Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Преобразования системы "двигательное окончание - мышечное волокно" мышц голени после спинальной травмы

На правах рукописи

(JÜ344Y5£3U

СКАКОВ Виктор Николаевич

ПРЕОБРАЗОВАНИЯ СИСТЕМЫ «ДВИГАТЕЛЬНОЕ ОКОНЧАНИЕ - МЫШЕЧНОЕ ВОЛОКНО» МЫШЦ ГОЛЕНИ ПОСЛЕ СПИНАЛЬНОЁ ТРАВМЫ (МОРФО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.02 - анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 2 окт 2008

Уфа-2008

003447598

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ижевская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Виктор Михайлович Чучков.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Эдуард Салихович Валишин; доктор медицинских наук, профессор Игорь Иванович Марков.

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «_»_ 2008 года в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 208.006.02. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

С.В.Фёдоров

Введение

Актуальность проблемы. Травмы позвоночника остаются одной из актуальных медико-социальных проблем современной медицины, так как часто осложняются повреждением спинного мозга в виде компрессии, размозжения, частичного или полного его разрыва, что приводит к инвалидизации пострадавших. Частота возникновения подобных травм по разным оценкам колеблется от 11 до 112 на 100.000 человек. Частичные или полные повреждения спинного мозга человека достаточно часто наблюдаются в спорте, на производстве, в бытовых условиях. Одними из последствий являются парезы и параличи конечностей. В нейроморфологии нередки экспериментальные исследования периферических нервных структур при спинальной травме, смоделированной различными методами (полное и частичное пересечение, ушиб, сдавление). В последнее время актуальным решением проблемы восстановления двигательной активности в меньшей или большей степени представляется в использовании стволовых клеток, помещенных в поврежденную область спинного мозга. Очевидно, что травма и восстановление поврежденного фрагмента спинного мозга с использованием стволовых клеток приводят как к местным, так и отдаленным изменения вовлеченных органов и систем. Для сравнительного определения морфологических преобразований, происходящих на нервно-мышечном уровне на различных этапах восстановления дефекта спинного мозга с применением стволовых клеток, необходимо представлять перестройку области нервно-мышечного контакта в контроле -при экспериментальном нарушении целостности спинного мозга. Остаются недостаточно изученными изменения, происходящие на уровне системы «двигательное окончание - мышечное волокно» скелетных мышц при экспериментальной травме спинного мозга с использованием современных гистохимических методов исследования.

Цель исследования - установить преобразования системы «двигательное окончание - мышечное волокно» мышц голени крысы при экспериментальной травме спинного мозга.

Задачи исследования:

1. Определить качественные и количественные характеристики системы «двигательное окончание — мышечное волокно» мышц голени интактной крысы.

2. Смоделировать левостороннюю гемисекцию спинного мозга крысы и описать изменения системы «двигательное окончание - мышечное волокно» мышц голени конечности травмированной стороны через 14 и 28 суток после травмы.

3. Провести сравнительный анализ гистохимических и морфометрических характеристик системы «двигательное окончание - мышечное волокно» мышц голени конечности травмированной стороны с контралатеральной конечностью и контрольными показателями.

Научная новизна. В ходе проведенного эксперимента получены данные о перестройке системы «двигательное окончание - мышечное волокно» икроножной, камбаловидной и передней болынеберцовой мышц животного при экспериментальной травме спинного мозга с использованием гистохимических методов. Полученные гистохимические и морфометрические данные о преобразовании системы «двигательное окончание - мышечное волокно» мышц конечности со стороны травмы при сравнительном анализе параметров мышц интактного животного и мышц контралатеральной конечности животных экспериментальных групп могут быть использованы в дальнейших исследованиях нервно-мышечной системы при восстановлении дефектов спинного мозга с применением стволовых клеток. Данные исследования могут представлять интерес для практической медицины (травматологии, неврологии), а также для теоретических дисциплин, рассматривающих вопросы нормальной и патологической морфологии периферической нервной системы и миологии. Знания о перестройках в системе «двигательное окончание - мышечное волокно» скелетных мышц после спинальной травмы могут быть экстраполированы на опорно-двигательный аппарат человека и учтены в постановке проблем экспериментальной медицины.

Научно-практическая ценности Настоящее исследование имеет отчетливую практическую направленность и расширяет представления о преобразованиях в системе «двигательное окончание — мышечное волокно» скелетных мышц конечностей после спинальной травмы. Полученные сведения позволяют выявить гистохимические и морфометрические изменения параметров двигательного нервного окончания и скелетного мышечного волокна после экспериментальной травмы спинного мозга и проводить сравнительный анализ полученных данных с параметрами мышц контралатеральной стороны и мышц контрольной группы животных. Это может быть использовано в клинической (травматология, ортопедия, неврология, спортивная медицина) и экспериментальной медицине, а также в лекциях, посвященных морфологии периферической нервной системы и скелетных мышц.

Данная работа выполняется в рамках Государственного контракта №02.512.11.2095 от 9.04.2007 г. Федерального агентства по науке и инновациям.

Положения, выносимые на защиту.

1. Система «двигательное окончание - мышечное волокно» икроножной, камбаловидной и передней болынеберцовой мышц интактной крысы в репродуктивном периоде постнатального онтогенеза характеризуется как общими, так и специфическими гистохимическими и морфометрическими признаками.

2. После экспериментальной травмы спинного мозга (левосторонней гемисек-ции) отмечаются достоверные морфометрические и гистохимические изменения области нервно-мышечного контакта как в мышцах конечности со стороны травмы, так и с контралатеральной стороны.

3. Общей закономерностью изменения метаболического профиля мышечных волокон изученных мышц после сшшальной травмы через 14 и 28 суток является смещение в сторону промежуточного, окислительно-гликолитического типа.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио-2006» (Ханты-Мансийск, 2006); на научном конгрессе «Бехтерев - основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность» (Казань, 2007); на заседании Удмуртского отделения ВНОАГЭ (Ижевск, 2008).

Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 работ в рецензируемых и прочих изданиях. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр гистологии и анатомии человека Ижевской государственной медицинской академии, кафедре анатомии человека Самарского государственного медицинского университета, кафедре анатомии человека Мордовского государственного университета

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материла и методов исследования», «Результатов собственных исследований», «Обсуждения полученных результатов», «Выводов» и «Списка литературы», включающего 68 отечественных и 150 зарубежных источников. Работа напечатана на 120 машинописных страницах, включает 8 таблиц, 2 гистограммы и 51 микрофотографию.

Материал и методы исследования

Объектом исследования служили икроножная, камбаловидная и передняя большеберцовая мышцы голени белой беспородной крысы. Выбор мышц объясняется их различным волоконным составом и удобством экспериментальной модели. Мыш-

цы исследованы у интакгных и экспериментальных животных в репродуктивном периоде постнатального онтогенеза (4 — 5 месяцев жизни) по периодизации В.И. Ма-хинько и В.Н. Никитина (1975). Возраст животного определялся по весу, согласно данным П.П. Гамбарян и Н.М. Дукельской (1955). Выбор возрастной группы животного объясняется тем, что система «двигательное окончание - мышечное волокно» в репродуктивном периоде онтогенеза находится в стадии стабилизации гистохимических и морфометрических параметров, характеризующих конкретную скелетную мышцу (Сабельников Н.Е., 2006).

В настоящей работе использовано 22 животных. Исследованы мышцы левой и правой конечностей интактных и экспериментальных крыс. Спинальная травма осуществлялась путем боковой левосторонней гемисекции спинного мозга на уровне нижних грудных сегментов. Эксперимент выполнен в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР №577 от 12.08.77 г. Для эксперимента использован эфирный наркоз с предварительной наркотизацией. Участок кожи выбривался, операционное поле обрабатывалось раствором йода. Послойно рассекалась кожа, фасции, мышцы. Удалялись дуги позвонков с левой стороны и открывался доступ в позвоночный канал. После травматизации спинного мозга путем рассечения его левой половины, ушивались мышцы. Область обрабатывалась раствором антибиотика, после чего кожа ушивалась и обрабатывалась раствором йода. Смертность после операции (в первые несколько суток после травмы) в экспериментальной группе животных составила 30%. Материал забирался через 14 и 28 суток после операции. Двигательная активность, особенно конечности со стороны травмы, первые 1 - 2 недели заметно снижена: крысы подволакивают задние конечности, нередко заваливаются на бок. После 2 -3 недель двигательная активность частично восстанавливалась, тем не менее, не достигая нормы, что проявлялось в нарушении координации движений и малой скорости передвижения травмированных крыс.

По современным представлениям (Basso M.D., 2000), тяжесть спинальной травмы может быть установлена двумя способами: по размеру раны и морфологическим изменениям в очаге поражения и по остаточным нарушениям двигательных функций. Через 14 и 28 суток после эксперимента в области травмы можно было видеть швы, дефекты со стороны кожи, фасций, мышц или позвоночного столба. При извлечении спинного мозга из позвоночного канала, в области травмы обнаруживаются спайки: спинной мозг с оболочками достаточно прочно срастается с позвоноч-

ным столбом, что затрудняет его извлечение. Макроскопически в области проведенной гемисекции с левой стороны определяется некоторый дефект нервной ткани. Нами были изготовлены поперечные срезы спинного мозга, взятые выше, на уровне и ниже проведенного пересечения. На малом увеличении (ок.х10, об.х8) нарушения типичного рисунка серого и белого вещества спинного мозга на участках выше и ниже травмы не определяется, контуры центрального канала без изменений. В области травмы на поперечных срезах спинного мозга через 14 и 28 суток после травмы определяется деформация очертаний центрального канала. С левой стороны наблюдается изменение размеров передних и задних рогов спинного мозга, уменьшение их размеров в сравнении с правой стороной. Можно видеть дефект белого вещества бокового канатика - уменьшение его размеров, изменение формы и истончение, вследствие чего с левой стороны на уровне бокового канатика отмечается некоторое углубление.

Для исследования преобразований системы «двигательное окончание — мышечное волокно» мышц голени в контрольной и экспериментальных группах использовались гистохимические методики по определению активности АХЭ в области НМС и активности СДГ в мышечных волокнах.

Определение активности АХЭ в области НМС. Согласно данным литературы (Филимонов В.И., 1992, 1998) о влиянии способа умерщвления животного на выявление ХЭ-активности, предварительно наркотизированных гексеналом животных декапитировали.

Для данного исследования использовалась методика выявления ХЭ в зоне НМС тиоуксусной кислотой в модификации Г.М. Николаева и В.В. Шилкина (1983). После забоя животного мышцы забирались через 30 минут, это время обеспечивало необходимую миорелаксацию. Материал фиксировался в течение 18-24 часов в охлажденном растворе 10% формалина (рН 6,8 - 7,0). Срезы, толщиной в 40 мкм, изготовлялись на замораживающем микротоме В дальнейшем срезы помещались на 15 - 18 минут в инкубационную среду, которая имела следующий состав: 0,1М цитратный буфер рН 6,2 - 20 мл,

0,5% раствор нитрата свинца - 0,5 мл,

тиоуксусная кислота - 0,03 мл.

После инкубации срезы промывались в дистиллированной воде в течение 1,0 -1,5 часов, а затем заключались в глицерин-желатин.

Полученные микропрепараты оценивали методами качественного и количественного анализа. Качественными критериями являлись: выраженность активности

ХЭ; характер отложения продукта реакции и топография ФАЗ НМС; наличие или отсутствие околосинаптической активности фермента; количество ФАЗ, приходящихся на одно MB. Количественный анализ проводился согласно принципам непрямой морфометрии (Автандилов Г.Г., 1990). В исследовании использовался микроскоп МБИ-3 с бинокулярной насадкой (1,5х, объектив 40х, окуляр 7х). Для подсчета использовалась окулярная сетка с равноудаленными узлами пересечения. Характеристика сетки:

- площадь сетки - 59040 мкм2,

- число узлов пересечения - 528,

- расстояние между линиями сетки (А) — 11,9 мкм,

- площадь, соответствующая одному узлу пересечения - 111,9 мкм2.

- длина стороны сетки (L) - 246 мкм.

На стандартной площади среза мышцы, ограниченной сторонами сетки («накиде»), определялись следующие показатели:

- общее количество ФАЗ НМС,

- количество НМС с простой конструкцией ФАЗ,

- количество НМС со сложной конструкцией ФАЗ,

- количество MB.

Обработка данных производилась по оригинальной методике, разработанной и апробированной в ЯГМА (Шилкин В.В с соавт., 1992; Филимонов В.И., 1998). Мор-фометрия области НМС заключалась в определении количества узлов пересечения сетки, падающих на область НМС (для простых и сложных форм ФАЗ НМС); количества узлов пересечения сетки, падающих на ФАЗ НМС (для сложных форм ФАЗ НМС). Определялось также количество MB в «накиде». Результаты заносились в протокол отдельно по каждому «накиду». В зависимости от группы животных и изучаемой мышцы 300 объектов (ФАЗ НМС), описываемых для каждой мышцы, размещались в среднем 70 - 90 «накидах». Далее определялись средние показатели по каждому «накиду» отдельно.

Преобразование относительных единиц в общепринятые стандартные единицы измерения производили по формулам:

1. Площадь сечения области НМС (для простых и сложных форм ФАЗ) и площадь ФАЗ НМС со сложной конструкцией (мкм2) - ^SxA'îmkm2); где Х- количество узлов пересечений сетки, падающих на область НМС; S мкм2 - площадь, соответствующая одному узлу пересечения сетки.

2. Диаметр MB рассчитывался по формуле (мкм): &=Н£мв, где L - длина стороны сетки, Ym» - количество MB па площади среза, ограниченной сеткой.

Определялись следующие производные от первичных данных:

1. Отношение площади сечения сложной ФАЗ к площади сечения области НМС (доля ФАЗ на площади сечения области НМС, S^u/S,^);

2. Совокупное количество ФАЗ в расчете на 1 MB - ZHMC/MB и совокупная площадь сечений ФАЗ в расчете на 1 MB (мкм2) - ZS^^/mb. Эти показатели позволяют характеризовать систему «двигательное окончание - мышечное волокно».

Полученные данные по отдельным «накидам» суммировались для получения средних значений показателей изученных 300 объектов. Статистическая обработка данных, с соблюдением принципов медико-биологической статистики (Гланц С., 1999), включала нахождение средних значений каждого параметра, коэффициента репрезентативности, t-критерия Стьюдента, учитывался 95% доверительный интервал для разности. Анализ проводился с использованием программ Microsoft Excel '97 и Primer of Biostatistics V4.03.

Выявление активности СДГ в мышечных волокнах. Активность СДГ определялась методом с нитросиним тетразолием (Пирс А., 1962). Криостатные срезы толщиной 12 мкм подсушивали на предметных стеклах и помещали в инкубационную среду следующего состава: в 5 мл 0,1 M фосфатного буфера с рН 7,5 растворяли 5 мг нитросинего тетразолия и 13,5 мг сукцината натрия. Инкубация проводилась в течение 30 - 60 минут при 37'С. Далее срезы отмывали большим количеством дистиллированной воды, высушивали и заключали под покровные стекла в глицерин-желатин. В каждой мышце обсчитывали не менее 400 мышечных волокон.

Микрофотосъемка цифровой камерой Cannon с разрешением снимков 180 пикселей выполнялась на микроскопе МБИ-3, объектив 40*, окуляр 5* для методики с определением АХЭ и объектив 10х, окуляр 5х для определения СДГ. Полученные снимки обрабатывались в Adobe Photoshop CS2, версия 9.0. При обработке микроснимков допускалась умеренная балансировка яркости-контраста.

Результаты исследования и их обсуждение

Известно, что ФАЗ НМС скелетных мышц млекопитающих, имеющих различное происхождение, характеризуются общими чертами организации (Филимонов В.И., 1992, 1998; Шилкин В.В., Филимонов В.И., 1997; Сабельников Н.Е., 2000, 2006). Так, у половозрелой белой крысы ФАЗ НМС мышц голени имеет как общие, так и

специфические характеристики (Филимонов В.И., 1998) К общим признакам относятся высокий уровень активности ХЭ, четкая локализация ХЭ в области НМС, наличие в каждой мышце двух основных форм ФАЗ - простой и сложной. Простые характеризуются гомогенной локализацией мелкодисперстного конечного продукта реакции, сложные имеют трабекулярнуго конструкцию, ограничивающую ФНЗ Связь структурной организации ФАЗ НМС с делением мышц на красные, белые и смешанные автор прослеживает только в их крайних вариантах: в красной камбаловидной мышце определен низкий процент сложных ФАЗ, в белой подошвенной, как и в смешанной икроножной мышце преобладают сложные ФАЗ. Выявленные конструктивные особенности ФАЗ НМС имели определенную связь с функциональным делением мышц на быстрые и медленные: в медленной камбаловидной мышце преобладали простые ФАЗ, сложные имели незамкнутый контур и четкообразные трабекулы. Мышцу отличает наличие мелких округлых гомогенных ФАЗ, обозначаемых автором как глобулы ферментативной активности. В быстрых мышцах преобладали замкнутые сложные ФАЗ с равномерными по толщине трабекулами Эти данные сопоставимы с полученными нами качественными характеристиками ФАЗ НМС икроножной, камбаловидной и передней большеберцовой мышцы.

По нашим данным, по своему метаболическому профилю икроножная мышца интактной половозрелой крысы является гликолитической, камбаловидная - оксида-тивно-гликолитической с заметной долей гликолитических МВ, передняя большебер-цовая - гликолитической мышцей. По данным литературы (Валиуллин В.В., 1996), икроножная и передняя большеберцовая мышцы являются быстрыми (в МВ преобладает быстрый миозин), а камбаловидная - медленной (с преобладанием в МВ медленного миозина) мышцами.

Проявление активности АХЭ в области НМС мышц голени контрольной и экспериментальной групп животных имеет общие черты. Во всех исследуемых мышцах область НМС характеризуется насыщенной коричневой окраской, четкими границами локализации и мелкодисперстиым характером ФАЗ. Для получения насыщенной коричневой окраски конечного продукта гистохимической реакции для икроножной и передней большеберцовой мышцы крыс контрольной и экспериментальных групп требовалось около 20 минут инкубации в рабочем растворе. Для окрашивания ФАЗ НМС камбаловидной мышцы интактной крысы требовалось около 50 минут инкубации, после спинальной травмы (через 14 и 28 суток) время увеличивалось до 1 часа 20 минут, что указывает на сравнительно низкую активность АХЭ в камбаловидной

мышце как интактного животного, так и при экспериментальной травме. При отсутствии в области НМС ФНЗ конструкция относилась к простым формам, имеющим гомогенную ФАЗ. При наличии ФНЗ в области НМС конструкция описывалась как сложная. Сложная ФАЗ НМС может иметь трабекулярный характер локализации активности фермента с замкнутым или разорванным контуром и формированием дополнительных трабекул. Другой вид сложных ФАЗ НМС характеризуется глобулярным типом распределения ХЭ-позитивных участков: глобулы, имеющие различные формы и размеры, перемежаются ХЭ-негативными участками без определенных очертаний. Во всех изученных мышцах встречались и переходные формы. Ряд из них представляется простыми конструкциями с формированием некоторого центрального просветления - образование ФНЗ и усложнение конструкции. У некоторых гомогенных ФАЗ наблюдалось формирование дополнительных боковых трабекул, которые ограничивали некоторую ФНЗ. Тем не менее, все переходные формы можно отнести к одной из основных двух - простой гомогенной или сложной трабекулярной.

В области ряда ФАЗ НМС отмечается неравномерное снижение ферментативной активности. Данные особенности более характерны для сложных конструкций, но иногда обнаруживаются и в области НМС с простым строением ФАЗ. Можно обнаружить сложные трабекулярные конструкции с изменением характера трабекул. При этом отмечается истончение трабекул ФАЗ с увеличением ФНЗ. Иногда, при изменении тинкториальных свойств области НМС, формируются четкообразные и глобулярные трабекулы. Помимо преобразований ФАЗ НМС, на одном МВ можно выявить две конструкции или появление малых гомогенных глобул на некотором расстоянии от основной ФАЗ, которые являются отражением процесса спраутинга.

В изученных нами мышцах специфическими признаками явились распределение конечного продукта реакции в области НМС со сложными ФАЗ по типу трабеку-лярных {для икроножной и передней большеберцовой мышц) или глобулярных (для камбаловидной мышцы) сложных конструкций, характеризующих каждую мышцу, а также преобладание в мышце МВ определенного метаболического профиля. Данные качественные параметры определяют морфометрические характеристики системы «двигательное окончание - мышечное волокно».

Топография двигательных окончаний исчерченных мышц начинает определяться к моменту рождения и окончательно устанавливается к предпубертатному периоду онтогенеза, с последующим незначительным изменением (Сабельников Н.Е.,

2006). В коде проведенного нами исследования на фоне экспериментальной травмы изменений гистотопографии НМС в изученных мышцах не обнаружено.

Во всех изученных нами мышцах интактного животного преобладают сложные ФАЗ НМС, составляющие около 2/3 от всех НМС. Наибольшей площадью отличаются сложные ФАЗ НМС икроножной мышцы, наименьшей - передней большеберцовой мышцы. Соотношение площади ФАЗ к площади всего НМС, указывающее на выраженность ФНЗ, свидетельствует о наибольшей площади ХЭ-негативных участков в камбаловидной мышце, что связано с преобладанием глобулярных сложных ФАЗ НМС. Наибольший диаметр MB также отмечается в камбаловидной мышце, наименьший диаметр MB характеризует переднюю большеберцовую мышцу. При этом совокупное количество НМС, приходящихся на одно MB, отражающее степень ин-нервированности волокна, имеет обратное соотношение. О степени иннервированно-сти MB также свидетельствует совокупная площадь НМС, приходящаяся на одно MB.

При проведении эксперимента мы использовали левостороннюю гемисекцию спинного мозга. Определено, что восстановление локомоций конечности со стороны травмы при гемисекции спинного мозга происходит постепенно в течение приблизительно одного месяца (Basso D.M, Murray М., Goldberger М.Е., 1994). Это подтверждается и нашими наблюдениями. При повреждении спинного мозга преобразования на уровне морфо-функциональной системы «двигательное окончание - мышечное волокно» нужно оценивать с позиции деэфферентации и деафферентации MB, а также нарушения двигательной активности мышц задней конечности, протекающих по типу гипокинезии и, возможно, иммобилизации, с частичным восстановлением функций к концу 1-го месяца после сгшнальной травмы.

Сопоставление результатов вентральной ризотомии и ТСМ со смешанной денерва-цией мышцы путем иссечения седалищного нерва показывало отсутствие принципиальных отличий реакции ФАЗ НМС в этих сериях (В.И. Филимонов, 1998) Отмечается прогрессирующая атрофия MB, снижение активности АХЭ в области НМС, непропорциональное уменьшение площади сечения ФАЗ и области НМС, преобладание гомогенных форм ХЭ-позитивной зоны, истончение и фрагментация трабекул сложных ФАЗ, изменение тинкториальных свойств НМС. В настоящем исследовании отмечается изменение соотношения доли простых ФАЗ НМС (гистограмма 1).

Гистограмма 1

Соотношение простых и сложных ФАЗ НМС мышц голени у интактных и спинальных животных

Распределение простых и сложных ФАЗ НМС в икроножной мышце

.1 2 3 4 5-,

Группы животных

Распределение простых и сложных ФАЗ НМС ь камбаловидной мышце

Группы животных

Распределекие простых н сложных ФАЗ НМС большеберцовой мышце в передней

О".100

80 /

з« 60 - ■ в% сложных О'Й гростых

.40 # \ • >

.20- 37,03 32,92 32,03 И,1< эогё

Г 2. 3 Группы животных 4 5

Примечание: группы животных: I - контроль; 2 - 5 - спинальная травма: 2 — 14 суток (сторона травмы); 3-14 суток (контралатеральная сторона); 4-28 суток (сторона травмы); 5-28 суток (контралатеральная сторона).

Во всех случаях, за исключением камбаловидной мышцы, где через 2 недели после спинальной травмы в мышцах обеих конечностях и икроножной мышце, где через месяц после ТСМ в мышце травмированной стороны отмечается увеличение доли простых ФАЗ НМС, можно видеть уменьшение доли гомогенных конструкций в сравнении с контролем. Эти данные несколько отличаются от данных В.И. Филимонова. Указанное несоответствие данных можно объяснить тем, что к концу 2-4 недели после гемисекции спинного мозга в изученных мышцах преобладают дегенеративные изменения ФАЗ НМС со сложными конструкциями, ведущими к их элиминации. Описанные авторами (Филимонов В.И, 1992, 1998; Шилкин В.В., Филимонов В.И., 1997) явления неспецифической реакции области НМС на внешнее воздействие, которое заключается в гипертрофии трабекул с трансформацией сложной конструкции в гомогенную, к этому посттравматическому этапу уже заканчиваются. Исключением, по-видимому, является камбаловидная мышца, значительно отличающаяся от остальных по составу MB. Отмечаемые же в мышцах и нарастающие регенеративные процессы, заключающиеся в частности в появлении НМС de novo за счет спраутинга, находят отражение в показателях икроножной мышцы через 28 суток после травмы. Эти процессы характерны в целом для peí е-нерации ХЭ-позитивных зон НМС в денервированной мышце, регенерация идет как за счет увеличения активности и гипертрофии сохранившихся ФАЗ, в первую очередь гомогенных конструкций, так и за счет образования новых, с глобулярным характером активности АХЭ.

Полученные данные о качественных и морфометрических преобразованиях системы «двигательное окончание - мышечное волокно» сопоставимы с процессами, описанными на уровне НМС рядом исследователей. Прогрессирующая деструкция ФАЗ НМС, элиминация части из них при отсутствии восстановления связей с мотонейроном свидетельствуют о необратимости постденервационных процессов. В поздние сроки - от 1,5 до 5-ти месяцев - преобладают деструктивные перестройки: неравномерное снижете активности АХЭ, истончение, фрагментация и редукция трабекул, крупнозернистый характер конечного продукта реакции, около-и внесинаптическая гранулярная активность фермента, уменьшение размера ФАЗ и увеличение ФНЗ. Как отмечается, уменьшение числа и совокупной площади ФАЗ, приходящихся на одно MB, свидетельствуют о дефиците иннервации и деструк-

тивном характере изменений ХЭ-позитивной зоны НМС. В нашем исследовании отмечены сходные качественные изменения области НМС, однако имеется ряд особенностей морфометрических параметров системы «двигательное окончание — мышечное волокно», что можно объяснить сложностью процессов, протекающих в мышцах задних конечностей, как травмированной, так и контралатеральной стороны на фоне ТСМ. Нами отмечено достоверное снижение степени иннервированно-сти МВ икроножной мышцы, подтверждаемое снижением показателя совокупной площади ФАЗ НМС, приходящейся на одно МВ, в то время как данный показатель в камбаловидной и передней болыиеберцовой мышцах заметно уменьшается только к 28-м суткам эксперимента. Увеличение степени иннервированности МВ в камбаловидной и передней болыиеберцовой мышце к концу 2-ой недели после травмы имеет разные причины. В камбаловидной мышце наряду с увеличением совокупной площади ФАЗ НМС, приходящейся на одно МВ, также увеличивается количество двигательных окончаний в расчете на одно волокно, а также увеличивается количество гомогенных конструкций ФАЗ. Заметно возрастает и площадь сечения как простых, так и сложных ФАЗ НМС. Это указывает на задержку неспецифических ответных процессов, происходящих на уровне НМС. В передней большеберцовой мышце, напротив, наблюдается уменьшение доли простых ФАЗ НМС, также как и количества НМС, приходящихся на одно МВ. Однако, особенно в мышцах конечности травмированной стороны, отмечается увеличение площади сечения сложных ФАЗ НМС одновременно с увеличением площади ФНЗ, что указывает на преобладание дегенеративных изменений сложных ФАЗ НМС.

Изменения НМС при денервации, деафферентации, десимпатизации и ТСМ в целом аналогичны и характерны для интактных мышц животных более старших возрастных групп. Начиная с пубертатного и в последующих возрастных периодах (репродуктивный - 6 месяцев; период первой зрелости - 12 месяцев) в мышце можно видеть признаки естественной возрастной дегенерации, заключающейся в изменении организации трабекул сложных ФАЗ: их четкообразный характер, истончение, увеличение ФНЗ, приводящие в последующем (на втором году жизни - вторая зрелость (18 месяцев) и предстарческий период (24 месяца)) к фрагментации сложных конструкций, снижению активности АХЭ и разрушению ФАЗ НМС. Одновременно с процессами возрастной дегенерации в мышце наблюдаются естественные возрастные реге-

неративные процессы. Они проявляются в усложнении гомогенных ФАЗ за счет формирования боковых ответвлений, приводящих к замыканию некоторой ФНЗ или образования в центре конструкции некоторого ХЭ-негативного просветления. Помимо этого, во второй половине 1-го года и на 2-ом году жизни в мышце обнаруживается спраутинг, маркером которого являются гомогенные глобулы с высокой активностью АХЭ. В дальнейшем гомогенные глобулы увеличиваются в размерах, усложняются за счет появления ХЭ-негативного участка или боковых «выростов» - то есть, наблюдается формирование новых НМС (Сабельников Н.Е., 2006). Изменения в системе «двигательное окончание - мышечное волокно» мышц животных экспериментальных групп отражают инволютивную денервацию мышцы (Филимонов В.И., 1998; Коври-нина Т.Р., Филимонов В.И., Шилкин В.В., 2000). Одной из причин перестройки конструкции НМС может являться сглаживание метаболического профиля скелетных мышц в изучаемых моделях.

Таким образом, качественные критерии дистрофического процесса существенно не меняются в зависимости от причины, вызвавшей нарушение иннервации, и при гистохимических реакциях на ХЭ характеризуются снижением активности фермента, дезорганизацией и фрагментацией конструкции ФАЗ, частичной гомогенизацией. В общем, однотипные картины описываются после пересечения нерва, раздавливания его зажимом, повреждения спинного мозга. Частичная иммобилизация камбаловид-ной мышцы крысы вызывает мышечную атрофию, а также явления денервации (разрывы нервных терминалей, появление постсинаптических зон с малым количеством или отсутствием складок) и регенерации (образование мелких нервных терминалей в сочетании с широким распространением постсинаптических складок) в НМС, приводящие к спраутингу нервных терминалей в зоне концевых пластинок и перестройке последних (Fahim М.А., 1989).

Помимо качественных и морфометрических преобразований области НМС, в мышцах животных экспериментальных групп наблюдается изменение качественного состава MB (гистограмма 2).

Факторы, регулирующие фенотипы скелетных мышц, многочисленны (нейро-нальная, гуморальная и др.). Нарушение любой из систем регуляции приводит к изменениям фенотипа мышцы, затрагивающие как морфологические, так и функциональные свойства (Валиуллин В.В., 1996; Валиуллин В.В., Исламов P.P., Чуйков В.М.,

2001; Исламов Р.Р., 2004 и др.). Так, Н.П. Резвяков (1973, 1982) после денервации белой мышцы крысы выявил уменьшение количества быстрых МВ и изменение спектра ЛДГ в сторону увеличения доли анаэробных изоферментов ЛДГ, реиннервация приводила к исходному состоянию мышцы.

В настоящем исследовании наибольшие изменения состава МВ, определяемые по активности СДГ - маркера цикла Кребса, позволяющего сделать вывод о метаболизме МВ и степени утомляемости мышцы в целом, наблюдаются в камбаловидной мышце. Во всех экспериментальных группах животных в мышцах исчезают гликоли-тические волокна типа А и значительно увеличивается процентное содержание окси-дативно-гликолитических волокон промежуточного типа. Икроножная и передняя большеберцовая мышцы, хотя и не столь ярко, характеризуются теми же процессами - уменьшением доли гликолитических волокон на фоне увеличения процентного содержания оксидативно-гликолитических и оксидативных МВ. Несколько отличается распределение МВ в икроножной мышце контралатеральной стороны через 14 и 28 суток после спинальной травмы, что может указывать на ее большие адаптационные возможности в сравнении с камбаловидной и передней болынеберцовой мышцами. В целом, указанные изменения в составе МВ изученных мышц отражают процесс адаптации мышцы как органа к изменившейся нейротрофической регуляции на фоне спинальной травмы.

Таким образом, проведенное исследование системы «двигательное окончание — мышечное волокно» скелетных мышц голени на фоне экспериментальной травмы спинного мозга, моделированной левосторонней гемисекцией на уровне нижних грудных сегментов, позволяет соотнести полученные результаты с преобразованием области нервно-мышечного контакта под влиянием различных факторов и заключающихся в изменении выраженности активности АХЭ, изменении выявляемости ФАЗ НМС, изменении конструкции сложных ФАЗ, трансформации сложных ФАЗ в простые, а простых в сложные, изменении морфометрических параметров системы «двигательное окончание - мышечное волокно», увеличении числа переходных конструкций, изменении тинкториальных свойств ФАЗ и МВ. Полученные результаты открывают перспективу проведения дальнейшей оценки системы «двигательное окончание - мышечное волокно» скелетных мышц при спинальной травме на фоне восстановительной терапии с использованием стволовых клеток.

Гистограмма 2 Соотношение мышечных волокон различных типов | мышцах голени у интактных и спинальных животных

Распределение пиши мышачнынеопоконго активности СДГ в икроножной мышце

■ 2 ""■■ ' -

футвш жмеотыя

Рагарадатоние щпои иышечмыя волокон по актианоетк СДГ а каийниювиддаэй мышце

'' - " 'л' ■ - '

3 4

групгаи жкаожык

Распределение типов мышечных волокон по активности СДГ к передней бопыяеберцоеой млНце

Группы жкаопши

Примечание: группы животных: 1 - контроль; 2 - 5 - социальная травма: 2 - 14 суток (сторона травмы); 3-14 суток (контралатеральная сторона); 4-28 суток (сторона травмы); 5 — 28 суток (контралатеральная сторона).

Выводы

1. Система «двигательное окончание - мышечное волокно» икроножной, камбало-видной и передней большеберцовой мышц крыс контрольной и экспериментальных групп в репродуктивном периоде характеризуется как общими, так и специфическими гистохимическими и морфометрическими признаками.

2. К общим признакам относятся четкие границы, мелкодисперсный характер конечного продукта реакции и отсутствие вне- и околосинаптической активности ацетилхолинэстеразы в области нейромышечного синапса; распределение фермен-тоактивньгх зон нейромышечных синапсов на простые и сложные формы; наличие переходных форм, которые можно отнести к простым или сложным конструкциям.

3. К специфическим признакам, характеризующим конкретную мышцу, относятся преобладание трабекулярных или глобулярных сложных ферментоакгивных зон нейромышечных синапсов; преобладание мышечных волокон определенного метаболического профиля; морфометрические параметры нейромышечного синапса, мышечного волокна и степени иннервированности.

4. Вследствие моделирования спинальной травмы во всех изученных мышцах конечности как травмированной стороны, так и контралатеральной конечности через 2 и 4 недели после травмы отмечается общая тенденция изменения метаболического профиля мышечных волокон, заключающаяся в смещении метаболизма от гликоли-тического к оксидативному и, в большей степени, к окислителько-гликолитическому.

5. Во всех изученных мышцах после травмы в области нейромышечных синапсов нарастают дегенеративные изменения, что особенно проявляется в мышцах конечности травмированной стороны. Дегенеративные процессы заключаются в изменении характера отложения конечного продукта гистохимической реакции в области нейромышечных синапсов с простыми и сложными ферментоактивными зонами, уменьшении морфометрических показателей нейромышечных синапсов и достоверное снижение степени иннервированности мышечного волокна. Указанные процессы нарастают к концу 4-ой недели эксперимента.

6. В мышцах голени на фоне спинальной травмы через 2 и 4 недели усиливаются, в сравнении с контролем, регенеративные процессы. Регенерация области нейромышечного синапса заключается в появлении новых сложных ферментоактивных зон нейромышечных синапсов за счет трансформации в сложные ранее сформированных простых конструкций и усиления спраутинга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Рецензируемые издания

1. Скаков, В.Н. Гистохимическая характеристика области нейромышечного синапса мышц бедра половозрелой крысы / В.Н. Скаков // Морфологические ведомости. -

2006. -№3-4. -С.58.

2. Скаков, В.Н. Гистохимическая характеристика системы «двигательное окончание -мышечное волокно» некоторых скелетных мышц задней конечности белой крысы в репродуктивном периоде онтогенеза / В.Н. Скаков // Морфологические ведомости. -

2007. -№1-2. -С. 124-126.

3. Глушкова, Т.Г. Некоторые вопросы определения, расположения и развития стволовых клеггок (обзор) / Т.Г. Глушкова, Э.С. Паутов, В.Н. Скаков, и др. // Морфологические ведомости. -2007. -№1-2. -С.275-278.

4. Скаков, В.Н. Гистохимические изменения в области кейромышечных синапсов камбаловидной мышцы крысы на фоне спинальной травмы / В.Н. Скаков, Э.С. Паутов, Н.Е. Сабельников, и др.// Морфологические ведомости. -2007. -№3-4. -С.281-282.

5. Морозов, В.И. Возможности естественной возрастной регенерации области нейро-мышечных синапсов скелетных мышц крысы / В.И. Морозов, В.Н. Скаков, Э.С. Паутов, и др. // «Материалы научного конгресса «Бехтерев — основоположник нейронаук: творческое наследие, история и современность»: приложение к журналу: Неврологический вестник: журнал им. В.М. Бехтерева. -2007.-Т.39, вып.1. -С.186.

6. Чучков, В.М. К вопросу о двигательной иннервации скелетных мышц / В.М. Чуйков, В.Н. Скаков, Т.Г. Глушкова, и др. // Морфология. -2008. -Т. 133, -№3. -С. 119.

Прочие издания

7. Скаков, В.Н. Преобразования системы «двигательное окончание - мышечное волокно» некоторых мышц задней конечности интактной белой крысы в постнатальном онтогенезе / В.Н. Скаков, Н.Е. Сабельников, В.М. Чучков // Ученые записки Ульяновского гос. универ. Серия Биология. Вып. 1 (10). -Ульяновск, 2006. -С.65-70.

8. Чучков, В.М. Преобразования системы «двигательное окончание - мышечное волокно» скелетной мышцы в постнатальном онтогенезе / В.М. Чучков, Н.Е. Сабельников, В.Н. Скаков // Научный вестник Ханты-мансийского гос. мед. института. -2006. -№2.-С. 110-111.

9. Скаков, В.Н. Пластичность области нервно-мышечного соединения скелетных мышц крысы в норме и в эксперименте / В.Н. Скаков, Э.С. Паутов, Н.Е. Сабельников, В.М. Чучков И Астраханский медицинский журнал. -2007. -№2. -С.170-171.

10. Паутов, Э.С. Перспективы использования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в лечении травмы спинного мозга (обзор) / Э.С. Паутов, Т.Г. Глушкова, С.П. Селякин, и др. // Материалы V Российской научной конференции «Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения». -Уфа, 2007. -С.137-143.

Принятые сокращения:

АХЭ - ацетилхолинэстераза

МВ - мышечное волокно

нмс - нейромышечный синапс

сдг - сукцинатдегидрогеназа

тем - травма спинного мозга

ФАЗ - ферментоактивная зона

ФНЗ - ферментонегативная зона

хэ - холинэстераза

Формат 60x90/16 Бумага офсетная Гарнитура шрифта Тайме. Усл.печ.л. 3,89. Тираж 100 экз.

Издательство ООО «Стерх» г. Сочи, ул. Тимирязева, 10