Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Патогенетическое обоснование применения синтетического аналога дерморфина при хронических воспалительных заболеваниях легких, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей

ГУСЕВА Ольга Евгеньевна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНАЛОГА ДЕРМОРФИНА ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ, СОЧЕТАННЫХ С ДЕФЕКТАМИ ОРГАНОГЕНЕЗА РЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ, У ДЕТЕЙ (клинико-экспериментальное исследование)

14.01.08 - педиатрия 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

~ 4 ФЕВ 20ш

Хабаровск - 2010

Работа выполнена в Хабаровском филиале Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ Охраны материнства и детства (директор - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ В.К. Козлов); на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ С.С. Тимошин).

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ Владимир Кириллович Козлов Доктор медицинских наук Ольга Антоновна Лебедько

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Татьяна Александровна Гвозденко Доктор медицинских наук, профессор Марина Федоровна Рзянкина

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

Зашита диссертации состоится ^»2010 г. в /О часов на заседании Диссертационного совета Д 208.026.01 в Дальневосточном государственном медицинском университете по адресу: 680000, г. Хабаровск, ул. Муравьёва-Амурского, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного медицинского университета.

Автореферат диссертации разослан января 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.026.01

доктор медицинских наук,

профессор

Вячеслав Анатольевич Добрых

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одной из актуальнейших задач современной детской пульмонологии является поиск эффективных методов коррекции структурно-метаболических нарушений в системе органов дыхания на ранних этапах онтогенеза. О необходимости такого поиска свидетельствует неуклонно увеличивающееся число детей с дефектами органогенеза респираторной системы, в подавляющем большинстве случаев осложненных хроническим воспалительным процессом с непрерывно-рецидивирующим типом течения [Таточенко В.К., 2001; Середа Е.В., 2002; Спичак Т.В., 2005; Шендерук Т.В., 2007].

В настоящее время фундаментальной основой в пульмонологии является изучение молекулярных механизмов пато- и саногенеза, одним из основных направлений которого считается исследование биогенеза активных кислородных метаболитов (АКМ). В качестве мессенджеров межклеточной и внутриклеточной сигнализации, радикальные дериваты кислорода регулируют морфогенез органов дыхания, обеспечивая реализацию антагонистических процессов детерминации, пролиферации, дифференцировки, редукции и интеграции [Воейков В. Л., 2000; Thannickal V.J., 2000; Land S.C., 2005; Yao Н„ 2007]. Кроме того, свободные радикалы или непосредственно, или через формирование продуктов липидной пероксидации, активируя редокс-чувствительные факторы транскрипции и каскады стресс-киназ, являются триггерами воспалительных процессов в респираторной системе [Saugstad O.D., 1996; Dworski R., 2000; Rahman I., 2005; Domej W., 2006]. Тем не менее, в литературе практически отсутствуют данные об особенностях процессинга и де-токсикации свободных радикалов при хронических воспалительных заболеваниях легких (XB3JI), сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей.

Создание нового поколения лекарственных средств, реализующих принципы «молекулярной лингвистики», является одной из основных задач наномедицины. В этом аспекте, вследствие высокой эффективности, низкой токсичности, возможности применения в наномолярных концентрациях, молекулярные регуляторы пептидной природы привлекают особое внимание исследователей.

Пептидными нанопрепаратами, проходящими в настоящее время этап доклинических исследований, являются синтетические аналоги регуляторного пептида дерморфина. К ним относятся: аргининсодержащий аналог H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH - смешанный агонист периферических рецепторов и антагонист центральных ц1 - рецепторов эндогенной пептидергической системы, широко представленной в органах дыхания и активно участвующей в процессах структурно-функционального созревания легких [Sunday М.Е., 2001; Gomez-Roman J.J., 2002] и безаргининовый аналог H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH.

Известно, что, в качестве универсальных передатчиков сигнала, активные дериваты кислорода обеспечивают функционирование пептидергической системы легких, в то же время имеются данные, свидетельствующие о способности эндо- и экзогенных пептидов воздействовать на биогенез самих АКМ [Carnesecchi S. et al., 2009; Ping-Chia L. et al., 2009; Qi S. et al., 2009]. Однако вопрос о наличии у синтетических аналогов дерморфина корригирующих эффектов в отношении биогенеза АКМ в системе органов дыхания - до настоящего времени оставался открытым.

Исследованию роли свободнорадикальных нарушений в патогенезе XB3JI, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей, теоретическому и экспериментальному обоснованию возможности применения синтетических аналогов дерморфина при данной патологии - посвящена настоящая работа.

Цель исследования: патогенетическое обоснование возможности применения синтетических аналогов дерморфина в качестве корректоров свободнорадикальных нарушений при хронических воспалительных заболеваниях легких, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клинического течения различных периодов ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей.

2. Исследовать процессы свободнорадикапьного окисления в сыворотке крови, мембранах эритроцитов, бронхоальвеолярном лаваже, гранулоцитах цельной крови у детей в различные периоды XB3J1, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

3. В эксперименте in vivo на модели гипобарической гипоксии изучить влияние синтетических аналогов дерморфина H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH и H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH на нарушения процессов свободнорадикального окисления и синтеза ДНК в системе органов дыхания новорожденных белых крыс.

4. В эксперименте in vitro изучить влияние синтетических аналогов дерморфина Н-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH и H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH на оксидативный метаболизм гранулоцитов у детей в различные периоды ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

5. С помощью безаргининового аналога H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в экспериментах in vivo и in vitro установить возможные NO-зависимые механизмы эффектов олигопеп-тида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH.

Научная новизна

Установлено, что у детей в периоде ремиссии ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, имеет место снижение функционального резерва гранулоцитов на фоне гиперпродукции этими клетками супероксид-анион- и гидроксил-радикалов

Установлена сопряженность нарушений биогенеза АКМ в гранулоцитах, мембранах эритроцитов, сыворотке крови, бронхоальвеолярном лаваже у детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

В эксперименте in vivo выявлено разнонаправленное влияние внутриутробной гипоксии на пролиферативную активность эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи новорожденных белых крыс на фоне развития оксидативного стресса как на органном, так и на организменном уровнях.

В эксперименте in vivo установлено корригирующее влияние олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH на нарушения свободнорадикального статуса легких и крови новорожденных белых крыс, перенесших пренатальную гипоксию.

В эксперименте in vivo выявлено корригирующее влияние олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH на нарушения тканевого гомеостаза эпителиально-гладкомышечного компартмента трахеи новорожденных белых крыс.

В эксперименте in vitro определен корригирующий эффект олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в отношении нарушений оксидативного метаболизма гранулоцитов цельной крови у детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

Теоретическая значимость

Выявленные особенности оксидативного статуса на молекулярно-клеточном, органном и организменном уровнях у детей с XB3J1 на фоне дефектов органогенеза респираторной системы свидетельствуют о наличии возрастной эволюции нарушений биогенеза АКМ и способствуют пониманию молекулярных механизмов прогредиентности патологии. Полученные нами данные подтверждают концепцию о формировании постгипокси-ческого структурного следа дизадаптации в органогенезе легких. Выявлена тканевая специфичность морфогенетических реакций со стороны эпителиально-гладкомышечного компартмента слизистой воздухоносных путей, обусловленная нарушением оксидативного метаболизма. Результаты исследования расширяют представление о патогенезе респираторных заболеваний в аспекте оценки регенераторных стратегий эпителиальной ткани.

Установлено, что аргининсодержащий аналог дерморфина - олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH обладает антиоксидантными антирадикальными, цитопротективными свойствами в системе органов дыхания и корригирующими - в отношении оксидативного статуса гранулоцитов. Результаты исследования свидетельствуют об участии оксид азот-зависимых механизмов в реализации протективных эффектов олигопетида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH. Выявленные особенности влияния олигопептида на синтез ДНК эпи-телиоцитов и гладких миоцитов трахеи вносят значительный вклад в понимание роли свободнорадикальной и пептидергической регуляции в ремоделировании слизистой респираторного тракта на ранних этапах онтогенеза. Результаты исследования свидетельствуют о патогенетической обоснованности применения синтетического аналога дерморфина - H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH при хронических воспалительных заболеваниях легких, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследований

На основе параметров спонтанной и индуцированной хемилюминесценции (XMJ1) различных биологических субстратов разработан алгоритм оценки прооксидантно-антиоксидантного статуса у детей с XB3JI. Установлена необходимость применения препаратов, обладающих антиоксидантным антирадикальным эффектом, у детей в периоды обострения и ремиссии XB3JI, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

Учитывая мапоманифестное течение обострения XB3J1, низкую информативность рутинных методов диагностики, исследуемые XMJI-параметры могут служить в качестве дополнительных высокоинформативных критериев прогнозирования фазы обострения хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе. Кроме того, использование комплекса ХМЛ-параметров оценки прооксидантно-антиоксидантного статуса рекомендуется в качестве критерия эффективности коррекционных мероприятий при различных видах бронхолегочной патологии.

Экспериментально in vivo и in vitro обоснована целесообразность разработки новых лекарственных средств на основе олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в качестве антиоксидантов и цитопротекторов нового поколения для применения в пульмонологической педиатрической практике при XB3J1. Способность олигопептида модулировать синтез ДНК в эпителиоцитах и гладких миоцитах респираторного тракта открывает возможность создания на его базе фармакологических препаратов направленного действия (с доставкой к органу-мишени с помощью ингаляционных методов) - нанокорректоров процессов патологического ремоделирования воздухоносных путей.

Результаты исследования внедрены в лечебно-профилактические учреждения г. Хабаровска (ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ Охраны материнства и детства), полученные результаты используются в практической деятельности врачей.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на XVI Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006), на ряде научно-практических конференциях с международным участием «Актуальные вопросы лечения и реабилитации патологии кардиореспираторной системы», (Владивосток, 2007); «Актуальные вопросы состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном Федеральном Округе» (Хабаровск, 2007); «Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона» (Хабаровск, 2008); «Актуальные проблемы педиатрии, детской хирургии и ортопедии на современном этапе» (Хабаровск, 2009); на симпозиуме «Механизмы формирования фетоп-лацентарной недостаточности при вирусном повреждении организма беременных» (Благовещенск, 2008).

Материалы диссертации представлены в докладе «Нарушения оксидативного метаболизма при хронических бронхообструктивных заболеваниях легких у детей» на Х-ом Краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов Хабаровского края, секция медицинские науки (2008). Работа была удостоена I призового места. Доклад по данным проведенного исследования был представлен на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008).

Положения, выносимые на защиту:

1. У детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, в периоде обострения имеет место выраженный оксидативный стресс, проявления которого на мембранно-клеточном, органном и организменном уровнях сохраняются и в периоде ремиссии.

2. У детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, выявлено наличие возрастных особенностей нарушений на различных уровнях сво-боднорадикального статуса.

3. У детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, формирование оксидативного стресса на клеточно-мембранном, органном и организменном уровнях сопряжено с нарушениями оксидативного метаболизма гранулоцитов (снижение функционального резерва на фоне гиперпродукции супероксид-анион- и гидроксил-радикалов).

4. Внутриутробная гипоксия индуцирует нарушения ДНК-синтетической активности клеток эпителиально-гладкомышечного компартмента трахеи на фоне системного и локального оксидативного стрессов на раннем этапе постнатального онтогенеза.

5. Олигопептид Н-Аг£-Туг-0-А1а-РЬе-01у-0Н обладает антиоксидантными антирадикальными, цитопротективными эффектами в системе органов дыхания и корригиру-шими - в отношении оксидативного метаболизма гранулоцитов. В реализации этих свойств участвуют оксид азот-зависимые механизмы.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 184 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы,

включающего 262 источника, из них 157 отечественных, 105 зарубежных. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 17 рисунками. Публикации

По материалам диссертационного исследования опубликовано 19 работ, включая 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских и докторских диссертаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование осуществлялось в несколько этапов и состояло из экспериментального и клинического блоков.

Характеристика исследуемых веществ: исследовали синтетические аналоги регуля-торного пептида - дерморфина. Олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH (условное название «седатин») - смешанный агонист опиоидных периферических 6-/ц- и антагонист центральных pl- рецепторов, содержащий L-аргинин в N-фланговом положении. Для выяснения возможной роли аргинина в реализации эффектов препарата, использовали без-аргининовый аналог H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH.

Исследуемые пептиды были синтезированы в лаборатории химии пептидов Кардиологического научного центра РАМН (г. Москва) классическим методами пептидной химии в растворе и твердофазным методом и любезно предоставлены для исследования зав.лаб. профессором Ж.Д. Беспаловой.

Клинический этап. Работа выполнена на базе НИИ Охраны материнства и детства Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН г. Хабаровска (директор - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ В.К. Козлов) в 2004 - 2008 гг. в рамках общеинститутской НИР 012 «Региональные особенности распространённости, клинико-морфологические и иммунологические аспекты неспецифических воспалительных заболеваний лёгких у детей. Пути оптимизации патогенетического лечения».

Для решения поставленных задач с апреля 2004г. по июнь 2008 г. в условиях педиатрического отделения № 1 клиники ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ ОМиД было проведено обследование и лечение 111 детей в возрасте от 6 до 17 лет с диагнозом ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в различные периоды заболевания.

Дизайн исследования был одобрен решением заседания Этического комитета ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ ОМИД от 28.11.05 г. (протокол № 4).

Комплексное обследование пациентов проводилось согласно теме НИР 012, по дифференциально-диагностическому алгоритму.

Критерии включения в исследование: возраст 6-17 лет; верифицированный дефект органогенеза респираторной системы - установленный диагноз: порок развития легких; бронхитический вариант обострения ХВЗЛ и/или период ремиссии, а также добровольное информированное согласие родителей на участие ребенка в исследовании.

Критерии исключения из исследования: возраст младше 6 лет; не верифицированный диагноз - порок развития легких; обострение ХВЗЛ по пневмоническому типу, отсутствие согласия между врачом и родителями пациента.

Для реализации цели исследования и решения поставленных задач среди контингента обследованных детей было выделено 3 клинические группы:

1-я группа - 54 пациента с ХВЗЛ на фоне порока развития респираторной системы в периоде ремиссии;

2-я группа - 33 пациента с обострением ХВЗЛ по бронхитическому типу на фоне порока развития респираторной системы;

3-я группа - 40 практически здоровых детей

Анализируемые группы были сопоставимы по возрастно-половому составу. В каждой группе пациентов были выделены подгруппы, в зависимости от возраста: I подгруппа -6-11 лет; II подгруппа - 12-17лет.

Характеристика клинических и лабораторных методов исследования

Клиническое обследование детей включало сбор анамнеза жизни и заболевания, физи-кальный осмотр ребенка, стандартные лабораторные исследования. Анализ проводился методом анкетирования по разработанной карте-схеме, включавшей блоки по исследованию генеалогического, акушерского, аллергологического анамнеза, анализ антенатального, перинатального и постнатального периодов, перенесенные заболевания, возраст дебюта бронхо-легочной патологии, оценку соматического статуса ребенка.

Сбор анамнеза, осмотр, перкуссия, пальпация, аускультация проводились по общепринятым в клинической практике методикам. Во всех случаях проводился ретроспективный анализ первичной медицинской документации (амбулаторная карта больного ф. №112/у, история болезни стационарного больного ф. № 003/у).

Хемилюминесцентный анализ процессов свободнорадикального окисления Хемилюминесцентное исследование проводили на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО ДВГМУ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ С.С. Тимошин). Материалом для исследования служили сыворотка крови, мембраны эритроцитов, гранулоци-ты цельной крови, бронхоапьвеолярный лаваж (БАЛЖ) пациентов с XB3JI, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, в различные периоды заболевания.

Регистрацию XMJ1 осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50В «PERKIN ELMER» по методикам Ю.А. Владимирова и соавт. (1991), М.П. Шерстнева (1997), А.В. Арутюняна и соавт. (2000), Z. Cheng et. al. (2003).

Определяли: S-sp - свегосумму за 1 минуту спонтанной ХМЛ, величина которой прямо коррелирует с интенсивностью генерации АКМ; S-luc - светосумму за 1 минуту люцигенин-зависимого свечения, величина которой прямо коррелирует с образованием супероксид-анион-радикала; S-lum - светосумму за 1 минуту люминол-зависимой XMJI, величина которой находится в прямой зависимости от интенсивности продукции гидро-ксил-радикала; h - амплитуду быстрой вспышки Fe2+ -индуцированного свечения, свидетельствующую о концентрации гидроперекисей липидов; Sind-1 - светосумму за 2 минуты Fe2+ -индуцированной ХМЛ, величина которой указывает на скорость образования перекисных радикалов; Н - амплитуду Н202 - индуцированного люминол-зависимого свечения, величина которой обратно коррелирует с перекисной резистентностью субстрата; Sind-2 - светосумму за 2 минуты Н2О2 - индуцированной люминол-зависимой XMJ1, величина которой обратно коррелирует с активностью антиоксидантной антирадикальной системы защиты (АОРЗ).

Исследование влияния синтетических аналогов дерморфина на показатели окси-дативного метаболизма гранулоцитов цельной крови пациентов проводили по методикам ХМЛ-анализа У.Р. Фархутдинова (2007), V. Witko-Sarsat et al. (2003). Регистрировали светосуммы: базальной ХМЛ - S-lum и S-Iuc и стимулированной фагоцитозом опсони-зированного зимозана ХМЛ: S-(lum+z) и S-(luc+z).

Помимо абсолютных, определяли также относительные параметры ХМЛ-значений. Коэффициент стимуляции (К) - отношение уровней S-(luc+z) / S-luc ; S-(Ium+z) / S-lum, раскрывает величину резервных возможностей гранулоцитов.

Экспериментальный этап проводился на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО ДВГМУ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ С.С. Тимошин).

Эксперимент in vitro. Исследовались образцы цельной крови детей всех наблюдаемых клинических групп.

Оксидативный метаболизм гранулоцитов изучался по методике А.Р. Монастырской и соавт. (1987) на фоне введения в инкубационную среду исследуемых пептидов в концентрации 10"8 М. Методом ХМЛ анализа определяли S-lum, S-luc, S-(lum+z), S-(luc+z), а также коэффициенты стимуляции (S-(luc+z) / S-luc), (S-(lum+z) / S-lum).

Согласно дизайна исследования образцы цельной крови детей исследуемых клинических групп подразделялись на группы:

• Группа «И» - интактные образцы цельной крови пациентов, не подвергавшиеся обработке препаратами;

• Группа «Арг(+)аналог» - образцы цельной крови пациентов, обработанные арги-нинсодержащим олигопептидом;

• Группа «Арг(-)аналог» - образцы цельной крови пациентов, обработанные безарги-ниновым аналогом;

• Группа «Ф» - образцы цельной крови пациентов с введением эквиобъемного количества изотонического раствора хлорида натрия;

В качестве контроля анализировались ХМЛ-значения гранулоцитов цельной крови здоровых детей. Эксперимент in vivo.

Характеристика экспериментальных животных. В экспериментальных исследованиях использовали самок беспородных белых крыс 3-4 месячного возраста. Животных с 14 по 19 день гестации на 4 часа ежедневно помещали в барокамеру и создавали разрежение, соответствующее высоте 9000 м над уровнем моря (давление 224 мм.рт.ст.). Потомство подопытных и интактных крыс забивали методом быстрой декапитации на 7 сутки пост-натапьного развития. Всего в эксперименте было использовано потомство от 75 самок. Эксперименты проводили на 182 новорожденных белых крысах.

Крысы 1 группы - с нормальным кислородным обеспечением пренатального периода, получали аргининовый аналог H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH с 2 по 6 сутки постна-тапьного развития, в режиме ежедневного внутрибрюшинного введения, в дозе 100 мкг/кг.

Крысы 2 группы - с нормальным кислородным обеспечением пренатального периода, получали безаргининовый аналог H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в аналогичном режиме.

Крысы 3 группы - перенесшие пренатальную гипоксию. Состояние гипоксии моделировали ежедневным 4-часовым пребыванием самок-крыс в барокамере СБК-49 (высота 9000 м.), с 14-й по 19-й день беременности.

Крысы 4, 5 группы - перенесшие пренатальную гипоксию и получавшие, соответственно, олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH и безаргининовый аналог в выше обозначенном режиме.

Животным 6 группы - группы «контроль» в соответствующем режиме вводили эк-виобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия.

Эксперименты проводились согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ № 755 от 12 августа 1977г. Министерства Здравоохранения СССР). Дизайн экспериментальных исследований был одобрен на заседании комитета по биомедицинской этике ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства 17.10.05 (протокол № 5).

Метод авторадиографии. Объектами исследования служили эпителий и гладкие миоци-ты трахеи 7-суточных белых крыс. Новорожденным животным за 1 час до эвтаназии вводили 3Н-тимидин в дозе 1 мкКюри на грамм веса (уд.активность 84 Кюри/моль). Ра-

диоавтографы готовили по принятой в лаборатории методике. Индекс меченых ядер (ИМЯ) - отношение числа меченых 3Н-тимидином ядер к общему их количеству - определяли на основании просмотра 2000-2500 ядер и выражали в процентах. Мечеными считали ядра, над которыми проецировалось не менее 5 треков. Средним числом зерен серебра над 100 мечеными ядрами выражали интенсивность метки (ИМ), характеризующей скорость прохождения клетками синтетического периода клеточного цикла.

Определение методом XMJI-анализа оксидативного статуса различных биосубстратов экспериментальных животных. Исследованию подвергали сыворотку крови и го-могенаты легких новорожденных белых крыс по методикам описанным выше. Определяли: Ssp; S-luc; S-lum; h; Sind-1; H; Sind-2.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обработаны с применением математико-статистических методов с вычислением относительных величин (среднее арифметическое, среднее геометрическое, стандартное отклонение, ошибку средней величины, достоверность различий между показателями с учетом доверительной вероятности по критерию Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05. Качественные признаки характеризовали с помощью ранговой оценки с последующим корреляционным анализом (метод Спирме-на).

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

В зависимости от признаков активности хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе детей нами были сформированы клинические группы наблюдения. Период болезни определялся данными комплекса клинико-лабораторных, инструментальных методов обследования. В ]00% случаев дефект органогенеза легких верифицирован морфологически путем трансторакальной биопсии.

Нозологическая структура: врожденные пороки развития легких по типу тканевой дисплазии, включающей «изменения тканевых компонентов - соединительной ткани, хряща и паренхимы легкого, перекалибровку сосудов, ангиоматоз, чередование участков эмфиземы и ателектазов, а также метаплазию эпителия трахеи и бронхов, утолщение стенок сосудов» [Акинфеев A.A., Рыжавский Б.Я., 2004], - составили 68,6%, по типу гипоплазии - 31,4%.

При поступлении в клинику ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ ОМиД в периоде обострения XB3J1 состояние средней степени тяжести было зарегистрировано у 28,57% пациентов младшей возрастной группы, в то время как в старшей возрастной группе в средней степени тяжести было госпитализировано 41,66% пациентов (табл. 1). У пациентов старшей возрастной подгруппы обострение не сопровождалось повышением температуры тела в 83,3% случаев, у пациентов младшего возраста - в 66,6%. Фебрилитет в младшей возрастной подгруппе отмечался чаще, чем у пациентов старшего возраста.

Исследуя особенности клинического течения различных периодов XB3JI у наших пациентов, нами была выявлена маломанифестность симптомов в периоде обострения хронического бронхолегочного процесса.

Характер кашля в возрастных группах практически не различался по частоте встречаемости сухого и влажного, в то время как малопродуктивный кашель несколько чаще отмечался у пациентов младшего возраста.

Достоверно чаще у пациентов младшего возраста отмечалось жесткое дыхание. Со стороны аускультативной картины в легких в отношении хрипов сколь либо значимой разницы между возрастными группами выявлено не было.

Таблица 1

Характеристика основных клинических симптомов у пациентов в периоды ремиссии и обострения ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, (%±гп)

Возрастной диапазон (годы) I возрастная подгруппа (6-11 лет) 11 возрастная подгруппа (12-17 лет) 1 возрастная подгруппа (6-11 лет) И возрастная подгруппа (12-17 лет)

Обострение Ремиссия

Состояние при поступлении: удовлетворительное средней тяжести 71,42*10,10 28,57*10,10 5833*14,86 41,66*14,86 Симптомы хронической интоксикации

Температура тела: нормотермия субфебрилитет фебрилитет 66,66*10,54 9,52*6,56 23,80^9,52 8ззз±идз 0*25,74 16,66*11,23 39,13*10,40 22,58*7,63

Характер кашля: сухой влажный малопродуктивный 23,80*9,52 5238±11,16 23,80*9,52 25,0*13,05 5833*14,86 16,66*11,23 21,73*8,79 8,69*6,00 12,9*6,12 38,7*8,89**

Экспираторная одышка 38,09*10,85 41,66*14,86 30,43*9,81 51,61*9,12

Аускультативная картина: везикулярное дыхание жесткое дыхание локально ослабленное 90,47±6,56 9,52*6,56 50,0±15,07* 16,66*11,23 47,82*10,64 52,17*10,64 0*15,68 70,96*8,28 22,58*7,6* 6,45*4,48

Характер хрипов: хрипы отсутствуют рассеянные сухие хрипы рассеянные влажные хрипы рассеянные сухие и влажные хрипы локальные влажные хрипы 47,61 ± 11,16 14,28*7,82 28,57±10,10 4,76*4,76 19,04±8,78 5833*14,86 16,66*11,23 25,0*13,05 0*25,74 833*833 95,65*4,34 434*4,34 0*15,68 83,87±6,71 6,45*4,48 9,67*539

Примечание: * - р<0.05 при сравнении между возрастными подгруппами.

" - р<0.01 при сравнении между возрастными подгруппами.

Клинические симптомы у больных с минимальной степенью активности воспалительного процесса - в периоде ремиссии характеризовались следующими признаками. Симптомы хронической интоксикации в младшей возрастной подгруппе наблюдались более чем у трети пациентов, в старшей возрастной подгруппе - у 22,6%. При этом в периоде ремиссии кашель беспокоил около 1/3 детей младшего возраста и более половины детей старшего возраста.

Достоверно чаще влажный кашель отмечался у пациентов в возрасте 12-17 лет. У 6,45% пациентов старшего возраста были зарегистрированы жалобы на одышку с затрудненным выдохом, в то время как в группе пациентов младшего возраста жалоб такого характера не отмечалось. Аускультативная картина легких у детей младшей возрастной группы характеризовалась следующими признаками. Жесткое дыхание отмечалось достоверно чаще - более чем у половины пациентов, в то время как у детей старшего возраста в периоде ремиссии жесткое дыхание регистрировалось у 22,6% пациентов. Локальная симптоматика в виде влажных локальных хрипов отмечалась только у пациентов старшего возраста. В 4,34% наблюдались влажные рассеянные хрипы. У детей старшей возрастной группы отмечалось в 70,9% везикулярное дыхание, в 22,6% - жесткое.

При исследовании ХМЛ-показателей оксидативного статуса биосубстратов пациентов различных возрастных групп нами были выявлены следующие особенности.

Анализ ХМЛ-грамм сыворотки крови детей младшего возраста в периоде обострения ХВЗЛ по бронхитическому типу позволил выявить (Рис. 1) выраженные нарушения биогенеза АКМ на системном уровне. Так, показатель интенсивности свободнорадикаль-ных процессов (Ssp) превышал аналогичный в контроле в 5,2 раза, при этом зарегистрировано достоверное увеличение продукции супероксид-радикала (Slue) в 5,5 раза, гидро-ксил-радикала (Slum) - в 5,7 раза. Значительный вклад в этот процесс вносила активация перекисного окисления липидов, о чем свидетельствовало увеличение концентрации гидроперекисей липидов (h) в 5,3 раза и ускорение образования перекисных радикалов ли-пидной природы (Sind-1) в 5,5 раза. Выявленные нарушения АКМ-статуса сопровождались ослаблением антиоксидантной антирадикальной системы защиты. Об этом свидетельствовало повышение показателя (Sind-2) в 5,2 раза, а также снижение резистентности к перекисному окислению (Н увеличилась в 5,1 раза).

Декомпенсированное накопление в сыворотке крови АКМ радикальной и не радикальной природы на фоне угнетения АОРЗ свидетельствует о наличии оксидативного стресса у пациентов младшего возраста в периоде обострения ХВЗЛ.

В периоде ремиссии (Рис. 1) у этой группы пациентов сохранялись признаки оксидативного стресса: хотя все исследуемые ХМЛ-параметры (Ssp, Slue, Slum, h, Sind-1, Sind-2, H) снизились в 1,7-2 раза в сравнении с аналогичными при обострении, но при этом продолжали превышать контрольные величины в 2,5-3 раза.

У пациентов старшего возраста в сыворотке крови в периоде обострения ХВЗЛ (Рис. 2) также выявлено наличие признаков оксидативного стресса: все исследуемые ХМЛ-параметры превышали контрольные значения в 4-4,7 раза. Признаки оксидативного стресса на системном уровне зарегистрировали у пациентов и в периоде ремиссии ХВЗЛ: исследуемые показатели продукции АКМ снизились в 2,5-2,8 раза в сравнении с аналогичными при обострении, однако продолжали превышать аналогичные в контрольной группе в 1,5-1,8 раза.

SM-l Slue

|р Контроль Я ХВЗЛ. ремиссия ■ ХВЗП. обострит |

Ssp h Skid-1 Slue Slum

□ Коигроа И ХВЗП, реииссия I ХВЗЛ. сйосгрвиив

Рис. 1. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного Рис. 2. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного статуса сыворотки крови пациентов младшей статуса сыворотки крови пациентов старшей возрастной подгруппы в различные периоды возрастной подгруппы в различные периоды ХВЗЛ. ХВЗЛ.

Примечание: ^ р<0.05 по отношению к группе "контроль".

* - р<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-обострение».

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периоде обострения имеет место окси-

дативный стресс, сохраняющийся, хотя и в меньшей степени выраженности, и в периоде ремиссии.

При сравнительном анализе XMJl-статуса сыворотки крови пациентов различных возрастных подгрупп установлено, что у пациентов младшего возраста отмечались более выраженные признаки оксидативного стресса в периоде ремиссии ХВЗЛ, чем у пациентов старшей возрастной подгруппы, о чем свидетельствует достоверное превышение (Ssp), (Slue), (Slum), (h) (Sind-1), (Sind-2), (H) в 1,2-1,5 раза (Табл. 2).

Известно, что мембрана эритроцитов является универсальной моделью плазматической мембраны, и метаболические процессы, происходящие в них, отражают изменения в мембранах других органов и тканей, в т.ч. и в легких, представляющих наиболее крупную мембрану организма [Merker М.Р. et al., 2004].

У детей младшего возраста на мембранно-клеточном уровне выявлены сходные изменения активности процессинга АКМ, что и в сыворотке крови (Рис. 3). При обострении ХВЗЛ показатели XMJI превышали контрольные значения в 2,7^,6 раза. В периоде ремиссии ХМЛ-параметры снизились в сравнении с аналогичными при обострении, но сохранялись на достоверно высоком уровне по отношении к контролю, превышая их в 1,3-1,9 раза. У пациентов старшего возраста выявлена аналогичная динамика свободно-радикальных изменений в мембранах эритроцитов (Рис. 4). В периоде обострения исследуемые ХМЛ-параметры превышали контрольные значения в 3,5-6,1 раза.

И

нД 1-tJ

Ja, Л

>) Sind-1 Slue Slum H Sind-2

|оКон1^иъ иЖЭЛ, ремиссия ■ ЖЗП. ofonpetuej

□ KtMpoib В 133,1. миссия |ЖЗЛ, о&ареше

Рис. 3. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного Рис. 4. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного статуса мембран эритроцитов пациентов младшей статуса мембран эритроцитов пациентов старшей возрастной подгруппы в различные периоды возрастной подгруппы в различные периоды ХВЗЛ. ХВЗЛ.

Примечание: ^ - р<0.05 по отношению к группе "контроль".

* - р<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-обострение».

В периоде ремиссии ХВЗЛ зарегистрировано снижение интенсивности процессов свободнорадикального окисления (СРО): все исследуемые параметры снизились в 1,8-2,8 раза, но продолжали превышать контрольные значения в 1,4-1,8 раза.

Сравнительный анализ ХМЛ-показателей мембран эритроцитов у пациентов различных возрастных групп продемонстрировал, что нарушения биогенеза АКМ на мем-бранно-клеточном уровне (в отличие от аналогичных процессов на организменном уровне) были более выражены в старшей возрастной группе как в периоде обострения, так и в периоде ремиссии ХВЗЛ (Табл. 2).

Фибробронхоскопия и исследование бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) осуществлялись по строгим клиническим показаниям. По этическим причинам здоровым детям данная процедура не проводилась. В связи с чем, полученные показатели БАЛЖ нами были оценены в отношении интенсивности воспалительного процесса.

Установлено, что в БАЛЖ пациентов старшей возрастной подгруппы в периоде обострения ХВЗЛ имела место более выраженная, чем в младшей возрастной подгруппе, интенсификация процессов СРО (Табл. 2). Так, в старшей возрастной подгруппе в периоде обострения активизировался процессинг АКМ: показатели (Ssp), (Slue), (Slum) превышали аналогичные у пациентов младшей подгруппы в 2 - 2,5 раза.

Таблица 2

ХМЛ-показатели мембран эритроцитов (МЭ), бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) и

сыворотки крови (СК), пациентов младшей и старшей возрастных подгрупп __в различные периоды ХВЗЛ, (М±т) _

Показатель (отн.ед.) ХВЗЛ-обострение ХВЗЛ -ремиссия ХВЗЛ-обострение ХВЗЛ -ремиссия

6-11 лет 12-17 лет

Ssp МЭ 1,28±0,06* 0,54+0,03*,*** 2,46±0,11*,** 1,31±0,05*,**,***

БАЛЖ 1,6210,10 0,74+0,04*** 3,24±0,2** 1,72±0,11**

CK 0,234±0,010* 0,123±0,007*,*** 0,251±0,01* 0,100±0,005*, »*,»**

h МЭ 1,74±0,14* 0,61±0,04*,*** 3,07±0,24*,** 1,70±0,13*,*♦,***

БАЛЖ 2,11±0,13 0,81+0,05*** 4,12±0,32** 2,36±0,16**

CK 0,281 ±0,017* 0,155±0,010*,**,*** 0,315±0,025* 0,111±0,007*, **,***

Sind-1 МЭ 2,86±0,19* 1,19+0,04*,*** 5,83±0,27*,** 3,16±0,11 *,*♦,***

БАЛЖ 3,62+0,17 1,62+0,10*** 6,48±0,22** 3,40±0,16**

CK 0,553±0,021* 0,284±0,013*,**,*** 0,581+0,030* 0,229±0,011 *,**,**•

Slue МЭ 0,85±0,05* 0,47+0,03*,*** 1,49±0,09*,** 0,89±0,04*,**,***

БАЛЖ 1,19±0,06 0,57+0,04*** 2,62±0,11** 1,45±0,I0**

CK 0,211±0,015* 0,098±0,006*,**,*** 0,200+0,012* 0,078±0,005*,**,***

Slum МЭ 1,15±0,07* 0,56+0,03*,*** 1,94±0,12*,** 1,12±0,06*,**,***

БАЛЖ 2,00±0,10 0,78±0,05*** 5,11±0,26** 2,40±0,11**

CK 0,334±0,020* 0,160±0,010*,**,*** 0,340+0,019* 0,120±0,009*,**,***

H МЭ 3,52±0,13* 1,85+0,11*,** 5,10±0,25*,** 3,55±0,12*,**,***

БАЛЖ 3,95±0,15 1,35+0,10*** 6,62+0,34** 4,28±0,24**

CK 0,665±0,043* 0,390±0,024*,**,*** 0,670+0,038* 0,255±0,020*,*♦,***

Sind-2 МЭ 5,26±0,30* 1,93+0,09*,*** 7,27±0,44*,** 4,9I±0,24*,**,***

БАЛЖ 5,71 ±0,34 2,54+0,15*** 8,99+0,47** 5,55±0,31**

CK 0,890±0,040* 0,428±0,028*,*** 0,920±0,053* 0,340±0,023*,**, ***

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе «контроль»;

** - р<0.05 при сравнении между возрастными подгруппами;

*** - р<0.05 внутри возрастных подгрупп "ХВЗЛ-обострение», "ХВЗЛ-ремиссиия».

Более интенсивно протекали процессы перекисного окисления липидов: значения (h), (Sind-1) превышали аналогичные значения в 1,9 -1,8 раза. Изменения АОРЗ также были более выражены у пациентов старшей возрастной группы.

В периоде ремиссии у пациентов старшего возраста (Табл. 2) также отмечалась более высокая генерация кислородных дериватов: показатели (Ssp), (Slue), (Slum), хотя и снизились по сравнению с аналогичными в периоде обострения, однако продолжали превышать показатели у пациентов младшего возраста в 2,3 - 3,1 раза. ХМЛ-параметры, характеризующие процессы перекисного окисления липидов: (h), (Sind-1) также значительно превышали аналогичные значения в младшей группе в 2,9 - 2,1 раза. Кроме того, значения (Sind-2) и (Н) в 2,1-3,1 раза превосходили аналогичные в группе пациентов младшего возраста.

Необходимо отметить, что в периоде ремиссии у пациентов старшего возраста сохранялся более интенсивный процессинг АКМ на фоне более выраженного угнетения АОРЗ. Все исследуемые XMJl-параметры в периоде ремиссии снизились в 1,5-2,1 раза. В то время как у пациентов младшего возраста в периоде ремиссии зарегистрировано большее снижение интенсивности свободнорадикальных процессов: (Ssp), (Slue), (Slum), (h), (Sind-1) снизились в 2,1-2,6 раза на фоне повышения активности АОРЗ.

Выявленные особенности ХМЛ-грамм мембран эритроцитов, БАЛЖ и сыворотки крови у пациентов с ХВЗЛ младшего и старшего возраста свидетельствуют о наличии возрастной эволюции нарушений оксидативного статуса на мембранно-клеточном, органном и организменном уровнях.

Гранулоциты и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участников воспаления в респираторной системе. Кроме того, в других органах и тканях отсутствует такой специфический для легких эффект, как явление значимого нарастания способности гранулоцитов превращать кислород в АКМ при прохождении через сосудистое русло легких [Коган А.Х. и соавт., 1989].

Важнейшим механизмом, задействованным в процессах активации гранулоцитов является изменение интенсивности кислород-зависимого метаболизма и генерации свободных радикалов (CP) [Маянский А.Н., 2005; Behe Р. et al., 2007; Nauseff W.M., 2007]. При анализе оксидативного статуса гранулоцитов цельной крови пациентов младшей возрастной подгруппы (Табл. 6) установлено, что в периоде обострения базальная продукции супероксид радикала (Slue) превышала контрольные значениями в 5,4 раза. При стимуляции зимозаном продукция супероксид радикала (Sluc+Z) возросла в 5,1 раза, превысив при этом контрольные показатели (Sluc+Z) в 3,07 раза. Однако, при сравнении, ответ на стимуляцию зимозаном гранулоцитов контрольной группы (Sluc+Z) составил 9-кратное увеличение продукции супероксид радикала.

Помимо абсолютных, исследовали относительные параметры оксидативного метаболизма гранулоцитов, а именно коэффициент стимуляции, отражающий резервные возможности гранулоцитов. Исследование позволило зарегистрировать снижение резервных возможное™ гранулоцитов исследуемой клинической группы - коэффициент стимуляции (K-luc) был ниже аналогичных контрольных значений в 1,7 раза. При исследовании показателей генерации гидроксил-радикала выявлен аналогичный характер изменений. Так, показатели базальной и стимулированной генерации гидроксил-радикала (Slum) превышали контрольные значения в 4,9 - 2,8 раза, соответственно. Однако коэффициент стимуляции (K-Ium) при этом был ниже контрольных цифр в 1,8 раза.

В периоде ремиссии у пациентов младшей возрастной подгруппы (Табл. 6) ХМЛ-показатели гранулоцитов снизились в 1,2-2,1, но сохранились в пределах, достоверно превышающих показатели в группе «контроль» в 2,1-2,6 раза. Индексы стимуляции (К-luc), (K-lum) в периоде ремиссии возросли в 1,5 раза, не достигнув, однако, контрольных значений.

При исследовании оксидативного метаболизма гранулоцитов пациентов с ХВЗЛ старшей возрастной подгруппы как в периоде обострения, так и в периоде ремиссии была зарегистрирована аналогичная динамика ХМЛ-параметров (Табл. 7).

Следует подчеркнуть особо неблагоприятное соотношение интенсивности двух процессов оксидативного метаболизма гранулоцитов - неадекватно высокий уровень базальной генерации АКМ и неадекватно низкий уровень стимулированного ответа. Снижение резервных возможностей гранулоцитарной системы имеет ключевое значение в хронизации и персистировании воспалительного процесса в бронхолегочной системе. Таким образом, у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периодах обострения и ремиссии имеет место снижение функционального резерва грану-

лоцитов на фоне гиперпродукции супероксид-анион- и гидроксил-радикалов этими клетками.

При исследовании возрастных особенностей оксидативного метаболизма грануло-цитов у наших пациентов установлено, что у детей старшей возрастной подгруппы в периоде ремиссии имело место более выраженное истощение функциональных резервов этих клеток.

С помощью корреляционного анализа выявлено, что гранулоцитарные АКМ - супероксид- и гндроксил-радикалы - участвуют в формировании нарушений оксидативного статуса на клеточно-мембранном, органном и организменном уровнях у детей с XB3JI в периоды обострения и ремиссии XB3JI. При исследовании структуры значимых корреляций в периоде обострения между параметрами XMJI-ответа гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови, БАЛЖ выявлено наличие сильной прямой корреляции связи между показателями люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции гранулоцитов и эритроцитарных мембран (г=0,83 и г=0,87, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и сыворотки крови (г=0,80 и г=0,84, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и БАЛЖ (г=0,85 и г=0,82, соответственно).

При исследовании структуры значимых корреляций у детей с ХВЗЛ в периоде ремиссии между параметрами ХМЛ-ответа гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови, БАЛЖ выявлено наличие сильной прямой корреляции связи между показателями люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции гранулоцитов и эритроцитарных мембран (г=0,80 и г=0,82, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и сыворотки крови (г=0,75 и г=0,77, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и БАЛЖ (г=0,84 и г=0,88, соответственно).

Таким образом, корреляционные взаимосвязи показателей оксидативного статуса гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови и бронхоальвеолярного лаважа у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы свидетельствуют о сопряженности нарушений оксидативного метаболизма на локальных и системном уровнях.

Выявленная нами повышенная генерация гранулоцитами АКМ вероятно играет значительную роль в АКМ-обусловленном повреждении тканей респираторного тракта и может представлять собой частный случай аутофагоцитарных заболеваний.

Полученные данные свидетельствуют о несовпадении у наших пациентов сроков клинической ремиссии и метаболической. Дети с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы нуждаются в антиоксидантной антирадикальной терапии не только в периоде обострения, но и в периоде ремиссии.

Для исследования возможных антиоксидантных антирадикальных свойств синтетических аналогов дерморфина возникла необходимость в экспериментальном моделировании состояния оксидативного стресса на соответствующем локальном и системном уровнях. Нами была использована модель гипобарической гипоксии, поскольку многими клинико-экспериментальными исследованиями [Haworth S.G., Hislop A.A., 2003; Peyron-net J. et al., 2007] установлено, что хроническая внутриутробная гипоксия является универсальным повреждающим фактором, вызывающим дезинтеграцию структурно-метаболических процессов в системе органов дыхания.

Анализ экспериментальных данных продемонстрировал (Табл. 3), что воздействие внутриутробной гипоксии интенсифицировало процессы СРО в легких новорожденных белых крыс - показатель (Ssp) увеличился в 1,9 раза, при этом отмечалось значительное увеличение продукции супероксид-радикала (Slue) и гидроксил-радикала (Slum) в 2,3 и 2 раза, соответственно. Зарегистрирована активация перекисного окисления липидов (h) и

16

ускорение образования перекисных радикалов липидной природы (ЭтсН) - показатели возросли в 2,15 и 2,2 раза, соответственно. Выявленные нарушения свободнорадикально-го статуса обусловлены ослаблением антиоксидантной антирадикальной защиты в целом и снижением резистентности к перекисному окислению, в частности - показатели (5т(1-2) и (Н) снизились в 2 раза и 3 раза, соответственно.

В сыворотке крови новорожденных крыс, перенесших пренатальную гипоксию, зарегистрировали изменения в сравнении с контрольным уровнем аналогичной направленности что и в легких, но в большей степени выраженные (Табл. 3).

Таблица 3

Влияние пренатальной гипоксии на показатели спонтанной и индуцированной ХМЛ гомогена-

тов легких и сыворотки крови новорожденных белых крыс, (М±ш).

Показатель (отн.ед.) Контроль Гипоксия

Легкие Кровь Легкие Кровь

Ssp 1,44 ±0,08 0,31 ±0,02 2,86±0,15* 0,74±0,062*

h 1,32±0,10 0,186±0,01 2,83±0,15* 0,64±0,05*

Sind-1 3,27±0,21 0,797±0,04 7,12+0,43* 2.23±0,11*

Slue 0,9310,05 0,235±0,18 2,13±0,10* 0,520±0,35*

Slum 1,48±0,09 0,330±0,23 3,08±0,14* 0,790±0,50*

H 4,63+0,25 1,69+0,10 12,56±1,11* 6,06±0,52*

Sind-2 8,27+0,65 2,34+0,20 17,14±1,15* 9,30±0,70*

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "контроль".

Одним из основных показателей структурного гомеостаза системы органов дыхания является ДНК-синтетическая активность эпителиально-гладкомышечного компар-тмента воздухоносных путей [Zäher Т.Е. et al., 2007].

Являясь универсальными передатчиками сигналов, АКМ осуществляют свою эф-фекторную роль, воздействуя на активность факторов транскрипции в режиме позитивной или негативной регуляции [Zäher Т.Е. et al., 2007; Reddy S.P., 2008]. В частности, доказано участие АКМ в регуляции активности универсального фактора транскрипции -ядерного фактора NF-кВ [Martin L.D. et al., 1998; Janssen-Heininger Y. et al., 2000; Barnes P.J. et al., 2003]. Осуществляя редокс-активацию через NF-кВ, оксиданты вовлекаются в регуляцию процессов морфогенеза на уровне генома [Gardner A.M. et al., 1997; Franco R. et al., 2007].

В нашем исследовании мы попытались выяснить, реализовались ли эффекты АКМ в отношении пролиферативной активности эпителиально-гладкомышечного компартмен-та у новорожденных белых крыс, перенесших внутриутробную гипоксию.

Авторадиографический анализ (рис. 5) продемонстрировал, что в трахее 7-суточных новорожденных крыс, перенесших пренатальную гипоксию, имеют место разнонаправленные изменения пролиферативной активности эпителиоцитов и гладких мио-цитов. Величина ИМЯ эпителиоцитов снизилась на 69,1%, при этом наблюдалось статистически значимое замедление прохождения эпителиоцитами S-периода клеточного цикла. В этих условиях ДНК-синтетическая активность гладких миоцитов превышала контрольные показатели в отношении ИМЯ - на 50,1%, ИМ - на 21%.

Таким образом, воздействие пренатальной гипоксии вызывает разнонаправленные изменения активности синтеза ДНК в эпителиально-гладкомышечном компартменте трахеи новорожденных белых крыс: снижение - в эпителиоцитах и повышение - в гладких миоцитах. Более высокая резистентность гладких миоцитов в сравнении с эпителиоцитами к воздействию оксидативного стресса, обусловлена, вероятно, тканеспецифическими особенностями эффекторной АКМ-регуляции процессов клеточного цикла.

Полученные нами in vivo данные о стимулирующем влиянии пренатального ги-поксического воздействия на величину пула пролиферирующих гладких миоцитов трахеи 7-суточных белых крыс в определенной степени согласуются с результатами исследований гипоксического воздействия in vitro: пролиферативной активности фетальных гладких миоцитов трахеи человека [Pandya Н.С., 2002] и трахеи 28-36 суточных крыс [Cogo А., 2003] и отражают типичную реакцию гладкомышечной ткани на оксидативный стресс. Участие АКМ в качестве универсальных внутри- и межклеточных мессенджеров эффекторных процессов, результатом которых является активация процессов синтеза ДНК в гладких миоцитах воздухоносной системы, косвенно подтверждается данными [Patel Н. J. et al., 1999] об антипролиферативном действии супероксиддисмутазы в отношении гладких миоцитов бронхов человека.

1

□ Контроль ■ Гипоксия

ИМ, эпштрты ИМ, иио1|Гы

□ КотршыГигшия

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "контроль"

Рис. 5. Показатели ИМЯ и ИМ эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи 7-суточных белых крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии.

Следует отметить, что изменения оксидативного статуса и пролиферативной активности были выявлены у 7-суточных крыс (через 10 суток после заключительного ги-побарического воздействия), что свидетельствует о сохранении постгииоксического структурно-метаболического следа в системе органов дыхания как минимум до конца периода новорожденности. Пренатальная гипоксия является ведущим фактором риска формирования пневмопатий новорожденных, в т.ч. бронхолегочной дисплазии [Tang J.R., 2000; Balasubramaniam V., 2003; Polosukhin V.V., 2007; Steinke J.W., 2008], сопровождающейся ремоделированием воздухоносных путей. [Cheung Е., 2000; Cogo А., 2003; Cutz Е., 2007; Polosukhin V.V., 2007; Coraux С., 2008; Steinke J.W., 2008]. В литературе имеются единичные данные, полученные преимущественно в экспериментах in vitro - на клеточных культурах эпителиоцитов и гладких миоцитов воздухоносных путей различных видов млекопитающих, о пролиферотропных эффектах непосредственного гипоксического воздействия [Cheung Е., 2000; Pandya Н.С., 2002; Cogo А., 2003]. Аналогичных данных о ранних постнатальных последствиях недостаточного кислородного обеспечения эмбриогенеза, зарегистрированных в эпителиальном и гладкомышечном клеточных пулах слизистой респираторного тракта in vivo (в условиях целостного организма), в доступной литературе нами не обнаружено. В нашем исследовании установлено, что у новорожденных белых крыс постгипоксическое нарушение процессов синтеза ДНК в эпителиально-гладкомышечном компартменте трахеи происходит на фоне оксидативного стресса как в легких, так и на уровне организма в целом.

Учитывая выявленные АКМ-опосредованные механизмы постгипоксического повреждения в системе органов дыхания новорожденных крыс, при выборе возможных

средств коррекции нарушений клеточно-тканевого гомеостаза мы ориентировались на вещества, обладающие в первую очередь антиоксидантными, мембраностабилизирую-щими, и, следовательно, цитопротективным свойствами.

В литературе имеются единичные данные о наличии антиоксидантных антирадикальных, цитопротективных свойств у некоторых опиоидных агонистов 5- и р- рецепторов [Флейшман М.Ю. и соавт., 1996., 2004; Лебедько O.A., 2004], однако данных о наличии подобных эффектов в системе органов дыхания у смешанных 8-/ц- агонистов - синтетических аналогов дерморфина - нами не обнаружено.

Решая этот вопрос, в наших исследованиях была предпринята попытка установить возможные эффекты синтетических аналогов дерморфина на биогенез АКМ в легких и крови экспериментальных животных, развивавшихся в условиях как нормоксии, так и недостаточного кислородного обеспечения пренатапьного периода.

Установлено, что в условиях нормального кислородного обеспечения (Табл. 4) ар-гининсодержащий аналог активизирует АОРЗ, снижает содержание гидроперекисей ли-пидов и уровень образования и накопления перекисных радикалов на фоне сохраняющихся в пределах контрольных цифр показателей интенсивности свободнорадикальных процессов и устойчивости субстрата к перекисному стрессу.

Таблица 4

Влияние олигопептидов на ХМЛ-показатели гомогенатов легких и сыворотки крови новорож-

денных белых крыс с нормальным кислородным обеспечением. (М±ш)

Показатель (отн.ед.) Контроль Аргининовый аналог Безаргининовый аналог

Легкие Кровь Легкие Кровь Легкие Кровь

Ssp 1,44±0,08 0,31 ±0,02 1,49+0,06 0,22+0,02* 1,61 ±0,09 0,34+0,03

h 1,32+0,10 0,186+0,01 0,82+0,05* 0,14+0,01* 1,40+0,08 0,22+0,02

Sind-1 3,27±0,21 0,797±0,04 2,55+0,12* 0.51+0,04* 3,68+0,17 0,83+0,05

Sluc 0,93±0,05 0,235±0,18 0,79±0,04* 0,167±0,008* 0,99±0,05 0,250±0,15

Slum 1,4810,09 0,330±0,23 1,36±0,06 0,240±0,010* 1,40±0,08 0,345±0,22

H 4,63+0,25 1,69+0,10 4,87+0,20 1,16+0,08* 4,80+0,26 1,80+0,13

Sind-2 8,27+0,65 2,34+0,20 6,42+0,62* 1,70+0,15* 8,50+0,68 2,72+0,25

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "контроль".

На уровне организма (в сыворотке крови) эффект аргининового аналога был более выраженным, нежели в легких (Табл. 4). ХМЛ-анализ позволил выявить достоверное повышение активности антиоксидантной антирадикальной системы защиты, устойчивости к перекисному окислению липидов на фоне снижения интенсивности процессинга свободных радикалов в целом, угнетения генерации супероксид-анион- и гидроксил-радикалов, в частности. Кроме того, введение олигопептида сопровождалось снижением концентрации гидроперекисей липидов в сыворотке крови.

Полученные данные свидетельствуют о способности аргининсодержащего олигопептида Н-А^-Туг-0-А1а-Р11е-01у-0Н в условиях нормоксии эмбриогенеза модулировать биогенез АКМ определенным образом - активируя эндогенные механизмы детоксикации и ингибируя генерацию АКМ.

При исследовании ХМЛ гомогенатов легких и сыворотки крови 7-суточных белых крыс, получавших безаргининовый аналог, не выявили сколь-либо значимых изменений свободнорадикального статуса как на органном, так и на системном уровнях. Все показатели сохранились в пределах контрольных значений (Табл. 4).

При изучении влияния аргининового аналога Н-А^-Туг-0-А1а-РЬе-01у-0Н на показатели активности синтеза ДНК в клетках эпителиально-гладкомышечного компар-тмента трахеи крыс, развивавшихся в условиях нормоксии эмбриогенеза (Рис. 6, 7), установлено наличие митогенного эффекта пептида в отношении эпителиоцитов и отсутствие пролиферотропных свойств - в отношении гладких миоцитов.

В эпителии трахеи ИМЯ увеличился на 35%, при этом показатели ИМ оставались в пределах контрольных уровней. Введение безаргининового аналога не оказало влияния на интенсивность клеточного деления и скорость прохождения Э-периода эпителиоцита-ми и гладкими миоцитами.

Учитывая антиоксидантные антирадикальные, тканеспецифические пролиферо-тропные свойства аргининсодержащего олигопептида, мы сочли необходимым выяснить: сохраняются ли эти эффекты при гипоксическом воздействии.

ИМЯ. эпителиоциты

I

i

Контроль Аре {*) аналог Арг(-)аг □ Контроль □ Apr(+)аналог 1Арг(-)анаг>

Контроль Apr (+) аналог Apr [•) аналог

□ Контроль □ Apr (+) аналог ■ Apr (-) аналог

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "контроль" ** - р<0.05 по отношению к группе "гипоксия" Рис. 6. Влияние олигопептидов на показатели ИМЯ эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи новорожденных белых крыс, развивавшихся в условиях нормоксии эмбриогенеза.

О Контроль □ Apr (+) аналог ■ Apr (-) аналог

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "гипоксия"

Рис. 7. Влияние олигопептидов на показатели ИМ эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи новорожденных белых крыс, развивавшихся в условиях нормоксии эмбриогенеза.

За исключением процесса образования перекисных радикалов в легких (показатель хотя и снизился, но сохранил статистически значимое увеличение в сравнении с контролем) олигопептид нивелировал все прочие постгипоксические нарушения биогенеза АКМ в легких и сыворотке крови (Табл. 5).

В легких снизились и практически достигли контрольных значений показатели интенсивности биогенеза АКМ, при этом отмечалось угнетение генерации супероксид-анион- и гидроксил-радикалов. Зарегистрированы снижение интенсивности перекисного окисления липидов, активация АОРЗ легких.

Изменения аналогичной направленности выявили при исследовании показателей свободнорадикального статуса на уровне организма (Табл. 5). При введении аргининово-го аналога животным, подвергнутым пренатальной гипоксии, в сыворотке крови отмечалось снижение продукции АКМ, интенсивности перекисного окисления липидов, скоро-

20

сти накопления перекисных радикалов (показатели практически достигли контрольных значений) на фоне стимуляции показателей АОРЗ.

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что аргининсодежащий оли-гопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH обладает антиоксидантными антирадикальными свойствами и способен нивелировать на раннем этапе постнатального онтогенеза постги-поксические проявления оксидативного стресса на локальном и системном уровнях.

Поскольку безаргининовый аналог дерморфина не продемонстрировал какой-либо активности (Табл. 5) в отношении исследуемых процессов, выявленные эффекты арги-нинсодержащего пептида в значительной степени обусловлены наличием на N-фланге L-аргинина, в результате освобождения которого запускается синтез важнейшего клеточного трансдуктора - оксида азота.

В физиологических концентрациях N0 активно участвует в формировании АОРЗ легких [Suzy A.A., 2002; Suschek C.V., 2003]. Имеются данные, полученные in vitro, свидетельствующие о том, что в этих же концентрациях NO подавляет пролиферативную активность гладких миоцитов воздухоносных путей [Hamad A.M. et al., 1999]. Эти эффекты NO рассматриваются как защитные, нивелирующие действие многочисленных эндо- и экзогенных оксидантов и митогенов, и играющие важную роль в адаптации воздухоносных путей плода к условиям внеутробного существования.

Поскольку повышение активности антиоксидантной защиты является одним из ключевых механизмов цитопротективного эффекта, уместно предположить наличие последнего у изучаемого аргининового аналога в условиях гипоксического повреждения тканей.

У новорожденных крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии, при воздействии аргининсодержащего аналога наблюдались разнонаправленные изменения ДНК-синтетической активности эпителиоцитов и гладких миоцитов. Олигопептид предотвратил снижение количества ДНК-синтезирующих эпителиоцитов: ИМЯ увеличился на 217%, достигнув показателей, близких к контрольным (Рис. 8). При этом численность гладких миоцитов, находящихся в S-периоде клеточного цикла практически достигла контрольных значений - показатель ИМЯ снизился на 31,46% (Рис. 8).

Так как внутри эпителиально-гладкомышечного компартмента эпителий является наиболее активной в метаболическом отношении тканью, то именно от состояния эпителиального пласта в основном зависит биогенез, а, следовательно, и баланс контрактиль-ных и дилятационных, прооксидантных и антиоксидантных агентов, а также морфоге-нетически активных факторов [Puchelle Е., 2006; Coraux С., 2008]. Выявленное нами свойство олигопептида стимулировать физиологическую регенерацию эпителия слизистой воздухоносных путей, возможно, является одним из механизмов реализации корригирующего эффекта пептида в отношении постгипоксических изменений синтеза ДНК обоих типов клеток эпителиально-гладкомышечного компартмента. Данный эффект проявился нормализацией ИМЯ и ИМ эпителиоцитов и гладких миоцитов в группе «гипоксия + Арг(+)аналог» (Рис 8, 9).

Об оксид азот-опосредованном механизме корригирующего влияния олигопептида также свидетельствует отсутствие такового у его безаргининового аналога в отношении пролиферативной активности эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи новорожденных белых крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии.

При пневмопатиях новорожденных типичная патоморфологическая картина, наряду с деструктивными изменениями эпителиального пласта, включает увеличение объема и массы гладкомышечного слоя слизистой воздухоносных путей [Fahy J.V., 2000; Ао-shiba К., 2004].

Таблица 5

Влияние олигопептидов на показатели спонтанной и индуцированной ХМЛ гомогенатов легких и сыворотки крови __новорожденных белых крыс, подвергнутых пренаталъной гипоксии, (М±т)__

Показатель (отн.ед.) Бяр 11 вше!-! БЬс 81шп Н 8тс1-2

Контроль Легкие ] ,44±0,08 1,32±0,10 3,27+0,21 0,93±0,05 1,48±0,09 4,63+0,25 8,27+0,65

Кровь 0,31 ±0,02 0,186+0,01 0,797±0,04 0,235±0,18 0,330±0,23 1,69+0,10 2,34+0,20

Гипоксия Легкие 2,86±0,15* 2,83+0,15* 7,12+0,43* 2,13±0,10* 3,08±0,14* 12,56+1,11 * 17,14+1,15*

Кровь 0,74±0,062* 0,64±0,05* 2,23±0,11* 0,520±0,35* 0,790±0,50* 6,06±0,52* 9,30±0,70*

Гипоксия Арг(+)аналог Легкие 1,57+0,09** 1,25±0,06** 5,12±0,34*,** 1,00±0,06 1,61+0,08 4,91±0,28** 9,44±0,70**

Кровь 0,283±0,024** 0,20±0,016** 0,71 ±0,052** 0,265±0,17 0,312±0,20 1.52±0,10** 2,10±0,16**

Гипоксия Арг(-)аналог Легкие 2,90±0,17* 2,75±0,16* 8,72±0,50* 2,18+0,11* 3,14±0,12* 13,04+1,22* 16,18+1,20*

Кровь 0,713±0,05* 0,577±0,04* 2,45±0,12* 0,545±0,30* 0,807±0,52* 6,41±0,58* 9,12±0,73*

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "контроль".

** - р<0.05 по отношению к группе "гипоксия".

ИМЯ, эпитвлиоциты

□ Контроль I

о Гипоксия + Арг(+)аналог |

I Гипоксия

I Гипоксия + Арг(-)аналог

ИМ. эпитвлиоциты

ИМ. миоциты

О Контроль га Гипоксия

а Гипоксия + Арг(+)аналог ■ Гипоксия + Арг(-)аналог

Рис. 8. Влияние олигопептидов на ИМЯ эпителиоцитов и гладких Рис. 9. Влияние олигопептидов на ИМ эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи новорожденных белых крыс, подвергнутых прена- миоцитов трахеи новорожденных белых крыс, подвергнутых прена-тальной гипоксии. тальной гипоксии.

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "контроль" ** - р<0.05 по отношению к группе "гипоксия"

Таблица 6

Влияние олигопептидов на XMJI-показатели гранулоцитов цельной крови in vitro _ у пациентов младшей возрастной подгруппы, (М±ш)_

Slue Sluc+Z K-luc Slum Slum+Z K-lum

Контроль 0,1810,01 1,62+0,070 8,8110,31 0,2310,02 2,17±0,1 9,2510,31

И 0,9810,05* 4,98+0,24* 5,0810,28* 1,19±0,11* 6,13+0,22* 5,1710,22*

о 1 i с 1> Ф 0,9710,05* 4,86+0,22* 5,01±0,23* 1,20±0,12* 6,07+0,21* 5,0810,23*

Ш У * О Арг(+) аналог 0,33±0,02 * ** *** 2,6210,11 * ** *** 8,0610,32 ** *** 0,41 ±0,03 * ** ♦ 3,57±0,10 * ** *** 8,7210,32 # ***

Арг(-) аналог 0,96±0,05* 4,83+0,25* 5,0210,20* 1,12±0,09* 6,15+0,23* 5,4910,21*

И 0,4810,03 * ** 3,5510,14 * ** 7,4310,318 * ** 0,64 ±0,03 * 4,98±0,19 * ** 7,8510,21 * **

ХВЗЛ-ремиссия Ф 0,4910,02 * ♦ ♦ 3,5910,19 * ** 7,4010,22 * ** 0,65±0,02 * ** 5,03±0,19 * ** 7,7710,29 * **

Арг(+) аналог 0,2010,01 ++ *** **** 1,77±0,10 ** *** **** 8,7010,34 ** *** **** 0,26±0,02 2,33±0,11 ** **% **#* 9,1010,42 ** *** ****

Арг(-) аналог 0,4510,020 * ** 3,4710,20 * ** 7,6710,23 * ** 0,62+0,04 * ** 4,85±0,19 7,8710,32 * **

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе " Контроль".

- р<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-обострение р<0.05 по отношению к группе "Арг(-)аналог» р<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-ремиссия»

Таблица 7

Влияние олигопептидов на ХМЛ-показатели гранулоцитов цельной крови in vitro у пациентов старшей возрастной подгруппы, (М±т)

Slue

Sluc+Z

K-luc

Slum

Slum+Z

K-luc

Контроль

0,21+0,01

2,02+0,10

9,42010,390

0,26+0,01

2.67+0,11

10,18+0,47

И

1,11 ±0,07

5,4510,23*

4,910±0,219*

1,25±0,09*

6,25+0,22

5,00±0,24*

1,07±0,08

5,16±0,21*

4,80±0,230*

1,20±0,08*

6,1410,23*

5,1210,25*

a

Apr(+) аналог

0,39+0,02 ♦ ** ♦*#

3,23±0,18

8,202±0,354

0,43±0,02 * ***

3,73+0,14 * ** ***

8,71 ±0,32 * ** ***

Apr(-) аналог

0,99±0,07

4,6810,19*

4,73010,205*

1,18±0,09

6,02+0,23

5,1010,22*

0,58±0,02

3,07±0,11 *

6,05±0,28 * **

0,59±0,03

4,18+0,15 * **

7,0310,22 "

I

(Г>

m X

0,59+0,02 * ♦ ♦

3,57410,13

6,1010,24 * **

0,5810,02 * **

4,09+0,14 * **

7,0510,27

Apr(+) аналог

0,2410,01

2,1810,09 *** ****

9,0710,36 *** ****

0,2810,01 *** ♦

2,77+0,11 ** *** ****

9,81 ±0,41 ** ****

Apr(-) аналог

0,56±0,02

3,4110,14 * **

6,0510,23 * **

0,5810,03 * **

4,13+0,13

7,1010,22 * **

Примечание: * - р<0.05 по отношению к группе "Контроль".

** - р<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-обострение *** - р<0.05 по отношению к группе "Арг(-)аналог» **** - р<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-ремиссия»

Известно, что многие хронические воспалительные заболевания легких сопровождаются, либо, в конечном итоге, осложняются ремоделированием воздухоносных путей [Puchelle Е., 2006; Sugiura Н., Ichinose М., 2008].

В этом контексте способность олигопептида нивелировать разнонаправленные изменения (снижение - в эпителиоцитах, увеличение - в гладких миоцитах) активности синтеза ДНК представляет несомненный практический интерес - перспективу создания на его основе препаратов для коррекции патологического ремоделирования воздухоносных путей на ранних этапах постнатапьного онтогенеза.

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют, что на раннем этапе постнатального онтогенеза аргининсодержащий олигопептид способен сдвигать баланс в системе «генерация АКМ - детоксикация АКМ» в легких и на уровне организма в целом в сторону усиления процессов деградации высокотоксичных форм АКМ как в условиях нормоксии, так и на фоне оксидативного стресса, опосредованного воздействием внутриутробной гипоксии.

Полученные нами данные свидетельствую в пользу того, что на уровне эпители-апьно-гладкомышечного компартмента слизистой оболочки воздухоносных путей исследуемый олигопептид потенцирует и оптимизирует один из детерминирующих факторов гистогенеза - активность внутриядерного синтеза ДНК, корригируя структурно-метаболические последствия гипоксии.

Экстраполируя данные эксперимента на клинический уровень, мы исследовали влияние синтетических аналогов дерморфина на XMJ1 гранулоцитов цельной крови наших пациентов in vitro. Изучали влияние препаратов в обеих возрастных группах как в периоде обострения XB3JI, так и в периоде ремиссии (Табл. 6,7).

Аргининсодержащий олигопептид корригировал нарушения оксидативного метаболизма гранулоцитов по всем исследуемым параметрам, в том числе и по уровню резервных возможностей гранулоцитарной системы (Табл. 6, 7). Полученные нами данные в определенной степени согласуются с результатами исследований [Azuma Y. Et al., 2000], свидетельствующие, что эндогенные ц - агонисты эндоморфины 1 и 2 модулируют продукцию супероксид радикала в культуре нейтрофилов: при «дыхательном взрыве» угнетают, в базальных условиях - стимулируют.

Не содержащий аргинин аналог не проявил активности, что подтверждает роль оксида азота в механизмах реализации выявленных корригирующих эффектов олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH.

Таким образом, установленные антиоксидантные, цитопротективные свойства олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH открывают перспективу использования его в качестве нанокорректора оксидативных нарушений в педиатрической пульмонологической практике.

На основе проводимых исследований планируется разработка биотехнологических способов индукции клеточной и внутриклеточной регенерации эпителиоцитов с помощью олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в терапии хронических воспалительных заболеваний легких, и создание новых технологий диагностики и дифференцированного подхода к терапии данной патологии. Селективная молекулярная коррекция нарушений метаболизма позволит пролонгировать период ремиссии у детей с XB3J1 и ингибировать прогредиентность заболевания.

выводы

1. Для детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы характерна маломанифестность клинических симптомов.

2. У детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периоде обострения имеет место оксидативный стресс, сохраняющийся, хотя и в меньшей степени выраженности, и в периоде ремиссии. При этом выявлена возрастная эволюция нарушений различных уровней оксидативного статуса.

3. У детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периодах обострения и ремиссии выявлено снижение функционального резерва гранулоци-тов на фоне гиперпродукции этими клетками супероксид-анион- и гидроксил-радикапов.

4. Корреляционные взаимосвязи показателей оксидативного статуса гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови и бронхоальвеолярного лаважа у детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, свидетельствуют о сопряженности нарушений оксидативного метаболизма на локальном и системном уровнях.

5. У детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы имеет место несовпадение сроков клинической и метаболической ремиссии. В связи с чем, данный контингент пациентов нуждается в антиоксидантной антирадикальной терапии не только в периоде обострения, но и в периоде ремиссии.

6. Пренатальная гипоксия вызывает разнонаправленные изменения активности синтеза ДНК в эпителиально-гладкомышечном компартменте трахеи новорожденных белых крыс: снижение - в эпителиоцитах и повышение - в гладких миоцитах.

7. У новорожденных белых крыс постгипоксическое нарушение процессов синтеза ДНК в эпителиально-гладкомышечном компартменте воздухоносных путей происходит на фоне оксидативного стресса в легких и на уровне организма в целом.

8. Олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH обладает антиоксидантными антирадикальными свойствами, нивелирует постгипоксические проявления оксидативного стресса на локальном и системном уровнях, корригирует нарушения синтеза ДНК в эпителиоцитах и гладких миоцитах воздухоносных путей новорожденных белых крыс, перенесших пренатальную гипоксию.

9. Олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH корригирует in vitro нарушения оксидативного метаболизма гранулоцитов у детей с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

10. В реализации корригирующих эффектов олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-ОН важную роль играет оксид азот-зависимые механизмы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В периоде обострения у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы целесообразно применение с целью дотации резервов эндогенной АОРЗ фармакологических препаратов с антиоксидантными антирадикальными свойствами.

2. Дети с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периоде ремиссии нуждаются во включении в комплекс реабилитационной медикаментозной терапии направленного антиоксидантного компонента.

3. Дети с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы нуждаются в направленной медикаментозной коррекции в отношении нарушений функциональных возможностей гранулоцитов. Определение низких значений коэффициента стимуляции при оценке оксидативного статуса гранулоцитов, достоверно свидетельствующих

о потенциальной емкости функциональной активности клеток, является показанием к максимально раннему применению корригирующих мероприятий.

4. С целью оптимизации диагностики степени активности воспалительного процесса у детей с XB3J1 на фоне дефектов органогенеза респираторной системы, в качестве дополнительных высокоинформативных критериев прогнозирования развития обострения, рекомендуется использовать разработанный алгоритм оценки оксидативного статуса в комплексе клинико-лабораторного обследования.

5. Внедрение в клиническую практику разработанного ХМЛ-метода оценки оксидативного статуса, в качестве дополнительного критерия прогноза прогредиентности заболевания, обосновывает возможность дифференцированного подхода к лечению больных с данной патологией. Использование комплекса ХМЛ-параметров оценки прооксидантно-антиоксидантного статуса рекомендуется в качестве критерия эффективности коррекционных мероприятий при различных видах и периодах бронхо-легочной патологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гусева, O.E. Особенности иммунного и цитокинового профиля у детей с бронхоле-гочной дисплазией [Текст] / М.В. Ефименко, Э.Х. Курпас, O.E. Гусева, Е.В. Пичуева, Козлов В.К. // Дальневосточный медицинский журнал. - 2004. - №3. - с. 110.

2. Гусева, O.E. Особенности иммунного статуса и цитокинового профиля у детей с бронхолегочной дисплазией при различных вариантах обострения [Текст] / Т.Ф. Боровская, Э.Х. Курпас, O.E. Гусева, М.В. Ефименко, В.К. Козлов, Е.В. Пичуева, С.Г. Гандуров // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2005. - Вып. 21.-с. 69-72

3. Гусева, O.E. Влияние аналогов дерморфина и лей-энкефалина на биогенез активных кислородных метаболитов в кардиореспираторной системе новорожденных белых крыс [Текст] / С.Ю. Крыжановская, O.E. Гусева, O.A. Лебедько, E.H. Сазонова, С.С. Тимошин // Дальневосточный медицинский журнал. - 2006. - №3. - с. 86-88.

4. Гусева, O.E. Корригирующее влияние неопиоидного аналога лей-энкефалина на биогенез активных кислородных метаболитов в кардиореспираторной системе новорожденных крыс, подвергнутых внутриутробной гипоксии [Текст] / С.Ю. Крыжановская, O.E. Гусева, O.A. Лебедько, E.H. Сазонова // Актуальные проблемы морфологии. Сборник научных трудов, посвященный 30-летию организации ГУ НИИ медицинских проблем Севера, СО РАМН. Выпуск №5 - Красноярск , 2006. - с. 85-87.

5. Гусева, O.E. Состояние системы биогенеза активированных кислородных метаболитов в сыворотке крови детей с пороком развития легких в стадии ремиссии и при обострении [Текст] / O.E. Гусева, O.A. Лебедько // XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания, II конгресс Евроазиатского респираторного общества, сборник трудов конгресса, Санкт-Петербург, 2006.- с. 69.

6. Гусева, O.E. Применение седатина для коррекции нарушений биогенеза активированных кислородных метаболитов в легких и крови новорожденных крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии [Текст] / O.E. Гусева, O.A. Лебедько // XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания, II конгресс Евроазиатского респираторного общества, сборник трудов конгресса, Санкт-Петербург, 2006,- с. 121.

7. Гусева, O.E. Этиопатогенетические и клинические особенности формирования хронических обструктивных болезней легких у детей Приамурья [Текст] / В.К. Козлов, Б.Я. Рыжавский, O.A. Лебедько, Н.В. Морозова, O.E. Гусева, М.В. Козлов // Бюл-

летень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - Благовещенск, 2008. - Вып. 30. -с. 11-13.

8. Гусева, O.E. Применение седатина для коррекции нарушений биогенеза активных кислородных метаболитов в легких и крови новорожденных крыс, подвергнутых пре-натальной гипоксии [Текст] / O.A. Лебедько, O.E. Гусева, С.С. Тимошин // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - Благовещенск, 2008. - Вып. 30. - с. 3840.

9. Гусева, O.E. Особенности оксидативного метаболизма фагоцитов цельной крови при хронических бронхообструктивных заболеваниях легких у детей [Текст] / O.A. Лебедько, O.E. Гусева, В.К. Козлов // Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе. Материалы научно-практической конференции с международным участием. -Хабаровск, 2007. -с. 86-87.

10. Гусева, O.E. Нарушения оксидативного метаболизма при хронических бронхообструктивных заболеваниях легких у детей [Текст] / O.E. Гусева // Наука - Хабаровскому краю. Материалы X краевого конкурса молодых ученых. - Хабаровск, 2008.- с. 172-178.

11. Гусева, O.E. Влияние in vitro синтетического аналога дерморфина на оксидативный метаболизм фагоцитов у детей с бронхолегочной дисплазией [Текст] / O.A. Лебедько, O.E. Гусева, С.С. Тимошин // Современные проблемы регионального развития. Материалы II научной конференции. - Биробиджан - Кульдур, 2008. - с. 151-152.

12. Гусева, O.E. Влияние седатина на постгипоксические нарушения в кардиореспира-торной системе новорожденных белых крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии [Текст] / O.A. Лебедько, С.С. Тимошин, O.E. Гусева, С.Ю. Крыжановская // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - Благовещенск, 2008. выпуск 30 -с. 1113.

13. Гусева, O.E. Пептидный препарат седатин - корректор нарушений кардиореспира-торной системы у новорожденных белых крыс, перенесших пренатапьную гипоксию [Текст] / O.E. Гусева, С.Ю. Крыжановская, O.A. Лебедько, С.С. Тимошин, В.К. Козлов // Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 70-летию Хабаровского края. - Хабаровск, 2008. - с. 190-194.

14. Гусева, O.E. Влияние пептидного препарата седатин на биогенез активных кислородных метаболитов в кардиореспираторной системе новорожденных белых крыс, развивавшихся в условиях нормоксии [Текст] / O.E. Гусева, С.Ю. Крыжановская, O.A. Лебедько, С.С. Тимошин, В.К. Козлов // Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 70-летию Хабаровского края. - Хабаровск, 2008. - с. 195-197.

15. Гусева, О. Е. Применение олигопептида H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в качестве нанокорректора нарушений оксидативного метаболизма при хронических бронхообструктивных заболеваниях легких на раннем этапе онтогенеза (экспериментальное исследование) [Текст] / O.E. Гусева, O.A. Лебедько, С.С. Тимошин, В.К. Козлов // Международный форум по нанотехнологиям 3-5.12. Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехноло-гий. - Москва, 2008. - с. 57016. Гусева, О. Е. Влияние синтетического аналога дерморфина на ДНК-синтетическую

активность эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи новорожденных белых крыс,

подвергнутых пренатальной гипоксии [Текст] / O.E. Гусева, O.A. Лебедько, С.С. Тимошин // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - № 1. - с. 95-97.

17. Гусева, О. Е. Особенности биогенеза активных кислородных метаболитов у детей с хроническими бронхообструктивными заболеваниями легких на фоне бронхолегоч-ной дисплазии [Текст] / O.A. Лебедько, O.E. Гусева, В.К. Козлов // Новые медицинские технологии. Новое медицинское оборудование. - Москва, 2009. №3. - с. 9-12

18. Гусева, O.E. Особенности биогенеза свободных радикалов у детей с хроническими воспалительными заболеваниями легких на фоне дефектов органогенеза респираторной системы [Текст] / O.E. Гусева, O.A. Лебедько, В.К. Козлов // Дальневосточный медицинский журнал. — 2009. — №2 — с. 64-66.

19. Гусева, O.E. Возрастные особенности хемилюминесценции цельной крови у детей с хроническими воспалительными заболеваниями легких на фоне дефектов органогенеза респираторной системы [Текст] / O.E. Гусева, O.A. Лебедько, В.К. Козлов // Дальневосточный медицинский журнал - 2009. - №4 - с. 74-77.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОРЗ - антиоксидантная антирадикальная система защиты

БАЛЖ - бронхоальвеолярный лаваж

ИМ - интенсивность метки

ИМЯ - индекс меченых ядер

СРО - свободнорадикапьное окисление

СР - свободные радикалы

ХВЗЛ - хронические воспалительные заболевания легких ХМЛ- хемилюминесценция NO - оксид азота

Бумага писчая формат 60x84/1 б.Тираж 100 экз. заказ № 62 Издательство Дальневосточного государственного

медицинского университета 680000,г.Хабаровск,ул.Муравьева-Амурского,35