокомпонентного анализа Для достижения этой цели мы создали тест-систему, в состав которой входит восемь различных антигенов Определение антител к ним, на наш взгляд, имеет наибольшее диагностическое значение Параметром унификации тест-системы являлось определение сорбционной дозы для каждого используемого антигена, при которой результаты отрицательного и положительного контролей помимо максимальной разницы, имели бы стандартные значения, характеризовались низкими фоновыми значениями и максимально нивелировали перекрестные реакции. При этом, как методика постановки анализа при практическом использовании тест-системы, так и подходы к оценке результатов анализа являлись едиными для всех антигенов.

Исследование сывороток 101 донора крови Москвы с целью определения точки отсечения отрицательных показателей показало, что около 90% сывороток в рабочем разведении имели разницу оптической плотности от -0,1 до +0,1. Исходя из этого, такие значения в дальнейшем рассматривались как показатели нормы, а значения с величиной разности оптической плотности > +0,2 рассматривались как положительные. Следует отметить, что для иммуносорбентов различной специфичности, указанные параметры были общими. Это является подтверждением правильности определения дозы антигена для сорбции.

Исследование воспроизводимости результатов при анализе стандартных сывороток с низким и высоким содержанием антител показали, что коэффициент вариации результатов для тест-системы не превышал 8,7%, что свидетельствует о высокой точности и надежности тест-системы. В связи с тем, что мы не располагали достаточным для статистических исследований количеством охарактеризованных другими методами сывороток, необходимых для расчета чувствительности теста, в настоящее время на основании анализа сывороток доноров крови, мы можем сделать заключение только о высокой специфичности теста (не ниже 90%). Еще одним доказательством специфичности теста являются результаты перекрестного торможения иммуноферментной реакции.

Таким образом, в результате выполненных исследований по химической, физико-химической и иммунохимической характеристике препаратов субклеточных фракций гор-монпродуцирующих органов и комплекса исследований, выполненных на этапе разработки теста, нами разработана комплексная, унифицированная скрининговая тест-система на основе антигенов микросомальных фракций гипофиза, щитовидной железы, слизистого и мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, надпочечника, яичника и цитоплазматиче-ской фракции щитовидной железы, обладающая высокой надежностью (> 90%) и специфичностью (« 90%)

Использование в комплексном скрининговом тесте антигенов микросомальных фракций, на наш взгляд, является правомерным, поскольку эти фракции содержали в своем составе комплекс диагностически значимых антигенов Подтверждением этому являются результаты сочетанного использования гель-фильтрации и ИФА при анализе сывороток больных Предложенная нами методика позволит в дальнейшем использовать два хорошо известных л распространенных метода для отбора гель-фильтрационных фракций антигенных препаратов, обладающих диагностической значимостью при определенной патологии

Разработанный тест был использован для анализа активности IgG антител в сыворотках здоровых и больных различными заболеваниями людей При анализе результатов исследования сывороток доноров крови городов Москвы и Тулы выявлена достоверно более часто регистрируемая высокая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы у доноров Тулы, которая в 15 раз превышала аналогичные показатели у однотипной по полу и возрасту группы доноров Москвы Позитивные реакции с большинством других органоспецифических антигенов у доноров Москвы и Тулы не имели достоверных различий Данное обстоятельство, на наш взгляд, может быть объяснено воздействием ряда неблагоприятных факторов окружающей среды (йодный дефицит, воздействие радиации вследствие аварии на ЧАЭС) на доноров г Тулы

При сопоставлении результатов ИФА сывороток крови, положительно реагировавших с антигенами щитовидной железы и антигенами Y enterocohtica, обнаружено, что среди 103 сывороток доноров г Москвы высокую активность антител к ЛПС Y enterocohtica имело 15 человек, а среди доноров г Тулы - у 14 человек Однако из 15 позитивных к Y enterocohtica сывороток доноров Москвы только одна реагировала с антигенами щитовидной железы, среди позитивных сывороток доноров Тулы таких сочетаний было 13, что составило 78,6% Полученные результаты можно расценивать как свидетельство наличия перекрестно-реагирующих эпитопов в составе антигенов щитовидной железы и Y enterocolitica

Разработанные иммуноферментный тест был использован для скрининга сывороток крови лиц пожйлого возраста (65 лет и старше), проживающих в пансионате ветеранов труда г Москвы Данное исследование, помимо собственно определения частоты обнаружения высокой активности IgG антител к антигенам гормонпродуцирующих органов, преследовало цель изучения динамики образования аутоантител при иммунизации этого контингента гриппозной вакциной Гриппол и при сочетании введения этой вакцины с поликомпонентной вакциной из антигенов условно-патогенных бактерий ВП-4 Результаты исследований позволяю заключить, что пожилые люди, чаще чем доноры Москвы, имели положительные реакции с антигенами гормонпродуцирующих органов Однако, только в случае определения антител к антигенам щитовидной железы эти различия носили достоверный характер Изучение динамики антителообразования у вакцинированных пожилых людей до, через один и пять месяцев после вакцинации свидетельствовало об отсутствии нарастания активности антител в процессе вакцинации обоими препаратами

За время выполнения работы нами был собран банк сывороток, состоящий из 618 образцов 12 нозологических форм заболеваний эндокринной системы Следует отметить, что при поступлении сывороток для анализа, достаточно часто мы располагали лишь клиническим диагнозом, в связи, и были лишены возможности группировать больных по полу, возрасту, длительности заболевания и характеру проводимой терапии Достоверные различия в активности антител, по сравнению с контрольной группой доноров станций переливания крови г Москвы, наблюдали в группе больных ДТЗ к антигенам щитовидной, поджелудочной желез и надпочечника При этом, наиболее высокая активность антител была вь'ражена у 27-29% пациентов с антигенами щитовидной железы и слизистого слоя желудка Аналогичную зависимость наблюдали в группе больных аутоиммунным тироидитом, при котором частота выявления высокой активности к антигенам щитовидной железы превышала 40%

В группе больных СД-1 наиболее высокую частоту позитивных реакций регистрировали в отношении антигенов щитовидной железы и желудка (23-25%). При этом наблюдали высокую активность антител к антигенам поджелудочной железы с частотой обнаружения, не превышающей 14%. В группе больных СД-2 аналогичный показатель был выше и составил 17,9%. В тоже время, наличие у значительной части больных СД-1 высокой активности антител не только к антигенам поджелудочной железы, но и к антигенам других органов, обнаруживаемые в отдаленные сроки от манифестации заболевания, является еще одним подтверждением аутоиммунной природы СД-1.

У больных хроническим гастритом, достоверно чаще обнаруживали IgG позитивные реакции к антигенам желудка (24-30%) и щитовидной железы (18-20%).

Достоверно чаще, чем у доноров, в сыворотках крови больных первичной хронической надпочечниковой недостаточностью была вьивлена высокая активность антител к антигенам микросомальной фракции надпочечников (58,3%).

Для остальных исследуемых нозологических групп больных регистрировали высокую частоту определения антител к различным антигенам. Однако, эти различия не носили достоверного характера, что можно объяснить статистически-малой численностью исследованных групп.

Поскольку среди сывороток больных большую долю составляли больные сахарным диабетом и аутоиммунным тироидитом, и эти группы характеризовались наиболее частыми положительными реакциями с антигенами разных эндокринных органов нами была определена частота сочетания в этих группах активности антител к антигенам нескольких органов Антитела к антигенам двух органов при СД-1 и СД-2 типов обнаруживали в 11,6-12% случаев. Сочетанную высокую активность к антигенам трех и более органов регистрировали в 15,8 и 9,3% случаев соответственно. В сыворотках больных АИТ частота указанных сочетаний была достоверно выше и составила - к антигенам двух органов -22,8%, а к трем и более-18,7%. Таким образом, полученные результаты указывают на сочетанное вовлечение в патологический процесс двух и более органов эндокринной системы и свидетельствуют о диагностической ценности комплексного подхода при диагностике аутоиммунных эндокринопа-тий.

При изучении активности антител у 124 больных ДБСТ, сочетание которых с эндокринной патологией ряд авторов выделяет в АПС-4 типа, среди больных СКВ и ССД довольно часто были выявлены случаи высокой активности антител к антигенам щитовидной железы (24,2-19,4%). Сыворотки больных СКВ характеризовались также высокой частотой позитивных реакций с антигенами других органов - поджелудочной железы (27,2%), желудка (24,2%) и надпочечника (21,2%). Анализ полученных результатов показал, что нередко один и тот же больной имел высокую активность антител одновременно к антигенам нескольких гормонпродуцируюш! х органов. Частота таких сочетаний у больных СКВ составила 24%, а при ССД-13,4%, что позволяет предположить сочетание системных аутоиммунных заболеваний с АПС.

При сопоставлении полученных данных с результатами определения высокой активности антител к антигенам условнопатогенных бактерий, выявлена высокая частота положительных определений IgM антител к антигенам Y.enterocolitica, S.aureus, Ecoli, P.mirabilis и IgG антител к антигенам щитовидной железы. На основании полученных результатов можно предположить наличие в антигенном составе щитовидной железы перекрестно-реагирующих антигенов не только с антигенами Y.enterocolitica, но и трем видами других условнопатогенных бактерий, что, в свою очередь, может свидетельствовать об их при°астности к этиопато-генезу аутоиммунных расстройств. Это воздействие может быть обусловлено, как серотипо-выми или видовыми антигенами бактерий, так и межвидовыми антигенами. Для изучения этого вопроса нами были проведены исследования по изучению перекрестных реакций с использованием иммуноблотинга. Результаты анализа позволяют заключить, что в составе бактерий S.aureus, E.coli, P.mirabilis и Y.enterocolitica имеются антигены, обладающие межвидовой серологической специфичностью. Антигенный состав Y.enterocolitica имеет более широкий спектр перекрестио-реагиующих антигенов, чем другие исследованные виды бактерий. Более широкий спектр образующихся антител свидетельствует о высокой антигенности Y enterocolitica. Возможно, в случае инфицирования этими бактериями, при определенных условиях, это может явиться причиной срыва толерантности к аутоантигенам человека.

При изучении с помощью иммуноблотинга перекрестных реакций между антигенами Y.enterocolitica и антигенами щитовидной железы установлено, что как в составе антигенов щитовидной железы, так и в составе антигенов Y enterocolitica, имеются антигены, обладающие перекрестной активностью. Причем, один из компонентов щитовидной железы с мол м 80 кДа, возможно, является апопротеиновым кором рецептора тироидстимулирующего гормона, т.е. первичнай антигенной мишенью в развитии аутоиммунного гипертироза.

Таким образом, выполненные исследования свидетельствуют о широте возможного использования антигенных препаратов субклеточных фракций гормонпродуцирующих органов. На основе антигенов микросомальных фракций гипофиза, щитовидной железы, желудка, поджелудочной железы, надпочечника, яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы, разработана унифицированная комплексная скрининговая иммунофермент-ная тест система, обладающая высокими показателями надежности, специфичности и чувствительности.

Выделенные антигенные препараты представляют и собственную ценность, так как их можно использовать при выполнении научных исследований по изучению перекрестно- реагирующих антигенов в составе различных органов и тканей человека и микроорганизмов, роль которых в этиопатогенезе аутоиммунных заболеваний становится все более понятной и широко обсуждается в научной литературе.

110