Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Протеомные технологии в диагностике грибовидного микоза

( ■ 'г™

На правах рукописи

/ Ь "

Братцева Екатерина Валериевна

ПРОТЕОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ ГРИБОВИДНОГО МИКОЗА

14.01.10 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 НОЯ 2010

Москва - 2010 г.

004613237

Работа выполнена в отделении клинической дерматоло». Федерального Государственного учреждения «Государственнь научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» и отде прогеомнкн Института биомедицинской химии им.В.М. Орехови РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук

Анна Алексеевна Кубано: Сергей Александрович Мошковски

Ирина Борисовна ТрофимоЕ Мария Владимировна Савватеева

Ведущее учреждение:

Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита диссертации состоится «_ Л _» 10 года в 12 час(

на заседании Диссертационного совета Д208.115.01 при Федерально Государственном учреждении «Государственный научный цент дерматовенерологии Росмедтехнологий» по адресу: 107076, г. Москв ул.Короленко, д.З, стр.6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ГНЦ Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «_ (Д » ОС^^^ 2010г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Наталия Константиновна Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грибовидный микоз (ГМ) является наиболее распространенным видом первичных Т-клеточных лимфом кожи (R. Willemze и соавт., 2005). Диагностика грибовидного микоза, особенно на ранних стадиях (I-II), является одной из наиболее сложных проблем в практике дерматовенеролога. В настоящее время не существует единого диагностического алгоритма грибовидного микоза. Однако большинство авторов считает, что диагностика грибовидного микоза основывается на клинической картине заболевания, данных гистологического и иммунофенотипического исследований. Определение клональной перестройки гена Т-клеточного рецептора методом ПЦР является вспомогательным методом диагностики (Клинические рекомендации. Дерматовенерология, 2008, Р. Lenane и соавт., 2007, N. Pimpinelli и соавт., 2005, SJ. Whittaker и соавт., 2003).

Трудности диагностики грибовидного микоза заключаются в разнообразии его клинических проявлений, а также их сходстве с проявлениями хронических воспалительных дерматозов (A.A. Каламкарян, 1983, И.Б. Трофимова, 1997, H.S. Zackheim и соавт., 2002). Более того, некоторые дерматозы имеют сходные с грибовидным микозом иммунопатологические механизмы, например псориаз, как Thl-опосредованное заболевание (E.W.Cowen и соавт., 2007, К. Ghoreschi и соавт., 2007).

Точность клинического диагноза ГМ, подтвержденного гистологическим методом, составляет от 50 до 75% (А.Н. Родионов, 1997, SJ. Whittaker и соавт., 2003). По данным G. Burg и соавт., точность иммунофенотипического исследования на поздних стадиях ГМ достигает 80% (G. Burg и соавт., 2005), однако на ранних стадиях заболевания точность диагностики оказывается ниже. Кроме того, все перечисленные методы диагностики требуют проведения биопсии кожи.

Для своевременной диагностики наиболее перспективным в настоящее время является поиск сывороточных биомаркеров (М.А. Tainsky, 2009). С этой целью успешно применяются протеомные технологии, которые представлены широким спектром различных методов. Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия MALDI-TOF, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков (В.М. Говорун и соавт., 2002, Т.С. Рооп, 2007). Однако применение масс-спектрометрии ограничивается чувствительностью этого метода. Для изучения белков, представленных в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем находится порог чувствительности масс-спектрометрических методов, возможно применение технологии хМАР. Данный метод дает возможность проводить количественное определение десятков целевых белков одновременно. В качестве целевых белков в настоящем исследовании были выбраны цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе грибовидного микоза. В этом случае продукция цитокинов осуществляется как атипичными лимфоцитами, так и различными иммунными клетками микроокружения. В отечественной литературе отсутствуют работы, выполненные с применением протеомных технологий при изучении различных аспектов грибовидного микоза, а количество работ иностранных исследователей весьма ограничено, что определило актуальность данного исследования.

Цель исследования: Установить молекулярные маркеры 1рибовидного микоза на основании результатов изучения протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови с целью разработки алгоритма диагностики заболевания.

Задачи исследования:

1 Провести анализ анамнестических данных больных грибовидным микозом для оценки своевременности диагностики данного заболевания

2 Исследовать протеомные профили сывороток крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров крови методом масс-спектрометрии MALDI-TOF

3 Изучить уровень цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с помощью технологии хМАР на различных стадиях заболевания

4 Провести сравнительное изучение протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров с целью выявления молекулярных маркеров грибовидного микоза

5 Разработать алгоритм диагностики грибовидного микоза на основании данных, полученных в результате исследования профилей белков и цитокинов сыворотки крови.

Научная новизна

- впервые в России изучен протеомный профиль сыворотки крови больных грибовидным микозом с применением метода MALDI-TOF масс-спектрометрии. При сравнении протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, больных псориазом и здоровых людей -доноров крови выявлены пики белков, которые достоверно отличаются у обследованных лиц.

- впервые изучен широкий профиль из 27 цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с применением технологии хМАР. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов IP-10 и ILIO, а также обратная корреляционная связь концентрации цитокина RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что подтверждает патогенетическую значимость данных цитокинов.

- впервые в сыворотке крови больных грибовидным микозом установлено достоверное увеличение концентрации цитокина IP-10 по сравнению с концентрацией этого цитокина у больных псориазом, а также увеличение концентрации цитокинов IP-10, IL-4, IL-1га и G-CSF по сравнению с их концентрацией в сыворотке крови здоровых доноров. На основании проведенных исследований установлено, что цитокин IP-10 может использоваться в качестве диагностического маркера грибовидного микоза.

- впервые разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, обладающий высокой точностью и основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокина IP-10. При дифференциальной диагностике грибовидного микоза и псориаза алгоритм основывается на последовательном определении концентрации в сыворотке крови концентрации цитокинов IP-10 и IL-6 и имеет вид «древа принятия решений».

Практическая значимость:

В сыворотке крови обследованных больных выявлены молекулярные маркеры грибовидного микоза. С применением данных маркеров разработан алгоритм, позволяющий диагностировать грибовидный микоз и, в необходимых случаях, провести его дифференциальную диагностику с псориазом. Применение алгоритма диагностики грибовидного микоза позволит своевременно выявить больных «группы риска» по развитию данного заболевания для диспансерного наблюдения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания у пациентов до постановки диагноза «грибовидный микоз» составляет от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом у 23,1% больных грибовидный микоз диагностируется на третьей стадии заболевания.

2. Выявлены масс-спектромегрические пики белков, являющиеся молекулярными маркерами грибовидного микоза. Точность диагностики с применением данных маркеров составляет 69-75%, качество диагностики по данным ROC-анализа расценивается как хорошее (AUK>0,7).

3. Выявлены 4 цитокина (IP-10, IL-4, IL-1га и G-CSF), уровень экспрессии которых достоверно отличается у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови (р<0.05). Уровень экспрессии цитокина IP-10 у больных грибовидным микозом достоверно выше, чем у больных псориазом (р<0,001), что позволяет использовать его в дифференциальной диагностике этих заболеваний.

4. Установлена прямая корреляция концентрационная связь цитокинов IP-10 и IL-10 и обратная корреляционная связь цитокинов RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании.

5. Показана высокая точность разработанного алгоритма диагностики грибовидного микоза, а также возможность выявления с его помощью больных, относящихся к группам риска по развитию грибовидного микоза.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ «Протеомные технологии в дерматовенерологии» (Москва, 2007 г.)

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в лекционный курс кафедры дерматовенерологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета и врачей ординаторов ФГУ «ГНЦЦ Росмедтехнологий».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, из них 1 - в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Клиническая характеристика больных. Обследование пациентов проводилось в консультативно-диагностическом центре ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», в условиях стационара городской клинической больницы №14, в отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии Гематологического научного центра РАМН.

В работу включено 39 больных грибовидным микозом, среди которых было 23 женщины и 16 мужчин (59% и 41% соответственно) в возрасте 28 -82 лет, средний возраст которых составил 57,4 ± 2,2 лет [М±ш].

Из 39 пациентов 18 (46,2%) имели первую стадию грибовидного микоза, вторую стадию имели 13 (33,3%) человек, третью стадию - 8 (20,6%). У всех больных грибовидным микозом была диагностирована классическая форма Алибера-Базена (в соответствии с классификацией WHO-EORTC, 2008).

В лабораторное исследование с применением протеомных технологий было включено 23 больных грибовидным микозом, в соответствии со следующими критериями:

• возраст от 18 лет и старше,

• информированное согласие на участие в исследовании;

• стадия грибовидного микоза I-III без генерализации патологического процесса (без вовлечения периферической крови и внутренних органов);

• диагноз грибовидный микоз, подтвержденный гистологическим и иммунофенотипическим методами;

• отсутствие терапии грибовидного микоза не менее 2-х недель до участия в исследовании;

• отсутствие следующих патологических состояний (тяжелый инфекционный процесс, наличие онкологических заболеваний, беременность), а также отсутствие серопозитивности в тестах на ВИЧ-инфекцию.

В группу сравнения вошли 29 больных псориазом: 8 женщин и 21 мужчина (28% и 72% соответственно) в возрасте от 21 до 76 лет (средний возраст 45,9 ± 2,9 лет). У всех больных был диагностирован распространенный псориаз, среднее значение индекса РАБ1 составило 30,4 ± 1,37.

Контрольную группу составили 22 здоровых человека - доноров крови: 16 женщин и 6 мужчин (73% и 27% соответственно) в возрасте от 29 до 71 года (средний возраст 50,9 ± 2,4 года).

При попарном сравнении групп по возрасту выявлены статистически значимые различия между группами больных грибовидным микозом и псориазом (р<0.05). В работе мы допускаем, что возраст больных не оказывает значимого влияния на результаты исследования (Е.\У. Со\уеп и соавт., 2007). При сравнении группы больных грибовидным микозом с группами контроля по полу статистически значимых различий не выявлено.

Протокол получения сывороток крови. Взятие венозной крови (8 мл) у пациентов производили путем стандартной флеботомии в пластиковые пробирки без наполнителя. Пробирки находились при комнатной температуре в течение 2 часов до образования сгустка, затем их центрифугировали в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин. Сыворотку крови разделяли на аликвоты по 1 мл, которые замораживали и хранили при температуре - 80°С. При транспортировке замороженных сывороток использовали сухой лед.

Масс-спектрометрическое исследование. Профилирование проводили на масс-спектрометре АЩоЯех, «Вгикег Бакошсз» в линейном режиме в диапозоне масс 2-30 кДа. Для калибровки использовали следующие внешние стандарты: гирудин (6964 Да), убиквитин, цитохром С (12230 Да),

карбангидраза (14511,5 Да) миоглобин (16951 Да). Спектры снимали вручную, по крайней мере, в двух повторениях до суммарной интенсивности около 105. В работе использовали нормальнофазовые чипы NP20, в качестве матрицы - насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Ciphergen) в 50% (об./об.) ацетонитриле, содержащем 0,5% (об./об.) трифторуксусной кислоты, разведенный в два раза тем же растворителем. Для анализа масс-спектрометрических пиков была использована программа Biomarker Wizard™ (Ciphergen Biosystems) со следующими настройками: соотношение сигнал/шум (первая ступень) 10, соотношение сигнал/шум (вторая ступень) 5, пороговая интенсивность пика 0%, допустимая ошибка в определении массы 0,2%. Массы пиков и их интенсивности экспортировали в таблицы MS Excel, значения интенсивностей в повторных измерениях усредняли.

Исследование с применением метода мультиплексного анализатора. Для анализа на мультиплексном анализаторе Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США), основанном на технологии хМАР, была выбрана панель из 27 цитокинов в составе коммерческой тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-Plex Panel (Bio-Rad, США). В исследуемую панель входили следующие цитокины: PDGF-bb, IL-lb, IL-lra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, IP-10, MCP-1(MCAF), MlP-la, MIP-lb, RANTES, TNF-a, VEGF. Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Для анализа сывороток на приборе Bio-Plex образцы размораживали, центрифугировали 10 мин при 13.2 тыс. об./мин. и 4°С и разводили в 4 раза.

Для построения стандартной калибровочной кривой лиофилизованную смесь стандартов растворяли в 500 мкл sample diluent и готовили серию из 8 разведений в standard diluent. Измерения проводили с низким и высоким разрешением. В качестве контролей использовали standard diluent и sample diluent. Все измерения проводили двух повторах.

Результаты измерений были представлены с помощью программы Bio-

Plex Manager 5.0. При статистической обработке значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимались за 0 пг/мл. Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю границу чувствительности, то его концентрацию принимали равной верхней границе.

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета Statistica 6.0 и языка программирования R, Для описания групп больных использовались стандартные методы описательной статистики. Статистическая проверка данных на нормальность осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилкса, проверка гипотез о значимости различий в исследуемых группах по количественному признаку - с помощью дисперсионного анализа (тест Шеффи) и U-критерия Манна Уитни с поправкой Бонферрони, по качественным признакам - с помощью критерия Фишера с поправкой Бонферрони. Выбранный критический уровень значимости р<0,05.

Оценка диагностического качества выбранных маркеров оценивалось с помощью ROC-анализа. Качество диагностических маркеров оценивалась по экспертной шкале для значений AUC (J.A. Hanley и соавт., 1982, М.Н. Zweig и соавт., 1993).

Сравнение диагностического исследования (маркера) с референтным диагнозом. Для выявленных маркеров рассчитывали показатели точности, чувствительности, специфичности и прогностической ценности положительного диагноза (PPV). Расчет производился по формулам, представленным в таблице 1.

Таблица 1. Формулы расчета показателей точности, специфичности, чувствительности и РРУ изучаемого маркера_

Референтный диагноз

здоровы выявлено заболевание

Изучаемый здоровы а Ь

метод выявлено с (количество человек) d

заболевание

Чувствительность = а/( а + с) (1)

Специфичность = d/( b + d) (2)

Точность = (а + d)/(a + b + с + d) (3)

Прогностическая ценность положительного диагноза (PPV) = а/( а + Ь) (4)

При обработке данных масс-спектрометрического исследования детекцию и выравнивание пиков производили с помощью программы ClinProTools (Bruker Daltonics). Кластерный анализ использовали для выявления групп схожих по масс-спектрометрическим профилям образцов.

Для снижения размерности данных использовали двухступенчатый подход: сначала выбирали среди групп коррелирующих пиков пики с наибольшим значением площади под ROC-кривыми, а затем оставшиеся пики ранжировали с использованием метода рекурсивного отбора признаков.

На втором этапе для отбора значимых признаков применяли алгоритм рекурсивного исключения признаков (Recursive Feature Elimination algorithm, RFE) (I. Gyuon и соавт., 2002). Для разработки диагностического алгоритма использовали метод опорных векторов (Support Vector Mashine, SVM). Из-за небольшого количества образцов точность диагностики определяли с помощью 10-кратной кросс-валидации. Кросс-валидацию повторяли 50 раз и вычисляли 95% доверительные интервалы для точности, чувствительности и специфичности диагностики (М. Pyatnitskiy и соавт., 2010).

Результаты исследования и их обсуяедение

У больных грибовидным микозом (39 человек) тщательно изучались анамнез и клиническая картина заболевания. Основные клинические характеристики представлены в таблице 2.

Таблица 2. Основные клинические характеристики больных грибовидным микозом

Клинические характеристики Число больных ГМ

Возраст, диапазон лет (среднее ± ст.ош. ср) от 28 до 82 лет (57,4 ± 2,2)

Пол

Мужчины 16(41%)

Женщины 23 (59%)

Возраст дебюта заболевания, диапазон лет (М±т) от 26 до 71 года (46,1 ± 2,26 лет)

Длительность заболевания, диапазон лет (М ±т) от 2 до 36 лет (10,3 ± 1,23 лет)

Стадия ГМ

I 18(46,2%)

II 13 (33,3%)

III 8 (20,5%)

Классическая форма (Алибера Базена) 39(100%)

У всех больных была диагностирована классическая форма грибовидного микоза (Алибера-Базена). Однако патологический кожный процесс отличался большим разнообразием проявлений, особенно на первой стадии заболевания. В этом случае высыпания были представлены различными по окраске и размерам эритематозными пятнами с шелушением на поверхности: псориазо- и парапсориазоподобными элементами, имели вид пигментно-пурпурозного дерматоза. У одного пациента имелся единственный очаг грибовиного микоза. У пациентов со II стадией ГМ на ряду с пятнистыми элементами имелись бляшки с различной степенью инфильтрации, разных размеров, окраска которых варьировала от розового до желтовато-красного и бурого цветов. На поверхности очагов поражения наблюдались множественные чешуйки. У некоторых больных на отдельных участках тела наблюдалась пойкилодермия. У пациентов с III стадией ГМ наряду с пятнистыми и бляшечными элементами имелись опухоли, формирующиеся как в области бляшек, так и на непораженной ранее коже. У части больных процесс носил генерализованный характер и имелось состояние близкое к эритродермии. Отмечалась разлитая эритема и инфильтрация всего кожного покрова, кожа была покрыта крупными и мелкими чешуйками. Эритродермическое состояние у некоторых больных сопровождалось появлением эктропиона, выпадением волос, изменением

ногтевых пластин. У некоторых больных отмечались повышение температуры тела, озноб, недомогание.

Пациенты предъявляли жалобы на зуд (53,8%) или жжение (15,4%) в области высыпаний, у 30,8% больных субъективных ощущений не было.

I

При анализе данных анамнеза больных грибовидным микозом было выявлено, что длительность заболевания (от момента появления первых симптомов) до постановки диагноза грибовидный микоз составила от 1 месяца до 23 лет (5,5 ± 0,84 года). У 43,6% пациентов грибовидный микоз был диагностирован на первой стадии, у 33,3% пациентов - на второй стадии и у 23,1 % пациентов на третьей стадии (рис. 1).

Рисунок 1. Распределение больных грибовидным микозом по стадиям на момент постановки диагноза.

Наиболее часто грибовидный микоз у пациентов первоначально диагностировался как дерматит (аллергический или контактный) - у 46,2%, псориаз, атопический дерматит (нейродермит), экзема - по 10,3% на каждый диагноз. У отдельных пациентов первоначально диагностировались парапсориаз (у 2 человек), васкулит (у 3 человек), генерализованный микоз (2 человека), В-клеточная лимфома кожи, болезнь Дарье, чесотка, болезнь

Девержи, туберкулез кожи, саркоидоз, отрубевидный лишай, гранулематозный панникулит.

Только у 18% пациентов грибовидный микоз был первым диагнозом (рис. 2). Необходимо отметить, что у 15,4% пациентов устанавливали более 2 различных диагнозов, сменявших друг друга. Более 25% пациентов получали системную терапию по поводу неверно установленного диагноза такими препаратами, как метотрексат, неотигазон, циклоспорин, препараты ГКС (преднизолон, метипред, дипроспан), плаквенил.

Рисунок 2. Первоначальные диагнозы больных грибовидным микозом

Результаты исследования с применением метода масс-спектрометрии МАЬБЬТОР. Образцы сыворотки крови от 23 больных грибовидным микозом, 29 больных псориазом и 22 здоровых доноров крови были проанализированы методом масс-спектрометрии. Для обработки данных были использованы значения площадей масс-спектрометрических пиков во всех образцах. Сравнение групп проводили по 182 пикам. На первом этапе статистической обработки данных проводилась проверка отдельных масс-спектрометрических пиков на возможность использования в

качестве биомаркеров, на втором этапе - разработка диагностического алгоритма с применением панели пиков.

При сравнении масс-спектрометрических пиков в группах больных грибовидным микозом и псориазом достоверные различия были обнаружены по 2 белковым пикам с m/z 4326 Да и 7674 Да (р<0,05). При сравнении данных в группах больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови статистически значимые различия (р<0,05) были обнаружены по 3 белковым пикам: m/z 14689 Да, 7848 Да и 4184 Да. Для оценки диагностического качества данных маркеров проводили расчет чувствительности, специфичности, точности и PPV, которые представлены в таблице 3. Методом ROC-анализа определяли диагностическое качество данных белковых пиков, в соответствии с экспертной шкалой AUC оно расценивается как хорошее (AUC>0,7).

Результаты проведенного исследования доказывают, что использование масс-спектрометрической технологии MALDI-TOF позволяет с достаточно высокой точностью проводить диагностику грибовидного микоза с использованием отдельных белковых пиков. Необходимо отметить, что точность диагностического алгоритма, основанного на использовании цанели пиков, не превышала 77%. Таким образом, показано, что наиболее перспективной является разработка метода диагностики грибовидного микоза, основанная на отдельных белках-биомаркерах, масс-спектрометрические пики которых представлены в таблице 3.

Таблица 3. Пики белков, имеющие достоверные отличия между исследуемыми группами

т/г пиков, Да АиС Точность, % Чувствительность, % Специфичность, % РРУ,% Порог отсечения

Пики белков, имеющие достоверные различия в группах больных грибовидным микозом и псориазом

4326 0,78 75 65,2 82,7 75 71*

7674 0,76 69 60,9 75,9 70,9 14*

Пики белков, имеющие достоверные различия в группах больных грибовидным микозом и здоровых доноров

4184 0,73 71,1 56,5 86,3 81,3 25,2**

7848 0,75 75,5 69,5 81,8 72 9 9**

14689 0,73 77,7 78,2 77,2 77,2 14,23*

* достоверные различия между группами при р<0,005; ** достоверные различия между группами при р<0,001

Таблица 4. Цитокины, концентрация которых в сыворотке крови достоверно отличается между группами

Название цитокина АИС Точность, % Чувствитель ность, % Специфичность, % РРУ,% Порог отсечения концентрации цитокина, пг/мл

Цитокины, концентрация которых достоверно отличается в сыворотке крови больных ГМ и здоровых доноров

1Ь-Жа 0,85 82,2 91,3 72,7 88 58,77**

1Ь-4 0,77 75,5 91,3 59 86 4,53*

в-СБР 0,82 80 78,2 81,8 78 17,33**

1Р-10 0,92 88,8 82,6 95,4 84 3233,9**

Цитокины, концентрация которых достоверно отличается в сыворотке крови больных ГМ и псориазом

1Р-10 0,8 76,9 65,2 86,2 75 5264,84**

* достоверные различия между группами при р<0,005; ** достоверные различия между группами при р<0,001

Результаты изучения уровня цитокинов в сыворотке кроь больных грибовидным микозом с применением технологии хМАР.

целью обнаружения молекулярных маркеров, представленных в сыворои крови в более низких концентрациях, чем это возможно определит методами масс-спектрометрии, нами был проведен анализ ряда целевы белков, в качестве которых были выбраны цитокины, с применение) технологии хМАР. На приборе BioPlex-200 (BioRad), в сыворотках кров больных ГМ, псориазом и здоровых людей было проанализировано содержание 27 цитокинов: PDGF-bb, IL-lb, IL-lra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, IP-10, MCP-1(MCAF), MIP-la, MIP-lb, RANTES, TNF-a, VEGF.

При сравнении полученных данных в группах больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови достоверные различия были обнаружены в концентрациях 4 цитокинов: IL-lra, G-CSF, IP-10 (р<0,001) и IL-4 (р<0,05). Все перечисленные цитокины были значительно повышены в группе больных ГМ. Результаты представлены в таблице 4. Установлено достоверное увеличение концентрации IP-10 (р<0,001) у больных ГМ при сравнении с больными псориазом.

Таким образом, наиболее значимое увеличение концентрации в сыворотке крови у больных грибовидным микозом выявлено для цитокина IP-10. В группе больных ГМ этот показатель составил 13,5± 2,8 нг/мл [М±т], тогда как у больных псориазом - 3,3±0,5 нг/мл, у здоровых доноров крови -1,8±0,2 нг/мл (рис.3). Таким образом, IP-10 является наиболее перспективным цитокином для использования в качестве молекулярного маркера грибовидного микоза. IP-10 (interferon-y inducible protein-10, CXCL10) - индуцированный интерфероном-у белок, является хемокином. Он принадлежит к семейству СХС хемокинов и играет важную роль в процессе воспаления, привлекая Т-лимфоциты в очаг воспаления путем модуляции их адгезии к эндотелиальным клеткам и трансмиграции в ткани. В коже продукция хемокинов осуществляется кератиноцитами в ответ

Рисунок 3. Концентрация 1Р-10 в сыворотке крови больных ГМ, псориазом и здоровых доноров

на различные стимулы, например, на синтез IFN-y активированными Т-лимфоцитами или TNF-a - макрофагами (D.M. Boorsma и соавт., 1994, X.S. Wu и соавт., 2009, D.M. Boorsma и соавт., 1998). Рецептором IP-10 является CXCR3, который экспрессируется на Т-лимфоцитах (преимущественно Thl-типа), и, в меньшей степени, на эозинофилах, моноцитах и NK-клетках (R. Bonecchi и соавт., 1998, D.D. Taub и соавт., 2001, Т. Jinquan и соавт., 2000).

Гипотеза патогенеза Т-клеточных лимфом кожи с участием IP-10 была предложена А.Н. Sarris с соавторами (А.Н. Sarris и соавт., 1995). Первый этап заключается в хоуминге в кожу активированных или атипичных Т-лимфоцитов, путем связывания лимфоцит-ассоциированного антигена (CLA) с Е-селектином, который экспрессируется в коже при реакциях гиперчувствительности замедленного типа или хроническом воспалении, часто предшествующих развитию TKJIK. Эти лимфоциты продуцируют IFN-у, в ответ на который кератиноциты эксперссируют IP-10. Это второй этап, заключающийся в эпидермотропизме активированных Т-лимфоцитов. На третьем этапе кератиноциты связываются с лимфоцитами посредством межклеточных молекул адгезии (ICAM), что, вероятно, приводит к формированию микроабсцессов Потрие (А.Н. Sanis и соавт., 1995). Результаты наших исследований также согласуются с этой гипотезой, так как

концентрация 1Р-10 не только повышена в сыворотке крови больных грибовидным микозом, но и увеличивается при прогрессировании заболевания (см. далее), то есть при усилении инфильтрации кожи Т-лимфоцитами.

Разработан диагностический алгоритм грибовидного микоза с применением цитокина 1Р-10 в качестве молекулярного маркера. Для дифференцировки сыворотки крови больных грибовидным микозом от сывороток крови здоровых доноров и больных псориазом методом хМАР установлен пороговый уровень концентрации 1Р-10 - 5,3 нг/мл, который может использоваться для диагностики грибовидного микоза. Чувствительность метода в данном случае составляет 65,2%, специфичность - 86,2%, прогностическая ценность положительного диагноза - 75%. Качество диагностики по данным ЯОС-анализа расценивается как очень хорошее (АиС>0,8).

Распространенным подходом к увеличению точности диагностики является совместное использование нескольких маркеров. С целью поиска оптимальной диагностической панели цитокинов мы использовали различные методы многомерной статистики.

Наибольшая точность алгоритма диагностики ГМ была достигнута при последовательном определении в сыворотке крови концентрации двух цитокинов: 1Р-10 и 1Ь-6 (рис. 4). При концентрации цитокина 1Р-10 в сыворотке крови выше 7,3 нг/мл пациенту ставится диагноз грибовидный микоз с точностью до 90%. Если концентрация 1Р-10 ниже 7,3 нг/мл, то переходят к оценке концентрации 1Ь-6 в сыворотке крови. Если она выше 13 пг/мл, то при наличии у пациента характерных клинических проявлений диагностируется псориаз. В том случае если концентрация 1Ь-6 в сыворотке крови ниже 13 пг/мл, у пациента нельзя исключить наличие грибовидного микоза. Данная категория пациентов является «группой риска», их необходимо направлять на дополнительные методы обследования и они должны оставаться на диспансерном учете.

ГМ Здоровые доноры Псориаз

< 7,3 нг/мл

-. ''' г ■ ' 1

-

Здоровые дошры Псориаз

3 дор овые доноры Пс ориаз

Рисунок 4. Диагностический алгоритм "древо принятия решений" для дифференциальной диагностики ГМ, псориаза и нормы, основанное на определении концентрации двух цитокинов 1Р-10 и IЬ-6 в сыворотке крови

При реализации алгоритма диагностики с определением в сыворотке крови концентрации 27 цитокинов методом хМАР с последующей обработкой данных с применением линейного дискриминанта Фишера, его точность составила 80%.

Анализ уровня цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом на разных стадиях заболевания. Выявлена прямая корреляция концентрация цитокинов IL-10 и IP-10 в крови больных грибовидным микозом со стадиями грибовидного микоза (rs=0,52 и 0,51 соответственно, при р=0,05). Напротив, концентрация цитокина RANTES достоверно снижается по мере увеличения тяжести заболевания (rs=0,5, при р=0,05).

Выводы

1. При анализе данных анамнеза больных грибовидным микозом установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания до постановки диагноза «грибовидный микоз» составила от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом 23,1% пациентов уже имели III стадию заболевания.

2. Изучение протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом и псориазом методом MALDI-TOF показало наличие 2 пиков белков с m/z 4326 Да и 7674 Да (р<0,05), позволяющих их использовать для дифференциальной диагностике этих заболеваний с точностью 69% и 75% соответственно. Качество диагностики с применением этих пиков по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7).

Выявлены 3 масс-спектрометрических пика белков с m/z 14689 Да; 7848 Да и 4184 Да, концентрация которых в сыворотке крови достоверно отличается (р<0,05) у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови. Точность диагностики в этом случае составляет 73%, 75% и 73%

соответственно, ее качество по результатам ЯОС-анализа расценивается как хорошее (АиС>0,7).

3. При изучении уровня цитокинов в сыворотке крови с применением технологии хМАР было показано, что у больных грибовидным микозом определяется значительное увеличение концентрации 4 цитокинов: 1Ь-1га, О-СЗБ, 1Р-10 (р<0,001) и 1Ь-4 (р<0,05) по сравнению с результатами здоровых лиц, и цитокина 1Р-10 (р<0,001) - по сравнению с больными псориазом.

4. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов 1Р-10 и 1Ь-10 (г5=0,52 и 0,5 при р=0,05) и обратная корреляционная связь концентрации цитокина ИАКТЕБ (г5=0,51 при р=0,05) в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что указывает на патогенетическую значимость этих цитокинов при данном заболевании.

5. Разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, основанный на определении концентрации цитокина 1Р-10. При уровне 1Р-10 в сыворотке крови выше 5,3 нг/мл, точность диагноза грибовидный микоз составляет 76,9%. Качество алгоритма по результатам ЮС-анализа расценивается как очень хорошее (АиС>0,8). В случае необходимости дифференциальной диагностики грибовидного микоза и псориаза возможно применение алгоритма, основанного на последовательном определении в сыворотке крови концентрации цитокинов 1Р-10 и 11.-6 и имеющего вид «древа принятия решений». Точность данного алгоритма диагностики составляет 90%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Братцева Е.В. Протеомные исследования в дерматологии/ Е.1 Братцева// Сб. тез. науч. раб. X Всерос. съезда дерматовенерологов. - ¡У 2008.-С.17.

2. Братцева Е.В. Поиск потенциальных биомаркеров хронически дерматозов с помощью протеомного анализа/ Е.В. Братцева, С./ Мошковский, Л.Ф. Знаменская и др.// Вестн. дерматол. венерол. - 2010 - Ж -С.13-20.

3. Братцева Е.В. Оценка возможности диагностики грибовидного микоза с помощью прямого протеомного профилирования сыворотки кров* Е.В. Братцева, Е.Е. Соколова, М.А. Пятницкий и др.//Сб. тез. науч. раб. «Санкт-Петербургские дерматологические чтения». - СПб., 2010. - С.35-36.

Заказ №838. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность проблемы

Первичные Т-клеточные лимфомы кожи (ТКЛК) представляют собой клинически и биологически гетерогенную группу неходжкинских лимфом. Они характеризуются клональной пролиферацией и миграцией в кожу атипичных Т-лимфоцитов или NK-клеток, при этом в период обследования пациента с целью постановки диагноза не обнаруживаются внекожные очаги роста опухоли. Классификация Всемирной Организации Здравоохранения и Европейской Организации по Исследованию и Лечению Рака (WHO-EORTC) насчитывает 8 видов первичных Т-клеточных лимфом кожи (Swerdlow S.H. и соавт., 2008). Наиболее распространенной из них является грибовидный микоз (<mycosis fungoides, ГМ), составляющий более 50% первичных лимфом кожи (Y.H. Kim и соавт., 2003).

Диагностика ГМ, особенно на-ранних (1-Й) стадиях заболевания, является одной из наиболее сложных проблем в практике дерматовенеролога (И.Э. Белоусова, 2009, A.A. Каламкарян, 1983). По данным отечественных и зарубежных авторов, от начала заболевания пациента до постановки диагноза ГМ проходит от нескольких месяцев до 7 лет (а по некоторым данным и до 40 лет) (P. Lenane и соавт., 2007, Г.Н. Тарасенко и соавт., 2006). В настоящее время не существует единой точки зрения на диагностический алгоритм ГМ (а, 2007, P. Lenane и соавт., 2007, N. Pimpinelli и соавт., 2005, S.J. Whittaker и соавт., 2003). Однако большинство авторов сходятся во мнении, что диагностика ГМ основывается на клинической картине заболевания, данных гистологического и иммунофенотипического исследований, вспомогательным методом диагностики является ПЦР-анализ клональной перестройки гена Т-клеточного рецептора (N. Pimpinelli и соавт., 2005).

Трудности в диагностике ГМ заключаются в разнообразии его клинических проявлений, а также их сходстве с проявлениями хронических воспалительных дерматозов, особенно на ранних стадиях ГМ (H.S. Zackheim и соавт., 2002). Необходимо также отметить, что грибовидный микоз имеет не только большие клинические сходства с хроническими воспалительными дерматозами, но и некоторые общие иммунопатологические механизмы. Например, на ранних стадиях в иммунопатогенезе грибовидного микоза ведущую роль играют Thl-лимфоциты, и преобладает соответствующий цитокиновый профиль, что сближает это заболевание с псориазом, как Thl-обусловленным заболеванием (С.Е. Griffiths и соавт., 2007, U. Mrowietz и соавт., 2009). Кроме того, в эпидермальном инфильтрате при псориазе в некоторых случаях выявляется клональность Т-лимфоцитов, что дает основание некоторым автором причислять псориаз «клональным дерматозом» (J.C. Chang и соавт., 1997, W.J. Lin и соавт., 2001, S. Vollmer и соавт., 2001).

Точность клинического диагноза ГМ, подтвержденного гистологическим методом, составляет от 50 до 75%. По данным G. Burg и соавт., точность иммунофенотипического исследования на поздних стадиях ГМ достигает 80% (G. Burg и соавт., 2005), однако на ранних стадиях заболевания точность диагностики оказывается ниже(А.Н. Родионов и соавт., 1997, И.Э. Белоусова, 2009, И.Б. Трофимова, 1997).

Все перечисленные исследования требуют проведения биопсии кожи. А с учетом того, что диагноз ГМ на ранних стадиях представляет большие затруднения, биопсии проводятся многократно на протяжении нескольких лет. То есть, для постановки точного диагноза пациент вынужден многократно подвергаться инвазивному вмешательству - биопсии кожи.

С целью совершенствования диагностики наиболее перспективным в настоящее время является поиск сывороточных биомаркеров различных заболеваний, в особенности онкологических (М.А. Tainsky, 2009). На 7 протяжении последних лет появились сообщения об успешном применении протеомного профилирования для поиска биомаркеров с целью совершенствования диагностики и расширения знаний в области патогенеза различных заболеваний (E.F. Petricoin и соавт., 2002, F. Simpkins и соавт., 2005), прогноза течения заболеваний (М. Albitar и соавт., 2006, G. Ricolleau и соавт., 2006), оценки эффективности терапии (V. Espina и соавт., 2004). Преимуществом протеомного профилирования по сравнению с исследованиями генома и транскриптома является то, что за конечную реализацию основных биохимических функций организма отвечают именно белки, поэтому изменения в белковом профиле могут быть непосредственно связаны с патофизиологическими процессами.

Протеомные технологии представлены достаточно широким спектром различных методов. Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия MALDI-TOF, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков(В.М. Говорун и соавт., 2002, Т.С. Рооп, 2007). Однако применение масс-спектрометрии ограничивается чувствительностью этого метода, т.е. ограниченной способностью детектировать белки/пептиды, представленные в сыворотке крови в низких концентрациях.

Для изучения таких белков возможно применение технологии хМАР, дающей возможность проводить количественное определение десятков целевых белков одновременно. В качестве целевых белков в настоящем исследовании были выбраны цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе ТКЛК, в том числе ГМ. В этом случае продукция цитокинов осуществляется как атипичными лимфоцитами, так и различными иммунными клетками окружения. Предложен ряд цитокинов и факторов ангиогенеза в качестве биомаркеров для ранней диагностики или прогноза течения лимфомы Ходжкина (R.O. Casasnovas и соавт., 2007) и некоторых неходжкинских лимфом(Х Cortes и соавт., 1997, L.M. Pedersen и соавт., 2005, Р. Salven и соавт., 2000, S.I. Labidi и соавт., 2009).

Нам не удалось обнаружить отечественных работ с применением протеомных технологий в изучении ГМ, а число работ иностранных исследователей очень ограничено.

Все изложенное определило цель и задачи работы.

Цель исследования: Установить молекулярные маркеры грибовидного микоза на основании результатов изучения протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови с целью разработки алгоритма диагностики заболевания.

Задачи исследования:

1 Провести анализ анамнестических данных больных грибовидным микозом для оценки своевременности диагностики данного заболевания

2 Исследовать протеомные профили сывороток крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров крови методом масс-спектрометрии MALDI-TOF

3 Изучить уровень цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с помощью технологии хМАР на различных стадиях заболевания

4 Провести сравнительное изучение протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров с целью выявления молекулярных маркеров грибовидного микоза

5 Разработать алгоритм диагностики грибовидного микоза на основании данных, полученных в результате исследования профилей белков и цитокинов сыворотки крови.

Научная новизна

- впервые в России изучен протеомный профиль сыворотки крови больных грибовидным микозом с применением метода МАГЛИ-ТОБ масс-спектрометрии. При сравнении протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, больных псориазом и здоровых людей -доноров крови выявлены пики белков, которые достоверно отличаются у обследованных лиц.

- впервые изучен широкий профиль из 27 цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с применением технологии хМАР. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов 1Р-10 и 1Ь-10, а также обратная корреляционная связь концентрации цитокина КАЫТЕЗ в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что подтверждает патогенетическую значимость данных цитокинов.

- впервые в сыворотке крови больных грибовидным микозом установлено достоверное увеличение концентрации цитокина 1Р-10 по сравнению с концентрацией этого цитокина у больных псориазом, а также увеличение концентрации цитокинов ГР-10, 1Ь-4, 1Ь-1га и в-СЯР по сравнению с их концентрацией в сыворотке крови здоровых доноров. На основании проведенных исследований установлено, что цитокин 1Р-10 может использоваться в качестве диагностического маркера грибовидного микоза.

- впервые разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, обладающий высокой точностью и основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокина 1Р-10. При дифференциальной диагностике грибовидного микоза и псориаза алгоритм основывается на последовательном определении концентрации в сыворотке крови концентрации цитокинов 1Р-10 и 1Ь-6 и имеет вид «древа принятия решений».

Практическая значимость:

В сыворотке крови обследованных больных выявлены молекулярные маркеры грибовидного микоза. С применением данных маркеров разработан алгоритм, позволяющий диагностировать грибовидный микоз и, в необходимых случаях, провести его дифференциальную диагностику с псориазом. Применение алгоритма диагностики грибовидного микоза позволит своевременно выявить больных «группы риска» по развитию данного заболевания для диспансерного наблюдения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания у пациентов до постановки диагноза «грибовидный микоз» составляет от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом у 23,1% больных грибовидный микоз диагностируется на третьей стадии заболевания.

2. Выявлены масс-спектрометрические пики белков, являющиеся молекулярными маркерами грибовидного микоза. Точность диагностики с применением данных маркеров составляет 69-75%, качество диагностики по данным 1ЮС-анализа расценивается как хорошее (АЦК>0,7).

3. Выявлены 4 цитокина (1Р-10, 1Ь-4, 1Ь-1га и О-СЗБ), уровень экспрессии которых достоверно отличается у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови (р<0.05). Уровень экспрессии цитокина 1Р-10 у больных грибовидным микозом достоверно выше, чем у больных псориазом (р<0,001), что позволяет использовать его в дифференциальной диагностике этих заболеваний.

4. Установлена прямая корреляция концентрационная связь цитокинов 1Р-10 и 1Ь-10 и обратная корреляционная связь цитокинов КАЫТЕБ в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании.

5. Показана высокая точность разработанного алгоритма диагностики грибовидного микоза, а также возможность выявления с его помощью больных, относящихся к группам риска по развитию грибовидного микоза.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в лекционный курс кафедры дерматовенерологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета и врачей ординаторов ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий».

Апробация и публикация материалов исследования:

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на научно-практической конференции ГУ НИКВИ МЗ РФ «Протеомные технологии в дерматовенерологии» (Москва, 2007 г.)

По материалам диссертации опубликовано 3 работы, из них 1 - в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав с описанием данных литературы и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 16 отечественных и 149 зарубежных источника. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 29 рисунками, 10 фотографиями.

выводы

1. При анализе данных анамнеза больных грибовидным микозом установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания до постановки диагноза «грибовидный микоз» составила от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом 23,1% пациентов уже имели III стадию заболевания.

2. Изучение протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом и псориазом методом MALDI-TOF показало наличие 2 пиков белков с m/z 4326 Да и 7674 Да (р<0,05), позволяющих их использовать для дифференциальной диагностике этих заболеваний с точностью 69% и 75% соответственно. Качество диагностики с применением этих пиков по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7).

Выявлены 3 масс-спектрометрических пика белков с m/z 14689 Да; 7848 Да и 4184 Да, концентрация которых в сыворотке крови достоверно отличается (р<0,05) у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови. Точность диагностики в этом случае составляет 73%, 75% и 73% соответственно, ее качество по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7).

3. При изучении уровня цитокинов в сыворотке крови с применением технологии хМАР было показано, что у больных грибовидным микозом определяется значительное увеличение концентрации 4 цитокинов: IL-Ira, G-CSF, IP-10 (р<0,001) и IL-4 (р<0,05) по сравнению с результатами здоровых лиц, и цитокина IP-10 (р<0,001) - по сравнению с больными псориазом.

4. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов IP-10 и IL-10 (rs=0,52 и 0,5 при р=0,05) и обратная корреляционная связь концентрации цитокина RANTES (rs=0,51 при р=0,05) в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что указывает на патогенетическую значимость этих цитокинов при данном заболевании.

5. Разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, основанный на определении концентрации цитокина 1Р-10. При уровне 1Р-10 в сыворотке крови выше 5,3 нг/мл, точность диагноза грибовидный микоз составляет 76,9%. Качество алгоритма по результатам ЯОС-анализа расценивается как очень хорошее (АиС>0,8). В случае необходимости дифференциальной диагностики грибовидного микоза и псориаза возможно применение алгоритма, основанного на последовательном определении в сыворотке крови концентрации цитокинов 1Р-10 и 1Ь-6 и имеющего вид «древа принятия решений». Точность данного алгоритма диагностики составляет 90%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы отмечается рост заболеваемости первичными лимфомами кожи, в том числе грибовидным микозом. Единого диагностического алгоритма грибовидного микоза в настоящее время не существует. Большинство отечественных и зарубежных авторов сходятся во мнении, что диагностика должна основываться на клинической картине заболевания, для подтверждения диагноза должны применяться гистологический и иммунофенотипический методы исследования. ПЦР-анализ клональной перестройки гена Т-клеточного рецептора на настоящий момент является вспомогательным методом.

Однако диагностика грибовидного микоза, особенно на ранних (1-Й) стадиях заболевания, является одной из наиболее сложных в практике дерматовенеролога. Все перечисленные исследования требуют проведения биопсии кожи. А с учетом того, что диагноз ГМ на ранних стадиях представляет затруднения, биопсии проводятся многократно на протяжении нескольких лет. То есть, для постановки точного диагноза пациент вынужден многократно подвергаться инвазивному вмешательству - биопсии кожи. По данным отечественных и зарубежных авторов, от начала заболевания пациента до постановки диагноза «грибовидный микоз» проходит от нескольких месяцев до 10 лет, к этому моменту более 20% пациентов уже имеют III стадию заболевания или внекожные очаги распространения патологического процесса.

Поэтому, по-прежнему, остается актуальной проблема поиска новых методов диагностики и биологических маркеров этого заболевания. В последние годы появились сообщения об успешном применении протеомного профилирования для поиска биомаркеров с целью совершенствования диагностики и расширения знаний в области патогенеза различных заболеваний, прогноза их течения и оценки эффективности терапии.

Преимуществом протеомиого профилирования по сравнению с исследованиями генома и транскриптома является то, что за конечную реализацию основных биохимических функций организма отвечают именно белки, поэтому изменения в белковом профиле могут быть непосредственно связаны с патофизиологическими процессами.

Протеомные технологии представлены достаточно широким спектром различных методов. Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия МА1ЛЭ1-ТОР, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков. Однако применение масс-спектрометрии ограничивается чувствительностью этого метода, т.е. ограниченной способностью детектировать белки/пептиды, представленные в сыворотке крови в низких концентрациях. Для изучения таких белков возможно применение технологии хМАР, дающей возможность проводить количественное определение десятков целевых белков одновременно.

По нашему мнению в качестве целевых белков наиболее перспективно использовать цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе Т-клеточных лимфом кожи. При этих заболеваниях продукция цитокинов осуществляется не только атипичными лимфоцитами, но и различными иммунными и неиммунными клетками окружения. Нам не удалось обнаружить отечественных работ с применением протеомных технологий в изучении ГМ, а число работ иностранных исследователей очень ограничено.

Целью нашей работы было выявление диагностически значимых молекулярных маркеров в сыворотке крови больных грибовидным с применением протеомных методов исследования. В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного исследования сывороток крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров крови.

Основу работы составило наблюдение за 39 больными с верифицированным гистологическим и иммунофенотипическим методами

103 диагнозом «грибовидный микоз»: 23 женщины и 16 мужчин (59% и 41% соответственно), в возрасте от 28 до 82 лет, средний возраст которых составил 57,4 ± 2,2 лет [среднее ± ст.ош.ср.]. Возраст дебюта ГМ варьировал от 26 до 71 года (46,1 ± 2,26 лет). Длительность течения заболевания составляла от 2 до 36 лет (10,3 ± 1,23 лет).

Клиническая картина отличалась разнообразием проявлений, особенно на ранних стадиях грибовидного микоза, и у большинства пациентов соответствовала стадии заболевания. При обследовании пациентов тщательно изучался анамнез заболевания, данные о полученном ранее лечении и эффективности проводимой терапии, сведения о перенесенных и сопутствующих заболеваниях.

Длительность заболевания (от момента появления первых симптомов) до постановки диагноза ГМ составила от 1 месяца до 23 лет (5,5 ± 0,84 года). На момент постановки диагноза 43,6% пациентов имели I стадию заболевания, 33,3% пациентов -II стадию и 23,1% - III стадию. При этом только у 18% пациентов диагноз ГМ был поставлен первоначально, у остальных больных неверно диагностировались другие заболевания кожи (15% пациентов имели более 2-х диагнозов). По поводу неверно диагностированных заболеваний кожи пациенты получали лечение такими системными препаратами как метотрексат, неотигазон, циклоспорин, препараты ГКС, плаквенил.

Согласно критериям включения пациентов в лабораторное исследование, из группы больных ГМ в исследования с применением протеомных методов было включено 23 пациента с грибовидным микозом. Контрольную группу составили 29 пациентов с диагнозом псориаз, а также 22 здоровых человека -доноров крови. У всех пациентов проводился забор венозной крови, из которой затем получали сыворотку.

Сыворотки крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров были проанализированы методом МАЫЛ-ТОР масс-спектрометрии на

104 приборе Autoflex, «Bruker Daltonics». Сравнение групп проводили по 182 пикам. На первом этапе статистической обработки данных проводилась проверка диагностической модели с использованием отдельных масс-спектрометрических пиков. Для определения точности диагностической модели, основанной на выбранных пиках, применяли метод ROC-анализа, рассчитывали точность, чувствительность и специфичность, PPV. На втором этапе проводили разработку диагностической модели с применением панели пиков.

При сравнении протеомных профилей сывороток крови больных ГМ и псориазом были выявлены достоверные различия по 2 белковым пикам с m/z 4326 и 7674 Да (р<0,05). Качество экспериментальной диагоностической модели, с применением этих пиков, по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7). Чувствительность диагностики составляет 65.2% (60,9%), специфичность — 60,9% (75,9%) соответственно.

При сравнении протеомных профилей сывороток крови больных ГМ и здоровых людей достоверные различия были обнаружены по 3 белковым пикам с m/z 14689Да, 7848 Да и 4184 Да (р<0,05). Качество экспериментальной диагоностической модели, с применением этих пиков, по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7). Чувствительность диагностики составляет 78.2% (69,5% и 56,5%), специфичность - 77,2% (81,8% и 86,3%) соответственно. В нашей работе не проводилось исследование природы диагностически-значимых пиков, однако применение непараметрических статистических критериев позволяет нам сделать заключение, что они имеют биологический смысл и не являются артефактами.

Точность экспериментальной диагностической модели, основанной на панели пиков, не превышала 77%. Таким образом, было показано, что наиболее перспективным является разработка метода диагностики грибовидного микоза с применением отдельных пиков белков.

С целью обнаружения молекулярных маркеров, представленных в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем это возможно определить методами масс-спектрометрии, нами был проведен анализ ряда целевых белков с применением технологии хМАР. В качестве целевых белков были выбраны цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе ТКЛК. На приборе BioPlex-200, «BioRad», в сыворотках крови больных ГМ, псориазом и здоровых людей было проанализировано содержание 27 цитокинов: PDGF-bb, IL-lb, IL-lra, IL-2, EL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, IP-10, MCP-1(MCAF), MIP-la, MIP-lb, RANTES, TNF-a, VEGF. Для разработки диагностической модели грибовидного микоза проводилось сравнение концентраций перечисленных выше цитокинов в трех группах пациентов. Для оценки диагностической значимости обнаруженных маркеров использовали ROC-анализ, рассчитывали точность, чувствительность и-специфичность, PPV.

При сравнении данных в группах больных грибовидным микозом и псориазом было установлено достоверное увеличение концентрации IP-10 (р=0,00029) у больных грибовидным микозом. При сравнении сывороток крови больных гриьбовидным микозом и по сравнению с здоровых людей выявлено увеличение концентрации 4 цитокинов: IL-lra, G-CSF, IP-10 (р<0,001) и IL-4 (р<0,05).

В работе проводилась оценка корреляция концентрации 27 цитокинов цитокинов в сыворотке крови со стадией грибовидного микоза. Нами выявлено, что концентрация цитокинов IL-10 и IP-10 в крови больных грибовидным микозом повышается по мере увеличения тяжести заболевания (коэффициент корреляции (rs) 0,52 и 0,51 соответственно, при р=0,05). Напротив, концентрация цитокина RANTES снижается при увеличении тяжести заболевания (rs=0,5, при р=0,05). Полученные данные позволяют сделать заключение о важной роли цитокинов, в особенности IP-10, в патогенезе

106

I * грибовидного микоза и подтверждают перспективность их использования в качестве маркеров ГМ.

Таким образом, наибольший интерес в качестве биологического маркера грибовидного микоза, на наш взгляд, представляет хемокин 1Р-10. С применением этого маркера нами было разработано несколько алгоритмов диагностики грибовидного микоза.

Первый диагностический алгоритм заключается в определении концентрации 1Р-10 в сыворотке крови. Грибовидный микоз возможно дифференцировать от псориаза при концентрации 1Р-10 выше 5264 пг/мл. Чувствительность диагностики в этом случае составляет 65%, специфичность -86,2%. Качество данной диагностической модели по результатам ЯОС-анализа расценивается как очень хорошее (АиС>0,8).

Распространенным подходом к увеличению точности диагностики является совместное использование нескольких маркеров, поэтому два следующих алгоритма основаны на определении в сыворотке крови двух и более цитокинов.

В основу второго алгоритма положенпринцип «древа принятия решений», который заключается в последовательном определении в сыворотке крови концентрации двух цитокинов: ГР-10 и 1Ь-6. Точность диагностики с применением этого алгоритма составляет 90%. Кроме того, он позволяет выявлять пациентов из «группы риска», которые далее могут быть направлены на дополнительное обследование или поставлены на диспансерный учет.

Третий диагностический алгоритм ГМ основана на определении в сыворотке крови концентрации 27 цитокинов и статистической обработке данных с применением линейного дискриминанта Фишера. Точность диагностики при этом составляет 80%.