Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Прогностическое и предиктивное значение ERCC1 и βIII-тубулина у больных немелкоклеточным раком легкого

На правах рукописи

Брежнев Никита Владимирович

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ И НРЕДИКТИВНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЕИСС! И рШ-ТУБУЛИНА У БОЛЬНЫХ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ЛЕГКОГО

14.01.12 - онкология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкг-Петербург - 2010

004601548

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Моисеенко Владимир Михайлович доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гершанович Михаил Айзерович доктор биологических наук, профессор Комов Вадим Петрович

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социального развития»

Защита диссертации состоится «25» мая 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета № Д 208.052.01 при ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» по адресу: 197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петро( Росмедтехнологий» и на сайте www.mioncologii.ru с 20 апреля 2010 г.

Автореферат разослан «20» апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н.

Бахидзе Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На протяжении последних десятилетий комплексное лечение больных злокачественными новообразованиями остается важнейшей медицинской проблемой, как в Российской Федерации, так и в других странах Европы и Северной Америки. Разрешение данного вопроса требует максимальной интеграции теоретических и практических достижений онкологии, координированного и целенаправленного взаимодействия специалистов, работающих в этой области медицины. Чрезвычайную актуальность сохраняет лекарственная терапия диссеминированного нсмелкоклеточного рака легких, являющаяся одним из приоритетных направлений современной онкологической практики.

Лечение больных немел ко клеточным раком легкого (HMPJ1) наиболее сложная проблема клинической медицины. Прежде всего, это связано с особенными характеристиками опухолевой ткани. НМРЛ представляет собой морфологически неоднородную группу, включающую в основном плоскоклеточный рак (70-75%), аденокарцнному (20-25%) различной степени днфференцировкн и другие, редкие формы рака. Они объединяются в группу НМРЛ по органному принципу, и вместе с тем каждая морфологическая форма имеет свои нюансы клинического течения, лечения и прогноза [Давыдов М.И. и соавт., 2003].

Рак легкого устойчиво занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований [Аксель Е.М. и соавт., 2007]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется свыше 63000 случаев этого заболевания [Чиссов В.И. с соавт., 2007]. В основном (70-80%) НМРЛ выявляется при значительном местнорегнонарном распространении и наличии отдаленных метастазов (ШВ - IV стадия), и эта группа больных неизлечима современными методами [SlinchcombeТ.Е. etal., 2009].

Лекарственное лечение рака носит, преимущественно, эмпирический характер и основано, скорее, на клинических данных, чем на понимании механизмов чувствительности к химическим агентам. В результате больные часто подвергаются воздействию высокотоксических препаратов и страдают от побочных эффектов в отсутствие каких-либо положительных результатов.

Развитие фундаментальных наук позволило понять отличия опухолевой клетки от нормальной на молекулярно-генетнческом уровне. По-видимому, под видом одного и того же морфологического типа опухолей скрывается несколько разновидностей заболевания, отличающихся по своему молекулярному патогенезу [Imyanitov E.N et al., 2005; Peto S.A. et al., 2001]. Поэтому, знание молекулярно-биологических и генетических особенностей НМРЛ может способствовать оптимизации лекарственного лечения пациентов данной нозологической группы.

Благодаря достижениям современной фармакогенетикн было обнаружено несколько полиморфизмов генов, кодирующих белки, которые участвуют в метаболизме лекарственных агентов, используемых при лечении НМРЛ [Beplcr G., 2008; Sequist L.V. et al., 2008; West H. et al., 2009].

Наибольшие успехи в этой области были достигнуты в отношении терапевтического применения таксанов и производных платины. В частности, эффективность лечения в существенной степени зависит от внутриопухолевой активности рШ-тубулина - белка, из которого формируются микротрубочки. Фундаментальные, н клинические исследования показали важную роль

гиперэкспрессии pill-тубулина в резистентности опухоли к препаратам таксанового ряда. Определение и регуляция уровней экспрессии pill-тубулина в опухолях может быть прогностическим фактором ответа опухоли на терапию таксанами.

Как известно, цитотоксичесхий эффект цисплатина связан с нарушением функции нитей ДНК и образованием внутри- и межспиральных сшивок, так называемых, аддуктов [Roberts J.J. et al., 1979], в результате чего нарушается структура и подавляется синтез ДНК. В меньшей степени происходит ингибирование синтеза РНК. Изменение конформации молекул ДНК приводит к нарушению считывая информации и соответственно к блокированию деления клеток.

Основную роль в репарации этих повреждений играет сложная система ферментов, которая выявляет образовавшиеся конгломераты, производит их вырезание, восполняет недостающий фрагмент и, наконец, сшивает восстановленные фрагменты. Работа этой системы и обуславливает восстановление опухолевых клеток после действия производных платины. Среди механизмов резистентности к платиновым производным наиболее значимым является NER (nucleotide excision repair) [de Laat W.L. et al., 1999]. Среди множества ферментов, участвующих в этом процессе, одним из ключевых, является ERCC1.

Таким образом, клинико-бнологнческая характеристика НМРЛ с использованием абсолютно новых возможностей изучения молекулярно-биологических маркеров может дать информацию о более точном прогнозе течения заболевания, помочь проведению рационального, индивидуальн смоделированного лечения, что и определяет чрезвычайную актуальность данной проблемы. 11ель исследования:

Повышение эффективности лекарственного лечения больных диссеминированным НМРЛ, за счет идентификации молекулярно-биологических прогностических и предиктивных маркеров.

Задачи нсуле/шттч;

1. Оценить внутриопухолевую активность биологических маркеров ERCC1 и pill-тубулина у пациентов с местио-распространеннымн и диссеминированными формами НМРЛ.

2. Сопоставить продолжительности общей выживаемости больных в группах с аденокарциномой н плоскоклеточным НМРЛ.

3. Изучить влияние молекулярных маркеров на течение болезни у больных с аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого.

4. Оценить степень корреляции уровней внутриопухолевой экспрессии ERCC1 и pill-тубулинас эффективностью лекарственной терапии препаратами из группы таксаны и производных платины у больных с различными морфологическими формами НМРЛ.

Положения, выносимые на защиту

1. Индивидуализация лечения больных НМРЛ на основе определения молекулярно-биологических параметров (ERCC1 и pill-тубулина) может оптимизировать выбор терапии и получить максимальный эффект.

2. Наряду с факторами, отражающими распространенность опухоли, ее морфологические особенности, для прогнозирования течения заболевания принципиально важным является изучение ряда молекулярно-биологических показателей злокачественного процесса.

Научная новизна работы

Впервые на значительном клиническом материале разработана методология оценки экспрессии белка pill-тубулина и ERCC1 в опухолевой ткани больных ИМРЛ. Оценена клиническая эффективность тестов на выявление экспрессии белка ßlll-тубулина и ERCC1.

Разработана и внедрена методика, позволяющая оценивать экспрессию в минимальных количествах биологического материала, в частности, в биопсийных препаратах.

Определена роль и место молекулярно-биологических маркеров |Ш1-тубулина и ERCC1 в оценке прогноза заболевания у пациентов аденокарцнномой и плоскоклеточным НМРЛ.

Оценена возможность использования уровней экспрессии ßlll-тубулина и ERCC1 в качестве предиктивных молекулярных маркеров у больных НМРЛ, позволяющих еще до начала лечения с определенной долей вероятности прогнозировать индивидуальную чувствительность опухолевого процесса к цитостатнческнм препаратам, в частности, к таксанам и производным платины.

Практическая значимость

Внедрение в медицинскую практику результатов исследования позволит увеличить эффективность лекарственного лечения НМРЛ на основе индивидуального подбора цитостатических препаратов.

Кроме этого, посредством метода ПЦР в реальном времени разработаны для практического применения в онкологических учреждениях новые методики оценки экспрессии генов в минимальных количествах биологического материала, в частности, в биопсийных препаратах.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую работу отделения трансплантации костного мозга и биотерашш ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологнй» и кафедры онкологии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены 05 апреля 2010 года на объединенной научной конференции отделения биотерапии и трансплантации костного мозга, химпотерапевтнческого и торакального отделении, отделения детской онкологии и гематологии, отделения опухолей желудочно-кишечного тракта и отделения общей онкологии ФГУ «ПИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологии» совместно с кафедрой онкологии Медицинской академии последипломного образования (МАПО).

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Работа содержит 15 таблиц, иллюстрирована 23 рисунками. Библиографический указатель содержит ссылки на 3 отечественных и 88 зарубежный источников.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы, в т.ч. одна статья в журнале, рекомендованном ВАК.

СОДЕРЖАНИЕ РАВОТЫ Материал и методы

Па первом этапе производился анализ частоты экспрессии ERCC1 и ßlll- тубулнна у больных HMPJ1. Исследование выполнялось с 2004 по 2009 гг. в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедшшологий».

В исследование включены данные о 217 больных, получавших стационарное и амбулаторное лечение и наблюдавшихся до октября 2009 года включительно. Краткая характеристика больных, опухолевый материал которых прошел молекулярно-генетический анализ на наличие различных уровней экспрессии ERCC1 и ßlll- тубулнна, представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Клиннко-морфологнческая характеристика больных HMPJl (п=217)

п/(%)

Число пациентов 217(100%)

Возраст (годы)

Средний 58

Диапазон 22-79

Пол

Мужской 156 (71,9%)

Женский 61 (28,1%)

Гистологический тип опухоли

Аденокарцинома 139 (64,1%)

Плоскоклеточн ы й 74 (34,1%)

Бронхоал ьвеолярн ы й 4(1,8%)

ЕСОО

0 50 (23,0%)

1 124 (57,2%)

2 42 (19,8%)

Как видно из представленной таблицы, в исследовании принимали участие пациенты в возраст от 22 до 79 лет, медиана возраста составила 58 лет. Общее число наблюдаемых пациентов - 21 человека - складывалось из 156 мужчины и 61 женщин. Общее состояние большинства больных (77% оценивалось на 1-2 балла (по шкале ЕСОО). Иными словами, практически все пациенты имел! клинические симптомы заболевания и были ограничены в нормальной деятельности и/или активно! работе. Лишь 50 больных (23%), общее состояние которых оценивалось на 0 баллов, не предъявлял! никаких жалоб и могли вести обычный образ жизни.

Для оценки влияния морфологического строения НМРЛ на клиническое течение болезш проводился анализ гистологических типов опухоли. У большинства больных - 64,1% (139 из 217) пр! морфологическом исследовании операционного материала была обнаружена аденокарцинома легкого Минимальное число больных — 1,8% (4 из 217) имело бронхоальвеолярное строение.

Молекулярно-генетическим методом изучения концентрации молекулярных маркеров опухолевой ткани явилась обратная полимеразная цеппая реакция (ПЦР) в реальном времени. Имени данный анализ, направленный на выявление уровня экспрессии рШ-тубулина н ЕЯСС1, позволи

количественно определят!, экспрессию мРНК в цигозоле злокачественных клеток. Использование ПЦР в реальном времени способствовал наиболее точной оценке концентрации мРНК изучаемых маркеров в небольшом количестве ткани, полученной, например, при пункции или биопсии. Основным требованием к исследуемому материалу является наличие более 80% опухолевых клеток в образце. Учитывая это условие, использование определенного метода обработки срезов с парафиновых блоков путем мнкродиссекции с последующим проведением количественной ПЦР позволило определить уровни ERCC1 и рШ-тубулина с высокой точностью. Для получения ДНК из срезов парафиновых блоков, а так же из биопсийных образцов использовалась методика, разработанная в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнолошй», включающая в себя депарафинизацию и лизис ткани с помощью протеиназы К [Imyanitov E.N. et al., 2001]

Оценка уровня экспрессии генов в образцах кДНК проводилась на основании построения относительной стандартной кривой количества копий таргетного гена по соотношению с реферным геном (SDHA - GenBank: NM_004168) в мультиплексной полуколичественной ПЦР в реальном времени с использованием флюоресцентно меченых зондов, специфичных к выбранным для амплификации участкам кДНК. Анализ результатов проводили с использованием метода калибровочной кривой. Праймеры для ПЦР были подобраны таким образом, чтоб исключить получение амплификата с геномной ДНК, присутствующей в пробе кДНК. Образцы РНК без обратной транскрипции резервировались как отрицательный контроль в ПЦР. Реакцию проводили на приборе ¡Cycler ¡Q Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, USA) в объеме 25 мкл, каждый образец в протоколе дублировался. В составе реакционной смеси был 1-кратный ПЦР-буфер с содержанием MgCl(2) 2,5 мМ, 125 мкМ dNTP, or 200 нМ каждого праимера и 500 нМ каждого из флюоресцентно меченых зондов, 1 ед. термоактивируемой Taq- полимеразы «Thermostat» («Синтол», Россия). Реакцию начинали с инкубирования проб при 95 °С в течение 10 минут для активации полимеразы, затем следовали 45 циклов: 95°С - 15 сек., 60 °С - 45 сек.

Корреляция между клиническими характеристиками и экспрессией ERCC1 и РШ-тубулина для биноминальных переменных производилась тестом хи-квадрат. Учитывая, что среди исследованных переменных не встречалось нормальное распределения при проведении корреляционного анализа, использовался метод Спнрмена. Анализ проводился в программном пакете PASW Statistics 18.0 for Mac.

Второй этап исследования анализ влияния клинических факторов (возраст, пол, общее состояние больного, снмптомиость заболевания, наличие опухолевых осложнений, число пораженных опухолью органов, гистологического типа опухоли) и изучаемых молекулярно-биологических маркеров (ERCC1 и рШ-тубулина) на продолжительность обшей выживаемости (ОВ) был проведен на основании исследования больных метастатическим IIMPJI, находившихся на амбулаторном и стационарном обследовании и лечении в отделении биотерапии и трансплантации костного мозга ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» в период с 2000 года по октябрь 2009 года.

В процессе работы из общего числа пациентов HMPJ1 (217 человек) для анализа прогностической роли ERCC1 и pill-тубулина было отобрано 67 пациентов с диссеминнрованной формой заболевания (ШВ и IV стадии). При этом в ходе исследования в 12 образцах опухолевой ткани не удалось выделить молекулу мРНК, возможно, в связи с погрешностями при приготовлении парафиновых блоков, и, как

следствие, не предстанилось возможным оценить уровень изучаемых маркеров. Таким образом, для оценки молекулярпо-биологических маркеров использовались клинические данные 55 больных HMPJ1.

Предиктивная роль молекулярно-биологнческих маркеров ERCC1 и ßlll-тубулина была изучена на основании данных о 31 пациенте с диссемпнированным НМРЛ (IIIB и IV стадии). Во всех наблюдениях диагноз НМРЛ был верифицирован морфологическим путем. Общее состояние больных оценивалось по 5-балльной шкале ECOG [Oken М.М. et al., 1982]. Общий статус всех пациентов в начале противоопухолевой терапии составлял 0-2 балла по шкале ECOG.

Все больные соответствовали следующим критериям включения: отсутствие предыдущего противоопухолевого лечения, возраст старше 18 лет, ожидаемая продолжительность жизни не менее 12 недель, допустимые отклонения в гематологических н биохимических показателях соответствовали 0-1 степени, в соответствии с критериями, разработанными Национальным раковым институтом США [NCI СТСАЕ v.3, 2006], отсутствие признаков метастатического поражения головного мозга, наличие измеримых и/или неизмеримых очагов.

К методам регистрации размеров и локализации опухолевых очагов были отнесены физикальный осмотр, рентгенография органов грудной клетки и костей, компьютерная томография органов грудной клетки, брюшной полости и полости малого таза с контрастированием, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и полости малого таза. Изотопные методы обследования (остеосциитнграфия) были выполнены только по клиническим показаниям.

Всем больным, вне зависимости от схемы проводимой химиотерапии, планировалось осуществить ежемесячный клинический осмотр с определением общего статуса больного по шкале ECOG, подсчет количества лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, определение уровня гемоглобина в периферической крови; мониторинг содержания билирубина и его фракций, креатинина, электролитов, активности трансаминаз в венозной крови. Диагностика гематологических и негематологнческих побочных эффектов химиотерапии, их коррекция и наблюдение за динамикой осуществлялись постоянно на протяжении всего курса лечения и в течение 28-30 дней после его окончания. Выраженность осложнений оценивалась в соответствии с критериями NCI СТСАЕ v.3, 2006.

Модификация доз введения цитостатиюов производилась в зависимости от степени побочных эффектов лечения и предусматривала только отмену препарата.

Каждые 6 недель химиотерапии осуществлялось контрольное измерение всех очагов опухолевого поражения с целью определения эффекта лечения. Оценка результатов терапии проводилась по общепринятым показателям (характер, частота, продолжительность эффекта) в соответствии с рекомендациями RECIST [URL: www.recist.com]. В случае появления клинических признаков прогрессирования заболевания все необходимые лабораторные и инструментальные исследования выполнялись вне вышеуказанного плана.

В качестве первой линии лекарственного лечения всем больным проводилась терапия различными комбинациями препаратов из групп производных платины и таксанов, представленными в таблице 2. Большинству пациентам 27 (87,1%) из 31 назначена была стандартная комбинация паклитаксел 175 мг/м2 и карбоплатин AUC6, двум (6,5%) проводилась

терапия доцетаксел 75 мг/м2 и цисплатин 60 мг/м2, и по одному - паклитаксел 175 мг/м2 и цисплатин 60 мг/м2 (3,2%) и доцетаксел 65 мг/м2 карбоплатнн АиСб (3,2%).

Таблица 2 - Используемые режимы нолмхнмиотерапии

Режимы полихимнотерапин

Доцетаксел/Карбоплатин 1 (2,9%)

Доцстаксел/Циеплагин 3 (8,6%)

Паклитаксел/Карбоплатин 29 (82,9%)

Паклитаксел/Цпсплатип 2 (5,7%)

Временем до прогресснрования опухоли считалось время от момента включения больного в исследование до документированного прогресснрования заболевания. Под общей выживаемостью понималось время от включения больного в исследование до смерти. Для оценки времени до прогресснрования опухоли и общей выживаемости использован метод регрессионного анализа Каплан-Мсйера. Внутригрупповой анализ времени до прогресснрования опухоли и общей выживаемости производился с помощью ранжирования Внлкоксона.

В результате анализа, не во всех 217 образцах, удалось идентифицировать две молекулярные детерминанты - ЕЯСС1 и рШ-тубулин. Это обусловлено, вероятно, индивидуальным генетическим профилем НМРЛ и отсутствием в некоторых анализируемых экземплярах генов, ответственных за синтез этих белковых молекул. Данные об экспрессии изучаемых ферментов приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Экспрессия молекулярно-биологическнх маркеров при НМРЛ

Практически во всех исследуемых образцах НМРЛ - 99,5% (216 из 217) удалось выделить ЕЯСС!. В анализируемых образцах в большинстве новообразовании - в 61,1% (132 случая) отмечалось низкое содержание мРНК Е11СС1 в опухолевой ткани. 28,7% образца опухоли легкого характеризовались высокой активностью и только 22 образца (10,2%) имели умеренные значения.

Экспрессия рШ-тубулина нами была обнаружена в 43,3% (94 из 217) случаев НМРЛ. При этом в большинстве новообразований, в 57,4% (54 образца) уровень этого фермента соответствовал низким значениям, высокие цифры наблюдались в 26,6%, в 15 образцах (16%) умеренная активность данного маркера.

Проведенное исследование корреляции экспрессии ЕЯСС1 и рШ-тубулин в образцах НМРЛ впервые в Северо-западном регионе РФ позволило выявить отсутствие какой-либо взаимосвязи с полом пациента (р=0,724 и р=0,326 соответственно), возрастом (р=0,277 и

Результаты

Маркер ЕИСС! рШ-тубулнн

Процент положительных случаев

99,5% (216/217) _43,3% (94/217)_

р=0,635 соответственно) и морфологической формой заболевания (р=0,314 и р~0,255 соответственно).

Для выявления прогностической значимости отдельных факторов нами проведена оценка влияния клинических, биохимических и молекулярно-генетичеекпх показателей на общую выживаемость НМРЛ. Для анализа были исследованы 55 образцов опухоли пациентов с местнораспространенным и диссеминнрованным НМРЛ (ШВ и IV стадии, 19,3% и 80,7% соответственно). По морфологическому типу образцы НМРЛ разделились на аденокарциномы 28 (50,9%) случаев и плоскоклеточный рак 27 (49,1%). Изучение групп пациентов с различными гистологическими вариантами диагноза производилось раздельно.

При сравнении медиан общей выживаемости двух исследуемых групп мы получили статистически достоверную разницу в продолжительности общей выживаемости (р<0,05) - 15,1 месяцев в группе с плоскоклеточиым раком лекого, и в группе с аденокарциномой легкого - 8,9 месяцев (Р"с- 1)- _

I I I I I I ' I 1 I ' I I I I I I I I I I I I I I I I I г

Время (месяцы)

Рисунок 1 - Общая выживаемость больных аденокарциномой и плоскоклеточным НМРЛ ШВ и

IV стадий.

Выполненный многофакторны и корреляционный анализ по методу Спирмена показал что у пациентов с аденокарциномой легких на продолжительность обще» выживаемости достоверно влиял пол пацнента: медиана общей выживаемости женщин по сравнению мужчинами составила; 14,3 месяца против 4,6 мес. соответственно (р=0,05). Подобна» закономерность наблюдается и прн анализе общесоматического статуса пациента, которы» также коррелировал с продолжительностью общей выживаемости: 12 месяцев прн нормально» активности больного (ЕСОО=1) и практически 4-х кратное уменьшение этого параметра npi снижении статуса ECOG=2 (р=0,199).

Медиамя пошей нмжийиемосш

о.о-

Ile выявлено влияния на общую выживаемость пациентов с аденокарциномами легких таких показателей как локализация первичного очага (р=0,283), возраст (р=0,172), наличие осложнений (р=0,093). Во время анализа всех выше перечисленных параметров на продолжительность ОВ у пациентов с илоскоклеточпымп изменениями достоверных корреляций также Fie установлено.

Во время изучения влияния молскулярно-генетических маркеров на течение болезни у больных с аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого получены следующие результаты. Из проанализированных двух показателей достоверное влияние на ОВ больных в исследуемых группах -аденокарцинома легкого и плоскоклеточный НМРЛ оказывал только ERCC1 (р=0,009 и р=0,005 соответственно). Прогноз для жизни ухудшался при повышенной активности данного маркера (рис. 2).

S и

Y

a-t Ншк.ш - 12.5 .j-i Нмстия • M

р ().(4MN

ч

L

.л llttih-ая • !•>.«■

. г < НыскТйИ • р (НЮ*

!............I,

1,......

1

> î'î гз îa гк :« лс зг за

> i t fi я nui'

H|1CM4 (ЧЛ'ЯПШ) Ирсмя (Ч1"С*ИЧ1

Рисунок 2 - Общая выживаемость больных аденокарциномой и плоскоклеточным

различными уровнями ERCC1.

НМРЛ с

3. ...

. Ниш.» - Ш.Ч т KM.'I . 1.5 р <1.211

i

, Мим*« • 14.Л

* Иыт а« - И.2

! ¡,1.......

Вркчя (\K4eilWi

Рисунок 3 - Общая выживаемость больных аденокарциномой и плоскоклеточным НМРЛ с различными уровнями рШ-тубулипа.

Что касается влияния рШ-тубулина на продолжительность ОВ больных НМРЛ, то результаты исследования показали отсутствие достоверной прогностической ценности данного фактора (р=0,211 и р=0,925), несмотря на различия в медианах ОВ в сравниваемых группах с низкой и высокой активностью рШ-тубулина, это может быть связано с небольшим числом пациентов (рис, 3).

Таким образом, на основании проведенного исследования можно утверждать, что высокая экспрессия ЕИСО в опухолевой ткани больных аденокарциномой и плоскоклеточным НМРЛ, вне зависимости от морфологического варианта, является маркером неблагоприятного прогноза заболевания, и может быть предложена к использованию в практической онкологии наравне с такими клиническими факторами, как стадия и морфологическая форма заболевания. Кроме того, оказалось, что уровень экспрессии р1П-тубулина у больных аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого не связан с риском смерти и не может быть использован в практике как маркер неблагоприятного прогноза в отношении продолжительности жизни.

Кроме того, в нашей работе мы оценили степень корреляции уровней внутриопухолевой экспрессии ЕЯСС1 и РШ-тубулина с временем до прогрессирования у больных с различными морфологическими формами НМРЛ, которым проводилась лекарственная терапия препаратами из группы таксанов л производных платины. С этой целью в ходе исследования был проанализирован 31 пациент с гистологически верифицированным местнораспространенным и диссеминированным НМРЛ, у 25 из них заболевание было IV стадии и только у 6-ти больных -ШВ стадии. Гистологически опухоли были представлены аденокарциномами - в 12-ти случаях (38,7%) и плоскоклеточными карциномами - в 19-ти (61,3%). Никогда не курили 11 больных, что составило 35,5% от общего числа включенных в исследование пациентов. Всем пациентам в качестве первой линии проводилась полихимиотерапия на основе препаратов платины и таксанов (таблица 2). Среднее число циклов полихимиотерапии составило 3 (от 2-х до 6-ти), всего в рамках настоящею исследования было проведено 104 цикла еысокотоксического лечения. Практически у всех пациентов были соблюдены стандартные интервалы между циклами. Только у 6 больных начало очередных циклов химиотерапии было отложено на сроки от 4 до 10 дней. Основанием для изменения сроков лечения у данных пациентов явилась гематологическая токсичность. Редуцирование доз химиопрепаратов на 25% от исходной было осуществлено у 1 пациента из-за развития фебрильной нснтропении. В соответствии с общепринятыми стандартами химиотерапии редуцированная доза препарата в дальнейшем не эскалировалась, несмотря на отсутствие токсических реакций третьей степени. В проведенном нами исследовании обшая эффективность терапии у не получавших ранее лекарственного лечения пациентов согласно критериям К£С18Т составила 25,8% (8/31), что включает в себя частичный регресс заболевания, который был достигнут у 8 из 31 больных - 25,8%, полных регрессов в нашем исследовании достигнуто не было. При этом клиническая эффективность (ПР+ЧР +стабилизация) данного лечения составила - 54,8%, так как у 29,0% больных без значимого уменьшения опухоли была достигнута стабилизация заболевания. В исследовании 14 (45,2%) пациентов не ответили на терапию, т.е. было зарегистрировано прогрессированне процесса. Медиана времени до прогрессирования составила 13,8 недель (колебания от 2,3 до 71,8 недель). Результаты проведенного лечения представлены в таблице 4 и рисунке 4.

Таблица 4 - Объективная эффективность терапии

Число пациентов (п=31) %

Полный регресс 0 0

Частичный регресс 8 25,8

Стабилизация 9 29,0

Прогрессиро ванне 14 45,2

Рисунок 4 - Регрессионный анализ времени до прогрессирования больных НМРЛ.

Во всех образцах опухолевой ткани пациентов, наблюдавшихся и получавших терапию в клинике, удалось выделить обе молекулярные детерминанты. При анализе уровней мРНК были получены следующие результаты: высокие значения ЕЯСС1 были обнаружены в 42,0% случаях, низкий его уровень определен у 18 (58,0%) проанализированных пациентов. Уровень рШ-тубулина в равных количествах встречался в высоких п низких значениях: 51,6% (16 образцов) и в 15 случаях (48,4%) соответственно.

Нами проанализирована зависимость экспрессии каждого маркера (ЕЯСС1 и рШ-тубулин) от иола, возраста, гистологического типа опухоли, курительного статуса, ЕСОв статуса, лечебного эффекта. Полученные результаты представлены в виде таблицы 5.

По аналогии с исследованием прогностической значимости ЕЯСС1 и РШ-тубулин, группы пациентов с различными гистологическими формами, нами проанализированы отдельно, и для предиктнвной их роли.

Таблица 5-Корреляция ЕЯСС1 я |Ш11-тувянна с основными клиинко-морфологическимм факторами

Ура—»ьЕЩО»'.'*»» ,■■.....:■..■. ■ ■ ^иаан, ЕВСС1

в нюткй высокий I' а ннжнв высокий Р

Пол Мужской Жмский 24 7 13 11 5 р-0,247 24 7 13 11 р-0,432

Во|раст <65 >65 26 5 14 1 12 4 р=0.177 26 5 15 3 11 2 р-0,927

Гисточопсческнй ш опухоли Ааемокоршиома Плосммиклочный 12 IV 4 11 Я 8 р=> 0.195 12 19 7 II 5 8 р=0,9В2

Куригедьний стг^с Да Нет 2» 11 12 3 8 8 20 11 11 9 7 4 р«0,654

! СХХ, сгагус 1 2 29 2 15 и 14 2 » 2 1« 0 11 2

Лечебкый эффал ПР.'В», С 11 17 14 15 0 2 14 р-Ц.000 17 14 11 7 6 7 р*03/Ю

Уровень №СС%1 нщкнй виижий 18 13 9 9 6 7 р-0.839

Уровень РШ-т^фулнна ншннй высокий 15 16 9 9 6 7 р=0,839

Нрои Оа-.к-.»!* то к- ни

Рисунок 5 - Время до прогрессировамня больных аденокарциномой п плоскоклеточным НМРЛ с различными уровнями рШ-тубулина.

Проведенный нами анализ внутриопухолевой активности ЕЯСС1 и рШ-тубулина показал существование корреляции между уровнями экспрессии и медианами до прогрессировать у больных с низкими и высокими экспресснями маркеров. При этом стоит отметить, что статистически значимая

связь в данном случае характерна только для рШ-тубулина как в группе с аденокарцнномами, так и с плоскоклеточными изменениями (р=0,002 и р=0,0001 соответственно).

Проведенный нами анализ показал, чго высокая экспрессия рШ-тубулина в опухолевой ткани является маркером неблагоприятного прогноза в отношении раннего прогрессировать заболевания (рис. 5). Различия кривых времени л.о прогрессирования у пациентов с аденокарцнномой и плоскоклеточным раком легкою с высокими и низкими значениями РШ-тубулина полностью подтверждают это заключение. Так, медиана больных аденокарцнномой, у которых в ткани опухали наблюдался низкий уровень мРНК изучаемого фермента, составила 23,8 недель, что значительно превышает подобный показатель (8,4 недель) в группе пациентов с повышенной активностью рШ-тубулнна (р=0,002). Подобная же ситуация и в отношении больных с плоскоклеточным раком легкого. Доказательством этого служит разница медиан времени до прогрессирования в группе пациентов с высокой и низкой внутриопухолевой концентрацией изучаемого маркера - 6,5 недель и 27,4 недель, соответственно (р=0,0001).

Основываясь на результатах нашей работы, можно предположить, что при наличии низкой экспрессии в опухолевой ткани, забранной перед началом лекарственного лечения больных с местнораспрострапенным и диссемннированным НМРЛ, препаратами выбора должны стать ¡рупиа растительного происхождения - таксаны.

Уровень Е11СС1 формально (с точки зрения статистической значимости) в нашем исследовании не показал преднктивного значения, однако это может быть связано с небольшим числом пациентов, так как нельзя не заметить уменьшение: времени до прогрессирования при высокой экспрессии у больных с аденокарциномон легкого 8,6 недель и плоскоклеточным раком 11,3 недель, по сравнению с низкими значениями ЕЯСС1 - 13,3 недель в группе с аденокарцнномой и 15,7 недель с плоскоклеточным раком легкого, р=0,827 и р=0,415 соответственно (рис. 6).

[)|НМИ (недели) Ир^чв 'IV 1<:

Рисунок 6- Время до прогрессирования больных аденокарцнномой и плоскоклеточным НМРЛ с различными уровнями ЕИСС1.

Полученные в результате нашей работы данные позволили разработать алгоритм для определения тактики и последовательности первой линии лекарственной терапии неоперабельных больных НМРЛ (рис. 7).

НМРЛ ШВ-ТУ ст

Адеиокарцинома, брогшгсшоальпсолярный рак

Мутация ГХН'К

Да

нгфитшшб чрлотшшб

Плоскоклеточный, крупною/сточный рак

Нет

Экспрессии ЕКСС1 и рШ-тубулин

ЕИСС! (-)

плагнно-содержащне схемы

/

ЕИСС! (+) режимы без производных платины

р111-туоулин (-)

I

цнсплапш/доцетаксел карбоплапш/паклитаксел

РШ-тубулин (+)

РШ-тубулин (-) рГП-тубулин (+)

гемцнгабин/паклитаксел

цнсшштин/гемцнтабнн цисплатин/зтопознд

доцетаксел

неметрексет/гемцитабин этопозид

Рисунок 7 - Алгоритм обследования и лечения больных немелкоклеточным раком легкого.

ВЫВОДЫ

1. Немелкоклеточныи рак легкого (НМРЛ) представляет собой гетерогенную группу, имеющую, наряду с морфологическими особенностями, ряд отличительных молекулярно-биологпческих характеристик (ЕЯСС1 и рШ-тубулин: низкая экспрессия в 61,1% и 57,4% случаях, средняя 10,2% и 16,0% и высокая 28,7% и 26,6% соответственно).

2. Внутриопухолевая активность биологических маркеров ЕКСС1 и рШ-тубулина у пациентов с местнораспространенными и диссеминированнымп формами НМРЛ не зависит от пола (р=0,724 и р=0,326 соответственно), возраста пациента (р=0,277 и р=0,635 соответственно) и морфологической формы заболевания (р=0,314 и р=0,255 соответственно).

3. Высокий уровень экспрессии ЕЯСО отрицательно влияет на показатели ОВ у пациентов с аденокарциномой (р=0,009) и плоско клеточным раком легкого (р=0,005).

4. Экспрессия рШ-тубулина не имеет достоверной прогностической ценности у больных аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого (р=0,211 и р=0,925 соответственно).

5. Продолжительность ВДП при проведении таксансодержащих режимов оказалась выше у пациентов с низкой экспрессией РШ-тубулина. Медиана ВДП у больных, в ткани опухоли которых наблюдался низкий уровень мРНК РШ-тубулина, составила 24,3 недели, в группе с повышенной экспрессией подобный показатель 8,0 недель (р=0,0001).

6. Низкая экспрессия Е11СС1 имеет определенное преднктивное значение у пациентов раком легкого. Медиана времени до прогрессировать у больных, в ткани опухоли которых наблюдался низкий уровень ЕЯСС1, составила 14,6 недель, что превышает подобный показатель (11,3 недель) в группе пациентов с повышенной экспрессией ЕКСС1 (р=0,412).

7. Медиана общей выживаемости пациентов с плоскоклеточным раком легких достоверно лучше (р<0,05) -15,1 месяцев, чем в группе с аденокарциномой - 8,9 месяцев.

8. Определение уровня экспрессии молекулярно-генетических маркеров: ER.CC! и РШ-тубулина в опухолевой ткани больных НМРЛ является перспективным методом отбора пациентов, потенциально чувствительных к терапии таксанамн и производным и платины.

Слисок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Брежнев U.B., Имянитов E.H., Моиееенко В.М. Роль тубулина в резистентности к препаратам таксанового ряда//Российский онкологический журнал. 2008. № 6. С. 49-52.

2. Брежнев Н.В., Проценко С.А., Суспицын E.H. Преднктивное значение ßIII-тубушша у больных немелкоклеточным раком легкого Н Материалы юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». Издательство СПбМАПО, 2010. С. 86-87.

3. Брежнев Н.В., Проценко С.А., Суспицын E.H. Иевлева А.Г. Имянитов E.H. Моиееенко В.М. Прогностическое значение pIII-тубулнна у больных НМРЛ // Материалы конференции VI съезда онкологов и рентгенрадиологов СНГ. В печати.

Благодарности

Выражаю сердечную благодарность научным руководителям диссертационной работы доктору медицинских наук, профессору Владимиру Михайловичу Моисеенко и доктору медицинских наук, профессору Евгению Наумовичу Имяннтову.

Искренне признателен сотрудникам отделения трансплантации костного мозга и биотерапии ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» за оказанную помощь в проведении клинической части работы к.м.н. С.А. Проценко, Т.Д. Михайличенко, к.м.н. Г.М. Телетаевой, к.м.н. А.И. Семеновой, к.м.н. A.B. Новику, к.м.н. В.А. Чубенко, к.м.н. Ф.В. Моисеенко, A.C. Жабнной.

Приношу глубокую благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии (к.м.н. E.H. Суешшыну, к.м.н. А.Г. Иевлевой) сотрудникам отделения патологической анатомии (д.м.н., проф. Д.Е Мацко., А.О. Иванцову).