Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Патоморфология раневого процесса в зоне кожи в условиях применения низкоинтенсивного электромагнитного излучения

Актуальность темы. Термические ожоги кожных покровов занимают видное место в структуре бытового и производственного травматизма. Технический прогресс не только не привел к снижению числа ожоговых травм, наоборот, частота термических поражений и летальность среди обожженных имеют явную тенденцию к росту1 {Алексеев А.Л. и соавт., 2000, 2006; Щегонев А.И, и соавт., 2002). Ожоги нередко сопровождают техногенные катастрофы и военные конфликты. Количество ожогов, полученных в быту, также не уменьшается (Герасимова Л.И., 2000).

В нашей стране ежегодно получают ожоги более 400 тысяч человек, hi них 30-35% составляют дети до 14 лет - «золотой фонд» и будущее нации (Азолов В.В. и соавт., 2001), Общепризнанно, что наибольшую опасность для жизни представляют обширные глубокие ожоги, сопровождающиеся развитием тяжелой ожоговой болезни. Поэтому традиционно внимание в комбустиологнн уделяется этой проблеме. Однако в настоящее время отмечается прогрессивный рост локальных глубоких ожогов, при которых зона поражения не превышает 30% поверхности тела. Удельный вес этой категории пострадавших увеличился за последние 30 лет вдвое и достиг 60 % от общего числа находящихся на стационарном лечении (Жегалов В.А. и соавт., 2001). Реабилитация таких больных представляет собой серьезную медико-социальную проблему, значение которой с каждым годом возрастает. Эти ожоги, особенно если они располагался в области лица, шеи, кистей, стоп, крупных суставов, нередко приводят к тяжелым функциональным и/нлн эстетически м дефекгам вплоть до инвалиднзацни пациентов (Внхрнев Б.С., Бурмистров В.М., 1986; Парамонов Б.А. и соавт., 2000).

Одной и~4 основных проблем лечения пострадавших от ожогон на протяжении всей истории развития комбустиологнн является своевременность и полнота восстановления кожных покровов, утраченных в результате ожоговой травмы. От этого во многом зависят характер течения и исход периода рсконвалесценцни. а, значит, н качество жизни пострадавших. Не менее важной проблемой является профилактика нослеожоговых рубцов. Используемые а этой снят наиболее распространенные в России консервативные методы оказываются зачастую недостаточно эффективными (Туманов В.П. 2004; Островский Н.В., 2006).

В связи с вышеизложенным разработка новых и совершенствование существующих консервативных, в том числе физиотерапевтических, методов. направленных на профилактику образования грубых обезображивающих рубцов при глубоких ожогах кожных покровов» является весьма актуальным.

Цель исследования Экспериментально-Морфологическое обоснование применения НЭМИ а комплексном лечении ограниченного глубокого термического ожога кожи.

Задачи исследовании:

1, Разработать модель получения унифицированной ограниченной ожоговой раны III Б степени у крыс н проанализировать влияние экспериментального коагуляционного некроза кожи на организм животного

2, In vivo в эксперименте на крысах с помощью комплекса морфологических, в том числе анторадиографнческого. морфометричсскнх и биохимических методов исследовать в динамике влияние ннзкоинтенейвногс электромагнитного излучения в комплексе с медикаментозной терапией на характер репаративных процессов в области ожоговой раны и сравнить с результатами только медикаментозной терапии.

3, Оценить на орган изменном, органном н тканевом уровнях степень обшей реакции организма у крыс я динамике при комплексном лечении ожоговой раны в различных сериях эксперимента. In vitro изучить прямое воздействие НЭМИ на морфофункцнональное состояние дермадышх фибробластов а культуре и дать оценку их пролифератнвиой н коллагенсинтетической функции при воздействии НЭМИ и без него.

Научная новизна. Впервые предложен и разработан новый экснериментальный метод моделирования ожога кожи III Б степени (удостоверение на рационализаторское предложение Хз 400 от 07.04.2004г.)- Необходимая степень повреждения тканей строго согласуется с дозой теплового воздействия, что позволяет получать унифицированную по площади и глубине ожоговую рану.

Впервые с помощью морфологических, в том числе пвтораднографического, ыорфометрического, и биохимических методов в эксперименте in vivo и in vitro обоснована эффективность применения НЭМИ в комплексном лечении глубокой ожоговой раны. Доказан противовоспалительный эффект НЭМИ и оптимизирующее влияние его на течение репаративных процессов в области коагуляцнониого некроза кожи с предотвращением избыточной выработки фибриллярного коллагена.

Экспериментальные исследования, проведенные на оригинальной модели ограниченного глубокого ожога кожи, подтвердили анальгеэнрующнй эффект НЭМИ, позитивное действие его на общее состояние и некоторые показатели гомеостаза обожженного животного.

Разработанный в ЦНИЛ СамГМУ новый алшритм оценки морфофункциоиального состояния меха попито в (фибробластов), основанный на морфологическом исследовании клеток монослоя н биохимическом анализе маркеров коллагена а культуральной среде (Патент № 2281513 РФ, 2006), позволил впервые установить факт н раскрыть механизм непосредственного действия НЭМИ на жизнеспособность, пролнферативиую и коллагснсннтетнческую функции малоднфференцированных клеток соединительной ткани наружных покровов организма.

Установлено, что НЭМИ оказывает стимулирующее действие на процессы размножения дермальных фибробластов с одновременным снижением их коллагенсинтетической функции. При этом усиление пролиферации после воздействия НЭМИ происходит за счет того, что часть клеток погибает, в результате чего в культуральную среду выходят биологически активные вещества, активизирующие Эту функцию клеток

Патент РФ «Способ стимуляции роста фибробластов» № 2287013 от 10.11.2006).

Практическая значимость. Предложенный нами метод моделирования локального термического ожога кожи позволяет получить в эксперименте у животных ожоговые раны, одинаковые по глубине и площади поражения. Метод прост в исполнении н воспроизводим с достаточно высокой точностью.

Результаты проведенных доклинических испытаний на живых системах, показавшие выраженное положительное действие на общее состояние н гомеостлз обожженных, а так же на процессы регенерации в области ограниченной ожоговой раны, позволяют рекомендовать включение этого физиотерапевтического фактора в комплекс лечебных мероприятий при локальных глубоких термических ожогах кожи.

Алгоритм исследования НЭМИ на культуре дермальных фибробластов, включающий анализ структурных особенностей моиослоя и определение маркеров коллагена в культуральной среде, может быть использован для всестороннего изучения прямого действия других физических, химических и биологических факторов на коллагенсинтезнрующие клетки соединительной ткани (механоциты).

Основные положении, выносимые на защиту. Разработанный способ моделирования локального термического ожога кожных покровов позволяет воспроизводить о эксперименте унифицированные ожоговые раны, сгрого дозированные по глубине и площади,

Глубокий коагуляционный некроз (ожоговые раны III Б степени), занимающий 6 % площади поверхности тела крысы, при отсутствии лечения приводят к гибели всех животных в течение первых 10 суток эксперимента.

Стандартная мазевая терапия сохраняет жизнь обожженным крысам, способствует полному заживлению ожоговых ран, но не предотвращает образование грубых обширных келондных рубцов.

Использование НЭМИ в комплексе лечебных мероприятий улучшает общее состояния животного, способствует ослаблению экссудата в ной фазы н зоне ограниченного термического ожога Ш Б степени н нормализации пролнферативиой фазы» результате чего формируется мягкий подвижный рубец с сетчатым расположением тонких пучков коллагеновых волокон и восстановлением структурных элементов кожн.

Исследования in vitro на культуре клеток дермальных фибробластов позволили раскрыть механизм непосредственного действия НЭМИ на морфофункцнональное состояние коллагененнтезнрующнх клеток.

Апробации работы. Материалы диссертации доложены на 12Л Internationa] congress of Uie European Association of Tissue Banking (Belgium, Brugge, November, 2003); на конференции «Теория и практика клеточных биотехнологий», проходившей в рамках ЕЕ Всероссийского симпозиума с между народным участием «Клинические и фундаментальные аспекты клеточных и тканевых биотехнологий (Самара, нюнь 2004); на Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, сентябрь 2006); на Поволжском форуме по восстановительной медицине, курортологии и физиотерапии (Самара, октябрь 2006), Диссертация апробирована на совместном заседании ЦНИЛ, кафедры патологической анатомии и кафедры гистологии и эмбриологии ГОУ ВГТО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава». Предзащита состоялась в ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава» на совместном заседании кафедр патологической анатомии, гистологии и судебной медицины

Публикации. По теме диссертации опубликованы б печатных работ, 2 из них - в журналах, рекомендованных ВАК. Получены I удостоверение на рационализаторское предложение «Способ моделирования ожога» № 400 от 7.04.2004 и патент Российской федерации «Способ стимуляции роста фибробластов в культуре» № 2287013 от 10. II .06.

Внедрение результатов исследовании. Основные результаты диссертационного исследования были внедрены к Ожоговые центры городской больницы №7 г. Саратова н городской больницы >'?! им, Н.И, Пкроговэ г. Самары, в учебный процесс кафедр патологической анатомии, восстановительной медицины, курортологии и фитотерапии НПО, общей хирургии с курсом оперативной хирургии и ЦИКЛ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росэлрава» и подтверждены актами внедрения.

Объем и структура диссертации. Диссертация наложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 213 источников, в том числе 47 зарубежных, Диссертация иллюстрирована 16 таблицами, 55 рисунками.

112 ВЫВОДЫ

1. Предложенный и разработанный нами простой способ моделирования термического ожога кожи позволяет получать унифицированные ожоговые раны, строго дозированные по площади и глубине. Коагуляцнонный некроз всех слоев кожн (ожог Ш Б степени), занимающий 6% плошали кожного покрова крыс без лечения вызывает тяжелые нарушения гомеостаза животных н приводит в результате к 100 % их летальности в течение первых 10 суток от эксперимента.

2. Местное лечение мазевыми препаратами глубокого ограниченного ожога кожн способствует сохранению жизни животных, но не приводит к нормализации гомеоетаза и не предохраняет от развития на месте поражения грубых деформирующих рубцов. Использование НЭМИ в сочетании со стандартным лечением ожоговой раны обеспечивает улучшение общего состояния жиаотных,предотвращает развитие кахексии, наблюдаемой у подопытных крыс без применения физиотерапевтического фактора и способствует формированию нежного бледно окрашенного рубца вследствие полноценного восстановления структурных элементов кожи.

3. В эксперименте in vivo при использовании НЭМИ отмечалось уменьшение лейкоцитарной инфильтрации и отека, по сравнению с животными, получавшими только мазевую терапию. Отличительной особенностью опытной серии является появление вокруг сосудов новообразованной соединительной ткани тучных клеток, синтезирующих медиаторы воспаления. Морфологические данные на всех этапах эксперимента коррелируют с показателями периферической крови и результатами биохимических исследований.

4. Исследования на культуре дермапышх фибробластов позволили впервые выявить ранее не известный факт прямого действия НЭМИ на морфофункцнональнос состояние малодифференцированных клеток соединительной ткани кожн и раскрыть механизм его влияния на процессы пролиферации и синтетической функций фибробластов.

Установлено, что после облучения часть клеток погибает, вследствие этого в сред>' выхолят биологически активные вещества, активизирующие рост фнбробластов. При этом усиление пролнферативной функции фнбробластов сопровождается уменьшением коллагеногсиеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РEKOMEI1ДАЦИИ

Устройство, состоящее из стеклянного стакана с круглым плоским дном, кипятильника и термометра, может быть использовано для моделирования у животных термических поражений кожи, унифицированных по площади и глубине. Площадь ожога легко рассчитывается по формуле ЯГ2. С целью определения относительной площади ожога для расчета поверхности тела у крыс удобно использовать формулу Мее-Рубнера в модификации Lee (1929), SeK' W040, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К. - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах. Применяв емкости с различным диаметром дна и варьируя время воздействия, можно воспроизводить термические поражения необходимой глубины и плошади.

Полученные нами в эксперименте данные позволяют рекомендовать применение НЭМИ в комплексном лечении локальных глубоких ожоговых ран. Проводить такое терапевтическое лечение необходимо по следующей схеме1, длительность сеанса 10 минут, продолжительность лечения - 3 курса по 10 ежедневных сеансов с перерывом между курсами 10 дней, постоянный режим, минимальная энергия, частота 77 Гц, зазор 3 см над поверхностью раны.

Комплексные исследования на культурах клеток - фнбробластов (морфологический анализ монослоя и биохимический - культуральиой среды) можно рекомендовать для биологического тестирования различных факторов (физических, фармакологических, имплантатов и др), с целью оценки их влияния иа пролнфератнвную и коллагенсинтетическую функции механоцнтов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение литературных источников (отечественных н зарубежных) показано, что термические ожоги кожных покровов занимают видное место в структуре бытового и производственного травматизма. Наиболее тяжелый контингент обожженных составляют пациенты с глубокими ожогами, которые сопровождаются развитием ожоговой болезни. Традиционно уделяется большое внимание вопросам изучения патогенеза и лечения обширных ожогов Ш Б степени, в то время как изучению ограниченных ожогов, зона поражения которых не превышает 10% поверхности тела, уделяется недостаточно мало внимания Однако в настоящее время отмечается неуклонный рост числа обожженных с локальными глубокими ожогами, количество которых по данным литературы возросло за последние 30 лет в 2 раза. Эти ожоги, особенно если они располагаются в области открытых участков тела и крупных суставов, нередко приводят к тяжелым функциональным и эстетическим дефектам вплоть до кивали дизайн и пациентов. Реабилитация таких больных представляет собой серьезную медико-социальную задачу.

Одной из основных проблем лечения пострадавших от ожогов янляется своевременность и полнота восстановления кожных покровов, утраченных в результате ожоговой травмы. Не менее важной проблемой является профилактика послеожоговых рубцов. Используемые в этой связи наиболее распространенные в России консервативные методы оказываются зачастую недостаточно эффективными. Поэтому разработка новых и совершенствование существующих консервативных, в том числе с применением физиотерапевтических методов, направленных на профилактику образования грубых обезображивающих рубцов при глубоких ожогах кожных покровов, представляется весьма актуальным. Сообщение в периодической печати о применении ннзконнтененвного электромагнитного излучения (НЭМИ) в различных областях медицины говорит о его хорошем эффекте и его опосредованном влиянии на многие регуляторные системы жизнеобеспечения организма. Однако единичные публикации о применении НЭМИ у больных в комбустНологни не подкреплены необходимыми доклиническими испытаниями. Отсутствуют обязательные для определения эффективности этого метода исследования с использованием фундаментальных методов научного анапнза. Кроме того, согласно Российскому -законодательству (Основы законодательства РФ об охране здоровья граждан, статья 43), внедрению в клинику новых методов лечения в обязательном порядке должно предшествовать глубокое и всестороннее изучение их на живых системах (животных и культурах клеток). Поэтому изучение вопросов морфогенеза в зоне коагуляцнонного некроза кожи при ожоге Ш Б в эксперименте на животных в условиях применения НЭМИ является необходимым и своевременным.

Для реализации цели исследования: эксиернментально-морфолотчсское обоснование применения НЭМИ в комплексном лечении ограниченного глубокого термического ожога кожи ■ в первую очередь необходимо было выбрать адекватную модель. Существующие модели (нагретые металлические пластинки, горящая вата и др.) в экспериментальной комбустнологии не позволяют многократно с достаточной точностью воспроизводить одинаковые по размеру и глубине ожоговые раны, а это, в свою очередь, не дает возможность получать сравнимые результаты Поэтому первоочередной задачей нашего исследования была разработка нового способа моделирования термических ожогов Ш Б степени - модели получения унифицированной ограниченной ожоговой раны степени у крыс с повреждением всех слоев наружного покрова и проанализировать влияние экспериментального коагуляционного некроз кожн на организм животного.

Нами была предложена, разработана и апробирована модель ограниченного ожога III Б степени (Удостоверение на рационализаторское предложение №400 от 07.04,2004). Простое устройство, состоящее из стеклянного стакана, наполненного водой, кипятильника и термометра позволяет строго дозировать и контролировать температуру (96° С), Площадь круга в основе стакана определенного диаметра даст возможность получать постоянно одинаковые но площади термические повреждения кожи. Проведенная серия предварительных исследований позволила эмпирическим путем выбрать режимы и длительность термического воздействия (35 секХ для получения коагуляционного некроза, захватывающего все слон кожи: эпидермис, дерму, вплоть до гиподермы Такая морфологическая картина соответствует в клинической классификации ожогов - ожогу II] G степени. В работе использовали стеклянный стакан с дном в виде круга диаметром 5 см, пяошддь которого соответствует 19,625 см2, В данном эксперименте это соответствует - 6% от общей площади поверхности тела животного, рассчитанной по формуле Мее-Рубнера в модификации Lee (1929): S=K- W°№ , где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах,

Применяя различные по диаметрам дна стаканы, можно увеличивать или уменьшать площадь экспериментального ожога. Данная модель, в отличие от веек известных, позволяет получать унифицированный ожог н должна найтн широкое применение в экспериментальной комбустнологии.

Опытным путем ( I серия экспериментов) выявлено, что не леченные ожоги III Б степени площадью 6% от поверхности тела представляют серьезную опасность для организма, вызывая глубокие нарушения гомеостаза, приводящие в конечном счете к кахексии и гибели животных в течение первых десяти суток эксперимента. Согласно литературным данным прежних лет (Вишневский А.А. н соаат., 1962; Вихреев Б.С., Бурмистров В-М, 1986 и др.) авторы не уделяли большого внимания таким ожогам, считая их незначительными и неопасными. Наши результаты исследований позволяют говорить о том, что данный патологический процесс представляет собой тяжелое повреждение наружного покрова тела, не является только местным страданием и требует более глубокого изучения на уровне систем жизнеобеспечения, По-видимому, при наличии таких ожоговых ран, также как и при обширных глубоких ожогах, развивается снмптомокомплекс ожоговой болезни.

Своевременное и полноценное восстановлен не кожных покровов при таких глубоких ограниченных ожогах необходимо не только с позиции косметической и функциональной эффективности, но и для сохранения жнзни пострадавшего. К сожалению, применяемые в нашей стране консервативные методы лечения таких ожогов оказываются зачастую недостаточно эффективными {В.М.Сизов, ПовстяноЙ Н Е., 1990; Азолов ВВ., Г.И. Дмитриев, 1995). В большинстве случаев остаются грубые деформирующие рубцы.

Поэтому основной задачей нашего исследования стало изучение в динамике влияние ннзконнтснсивного электромагнитного излучения в комплексе с медикаментозной терапией на характер репаративных процессов в области ожоговой раны у крыс - в сравнении с результатами экспериментов только традиционной медикаментозной терапией. Оценивали результаты лечения in vivo на организменном, органном и тканевом уровнях,

Работа выполнена в области экспериментальной медицины, основу которой составляют морфологические исследования. Эксперименты проведены на белых лабораторных крысах обоего пола весом 170'390 г с соблюдением всех этических требований, предъявляемых к работе е животными. Проведено 3 серии опытов: в первой ожог не лечили; во второй проводили стандартную медикаментозную терапию мазевыми препаратами (левомеколь до отторжения струпа, затем метилураииловая мазь до полной эпнтелизации раны); в третьей в комплекс лечебных мероприятий включали физиотерапевтическое воздействие в виде электромагнитного излучения малой мощности. Крыс выводили из эксперимента через 3, 7, 14, 28, 45 и 90 суток после нанесения ожога при помощи гильотины, Забирали область раневого дефекта с прилежащей кожей для морфологического изучения и периферическую кровь для клиннко-лабораторных и биохимических исследований.

Возле истине осуществляли при помощи аппарата ЭСИ-032-l «Протон» в течение 10 минут в постоянном режиме при минимальной энергии 50 мкА. Сеансы проводили контактным методом ежедневно, начиная со следующего дня после нанесения ожога, в течение 10 дней, затем делали перерыв до момента отторжения струпа, после чего рану обрабатывали бесконтактным методом с зазором 3 см над раной также в течение 10 дней. После двухнедельного перерыва проводили еще один десятидневный курс по стандартной методике.

Наблюдение за животными показало улучшение их общего состояния уже после первых сеансов электромагнитного воздействия; крысы становились более активными и спокойными, чем в серии сравнения, не проявляли aipeccHBHOCTH по отношению к экспериментатору, охотно принимали пищу. При внешнем осмотре у крыс, получавших только медикаментозную терапию, обнаруживался толстый буро-корнчнеиый струп, наползающий на приподнятые в результате отека края раны, который с четвертых суток начиная размягчаться в центре. У животных, получавших физиотерапию, форм провал ся тонкий струп, который сохранялся сухим и чистым вплоть до отторжении.

Морфологические исследования, выполненные с помощью общеморфологических, анторзднографнческих., морфометрнческнх методов показали уменьшение экссудатнвньгх явлений, микроциркуляторных расстройств и нейтрофильной инфильтрации в области ожоговой раны под действием НЭМИ в раин не сроки эхеперн мента. В более поздние сроки, начиная с 7 суток, НЭМИ способствует формированию полноценных грануляции, богатых новообразованными сосудами. Характерно, что созревание соединительной ткани под действием таких физиотерапевтических процедур происходит более равномерно по всей зоне глубокого ожога, в то время как у животных, получавших только мазевую терапию, на периферии зоны поражения и под новообразованным эпителием расположена более зрелая соединительная ткань, а в центре и дне до И суток сохраняются очаги кровоизлияний, лейкоцитарная инфильтрация, отек, нарушения мнкроцнркуляторного русла в виде застойного полнокровия, краевого стояния лейкоцитов, набухания клеток эндотелия. Отличительной особенностью серии с применением НЭМИ является появление большого количества тучных клеток в зоне регенерирующих тканей. На 7-14 сутки эксперимента в грануляционной ткани и в дерме прилежащей ннгактной кожи у крыс основной !рушш периваскулярно обнаруживаются скопления тканевых базофнлов

Особо интерес представляет тот факт, что применение НЭМИ не влияет на сроки рубцевания, но способствует формированию полноценного эпителиального пласта и рубца, состоящего из тонких пучков коллагеновых волокон, образующих сеть, по структуре напоминающую нормальную кожу. Через 45 суток от начала опыта у всех крыс зона ожога полностью зпителизнронйна. У животных, получавших только медикаментозное лечение, трубые пучки коллагеновых волокон располагаются параллельно батальной мембране, сосудов в рубце очень мало и расположены они хаотично, в глубине очага сохраняются участки менее зрелой соединительной ткани. У крыс, получавших НЭМИ, в по1раинчной с рубцом зоне в эти сроки эксперимента обнаруживаются зачатки новообразованных сальных желез и волосяных фолликулов.

Такая морфологическая картина хорошо коррелирует с содержанием окенпролнна в периферической крови: при использовании НЭМИ у животных до конца наблюдения (90 суток) обнаруживаются высокие показатели как свободного, так и бслковосвязанного окенпролнна (3&7,3±5,7 мкмоль/л по сравнению с 198,7±3,1 мкмоль/л при только медикаментозном лечении; норма 235,4±4,3 мкмоль/л), что говорит об активной перестройке рубпа. К концу опыта крысы опытной серии по внешнему виду и массе не отличались от здоровых; на месте ожоговой раны при пальпации определялся мягкий подвижный рубец; по краям зоны поражения отмечалось формирование волосяных фолликулов и сальных желез. В серии сравнения, где применялось только медикаментозное лечение, крысы до конца наблюдения оставались вялыми, с непостоянным аппетитом н отставали в массе и размерах от животных того же возраста, на месте ожоговой раны образуется широкий грубый рубец.

Выявленные морфологические изменения коррелируют с показателями периферической крови и результатами биохимических исследований медиаторов воспаления и коллагеногенеза. Прн использовании НЭМИ отмечаются более низкие показатели общего количества лейкоцитов периферической крови: лейкоцитоза, в то время как в серии животных, леченных только мазевыми препаратами, отмечается высокий лейкоцитоз. Гнетам и и в сыворотке крови имеет однонаправленную тенденцию к повышению у всех подопытных животных обеих серий с лечением, В то же время показатели серотонина в сыворотке крови в группах сравнения значительно отличаются между собой. Если в группе со стандартной местной терапией серотонин остается на низком уровне, за исключением повышения его на 28 сутки, в серии с применением НЭМИ серотонин повышается в 3,5-6 раз с пиком тоже на 28 сутки. Этот медиатор воспаления очень лабилен и может служить тестом для оценки течения регенераторного процесса,

К концу опыта (90 суток) крысы опытной серии по внешнему виду и массе не отличались от здоровых1, на месте ожоговой раны произошло полное восстановление волосяного покрова, при пальпации определялся мягкий подвижный рубец, В серии сравнения, где применялось только мазевое лечение, крысы до конца наблюдения оставались вялыми, с непостоянным аппетитом и отставали в массе и размерах от животных того же возраста. Такие полученные нами результаты косвенно подтверждают сведения об опосредованном действии НЭМИ на различные системы регуляции организма, нммуномодулнрующем и общеукрепляющим действии этого фактора.

Выполненные нами экспериментальные исследования на живых системах in vitro позволили установить неизвестный ранее факг наличия прямого действия НЭМИ на морфофуикннональное состояние малолнфферснцнрованиых клеток лермы.

Не менее важной задачей стало исследование факта непосредственного влияния НЭМИ на малоднфференцированные клеточные элементы соединительной ткани дермы- Для этого мы провели эксперименты In vitro, С помощью комплекса морфологических, морфометричсскнх и биохимических методов исследовали воздействие НЭМИ на морфофункциональнос состояние дермальных фибробластов в культуре. In vitro оценивали н сравнивали пролнферативную и коллагснсннтетнческую активность дермальных фибробластов при воздействии НЭМИ и без него.

В эксперименте была использована первичная культура дермальных фибробластов крысы при различных вариантах интенсивности се роста, разных посевных дозах и разном «возрасте» культуры. Облучение проводили в постоянном режиме бесконтактным методом со стороны дна флакона с зазором ] см при минимальной энергии 50 мкА, частоте импульсов 77±3 Гц и амплитуде импульса не менее 50 В. Время воздействие составляло 5 минут. Сеансы проводили ежедневно, начиная со следующего дня после пересева, в течение 5 дней. Использовали аппарат ЭСИ-032-1 «Протон».

Проведенное нами комплексное исследование с морфологической, морфометрнческой и количественной оценкой клеток монослоя и использование нового способа определения маркеров коллагена в культуральной жидкости позволили нам раскрыть механизм действия данного физиотерапевтического фактора.

Наши исследования показали наличие непосредственного (прямого) дейеттвия НЭМИ на фнбробласты в культуре, что под действием первого сеанса облучения часть клеток погибает и слущивается, в результате чего в культуральную среду выходят биологически активные вещества, которые активируют пролиферацию оставшихся фибробластов. Время удвоения клеток it культуре уменьшается а 1.5 раза, плотность клеток, достигаемая за одинаковое время, достоверно увеличивается по сравнению с культурой, не подвергавшейся облучению. При этом трансформации клеток не происходит. Клетки в культуре до 30 пассажа сохраняли характерные для нормальных фибробластов форму, размеры, структуру цитоплазмы, ядерно-цнтоплазменные отношения.

Характерно, что увеличение пролнфератнвиой активности сопровождается достоверным снижением содержания белконоснязанного оксипролина в культуральной среде, что свидетельствует об ослаблении коллагенсинтетичсской функции облученных фибробластов в культуре,

Результаты экспериментов на культурах клеток объясняют формирование нежного тонкого рубца, так как процессы фиброза происходят менее интенсивно. Поэтому исследовании на культурах клеток являются чрезвычайно перспективными и необходимыми для изучения свойств различных факторов.

Культуральный метод является не только в этическом плане самым оптимальным, но и позволяет проводить более глубокие исследования.

Примененный нами комплекс морфологических и биохимических методов исследования монокультуры механоинтов (фибробластов) и культуральной среды лает возможность оценивать не только цнтотоксическнй эффект изучаемого фактора, но н получать принципиально новые сведения о механизмах его действия на морфофункциональкос состояние различных культур коллагененнтезирующнх клеток.