Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Протективные свойства микобактериальных и синтетических препаратов при экспериментальной лепре

Кб од

3 с НОЙ ш

На правах рукописи

КАЛЯНИНА ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА

ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛЕПРЕ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1999

Работа выполнена в Научно-исследовательском инстит; по изучению лепры Министерства здравоохранения Российск Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А.А.Ющенко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.М.Мороз доктор биологических наук, профессор И.А.Баснакьян

Ведущая организация:

Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза

Защита состоится «_9 » декабря 1999 г. в 10 часов на засе нии диссертационного совета К.084.18.02 при Московском науч .исследовательском институте эпидемиологии и микробиоло] им. Г.Н.Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмир Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиот МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского

Автореферат разослан « 9 » /^лЗ/Ьь 1999 г. Ученый секретарь

диссертационного совета к.м.н. Новикова Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что лепра - одно из самых древних среди известных инфекционных заболеваний человека, эффективной вакцины против нее до сих пор не существует. Научные исследования, направленные на разрешение этой проблемы, в значительной мере ограничиваются отсутствием воспроизводимых методов культивирования M.leprae in vitro. Только доказательство C.C.Shepard (1960) возможности локального размножения M.leprae в подушечках лапок мышей, а также создание в 1971 г. W.F.Kirchheimer и E.E.Storrs модели генерализованной лепры на девятипоясных броненосцах позволили начать экспериментальные работы по получению противолепрозной вакцины. Модель Shepard стала общепринятой системой для оценки протективных свойств вакцины, а экспериментально зараженные броненосцы явились источником для получения достаточных количеств бактериальной массы M.leprae,

В 1976 г. ВОЗ была создана Специальная Программа по иммунологии лепры (IMMLEP), конечная цель которой заключалась в разработке противолепрозной вакцины. В рамках этой Программы разрабатывались четыре основных подхода к созданию вакцины:

1. Использование культивируемых непатогенных микобактерий, в частности M.vaccae, M.W, M.ICRC (Stanford J.L. с соавт., 1984; Deo M.G. с соавт.,1983; Talwar G.P.,1983; Chirmule N.B. с соавт., 1988; Ganapati R.,1989; Chiplunkar Sh.,1993; Yadava A.,1993; Chaturvedi V. с соавт.,1995; Vallishayee R.S. с соавт., 1996; Gupta M.D. с соавт., 1992,1996).

2. Создание авирулентных форм M.leprae путем инактивации генов, кодирующих факторы вирулентности. Поскольку возбудитель лепры до сих пор не получен в культуре, и факторы вирулентности его не определены, этот подход в настоящее время является только теоретической предпосылкой (Mahan M.J. с соавт.„1993)

3. Разработка субъединичной вакцины на основе одного или нескольких белковых антигенов, специфичных для M.leprae. Исследования антигенов M.leprae и их эпитопов пока не привели к выявлению бесспорно протективных антигенов (Lamb F.I. с соавт., 1988; Nomaguchi H. с соавт.,1991; Vega-Lopez F. с соавт.,1993; Menz В. с соавт., 1993; Convit J. с соавт.,1993; Thole J.E.R. с соавт., 1995; Winter N. с соавт.,1995).

4. Повышение протективного противолепрозного эффекта вакцины БЦЖ различными методами, в частности с использованием методов генной инженерии, а также путем модификации дозы, режима вакцинации,

места введения вакцины (Bloom B.R. с соавт., 1989; Stover C.K. с соавт., 1991,1993; Aldovini А. с соавт., 1991,1993).

К настоящему времени в рамках Программы IMMLEP были испытаны в полевых условиях вакцина БЦЖ, а также вакцина Convit, представляющая собой комбинацию вакцины БЦЖ и убитых нагреванием МЛергае, выделенных из тканей экспериментально зараженных броненосцев (МЛергае А). Результаты испытаний вакцинации БЦЖ показали невысокую и вариабельную степень ее защиты (20-80 %), преимущественно направленной против олигобактериальных форм лепры (Noordeen S.K., 1986, Bagshawe А. с соавт., 1989). Комбинированная вакцина БЦЖ + МЛергае А не обеспечила более высокой степени защиты, чем дает одна лишь БЦЖ (Karonga Prevention Trial Group, 1996). Еще в 8-ом Отчете Специальной программы исследований и подготовки кадров по тропическим заболеваниям ВОЗ (1987) отмечалось несовершенство комбинированной вакцины Convit, ее дороговизна, отсутствие надежных методов стандартизации отдельных партий, невозможность полной очистки микобактерий от тканей броненосцев.

Следует отметить, что по данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется от 500 до 800 тысяч новых случаев заболевания лепрой, при этом количество вновь выявленных больных не имеет тенденции к снижению. Высокая заболеваемость в эндемичных по лепре странах и отсутствие на сегодняшний день высокоэффективной вакцины против лепры свидетельствуют об актуальности поиска новых кандидатов в противолепрозные вакцины.

Цель работы Выявление препаратов, обладающих выраженной про-тективной активностью при экспериментальной лепрозной инфекции.

Задачи работы.

1. Изучить на модели экспериментальной лепры протективные свойства препаратов, приготовленных из 25 культивируемых штаммов микобактерий, выделенных от больных лепрой, экспериментально зараженных МЛергае животных, а также из почвы, поддерживаемых в музее культур НИИ по изучению лепры МЗ РФ.

2. Выяснить степень протективности синтетических и полусинтетических препаратов, полученных на основе специфического для МЛергае

синтетического антигена 3,6-ди-0-метил-Р-0-глгокопиранозы при экспериментальной лепрозной инфекции.

3. Получить дополнительные данные о биологических свойствах ми-кобактерий, наиболее перспективных для разработки противолепрозных вакцин.

4. Изучить зависимость протективных свойств от доз, режимов и способов введения микобактериальных и синтетических препаратов.

Научная новизна исследования заключается в том, что протективные свойства препаратов из культивируемых штаммов микобактерий, выделенных в НИИ по изучению лепры, почвенных МЛиАд, а также искусственных препаратов, полученных на основе отечественного синтетического углевода 3,6-ди-0-метил-(3-В-глюкопиранозы, изучены впервые.

Впервые установлено, что культивируемые штаммы микобактерий М.01 и М.011, выделенные из патологического материала от больных лепрой, а также МЛийл, изолированная из почвы, обладают наиболее выраженной способностью задерживать размножение МЛергае в подушечках лапок мышей, зараженных по методу БЬерагс!.

При экспериментальной лепрозной инфекции в качестве модельных "вакцин" применялись искусственные препараты на основе специфического для МЛергае синтетического антигена в полностью синтетическом и полусинтетическом вариантах. Показано, что полностью синтетическая вакцина не способна задерживать локальное развитие лепрозной инфекции, а полусинтетические препараты обладают протективными свойствами, но менее выраженными, чем препараты из микобактерий.

Определены оптимальные дозы, режимы, способы введения микобактериальных и искусственных препаратов, позволяющие получать максимальные протективные эффекты при вакцинации мышей.

Получены данные по культурально-биохимическим и иммунохими-ческим характеристикам микобактерий, являющихся наиболее перспективными для разработки противолепрозных вакцин.

Теоретическая и практическая значимость работы. Обнаружение защитных свойств против экспериментальной лепры у культивируемых штаммов микобактерий МЛиШ, М.01 и М.011 позволяет рекомендовать последние в качестве наиболее перспективных для разработки высокоэффективной противолепрозной вакцины. Данные по определению оптимальных доз, режимов и способов введения препаратов из М.1и{и, М.01, М.011 жи-

вотным, а также культурально-биохимических и иммунохимических характеристик штаммов окажут помощь при дальнейших исследованиях по разработке противолепрозной вакцины. Получен патент на изобретение «Способ иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции» №2135196.

Данные, установленные в ходе определения оптимальных доз антигена и режимов вакцинации животных синтетическими препаратами, при которых достигается наиболее выраженный протективный эффект, можно использовать для совершенствования полусинтетических препаратов с целью повышения их протективных свойств.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Задержка развития локальной лепрозной инфекции в подушечках лапок мышей, зараженных по БЬерагё, возникающая в ответ на однократную вакцинацию животных препаратами из живых М.1иАд, а также убитых М.01 и М.011, свидетельствует о наличии у данных штаммов ми-кобактерий протективных свойств, более выраженных, чем у живой вакцины БЦЖ.

2. Иммунизация полностью синтетическим препаратом ДМГ-ПАА-МДП не влияет на размножение МЛергае в лапках зараженных мышей. Полусинтетические препараты ДМГ-ПАА-БЦЖ и ДМГ-ДАД-БЦЖ обнаруживают протективные свойства только при многократном их введении мышам и значительно уступают по показателям протективности мико-бактериальным препаратам.

3. Близость культивируемых штаммов М.1иШ, М.01 и М.011 по выраженности протективного действия, культурально-биохимическим свойствам, антигенному составу, белковым спектрам, а также антигенное родство с МЛергае, позволяют рекомендовать данные штаммы для разработки противолепрозных вакцин.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Всероссийском съезде дерматологов и венерологов (Челябинск, 1989), 1-м Международном симпозиуме «Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях» (Москва, 1992), 15-ой конференции молодых ученых, посвященной 30-летию ЦНИИ эпидемиологии и микробиологии (Астрахань, 1992), юбилейной научной конференции Астраханского государственного медицинского института к 75-летию со дня основания (Астрахань, 1993), симпозиуме «Иммунодиагно-

стика и патогенез болезней, вызываемых микобактериями» (Астрахань 1994), научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию Академии медицинских наук (Москва, 1994), конференции «Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней» (Тамбов, 1994), областных научно-медицинских обществах микробиологов, эпидемиологов, паразитологов (Астрахань, 1989, 1996, 1998), дерматовенерологов (Астрахань, 1998), конференции, посвященной 50-летию НИИ по изучению лепры (Астрахань, 1998), 15-м Международном конгрессе по лепре (Китай, 1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, утверждено 1 рацпредложение, получено 1 решение Роспатента на выдачу патента на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных данных, обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 208 литературных источников (44 отечественных и 164 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 110 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 6 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы. Протективные свойства микобактериальных и синтетических препаратов изучали на экспериментальной модели лепроз-ной инфекции, предложенной БЬерагс! (1960). С этой целью в опытах использовали 2410 мышей линии СВА. Иммунохимическое тестирование штаммов микобактерий с наиболее выраженными протективными свойствами проводили с использованием 6 кроликов и 13 морских свинок.

Для получения микобактериальных препаратов было взято 25 штаммов микобактерий из музейной коллекции НИИ по изучению лепры, сведения о которых представлены в таблице 1. В качестве препаратов сравнения использовали стандартную лиофилизированную живую вакцину БЦЖ, а также музейную культуру М.уассае.

Микобактериальные препараты представляли собой взвесь живых или убитых автоклавированием микобактерий в физиологическом растворе с концентрацией 1х 108 микробных тел/мл. Жизнеспособность вакцинных препаратов проверяли на среде Левенштейна-Йенсена.

Группа искусственных вакцинных препаратов состояла из полностью синтетического препарата и двух вариантов полусинтетических. Син-

тетическая модельная вакцина, синтезированная в Институте биоорганической химии РАН, представляет собой растворимый синтетический конъю-гат, основу которого составляет карбоцепной полимер полиакриламид (ПАА), к которому ковалентно присоединены гаптен 3,6-ди-О-метил-р-Д-глюкопираноза (диметилглюкоза, ДМГ) и мурамилдипептид (МДП).

Таблица 1

Характеристика музейных штаммов микобактерий*

№ № Обозначение штамма Дата выделения Источник выделения

1 №1 09.01.79 Лепрома крысы, зараженной МЛергае шт. А-12.

2 №2 08.10.79 Сердце броненосца №15, зараженного МЛергае от больного Т.

3 №3 26.02.80 Лепрома больного Д.

4 №6 28.04.81 Лепрома больного П.

5 №7 18.06.81 Печень "здорового" броненосца №34.

6 №8 18.06.81 Легкое "здорового" броненосца №34

7 №9 15.07.81 Кожа больной Е.

8 №10 16.09.81 Лепрома мыши,зараженной |М.1ергае шт.А-19.

9 №11 30.10.81 Печень мыши, зараженной МЛергаетигшт шт.'ТГ.

10 №12 25.10.82 Лепрома больного О.

11 №13 27.01.82 Лепрома крысы, зараженной МЛергаетигшт шт."П".

12 №15 01.02.82 Печень мыши, зараженной МЛергаетигшт.

13 №16 30.03.82 Лепрома броненосца N11

14 №17 01.04.82 Сердце мыши, зараженной МЛергае шт.А-19.

15 №18 28.05.82 Лапка мыши, зараженной МЛергае от больной К.

16 №19 01.04.82. Печень мыши, заражешюй М.Ке(1го\У8ку.

17 №20 04.07.80 Лепрома мыши, зараженной МЛергае шт. К-2.

18 №21 04.02.80 Лепрома крысы, зараженной МЛергае шт. К-2.

19 №22 26.11.80 Лепрома крысы, зараженной |М.1ергае шт. 19.

20 №23 19.01.82 Лепрома броненосца N12, зараженного МЛерг'ае.

21 №24 07.01.83 Печень крысы, зараженной МЛергае шт. К-2.

22 №25 25.05.82 Лепрома больной У.

23 М.01- 20.10.85 Лепрома больной С.

24 М.011 01.11.89 Лапка мыши, зараженной МЛергае от больной К.

25 M.lufu 1980 Почва в Заире. Выделены Р.РойаеЬ. НИИ по изучению лепры предоставлены 1.К.5еус1е1 (1981)

* Периодически в лаборатории микробиологии НИИЛ, как и в других научных центрах мира, удается получать рост микобактерий in vitro при посеве на питательные среды патологического материала от больных лепрой или экспериментально зараженных M.leprae лабораторных животных. Однако, идентифицировать полученные микроорганизмы как M.leprae или воспроизвести такие эксперименты не удается.

Другие два варианта искусственных модельных вакцин получали совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИБХ (Бовин Н.В., Пименова Г.П.). В отличие от полностью синтетической вакцины вместо мурамилдипептида в качестве адъюванта и носителя антигенов использовали микобактерии БЦЖ. Первый вариант полусинтетической вакцины представляет собой микобактерии БЦЖ, конъюгированные с искусственным антигеном ДМГ-ПАА, второй вариант — аналогичный первому препарат, в котором в качестве полимерного носителя для ДМГ использовали диальдегидцекстран (ДАД).

Для вакцинации животных микобактериальные препараты вводили внутрибрюшинно, подкожно или внутрикожно по 1x107 бактериальных тел каждой мыши. При вакцинации искусственными препаратами доза АГ ва-риировала (1-50 мкг), а содержание БЦЖ было постоянным — 50 мкг.

Иммунизацию мышей осуществляли однократно за 1, 2, 4 недели до заражения или многократно (2-4 раза), соблюдая однонедельный интервал между вакцинациями и после заключительной вакцинации перед заражением.

Заражение мышей осуществляли по методу Shepard (I960). В мякоть правой задней лапы вводили 1x104 M.leprae. В качестве материала для заражения использовали пассируемые на мышах штаммы M.leprae, выделенные от нелеченых больных лепроматозным типом лепры.

Приготовление суспензии из мягких тканей лапок мышей, мазка для подсчета микобактерий, а также подсчет количества M.leprae в суспензии осуществляли по методу Shepard, McRae (1968).

Протективные свойства вакцинных препаратов оценивали по формуле, предложенной для этой цели Shepard и соавторами (1980), согласно которой «Показатель протективности» = ^(среднего «урожая» в контроле) -^(среднего «урожая» в опытной группе). За «урожай» принято среднее количество микобактерий в подушечках лап мышей, зараженных M.leprae.

Для изучения биологических свойств микобактерий с наиболее выраженными протективными свойствами (М.01, М.011, M.Iufij) применяли общеизвестные бактериологические и биохимические тесты с модификациями, предложенными в ЦНИИ туберкулеза г.Москва (Ильина Т.Б., 1981; Mycobacterial culture collection, 1980; Гришина Т.Д., 1994). Морфологию М.01, М.011, M.lufu изучали в мазках, окрашенных по Циль-Нильсену. Граму, Бою. Исследование культуральных свойств микобактерий проводили на плотной среде Левенштейна-Иенсена и жидкой полусшпе!ической

среде Школьниковой, используя разные режимы освещенности и температуры. В комплект сред для биохимической идентификации культур включали: среды, содержащие цитрат аммонийного железа, 5% хлористый натрий, салициловокислый натрий, параминосалициловую кислоту (ПАСК), паранитробензойную кислоту (ПНБК), тиофен-2-карбоксилгидразид (ТКГ), гидроксиламин (ГА); комбинированную среду с ТКГ и нитратом натрия; среды для определения каталазной и нитратредуктазной активностей микобактерий; среды с ТВИН-80; среды с набором амидов (мочевины, никотинамида, пиразинамида, ацетамида, сукцинамида, аллантоина) для определения амидазной активности; среды, содержащие основные противотуберкулезные и противолепрозный (диаминодифенилсульфон) препараты для определения лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций.

Иммунохимическая идентификация M.Ol, М.011, M.lufii проводилась в рамках совместного исследования (Калянина О.В. с соавт., 1998) с руководителем группы иммунохимии НИИ по изучению лепры Дячиной М.Н. при содействии сотрудников лаборатории биотехнологии ЦНИИТ г.Москва (Черноусова Л.Н., Калинина O.A.). В работе использовали методы двойной диффузии в геле (Ouchterloni, 1948) с применением антигенов 14 видов микобактерий из лабораторной коллекции штаммов, твердофазного иммуноферментного анализа (Voller и соавт., 1977), применяя в перекрестных реакциях гомологичные и гетерологичные кроличьи антисыворотки, внутрикожного тестирования антигенов из M.Ol, М.011 и M.Iufu на сенсибилизированных морских свинках с параллельной оценкой в опыте антигенов из M.leprae, пассированных на лабораторных животных.

Белковый спектр антигенов - соникатов исследуемых микобактерий изучали по электрофореграммам, полученным с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Laemmli (1970). В работе использовали набор белков-"маркеров" с молекулярной массой в диапазоне 14,4-97,4 kDa (Pharmacia, Швеция).

Для оценки достоверности полученных результатов проводили статистическую обработку данных с помощью программы «Statgraph», используя критерии Стьюдента и Вилкоксона.

Результаты исследования и их обсуждение.

Изучение протективных свойств микобактериальных препаратов.

Как указано выше, одним из подходов к разработке противолепроз-ной вакцины является использование других микобактерий. В этой связи первый этап исследования, включающий серию экспериментов, был посвящен изучению протективных-свойств препаратов из культивируемых штаммов микобактерий, выделенных из патологического материала от больных лепрой и экспериментально зараженных животных, а также из почвы.

Результаты предварительного тестирования 24 препаратов из убитых микобактерий, выделенных из «лепрозных» источников, показали, что большинство из них не обладает способностью задерживать интраплан-тарное размножение M.leprae.

Некоторый протективный эффект отмечен у штаммов № 2, № б, № 12, № 17. Однако перечисленные штаммы микобактерий уступали по про-тективности вакцине БЦЖ.

Наиболее выраженные протективные свойства были выявлены у штаммов М.01 и М.011. Их показатели протективности независимо от кратности введения препаратов практически не отличались друг от друга, а при однократном введении были несколько выше на позднем (10 мес.) сроке развития инфекции, чем в тот же срок при троекратном. При сравнении с БЦЖ их протективность оказалась выше, более чем в 2 раза.

Таким образом, из 24 препаратов убитых микобактерий, выделенных из лепрозных источников, только два (М.01 и М.011) обладали выраженной способностью задерживать развитие локальной лепрозной инфекции. Выявленное различие в протективных свойствах культивируемых микобактерий, вероятно, можно объяснить биологическими особенностями штаммов, каждый из которых был выделен из различных источников, хотя и лепрозных (ткани внутренних органов, лепромы экспериментально зараженных животных, человека). Кроме того, культуры микобактерий были получены на разных питательных средах при использовании различных стимулирующих агентов. Но только М.01 и М.011 культивировались на среде Школьниковой, модифицированной подложкой из перфторорганиче-скнх соединений. Особенности культивирования, возможно, отразились на ряде биологических свойств этих микроорганизмов, в том числе и протективных.

Оценивая влияние жизнеспособности М.01 и М.01 I на их протективные свойства, мы показали, что препараты in живых М.01 и \1.0t ! такж.-обладают протективностыо, сравнимой с накипном БЦЖ. а мекоюрь: .

случаях (в зависимости от условий введения и сроков оценки результатов) преобладают над последней. Вакцинация изучаемыми препаратами, как и 1ЩЖ, за 7 дней до заражения является менее эффективным способом, чем за 28 дней.

В данную серию экспериментов с живыми микобактериями в качестве препарата сравнения были включены живые M.vaccae. На основании антигенного родства с M.leprae, выявленного в реакциях клеточного иммунитета (Paul R.C. с соавт., 1975; Stanford J.L. с соавт., 1975; Watson S.R. с соавт., 1979), M.vaccae были включены в список кандидатов в противоле-прозные вакцины для оценки в полевых испытаниях в Индии (Stanford J.L. с соавт., 1984).

Из результатов нашего исследования следует то, что препарат из живых M.vaccae уступает по степени защиты не только БЦЖ, но и живым М.01 и М.011.

Протективные свойства M.vaccae в числе других культивируемых микобактерий изучал C.C.Shepard. Он наблюдал задержку размножения M.leprae у мышей, вакцинированных M.vaccae, через 9 месяцев после заражения. Однако в разных экспериментах при использовании различных штаммов этих микобактерий протективный эффект был нестабильным, и автор отдавал предпочтение M.BCG, подчеркивая уникальность последних в обеспечении защиты против M.leprae среди других микобактерий (Shepard С.С. с соавт., 1980).

Кроме штаммов микобактерий, выделенных из лепрозных источников, были изучены протективные свойства почвенных M.lufu. Выбор этих микобактерий основан на известном сходстве данных микроорганизмов по сульфоночувствительности с M.leprae (Portaels F., 1980; Seydel J.K. с соавт., 1982; Урляпова Н.Г.,1985). К тому же протективные свойства M.lufu ранее не изучались.

В экспериментах наряду с M.lufu были использованы вакцина БЦЖ, M.leprae, а также M.vaccae (последние, как и M.lufu, выделены из почвы). Результаты исследования продемонстрировали более высокие показатели протективности у M.lufu, чем у БЦЖ, M.vaccae и M.leprae. Препараты из живых M.lufu вызывали существенную задержку развития инфекции при однократном введении как за 1 неделю, так и за 1 месяц до заражения мышей M.leprae. Убитые M.lufu тормозили размножение M.leprae, если их вводили за 1 месяц перед заражением. Следует заметить, что при менее благоприятном режиме вакцинации для M.leprae, M.vaccae и БЦЖ (за 1 не-

делю до заражения), когда протективность отсутствовала или была минимальной, защитный эффект живых М.1иШ оставался высоким.

Таким образом, предварительный поиск позволил выделить три штамма микобактерий с наиболее выраженными протективными свойствами при экспериментальной лепре: М.01, М.011 и МЛиАл. Следующая задача заключалась в сравнительной оценке протективных свойств указанных штаммов, а также М.ВСО и МЛергае в зависимости от их жизнеспособности и режимов вакцинации. В данном эксперименте мы применили вместо внутрибрюшинного способа вакцинации животных внутрикожный. Этот способ БЬерагё считал более эффективным для иммунизации МЛергае или БЦЖ (БЬерагё С.С., 1980).

Результаты сравнительного анализа протективных свойств микобактерий, выделенных из различных источников, подтвердили предполагаемую высокую эффективность в защите против МЛергае трех культивируемых штаммов: М.01, М.011 и МЛийд. Максимальную протективность показали живые МЛиШ, а М.01 и М.011 оказались наиболее эффективными после прогревания. Все три микобактериальных препарата превысили протективность живой вакцины БЦЖ и практически сравнялись с убитыми МЛергае. Высокие показатели протективности для убитых МЛергае являются, на наш взгляд, закономерными, поскольку вакцинацию и заражение животных в данном эксперименте осуществляли гомологичным материалом.

Кратность вакцинации существенно не влияла на защитные свойства изучаемых препаратов, однако, мы полагаем, что однократное внутрикож-ное введение микобактериальных суспензий предпочтительнее многократного.

При сравнении показателей протективности по срокам развития экспериментальной лепрозной инфекции отмечена тенденция к повышению протективной активности у всех микобактерий к позднему (10 месяцев) сроку, что является немаловажным моментом для кандидатов в вакцинные препараты против хронической инфекции.

Для сравнения протективных свойств изучаемых микобактерий и микобактерий, ранее предлагавшихся в качестве противолепрозных вакцин для полевых испытаний, в таблице 2 приводим результаты исследований протективности, полученных на экспериментальной модели БЬерагс! разными авторами (по литературным данным).

Таким образом, на основании анализа литературы и полученных собственных результатов, мы считаем, что препараты из живых М.1иЛ1, а также убитых М.01 и М.011 обладают более выраженными протективными свойствами, чем ранее предлагавшиеся.

Таблица 2

Показатели протективности штаммов микобактерий, предлагаемых в качестве кандидатов в вакцины против лепры.

№№ Штаммы Показатели протективности Авторы

п/п микобактерий ранний срок поздний срок

1 М.1С11С(убит.) -0,34 0,90 Bhide M.G.et al. (1978)

2 М.ЛУ (жив.) 0,16 0,32 Shepard C.C. (1980)

М.\У (убит.) 0,15 0,29

3 М.ВСС (жив.) 0,82-2,05 0,4-2,27 —\\—

4 М/уассае (жив.) 0,41 0,95 —\\—

5 М.01 (убит.) 2,00 2,77 Наши данные

6 М.011 (убит.) 2,27 2,83 \\—

7 М.1иШ (жив.) 2,72 2,94 —\\—

8 М.ВСО (жив.) 1,27 2,19

9 М.уассае(жив.) 1,03 1,23 —w—

Изучение протективных свойств искусственных препаратов на основе 3,6-ди-0-метил^-0-глюкопиранозы.

Учитывая многообразие подходов к созданию нротиволепрозных вакцин, среди которых отмечаются использование синтетических антигенов, а также повышение протективного эффекта БЦЖ, совместно с ИБХ РАН были получены модельные вакцинные препараты на основе синтетического олигосахарида ДМГ.

Известно, что уникальным и специфичным для M.leprae является фенольный гликолнпид (ФГЛ-1). Молекула ФГЛ-1, располагающаяся над поверхностью клеточной оболочки микобактерии, содержит трисахарид, концевой сахар которого 3,6-ди-0-метил-Р-0-глюкопираноза (ДМГ) является доминирующей антигенной частью, определяющей ее специфичность (Hunter S.W. с соавт., 1981). Гаптен ДМГ, синтезированный по оригинальной методике отечественными авторами, был иммобилизован на нескольких полимерных носителях (ПАА, ДАД). В результате этого были получены антигенные препараты, иммитирующие ФГЛ-1. Предпосылкой получения и последующего изучения протективных свойств искусственных пре-

паратов служили доказательства иммуногенных свойств антигенов ДМГ-ПАА и ДМГ-ДАД и создание на их основе иммуноферментной тест-системы для выявления антител к М.1ергае (Байрамова Н.Э. с соавт, 1987; Ющенко А.А. с соавт, 1988; Сухенко Л.Т., 1994).

Для изучения протективных свойств в качестве вакцинных препаратов мышам в различные сроки перед заражением вводили следующие препараты: 1) синтетический антиген, состоящий из гаптена ДМГ и полимерного носителя ПАА (ДМГ-ПАА); 2) синтетический антиген, состоящий из ДМГ и полимерного носителя ДАД (ДМГ-ДАД); 3) полусинтетический препарат, представляющий конъюгат ДМГ-ПАА-БЦЖ; 4) полусинтетический препарат ДМГ-ДАД-БЦЖ; 5) полностью синтетический препарат ДМГ-ПАА-МДП.

Вакцинирующие дозы препаратов содержали 1-50 мкг антигена, доза БЦЖ — 50 мкг была постоянной. Препараты вводили одно-, дву- и трехкратно.

Результаты исследования показали, что сами антигены ДМГ-ПАА и ДМГ-ДАД независимо от дозы и кратности введения протективными свойствами против МЛергае не обладают. Это согласуется с общепринятым фактом, что "антиген - это еще не вакцина". Протективные свойства отсутствовали и у синтетического препарата ДМГ-ПАА-МДП.

В то же время, способность задерживать интраплантарное размножение МЛергае выявлена у полусинтетических препаратов ДМГ-ПАА-БЦЖ, ДМГ-ДАД-БЦЖ только при многократном их введении и содержании АГ в препарате в дозе 10-50 мкг. Показатели протективности препарата ДМГ-ПАА-БЦЖ (1,1-1,42) при данных условиях были несколько выше, а ДМГ-ДАД-БЦЖ (1,04-1,1) практически равной показателю протективности одной БЦЖ (0,86-0,95). Следовательно, можно считать, что протектив-ность антигена ДМГ-ПАА и самой вакцины БЦЖ можно повысить взаимным влиянием друг на друга при их конъюгации. Присутствие в подобном конъюгате ДАД существенной роли для повышения протективности БЦЖ не играет.

В литературе имеются данные об использовании иммунодоминант-ных синтетических или природных олигосахаридов, а также производных акриловой кислоты для конструирования искусственных вакцин, в частности против сальмонелезов и чумы (Покровский В.В. с соавт., 1986; Дмитриев Б.А. с соавт., 1994; Алексеева Н.Ю., 1997). Было показано, что полностью синтетические антигены, полученные на основе сополимеризации

олигосахаридных производных с акриламидом и имитирующие полисаха-ридную цепь соматических липополисахаридов сальмонелл и капсульных полисахаридов пневмококков, являются слабыми иммуногенами и способны вызывать протективный эффект у лабораторных животных только после многократной иммунизации в присутствии ПАФ.

Н.Ю.Алексеева (1997), изучая протективные свойства конъюгатов 0-полисахарида с синтетическими полиэлектролитами против вирулентных культур S.typhimurium и S.cholerae suis, отметила меньшую эффективность конъюгатов, содержащих полиакриловую кислоту и сополимеры акриловой кислоты по сравнению с другими полиэлектролитами.

Для сравнения протективных свойств искусственных и микобактери-альных препаратов на рис.1 представлена результирующая диаграмма, отражающая максимальные показатели протективности, достигнутые при вакцинации мышей исследуемыми препаратами различной природы. Для сравнения приведены максимальные показатели протективности, полученные при вакцинации микобактериями, используемыми в качестве вакцин для полевых испытаний в настоящее время (живые M.BCG, убитые М.leprae, живые M.vaccae).

Рисунок 1. Максимальные показатели протективности микобактериальных и искусственных препаратов Условные обозначения: 1 — М.01 (убитые); 2 — М.011 (убитые); 3 — M.lufu (живые); 4 — ДМГ-ПАА-БЦЖ; 5 — ДМГ-ДАД-БЦЖ; 6 — ДМГ-ПАА-МДП; 7 — БЦЖ (живая); 8 — M.leprae (убитые); 9 — M.vaccae (живые)

Как показано на диаграмме, наиболее выражены протективные свойства у препаратов из живых M.lufu, а также убитых М.01 и М.011. Последние проявляют почти одинаковую эффективность с убитыми M.leprae, а

живые M.Iufu даже превышают ее. Все 3 исследуемых препарата из мико-бактерий обладают большей протективностью, чем M.BCG и M.vaccae. Они также эффективнее искусственных препаратов.

Протективные свойства полусинтетических препаратов ДМГ-ПАА-БЦЖ, ДМГ-ДАД-БЦЖ оказались недостаточно высокими и по отношению к БЦЖ, M.leprae и M.vaccae, так как при вакцинации БЦЖ и убитыми M.leprae можно достичь более высоких показателей протективности, а вакцинация живыми M.vaccae создает практически одинаковый с ними защитный эффект.

Возможно использование других носителей, а также более глубокое изучение их влияния на механизм протективного иммунитета при лепре, приведет к повышению протективности и созданию более совершенных препаратов на основе ДМГ. На данном же этапе препараты из живых M.lufu, а также убитых М.01 и M.Ol 1 являются наиболее перспективными претендентами для дальнейших исследований в плане разработки проти-волепрозных вакцин.

С целью получения дополнительных данных о биологических свойствах M.Ol, М.011 и M.lufu была проведена их культурально-биохимическая и иммунохимическая идентификация. Результаты исследований показали, что указанные штаммы обладают сходными культураль-но-биохимическими свойствами и могут принадлежать к III группе нефо-тохромогенных микобактерий (по классификации Раньон).

В литературе встречаются многочисленные сведения о культурах, выделенных из лепрозных источников, которые по культурально-биохимическим свойствам отнесены к условно-патогенным микобактери-ям, принадлежащим к различным группам по классификации Раньон (Веашеп B.L. с соавт., 1974; Skinsnes O.K., 1975; Kato L. с соавт., 1977; Portaeis F. с соавт., 1982, 1986; Chatteijee B.R. с соавт., 1989; Bapat C.V., 1989).

Datta A.K. с соавт. (1985) методом тонкослойной хроматографии определил идентичность набора миколовых кислот у M.lufu, штаммов микобактерий, выделенных от больных лепрой (M.ICRC, штаммы Skinsnes МО-75 и Ш-75) и туберкулезом (M.W). При этом были показаны принадлежность данных штаммов к комплексу M.avium-intracellulare-scrofulaceum (MAIS) и отличие от M.leprae, M.tuberculosis, M.vaccae. Аналогичные результаты, свидетельствующие о принадлежности изолятов из лепрозных поражений к комплексу MAIS были получены Young D.B. (1980).

Фактически все культуры, выделенные различными авторами от больных лепрой и экспериментально зараженных животных, не нашли применение в практической лепрологии. Как показало настоящее исследование, из 24-х культур микобактерий, полученных в НИИЛ при посеве патологического материала на питательные среды, также далеко не у всех были выявлены протективные свойства. Только микобактерии М.01 и М.011 обладают выраженной способностью задерживать развитие локальной лепрозной инфекции в подушечке лапки мыши, что делает их полезными для разработки противолепрозных вакцин.

Отмеченный нами факт сочетания выраженных протективных свойств с общностью биохимических характеристик микобактерий, выделенных из лепрозных поражений и почвы, нашел отражение в литературных источниках, а именно, в вышеупомянутой работе Ба^ А.К. с соавт. отмечалась идентичность набора миколовых кислот МЛиАл и, в частности, МЛСЯС, последние являются одним из кандидатов в противолепрозные вакцины.

М.1иЙ1 является малоизученной, неклассифицированной микобакте-рией. В литературе встречаются немногочисленные сведения, характеризующие этот микроорганизм. Например, Л У.Е. с соавторами (1994) моле-кулярно-генетическими методами показал, что "МЛи1;и" является близкородственной с Млп1гасе11и1аге. Следовательно, близкородственная связь М.1иШ с МлШгасе11и1аге может служить косвенным подтверждением нашего предположения о принадлежности МЛиАд, а значит и М.01 и М.011 к III группе нефотохромогенных микобактерий, поскольку и Млгйгасе11и1аге относятся к той же группе по классификации Раньон. В то же время, изучаемые микобактерии обладают специфическими особенностями, не позволяющими отнести их к какому-либо определенному виду из данной группы.

Нами показана близость М.01, М.011 и М.1и{ц по протективным и культурально-биохимическим свойствам. Чтобы ответить на вопросы: являются ли эти штаммы родственными по антигенному составу и можно ли объяснить наличие выраженных протективных свойств в эксперименте против М.1ергае антигенным родством с последними, были проведены им-мунохимическое тестирование перечисленных микобактерий.

Результаты изучения антигенного спектра М.01, М.011 и МЛийл в реакции преципитации показали их антигенную близость с М.АогйнШт, хотя каждый из штаммов имел перекрестно реагирующие антигены с другими

видами микобактерий. Антигенное родство штаммов было показано в ИФА и в реакциях ГЗТ на морских свинках, сенсибилизированных данными микобактериями, а также пассированным штаммом МЛергае. Внутри-кожные реакции на морских свинках, сенсибилизированных гомологичным материалом, практически не отличались от соответствующих реакций на морских свинках, сенсибилизированных гетерологичными штаммами. Это свидетельствует о близости М.01, М.011, МЛийл, а также МЛергае по набору антигенов, выявляющих ГЗТ.

Электрофоретический анализ показал, что исследуемые микобакте-рии близки по белковому спектру, который состоит из 10-12 фракций. Наиболее выраженные белковые фракции расположены в зонах средне- и высокомолекулярных белков. Несмотря на близкое сходство белковых спектров, протеинограммы М.01, М.011 и МЛиШ не являются идентичными.

В совместных исследованиях (Саламатина О.С. с соавт., 1998) методом иммуноблоттинга был проведен анализ антигенов МЛергае, пассируемых на мышах и крысах, М.01, М.011 и М.1и& с помощью 6 клонов мАТ, специфичных для МЛергае (из банка ВОЗ). В качестве референс-препарата использовали водно-солевой экстракт из МЛергае, выделенных от броненосца (из банка ВОЗ). Результаты исследования показали присутствие в штаммах М.01, М.011 и М.1иЙ1 антигенных детерминант, специфичных для МЛергае, что предполагает их антигенное родство с возбудителем лепры.

Таким образом, изложенные собственные данные, а также их обсуждение, свидетельствуют о том, что нами выявлены культивируемые штаммы микобактерий, обладающие способностью задерживать развитие локальной лепрозной инфекции в подушечке лапки мыши. Выраженные про-тективные свойства при экспериментальной лепрозной инфекции, а также предполагаемое антигенное родство с возбудителем лепры позволяют рекомендовать штаммы МЛийл, М.01 и М.011 в качестве наиболее перспективных претендентов для дальнейших исследований в плане разработки высокоэффективной противолепрозной вакцины.

ВЫВОДЫ

1. Впервые при экспериментальной лепрозной инфекции изучены протективные свойства препаратов, приготовленных из 25 культивируе-

мых штаммов микобактерий, выделенных от больных лепрой, экспериментально зараженных животных, а также из почвы. Установлено, что наиболее выраженной способностью задерживать размножение Mycobacterium leprae в подушечках лап мышей, зараженных по Shepard, обладают штаммы микобактерий M.lufu (получен патент на изобретение № 2135196), а также М.01 и М.011.

2. Установлено, что искусственно синтезированный диметилглюко-за-полиакриламид-мурамилдипептид не обладает протективным эффектом при экспериментальной лепре. Протективные свойства полусинтетических конъюгатов диметилглюкоза-полиакриламид-БЦЖ и диметилглюкоза-диальдегиддекстран-БЦЖ при экспериментальной лепре выявляются только при многократном внутрибрюшинном введении мышам при содержании антигена в препарате 10-50 мкг.

3. Протективный эффект препаратов из живых Mycobacterium lufu, а также убитых культур М.01 и М.011 значительно выше, чем у полусинтетических препаратов, вакцины БЦЖ и Mycobacterium vaccae при однократном внутрикожном введении мышам за 28 дней до заражения Mycobacterium leprae.

4. Выявлено сходство штаммов микобактерий M.lufu, M.Ol, М.011 между собой по культурально-биохимическим и протективным свойствам, отличающим их от известных видов микобактерий и позволяющим отнести к III группе нефотохромогенных микобактерий по классификации Раньон.

5. Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать штаммы микобактерий M.lufu, M.Ol и M.Ol 1 в качестве наиболее перспективных для исследований по разработке высокоэффективных противоле-прозных вакцин.

Опубликованные работы по теме диссертации

1. Иртуганова O.A., Калянина О.В., Урляпова Н.Г.Скрининг препаратов на модели экспериментальной лепры // Ланималогия.- 1993.- №1.-С.60-60.

2. Иртуганова O.A., Урляпова Н.Г., Макаревич Н.М., Калянина О.В. Идентификация культур из тканей, инфицированных возбудителем

лепры // Экспериментально-клиническая иммунопатология и аллергология,- Чебоксары, 1988.- С.38-42.

3. Калянина О.В. Изучение протективных свойств потенциальных противолепрозных вакцин // Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней: Сб. тр. мол. ученых,- М., 1992.- С.65-67.

4. Калянина О.В. Разработка и изучение протективных свойств искусственной вакцины против лепры // Науч. конф. мол. ученых России, посвящ. 50-летию АМН: Тез. докл.- М., 1994.- С.281-281.

5. Калянина О.В., Бовин Н.В., Пименова Г.П.К вопросу о создании искусственной вакцины против лепры // Тез. докл. 6-го Всерос. съезда дерматологов и вернерологов.- М., 1989.- Ч.2.- С.438-439.

6. Калянина О.В., Иртуганова O.A., Урляпова Н.Г.Скрининг препаратов на протективную активность при лепре // Материалы юбил. науч. конф.АГМИ.- Астрахань. 1993.-С.210-214.

7. Калянина О.В., Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Корнеев A.A., Чер-ноусова Л.Н., Калинина O.A., Саламатина О.С. Культурально-биохимическая и иммунохимическая характеристика лабораторных штаммов M.Ol, М.011 и M.lufu // Иммунодиагностика и иммунореабилитация при лепре, туберкулезе и других хронических заболеваниях: Материалы симпоз.- Астрахань, 1998,- С.68-69.

8. Калянина О.В., Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Ющенко A.A., Черноусова Л.Н., Калинина O.A., Саламатина О.С. Сравнительная культу-рально-биохимическая и иммунохимическая идентификация лабораторных штаммов культивируемых микобактерий // Проблемы туберкулеза (направлена в печать).

9. Саламатина О.С., Дячина М.Н., Калинина O.A., Черноусова Л.Н., Калянина О.В., Юшин МЛО.Выявление видоспецифических антигенных детерминант M.leprae с помощью моноклональных антител // Актуальные вопросы дерматологии и венерологии: Сб. науч. тр.- Астрахань-1998.-С.115-117.

10. Юшин М.Ю., Васильев А.Э., Калянина О.В.Изучение некоторых свойств M.lufu в опытах in vivo // Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней: Материалы конф. -Тамбов; Астрахань, 1994.- С.137-138.

11. Юшин MJO., Калянина О.В.Протективные свойства M.lufu при экспериментальной лепрозной инфекции // Проблемы туберкулеза.-1995.- № 2.- С.47-48.

12. Юшин М.Ю., Калянина О.В. Способ иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции // Патент № 2135196.- 1999 г.

13. Yushin M.Y., Dyachina M.N., Kalyanina O.V., Degtyarev O.V., Bochanovsky V.A.Prospects of using M.lufu in leprosy studies // 15th Int. Lepr. Congress: Abstracts.- Beijing.- 1998.- Ml 13.