Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Определение факторов прогноза течения рака молочной железы на основании молекулярно-генетических исследований

На правах рукописи

ЗИННАТУЛЛИНА Гузель Фардинатовна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРОВ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОСНОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.00.14 - Онкология 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 17-5623

УФА 2007

003175623

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г Уфа

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Ганцев Шамиль Ханафиевич Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Зинченко Рена Абульфазовна Вырупаев Сергей Викторович

Ведущая организация Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «7» ноября 2007г в _ часов на заседании

диссертационного совета К 208 006 01 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования '<Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу 450000, г Уфа, ул Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Автореферат разослан «_»_2007г

Ученый секретарь диссертационного совета

И Р Рахматуллина'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в России сохраняется высокий уровень заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований различных локализаций Статистические показатели последних лет свидетельствуют о том, что рак молочной железы занимает первое место в структуре онкопатологии женского населения большинства высокоразвитых стран мира, в том числе и в России, и имеет тенденцию к неуклонному росту [Чиссов В , 1999, Семиглазов В Ф., 2005].

Наряду с ростом заболеваемости происходит и увеличение смертности во всем мире При этом в структуре смертности от всех злокачественных новообразований женщин рак молочной железы имеет наибольший удельный вес, составляя в США 18%, в странах Европы-17% [Аксель Е М, 1994, Давыдов МИ, 2004], в России данный показатель в 1997г составил 17% [Чиссов В, 1999] Риск возникновения заболевания в течение жизни оценивается в среднем у женщин в 11% случаев В основе снижения смертности среди женщин от РМЖ лежит раннее выявление заболевания, качественное и полное лечение [Гарин А М, 2001]

За последнее десятилетие произошли существенные изменения в понимании механизмов развития рака молочной железы, методов диагностики и лечения, но закономерности функционирования генома раковой клетки еще далеки от своего понимания На сегодняшний день картирован и клонирован целый ряд генов, вовлеченных в канцерогенез, эти гены являются и хранителями клеточного цикла, и генами общего контроля Доказано, что мутации или структурные изменения, нарушающие функцию генов, поддерживающих стабильность генома, и, прямо или косвенно участвующих в репарации повреждений ДНК, предрасполагают к возникновению опухоли [Rebbeck Т R, 2002, Buslov К В., 2004]

Выделяют наследственные и спорадические формы рака молочной железы [Любченко JIН, Гарькавцева Р Ф, 2004] Наследственная предрасположенность к возникновению злокачественного новообразования

проявляется в накоплении случаев указанного заболевания в семьях Установлен аутосомно-доминантный тип наследования рака молочной железы в семьях с высоким риском [Pharoah Р D, 2002; Antoniou А, 2003] Большим достижением молекулярной биологии в конце прошлого века было открытие генов BRCAI и BRCA2 [Miki Y, 1994, Wooster R, 1995] Наибольшая доля наследуемых форм рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в этих генах [Walsh Т et al, 2006] Мутации гена BRCA1 являются высокопенетрантными и риск возникновения данной патологии у носителей таких мутаций достигает 50-90% [Grzybowska Е, 2000, Pohlreich Р, 2005, Mitchell G , et al, 2006, Walsh T et al, 2006] Необходимо отметить, что спектр и частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 может сильно варьировать в различных популяциях и регионах [Peelen Т , 1997, Hakansson S , 1997, Stoppa-Lyonnet D, 1997, Gayther S А , 1997, Santarosa M , 1998, Grzybowska E , 2000, Van der Looij M , 2000; Diez О , 2003, Pohlreich P, 2005]

Редкие терминальные мутации генов BRCAI 12 отвечают не более чем за 25% всех семейных форм заболевания РМЖ Оставшееся разнообразие случаев рака молочной железы можно объяснить комбинацией более распространенных, низкопенетрантных полиморфных вариантов других генов [Pharoah Р, 2002]

Спорадическая форма рака, также как и семейная, имеет генетическую компоненту, только ее структура может быть намного сложнее Опухоль, в этом случае, развивается под воздействием не одной мутации, а целой группы Исследования полиморфизма генов, вовлеченных в канцерогенез, позволили выявить такие сочетания полиморфных состояний генов, которые повышают вероятность возникновения рака Большое внимание исследователей направлено на изучение генов NBSI (Nijmegen breakage syndrome), ATM (Ataxia telangiectasia mutated), CHEK2 (Cell-cycle checkpoint kinase), CASP8 (каспаза 8), TGFbl (трансформирующий фактор роста), XRCCA (X-ray repair complementing defective m Chinese hamster) и др [Dufault MR et al, 2004, Buslov К В , 2004,

Bogdanova N, 2005, Antomou А С and Easton D F , 2006, Bierie В , Moses H L, 2006, Cox A , 2007]

Молекулярно-генетические работы, посвященные изучению рака молочной железы, проводятся и в России. Они затрагивают, в основном, исследования мутаций генов BRCAI и BRCA2 у больных с отягощенным семейным анамнезом раком молочной железы и раком яичников (РЯ) [Логинова А Н, 2004, Любченко Л Н , Гарькавцева Р Ф , 2004, Мандельштам М Ю , 2005, Смирнова Т Ю , Карпухин А В , 2007, Любченко Л Н, Гарькавцева Р Ф , 2007] Выявление мутаций в изучаемых генах обеспечивает объективный критерий для формирования групп повышенного риска рака молочной железы с целью его профилактики и ранней диагностики

В связи с высоким уровнем заболеваемости и неуклонным ростом смертности от рака молочной железы во всем мире идентификация генов, вовлеченных в развитие РМЖ, является важной медико-генетической задачей, решение которой будет способствовать формированию фундаментальных представлений о патогенезе этого заболевания, а также позволит выявить генетические факторы риска развития РМЖ

На основании вышесказанного были определены следующие цель и задачи

Цель исследования повышение уровня диагностики рака молочной железы на основе анализа клинического течения заболевания и выявления молекулярно-генетических маркеров риска развития данной патологии Задачи исследования

1 Создать банк ДНК больных раком молочной железы, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа - Югра и дать клиническую характеристику больных раком молочной железы

2 Провести поиск мутаций 5382msC и CysölGly гена BRCA1 у больных раком молочной железы

3 Изучить частоту распространения мутаций IVS2+1G>A, I157T и CHEK2de\e9,10(5kb) гена СНЕК2 (Cell-cycle checkpoint kinase), мутации 657del5 гена NBS\ (Nymegen breakage syndrome) в группе контроля и больных раком молочной железы и оценить вклад перечисленных ДНК-маркеров в развитие данной патологии

4 У больных раком молочной железы и в группе здоровых женщин изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов TGF/31 (transforming growth factor /?). CAS Pi (caspase) и TP53 (супрессор опухоли) и провести анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов с риском развития рака молочной железы

5 Усовершенствовать подходы к ДНК-диагностике и определению тактики ведения больных раком молочной железы

Эти задачи представляются чрезвычайно актуальными и требуют своего решения

Научная новизна исследования. Впервые на базе лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН (г Уфа) создан банк ДНК больных раком молочной железы, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа - Югры На большом клиническом материале изучена частота встречаемости мутаций 5382msC и Cys61Gly гена BRCAI, впервые в республике Башкортостан и в ХМАО изучена частота встречаемости полиморфных локусов IVS2+1G>A, I157T и C#£K2dele9,I0(5kb) гена СНЕК2, делеции 657del5 гена NBS1 у больных раком молочной железы Впервые проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов L10P, D302H, R72P генов TGF/31 CASP8, ТР53, соответственно, у больных и здоровых доноров Изучена взаимосвязь проанализированных мутаций и полиморфизмов исследованных генов с клиническим проявлением рака молочной железы

Практическая значимость. Оценка частот распространения мутаций 5382msC и Cys61Gly в гене BRCAI, IVS2+1G>A и CHEK2de\e9,10(5kb) в гене

СНЕК2, а так же делеции 657del5 в гене NBSI позволяет проводить ДНК-диагностику рака молочной железы у женского населения нашего региона

Выявление мутаций IVS2+1G>A и C#£K2dele9,10(5kb) в гене СНЕК2 и полиморфизма R72P гена 7Р53 у больных раком молочной железы позволит определить дальнейшую тактику лечения и, тем самым, повысить уровень выживаемости при данной патологии

Положения, выносимые на защиту

1 Прямая зависимость между возрастом манифестации рака молочной железы и состоянием репродуктивной функции организма женщины

2 Высокая частота носительства (4%) мутации 5382msC гена BRCA1 у больных раком молочной железы с наследственными формами заболевания, а также у женщин с неотягощенным семейным анамнезом

3 Генетическими маркерами предрасположенности к развитию рака молочной железы являются мутации IVS2+1G>A и C/ffiOdele9,10(5kb) гена СНЕК2

4 У носителей генотипа Arg72/Pro72 гена супрессора опухолей 7Р53 высокий риск развития злокачественных новообразований молочной железы Генотип Arg72/Arg72 обладает протективным свойством

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции по вопросам онкологической помощи населению РФ (Казань, 2007), на научно-практической конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по Физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), проблемной комиссии «Онкология» (Уфа, 2006) Диссертация обсуждена на межлабораторном семинаре отдела геномики Института биохимии и генетики УНЦ РАН (2007), а также на кафедре онкологии Башкирского государственного медицинского университета (2007)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, 1 из работ представлена в журнале, рекомендованном ВАК РФ

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 14 таблицами, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 36 отечественных и 123 зарубежных источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы и методы исследования. Под нашим наблюдением находилось 410 больных раком молочной железы, проходивших стационарное лечение в отделении маммологии Клинического онкологического диспансера МЗ Республики Башкортостан (г Уфа) и пациентки онкологического отделения Сургутской окружной клинической больницы Ханты-Мансийского автономного округа (п=122) (г Сургут) за период 2001-2007г Для лабораторных методов обследования забор крови осуществлялся на базе вышеуказанных лечебных учреждений после осмотра исследуемых групп Исследование проводилось на основании письменного согласия пациентов В качестве контроля использованы образцы крови 1177 здоровых женщин, проживающих в тех же регионах, что и обследуемая группа

Данные о каждой пациентке со злокачественным новообразованием молочной железы и здоровых доноров, собранные путем опроса, объективного и физикальных методов обследования, занесены в специально разработанную нами формализованную карту (ФК), на основании которой создана компьютерная база данных ФК заполнялась индивидуально на каждого пациента и доноров контрольной группы для последующего занесения в генетический регистр «Рак молочной железы» У исследуемой группы больных диагноз был верифицирован Возраст пациентов, участвовавших в данном исследовании, колеблется от 26 лет до 81 года Средний возраст манифестации заболевания составляет 50,5±11,5 лет В ходе исследования уточнялись данные

об этнической принадлежности пациенток путем опроса и выяснения национальной принадлежности родителей до третьего поколения

Лабораторные исследования выполнены на базе лаборатории Молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН (Уфа, Россия) и лаборатории по изучению рака молочной железы Ганноверской медицинской школы (Ганновер, Германия) выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод аллель-специфичной ПЦР, метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (real-time PCR), секвенирование вариабельных фрагментов ДНК с помощью секвенатора ABI3100

Статистические методы анализа. Сравнение частот аллелей и генотипов проводили при помощи теста х2> полученные значения р признавались достоверными при значении меньше 0,05 Силу ассоциаций выражали в значениях риска, оцененного как относительный шанс (OR) с 95%-ным интервалом достоверности (CI) Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа "Медико-биологическая статистика" С Гланца [Glantz S , 1998]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клиническая характеристика больных раком молочной железы.

Среди больных было отмечено наличие случаев рака молочной железы в анамнезе в 9,6% случаев, которые распределились следующим образом у представителей I степени родства у 20 больных, II степени родства - у 12 пациенток, III степени родства - в 4 случаях заболевания

При распределении исследуемой группы больных по возрасту возникновения рака молочной железы, пик манифестации заболевания отмечается в возрасте от 41 до 60 лет, что составляет 59% из всей выборки больных В возрастной группе до 55 лет рак молочной железы установлен в

60% случаев В 55,7% случаев к моменту манифестации заболевания менструальная функция была сохранена Прослеживается зависимость между возрастом манифестации заболевания и состоянием репродуктивной функции организма женщины

По стадиям заболевания, установленным при первичном обращении, у исследуемой группы I стадия заболевания выявлена в 14% случаев, Па стадия — в 26%, IÍ6 стадия - в 27% случаев, Illa стадия- в 20% случаев, III6 стадией- в 5,5%, Шс стадией- в 4%, и IV стадия установлена в 3,5% случаев рака молочной железы Из этого следует, что большую часть обследованных больных с данной патологией составили пациентки со На, Иб и Illa стадиями

Среди морфологических вариантов рака молочной железы большую часть составляют инфильтративный протоковый рак и рак с преобладанием внутрипротокового компонента (60%), а также инфильтративный дольковый рак (33%), которые, по данным литературы, имеют тенденцию к мультицентричному и двустороннему поражению молочных желез [Божок А А, 2005] Особые гистологические варианты (тубулярный, папиллярный, медуллярный, слизистый, криброзный) имеются у 6,5% исследуемой группы больных При распределении групп по степени клеточного атипизма опухолевой ткани (степени злокачественности) нами получены следующие результаты I- 27%, II- 43%, III- 30% Таким образом, большую группу составляют опухоли с умеренной и низкой дифференцировкой клеток

Изучение мутации 5382insC гена BRCAI у больных раком молочной железы.

Проведен анализ распространения мутаций 5382msC (c5266dupC) и CysólGly гена BRCA1 у больных раком молочной железы (п=375) Поиск мутации 5382msC гена BRCAI был выполнен с помощью ПДРФ анализа (рис 1) с использованием эндонуклеаз рестрикции ScrFl или Ddel Все позитивные случаи были подтверждены секвенированием (рис 2)

1 2 3 4 5 6 Рис.1. Электрофореграмма рестрикционного анализа мутации 5382тзС гена ВЯСА 1. Дорожка 1 - маркер молекулярного веса; 3, 4, 5 - образцы гомозигот по аллелю дикого типа; 2, 6 — образцы ДНК гетерозигот по мутации 5382тзС.

<Е<гв «с т т п с с т т т сг 13ТСС т с нтккяит яви гтыгггя т т» 163 181 13 3 а о 5

Рис. 2. Фрагмент нуклеотидной последовательности гена ВЯСА1 с мутацией 5382шзС гена в гетерозиготном состоянии.

1 2 3 4 5 6 7 Рис. 3. Электрофореграмма после аллель-специфичной ПЦР мутации Суз6Ю1у гена ВЛСА1. Дорожка 1 - маркер молекулярного веса; 3, 4, 5, 6 - образцы без мутации; 2,1 - образцы ДНК с мутацией СуБбШ1у.

Поиск мутации СуБбЮ1у был выполнен с помощью аллель-специфичной ПЦР, реакция проводилась с использованием внутреннего контроля для гена МХП (рис.3).

Выявлено 15 носителей инсерции цитозина в позиции 5382 гена ВЕСА 1 среди больных раком молочной железы (4,0%) У 6 пациенток, являющихся носителями мутации, отмечены случаи заболевания в семье Средний возраст манифестации заболевания у носителей данной мутации составил 42,8±5,8 лет, тогда как средний возраст пациентов без мутации 50,5±6,7 лет Группа носительниц мутации неоднородна по этническому составу русские - 8, татары

- 4, украинцы - 1, марийцы - 1, мордва - 1 У 60 больных раком молочной железы башкирского этнического происхождения, инсерция гена ВИСА 1 не выявлена Возможно, что широко распространенная в Центральной и Восточной Европе 53821шС не характерна для башкир Для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дальнейших исследований

По стадиям заболевания группа больных раком молочной железы, являющихся носителями инсерции цитозина в 5382 позиции гена ВЯСА1, распределились следующим образом I стадия заболевания установлена у 2 (13,3%) пациенток, НА стадия - у 7 (46,7%), ПВ стадия - у 2 (13,3%), ША стадия установлена у 1 (6,7%) больной, и ШВ стадия - в 2 (13,3%) случаях

Среди морфологических вариантов рака молочной железы большую часть составляют инфильтративный протоковый рак (50%), инфильтративный дольковый рак и аденокарцинома - по 25% случаев

При распределении носителей данной мутации по состоянию репродуктивной функции получены следующие результаты сохраненная функция у 11 больных раком молочной железы, менопауза до 5 лет у 4 больных Ранее всем носителям исследуемой мутации среди больных раком молочной железы было проведено оперативное лечение - 15, комбинированное

— 4, комплексное лечение - 4 пациенткам Только хирургическое лечение было проведено в 8 случаях рака молочной железы

В одном случае среди носителей мутации 53821шС гена ВКСА1 установлено заболевание выявлено в возрасте 33 лет, и, несмотря на проведенное комплексное лечение (в неоадъювантном режиме курс лучевой терапии, 3 курса химиотерапии, мастэктомия, в адъювантном режиме до 5

курсов химиотерапии), через 6 месяцев было отмечено прогрессирование болезни, выявлено множественное вторичное поражение головного мозга, что явилось причиной летального исхода Среди носителей мутации в 80% случаев отсутствуют эстрогеновые и прогестероновые рецепторы У 9 пациенток (что составляет более 50%) отсутствует поражение лимфатических узлов Полученные результаты согласуются с мировыми данными ранняя манифестация заболевания, преобладание негативного статуса эстрогеновых и прогестероновых рецептров

По данным литературы, опухоли, вызванные мутациями генов BRCA1 и BRCA2, имеют более высокую степень злокачественности относительно спорадических случаев рака молочной железы [Wagner Т, 1998 ] Для нашей выборки больных с мутацией 5382msC характерна средняя степень злокачественности G2-3, возможно, что такое отличие связано с небольшим количеством носителей мутации, выявленных в работе Считается, что для BRCAI-ассоциированного рака молочной железы характерен высокий уровень развития контралатерального РМЖ, некоторые исследователи рекомендуют проводить превентивную мастэктомию [Brekelmans, 2006] У носительниц мутаций гена BRCAX в нашем исследовании билатеральное поражение было отмечено только у одной пациентки

Мутация CysôlGly гена BRCA 1 среди больных раком молочной железы не выявлена

Таким образом, полученные нами результаты имеют существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы у женщин, проживающих в Башкортостане и Ханты-Мансийском автономном округе Наличие мажорной мутации в гене BRCAI позволяет проводить скрининговые исследования в группах повышенного риска и у женщин, не отмечающих случаев заболевания у родственников, с целью своевременной первичной профилактики возникновения и развития данной патологии

Изучение мутаций IYS2+1G>A, I157T, СЯ£7Ше1е9Л 0(5kb) гена СНЕК2 у больных раком молочной железы и в группе контроля.

Мы изучили три полиморфных локуса IVS2+1G>A, I157T и C#iX?dele9,10(5kb) гена СНЕК2 в выборке больных (п=410) и контрольной группе (п=1177). Поиск мутаций I157T и IVS2+1G>A гена СНЕК2 был выполнен с помощью ПДРФ анализа (рис. 4, 5). Фрагмент ДНК, охватывающий 2-ой и 3-ий экзоны гена СНЕК2, был амплифицирован с использованием мутагенных праймеров, что позволило последовательно провести скрининг на две мутации IVS2+1G>A и I157T с использованием эндонуклеаз рестрикции ScrFI и Pst\. Все позитивные случаи были подтверждены секвенированием (рис.6).

*>">*»• ЧГ"-» Цц&ф. фьф *г-.

1 2 3 4 5 6 7 8 Рис.4. Элеггрофореграмма рестрикдионного анализа (Scr FI) мутации IVS2+1G>A гена СНЕК2. Дорожка 1-6, 8 - образцы гомозигот по аллелю дикого типа; 7 - образец ДНК гетерозиготы по мутации IVS2+1G>A.

123456789 10 11 Рис. 5. Элеггрофореграмма рестрикционного анализа (РвЛ) полиморфного варианта 1157Т гена СНЕК2. Дорожки 3-10- образцы гомозигот по аллелю дикого типа; 1,2,11 - образцы ДНК гетерозигот по мутации II57Т.

Ш

а А;

л I

шш

ш

АИУ82+Ш>А БН157Т

Рис. 6. Фрагмент нуклеотидной последовательности гена СНЕК2: А) с мутацией ГУ82+Ш>А в гетерозиготном состоянии; Б) с мутацией 1157Т в гетерозиготном состоянии.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 7. Детекция мутации СШЖ?с1е1е9,10(5кЬ) гена СНЕК2, гель-электрофорез. Дорожка 1,3-6- образцы без делеции; 2, 7 - образцы ДНК с мутацией СНЕК2(1е\е9,10(5 кЬ).

Мутация ГУ82+10А.

Считается, что 1У52+Ю>А сплайсинг мутация может приводить к развитию рака молочной железы у жительниц Восточной Европы [АШпеп М., 2001; Во§ёапоуа К, 2005]. Функциональная роль 1У82+Ш>А мутации заключается в изменении сплайсинга мРНК СНЕК2, кодирующей укороченный протеин.

В нашей выборке больных мутация 1У52+Ю>А определена у 3 пациентов, что составляет 0,7%. В группе здоровых индивидов мутация не выявлена (р=0.02). Средний возраст манифестации заболевания составил

52,2±5,2 года среди носителей исследуемой мутации, тогда как у больных без мутации IVS2+1 G>A - 49,6±5,9 лет По этническому составу группа носителей данной мутации распределились следующим образом- русские-2, украинка-1 Менструально-овариальная функция сохранена у 1 пациентки, менопауза до 5 лет - у 1, от 5 и старше - 1 больной В одном случае в анамнезе отмечается наличие заболевания молочной железы у матери

Среди носительниц мутации IVS2+1G>A гена СНЕК2 заболевание установлено с I и IIA стадиями у пациентки с метахронным поражением молочной железы У двух больных обнаружено заболевание на стадии IIA и IIIB, с гистологическим вариантом опухоли - инфильтрирующий протоковый рак В двух случаях выполнено только оперативное лечение, в одном случае пациентке с IIIB стадией заболевания проведено комплексное лечение в неоадъювантном и адъювантном режимах

Полиморфизм I157T.

Функциональная значимость данного полиморфизма, заключается в том, что вариант I157T СНЕК2 способен к формированию димеров in vivo с другими молекулами СНЕК2 I157T, а также с протеином дикого типа Поврежденная СНЕК2 олигомеризация и сниженное автофосфорилирование в СНЕК2 I157T протеине может приводить к снижению функциональных СНЕК2 единиц в клетке

В результате исследования замена была определена у 20 из 410 пациентов с РМЖ (4,9%) и 46 из 1177 (3,9%) в контрольной группе (OR= 1 26, 95% CI 0 74-2 16, р=0 4) Носители полиморфизма I157T гена СНЕК2 не отмечали случаев заболевания в семье Средний возраст больных раком молочной железы, являющихся носителями полиморфного варианта составил 54,4±5,1 года и пациентами без I157T - 50,8±6,3 лет По состоянию репродуктивной функции носители полиморфного варианта гена распределились следующим образом функция сохранена - 11(57,1%), в менопаузе - 9 (42,9%) У носителей полиморфизма I157T среди исследуемой группы больных в 50% случаев

выявлено поражение подмышечных лимфатических узлов, в 30% случаев имело место генерализация процесса с летальными исходами

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов между больными и здоровыми индивидами не выявил достоверных различий, хотя в ряде работ при изучении полиморфного варианта I157T была показана ассоциация с РМЖ у пациентов (Восточная и Центральная Европа) [Alhnen et al, 2001, Friednchsen et al, 2004, Bogdanova N , 2005, Cybulski et al, 2007]

Делеция CHEE2dele9,10(5kb).

Протяженная делеция экзонов 9 и 10 гена СНЕК2 приводит к преждевременному стоп кодону Она встречается у больных раком молочной железы из Польши, Чехии, Словакии и Беларуссии [Walsh Т et al, 2006, Cybulski et al, 2007, Bogdanova N , 2007]

Частота мутации С/йЖМе1е9,10(5kb) среди наших пациентов значительно выше таковой в контрольной группе 7/410 (1,7%) и 1/1177 (0 1%) соответственно (OR = 20 8, CI 2 6-169 4, р = 0 0003)

Средний возраст манифестации заболевания у носителей данной мутации составил 44,8±5,1 года, тогда как у пациентов без CHEK2dele9,10(5kb) -49,5±6,2 лет В 5 случаях из 7 заболевание было выявлено в пременапаузе У 5 больных раком молочной железы, являющихся носителями данной мутации, заболевание выявлено на стадии с поражением подмышечных лимфоузлов, что требовало проведения комплексного лечения (хирургическое, лучевое и химиотерапевтическое лечение) В последующем у 4-х носителей мутации СШЖ? dele9,10(5kb) выявлено вторичное поражение костей скелета и легких

Сравнительный анализ наших результатов с данными литературы свидетельствует в пользу положительной ассоциации изученных мутаций с риском развития рака молочной железы (р = бхЮ"6 для IVS2+1G>A, р = 1x10"6 для I157T, и р < 10"7 для CHEK2de\e9,10(5kb)) Значения OR составили 2 9 (95%CI 1 8-4 6) для IVS2+1G>A, 3 2 (95%С1 2 0-5 0) для C#j0Odele9,lO(5kb) и 1 4 (95%CI 1 3-1 6) для II57Т Риск развития рака молочной железы у носителей

мутаций IVS2+1G>A и CHEK2dele9,10(5kb) несколько вьпне, чем при наличии замены I157T [Allmen et al, 2001, Schutte et al, 2003, Fnednchsen et al, 2004, Default et al, 2004, Kilpivaara et al, 2005, Bogdanova et al, 2005, Walsh et al, 2006, Cybulski et al, 2007, Bogdanova et al, 2007]

Таким образом, на основании результатов исследования полиморфных локусов гена СНЕК2 у больных раком молочной железы и здоровых доноров мы рекомендуем включать в алгоритм ДНК-диагностики скрининг на мутации IVS2+1G>A и CHEK2dele9,10(5kb)

Изучение мутании 6S7delS гена NBS1 у больных РМЖ и в группе контроля.

Наша задача заключалась в определении частоты распространения делеции 651del5 гена NBS1 в республике Башкортостан и Ханты-Мансийском автономном округе и оценке степени ассоциации мутации с риском развития рака молочной железы

Изучение мутации 6Sldel5 гена NBS 1 нами проведено в группе больных раком молочной железы (п=375) и в контрольной группе (п=500) методом аллель-специфичной ПЦР (allele-specific PCR assay) и в дальнейшем были подтверждены секвенированием (рис 8 )

Мутация 657й?е/5 гена NBSI в гетерозиготном состоянии определена у трех пациенток, что составляет 0 8%, в группе контроля делеция выявлена у одного индивида - 0 2% Достоверных различий между частотами генотипов и аллелей среди больных и здоровых индивидов не выявлено (р = 0 4) Возможно, это является следствием не большого объема выборки больных

Сравнительный анализ наших результатов с данными мировой литературы свидетельствует в пользу положительной ассоциации делеции 657delS гена NBSX с риском возникновения и развития рака молочной железы (р = 8x10"4) Значение OR составило 2 3 (95%CI 1 5-3 7)

Э 1 2 3 4 5 6 7

МВ51*657с1е15 внутренний контроль (МОС1)

и

3 5 Э 139

Рис. 8. Электрофореграмма детекции мутации 657а?е/5 гена в агарозном

геле. Дорожки 1,2 - наличие мутации, 3-7 - отсутствие делеции, Б - маркер молекулярного веса.

Фрагмент нуклеотидной последовательности гена N551 с мутацией 657с/е/5 в гетерозиготном состоянии.

Носители делеции гена А®51 в выборке больных принадлежат к трем разным этническим группам: русские-1, мордва-1, украинцы -1. Возможно, что данная мутация не харак терна для татар и башкир, но для подтверждения этого предположения, необходимо проведение дальнейшего изучения частоты распространения данной мутации у коренных жителей региона.

Среди носителей делеции семейных форм заболевания не установлено. Средний возраст возникновения рака молочной железы составил 49,3±6,7 года. Оценка клинйко-морфологических особенностей показала, что у одной пациентки манифестация заболевания наблюдалась в период пременопаузы. По стадиям группа больных распределилась, так: с I стадией -1, со ПА стадией заболевания - 2, гистологический вариант опухоли - инфильтрирующий

протоковый. Носители данной мутации получили только оперативное лечение по поводу рака молочной железы.

Анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма D302H гена CASP8 у больных раком молочной железы и в контрольной группе.

Нами проведено исследование D302H полиморфизма гена CASP8 у больных раком молочной железы (п=377) и здоровых доноров (п=523). Верификацию аллелей D302H полиморфизма проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием Taqman allelic discrimination system.

Проведенный анализ полиморфизма D302H гена CASP8 показал, что по распределению частот аллелей и генотипов данного ДНК-локуса выборки больных и здоровых доноров достоверно не отличаются (Х2^ 1.85, df = 2, р = 0.397) (рис.9.).

302Н/302Н

D302/D302

D302/302H

Рис. 9. Распределение частот генотипов полиморфизма D302H гена CASP8 у больных РМЖ и в группе контроля.

При сравнении частот аллелей и генотипов D302II гена CASPi между группами больных, разделенных по возрасту, менопаузальному статусу и стадии заболевания, достоверных различий также не выявлено.

Оценка распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма LIPP гена TGFbl у больных раком молочной железы и в группе контроля.

Нами проведено исследование L10P полиморфизма гена TGFbl у больных раком молочной железы (п=380) и здоровых доноров (п=524). Верификацию аллелей L10P полиморфизма проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием Taqman allelic discrimination system. Достоверных различий

частот аллелей и генотипов между больными и группой контроля в распределении не обнаружено (Х2=0.138, с^ = 2, р = 0.934) (рис. 10).

При сравнении частот аллелей и генотипов ЫОР гена ТОРЫ в группе больных, разделенных по возрасту, менопаузальному статусу и стадии заболевания достоверных различий не выявлено.

Рис. 10. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма ЫОР гена ТСРЫ у больных РМЖ и в группе контроля.

Изучение полиморфного локуса К72Р гена 77*53 у больных раком молочной железы и в группе контроля.

Нами проведено исследование Я72Р полиморфизма гена ТР53 у больных (п=183) и здоровых доноров (п=204). Верификацию аллелей проводили методом аллель- специфичной ГЩР (рис. 11).

Сравнительный анализ распределения частот аллелей выявил достоверные различия между больными и группой контроля (х2 = 11,19, <1Г = 1, р < 0,001). Оценка риска развития заболевания показала, что у носителей аллеля *Рго72 увеличивается вероятность возникновения рака молочной железы, по сравнению с носителями аллеля *Ащ72 (011=0,226; 95% С1 0,15 - 0,34; р = 0,0005),

177 bp — 141 bp —

1 2 3 4 5

Рис. 11. Электрофореграмма ГЩР-продукта полиморфного локуса R72P гена TPS3 у 5 пациентов с РМЖ. Образец №1 - гомозигота по рецессивному признаку, Рго72/Рго72, образцы № 2, 4 и 5 - гомозиготы по доминантному признаку, Arg72/Arg73, образец №3- является носителем генотипа Arg72/ Pro72).

Более высокая частота аллеля Pro72 обусловлена преобладанием гетерозигот у больных, в го время как различий в частоте распределения гомозигот по мутантному аллелю не выявлено. При изучении генотипов в группе больных, нами получены следующие результаты: 12% (22/183) являются

72 72 72 72

носителями генотипа Pro /Pro , 46,4% (85/183) - носители генотипа Arg /Pro , и 41,5% (76/183) пациенток имеют генотип Arg72/Arg72.

При попарном сравнении частот генотипов между выборками больных и контроля обнаружены достоверные отличия (р < 0,005): у больных выше частота генотипа Arg72/Pro72 (46% и 32%) и ниже частота гомозигот Arg72/Arg72 (рис. 12).

Рис. 12. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма R72P гена TP53 у больных РМЖ и в группе контроля.

Оценка степени ассоциации в значениях показателя соотношения шансов позволяет нам говорить о протективном свойстве генотипа Arg72/Arg'2,

ОК = 0,48 [95% С1 0,31- 0,73], р = 0,002 У носителей генотипа Агё72/Рго72 повышается вероятность возникновения злокачественного новообразования молочной железы, (Ж = 1,81 [95% С11,18 - 2,80], р = 0,007. (таб 1)

Таблица 1

Показатели OR при изучении полиморфного локуса R72P гена ТР53

Генотипы Больные Контроль OR [95%СГ} P

Arg"/Arg" 76 122 1 00

Arg'-VPro" 85 66 0 48 [0 31-076] 0 0021

Pro "/Pro" 22 16 0 45 [0 21-097] 0 0399

AA vi AP+PP 76/107 122/82 0 48 [0 31-0 73] 0 0012

AP vj AA+PP 85/98 66/138 1 81 [1 18-2 80] 0 007

При сравнении частот аллелей и генотипов данного полиморфизма гена ТР53 между группами больных, разделенных по возрасту, менопаузальному статусу и стадии заболевания, не обнаружено достоверных различий

У 46 носителей генотипа Arg72/Pro72 и 41 носителя генотипа Arg72/Arg72 заболевание было выявлено в пременопаузе Для 52 гетерозигот и 50 гомозигот по аллелю дикого типа характерно небольшие размеры опухоли (< 3 см) и поражение подмышечных лимфоузлов (44 и 33 больных РМЖ соответственно), что свидетельствует о неблагоприятном клиническом прогнозе заболевания

Таким образом, выявлена ассоциация рака молочной железы с полиморфизмом R72P гена ГР53, и показано, что у носителей генотипа Arg72/Pro72 выше риск возникновения и развития заболевания, в то время как генотип Arg72/Arg72 обладает протективным свойством

Выводы

1 Созданный банк ДНК больных раком молочной железы (п=410) позволяет сконцентрировать биологические материалы в крупных специализированных научных центрах и проводить генетические исследования

2 Клинической особенностью рака молочной железы у больных, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного

округа, является зависимость между возрастом возникновения заболевания и состоянием репродуктивной функции организма женщины

3 У больных раком молочной железы выявлена высокая частота носительства (4%) мутации 5382тзС гена В КС А1 Обнаружен более ранний возраст манифестации заболевания у носителей данной мутации Наличие мажорной мутации в гене ВКСАХ позволяет проводить скрининговые исследования в группах повышенного риска и у женщин с неотягощенным семейным анамнезом с целью своевременной первичной профилактики возникновения и развития данной патологии

4 Установлено, что мутации П/82+Ш>А и СЯйШс1е9,10(5кЬ) гена СНЕК2 являются маркерами высокого риска развития рака молочной железы У носителей СНЕК2Ае1е9,10(5кЬ) гена СНЕК2 повышен риск возникновения рецидива и прогрессирования заболевания

5 Выявлены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса гена 7Р53 между больными раком молочной железы и группой контроля Установлено, что маркером высокого риска возникновения злокачественного новообразования молочной железы является генотип *АгЕ72/*Рго72 (011 = 1,81), а маркером низкого риска - генотип *АЩ'!2/*АЩ72 (ОН = 0,48)

Практические рекомендации

1 У женского населения в группе риска необходимо определять генетические маркеры развития рака молочной железы, такие как мутации 5382тзС гена ВКСА\, 1У82+Ю>А и С#Ж2с1е]е9,10(5кЬ) гена СНЕК2, и полиморфизм Л72Р гена ТР53

2 Учитывая высокую вероятность развития билатерального поражения молочной железы у больных, являющихся носителями мутации гена ВКСАХ, рекомендуется более тщательное диспансерное наблюдение и проведение расширенного комплекса обследования

Работы, опубликованные до теме диссертации

1 Бермишева М А , Зиниатуллина Г.Ф., Кочанова В А , Ганцев Щ X , Хуснутдинова Э К Анализ полиморфизма R72P гена ТРЪЪ у больных раком молочной железы // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы управления качеством онкологической помощи населению Российской Федерации» -Казань -2007 - с 50-51

2 Зиниатуллина Г.Ф., Бермишева М А , Ганцев Ш X , Хуснутдинова Э К Изучение генетических факторов риска развития рака молочной железы // Академический журнал Западной Сибири -2007 -№3 -с 35-41.

3 Зиниатуллина Г.Ф., Бермишева М А , Ганцев Ш X, Хуснутдинова Э К Рак молочной железы Генетические факторы риска развития // Уральский медицинский журнал -2007.-№9 -с 23-35

4 Бермишева М А, Зиниатуллина Г.Ф., Ганцев Ш X, Доерк Т, Хуснутдинова ЭК Анализ ассоциации мутаций IVS2+1G>A, I157T и C/7£/v2dele9,10(5kb) геНа СНЕК2 с раком молочной железы // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по Физико-химической биологии и биотехнологии - Уфа -2007 -с 10-11

5 Бермишева М.А , Зиниатуллина Г.Ф., Ганцев Ш X , Доерк Т , Хуснутдинова Э К Изучение полиморфизма R72P гена р53 у больных раком молочной железы // Материалы конгресса Уральского федерального округа «Человек и лекарство», секция «Онкология» -Тюмень -2007 -с 21-23

Зиннатуллина Гузель Фарданатовна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРОВ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОСНОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14 00.14 - Онкология 03 00 15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 03.10 2007 Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать плоская Гарнитура Times New Roman Уел печ л 1,0 Уел кр -отг. 1,0 Уч.-изд л 0,9 Тираж 100 экз Заказ № 505

ГОУ ВПО Уфимский государственный авиационный технический университет Центр оперативной полиграфии УГАТУ 450000, Уфа-центр, ул К Маркса, 12

Актуальность темы. В настоящее время в России сохраняется высокий уровень заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований различных локализаций. В структуре онкологической заболеваемости наблюдается тенденция к значительному увеличению случаев рака молочной железы (РМЖ). Статистические показатели последних лет свидетельствуют о том, что рак молочной железы занимает первое место в структуре онкопатологии женского населения большинства высокоразвитых стран мира и имеет тенденцию к неуклонному росту. Отмечается рост заболеваемости и в России, с 1980г. рак молочной железы занимает первое место среди злокачественных новообразований женского населения [Чиссов В.И., 1999; Семиглазов В.Ф., 2002].

Наряду с ростом заболеваемости происходит и увеличение смертности во всем мире. При этом в структуре смертности от всех злокачественных новообразований женщин рак молочной железы имеет наибольший удельный вес, составляя в США 18%, в странах Европы- 17% [Аксель Е.М, 1994; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2004], в России данный показатель в 1997г. составил 17% [Чиссов В.И., 1999]. Риск возникновения заболевания в течение жизни оценивается в среднем у женщин в 11% случаев. В основе снижения смертности среди женщин от РМЖ лежит раннее выявление заболевания, качественное и полное лечение [Гарин A.M., 2006].

За последнее десятилетие произошли существенные изменения в понимании механизмов развития рака молочной железы, методов их диагностики и лечения, но закономерности функционирования генома раковой клетки еще далеки от своего понимания. На сегодняшний день картирован и клонирован целый ряд генов, вовлеченных в канцерогенез, эти гены являются и хранителями клеточного цикла, и генами общего контроля. Доказано, что мутации или структурные изменения, нарушающие функцию генов, поддерживающих стабильность генома, и прямо или косвенно участвующих в репарации повреждений ДНК, предрасполагают к возникновению опухоли. В последнее время расширяются исследования, связанные с поиском и характеристикой полиморфных вариантов ДНК в кодирующих и некодирующих районах генов, в той или иной степени вовлеченных в канцерогенез [Залетаев Д.В., 2001; Карпухин A.B., 2002; Rebbeck T.R., 2002; Buslov К.В., 2004].

На сегодняшний день выделяют две формы рака: наследственную и спорадическую [Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., 2004]. Наследственная предрасположенность к РМЖ проявляется в накоплении случаев указанного заболевания в семьях. Установлен аутосомно-доминантный тип наследования рака молочной железы в семьях с высоким риском [Pharoah P.D., 2002; Antoniou А., 2003]. Большим достижением молекулярной биологии в 90-х годах прошлого века было открытие генов BRCA1 и BRCA2. Наибольшая доля наследуемых форм рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в этих генах [Walsh Т. et al., 2006]. Например, мутации гена BRCAI являются высокопенетрантными и риск возникновения данной патологии у носителей таких мутаций достигает 50-90% [Grzybowska Е., 2000; Pohlreich Р., 2005; Mitchell G., et al., 2006; Walsh Т. et al., 2006]. Необходимо отметить, что спектр и частота мутаций в генах BRCA 1 и BRCA2 может сильно варьировать в различных популяциях и регионах [Peelen Т., 1997; Hakansson S., 1997; Stoppa-Lyonnet D., 1997; Gayther S.A., 1997; Santarosa M., 1998; Grzybowska E., 2000; Van der Looij M., 2000; Diez O., 2003; Pohlreich P., 2005].

Редкие высокопенетрантные терминальные мутации генов BRCA1/2 отвечают не более чем за 25% всех семейных форм заболевания РМЖ. Оставшееся разнообразие случаев рака молочной железы можно объяснить комбинацией более распространенных, низкопенетрантных полиморфных вариантов других генов [Pharoah Р., 2002].

Спорадическая форма рака, также как и семейная, имеет генетическую компоненту, только ее структура может быть намного сложнее. Опухоль, в этом случае, развивается под воздействием не одной мутации, а целой группы. Исследования полиморфизма генов, вовлеченных в канцерогенез, позволили выявить такие сочетания полиморфных состояний генов, которые повышают вероятность возникновения рака [Асланян М.М., 2007].

Большое внимание исследователей направлено на изучение генов NBS1 (Nijmegen breakage syndrome), ATM (Ataxia telangiectasia mutated), CHEK2 (Cell-cycle checkpoint kinase), CASP& (каспаза 8), TGFb\ (трансформирующий фактор роста), XRCCA (X-ray repair complementing defective in Chinese hamster) и др. [Dufault M.R. et al., 2004; Buslov K.B., 2004; Bogdanova N., 2005; Antoniou A.C. and Easton D.F., 2006; Bierie В., Moses H.L., 2006; Cox A., 2007].

Молекулярно-генетические работы, посвященные изучению рака молочной железы, проводятся и в России. Они затрагивают, в основном, исследования мутаций генов BRCAI и BRCA2 у больных с отягощенным семейным анамнезом раком молочной железы и раком яичников (РЯ) [Логинова А.Н., 2004; Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., 2004; Мандельштам М.Ю., 2005; Смирнова Т.Ю., Карпухин A.B., 2007; Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., 2007]. Выявление мутаций в изучаемых генах обеспечивает объективный критерий для формирования групп повышенного риска рака молочной железы с целью его профилактики и ранней диагностики.

В связи с высоким уровнем заболеваемости и неуклонным ростом смертности от рака молочной железы во всем мире идентификация генов, вовлеченных в развитие злокачественной опухоли, является важной медико-генетической задачей, решение которой будет способствовать формированию фундаментальных представлений о патогенезе этого заболевания, а также позволит выявить генетические факторы риска развития рака молочной железы.

На основании вышесказанного были определены следующие цель и задачи.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования: повышение уровня диагностики рака молочной железы на основе анализа клинического течения заболевания и выявления молекулярно-генетических маркеров риска развития данной патологии Задачи исследования

1. Создать банк ДНК больных раком молочной железы, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа — Югра и дать клиническую характеристику больных раком молочной железы.

2. Провести поиск мутаций 5382insC и Cys61Gly гена BRCA1 у больных раком молочной железы.

3. Изучить частоту распространения мутаций IVS2+1G>A, I157T и CHEK2de\e9,10(5kb) гена СНЕК2 (Cell-cycle checkpoint kinase), делеции 657del5 гена NBSl (Nijmegen breakage syndrome) в группе контроля и больных раком молочной железы и оценить вклад перечисленных ДНК-маркеров в развитие данной патологии.

4. У больных раком молочной железы и в группе здоровых женщин изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов TGF/31 (transforming growth factor /?), CASP8 (caspase) и TP53 (супрессор опухоли) и провести анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов с риском развития рака молочной железы.

5. Усовершенствовать подходы к ДНК-диагностике и определению тактики ведения больных раком молочной железы.

Эти задачи представляются чрезвычайно актуальными и требуют своего решения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые на базе лаборатории Молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН (г. Уфа) создан банк ДНК больных раком молочной железы, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа - Югры. На большом клиническом материале изучена частота встречаемости мутаций 5382insC и Cys61Gly гена BRCA1; впервые в республике Башкортостан и в ХМАО-Югра изучена частота встречаемости полиморфных локусов IVS2+1G>A, I157T и CHEK2del&9,10(5kb) гена СНЕК2, делеции 657del5 гена NBSI у больных раком молочной железы. Впервые проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов L10P, D302H, R72P генов TGF/31, С ASPS, TP 53, соответственно, у больных и здоровых доноров. Изучена взаимосвязь проанализированных мутаций и полиморфизмов исследованных генов с клиническим проявлением рака молочной железы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Оценка частот распространения мутаций 5382insC и Cys61Gly в гене BRCA 1, IVS2+1G>A и С#Е/Ше1е9,10(5кЬ) в гене СНЕК2, а так же делеции 657del5 в гене NBSI позволяет проводить ДНК- диагностику рака молочной железы у женского населения нашего региона.

Выявление мутаций IVS2+1G>A и C#££2dele9,10(5kb) в гене СНЕК2 и полиморфизма R72P гена ТР5Ъ у больных раком молочной железы позволит определить дальнейшую тактику лечения и, тем самым, повысить уровень выживаемости при данной патологии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Прямая зависимость между возрастом манифестации рака молочной железы и состоянием репродуктивной функции организма женщины.

2. Высокая частота носительства (4%) мутации 5382insC гена BRCAI у больных раком молочной железы с наследственными формами заболевания, а также у женщин с неотягощенным семейным анамнезом.

3. Генетическими маркерами предрасположенности к развитию рака молочной железы являются мутации IVS2+1G>A и CHEK2d&\e9,10(5kb) гена СНЕК2.

ТУ 7?

4. У носителей генотипа Arg /Pro гена супрессора опухолей 7Р53 высокий риск развития злокачественных новообразований молочной железы.

ТУ 7?

Генотип Arg /Arg обладает протективным свойством.

ВЫВОДЫ

1. Созданный банк ДНК больных раком молочной железы (п=410) позволяет сконцентрировать биологические материалы в крупных специализированных научных центрах и проводить генетические исследования.

2. Клинической особенностью рака молочной железы у больных, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа, является зависимость между возрастом возникновения заболевания и состоянием репродуктивной функции организма женщины.

3. У больных раком молочной железы выявлена высокая частота носительства (4%) мутации 5382шзС гена ВЯСА1. Обнаружен более ранний возраст манифестации заболевания у носителей данной мутации. Наличие мажорной мутации в гене ВЯСА1 позволяет проводить скрининговые исследования в группах повышенного риска и у женщин с неотягощенным семейным анамнезом с целью своевременной первичной профилактики возникновения и развития данной патологии.

4. Установлено, что мутации 1У82+Ш>А и СНЕК2&ъ\ъ9,10(5кЬ) гена СНЕК2 являются маркерами высокого риска развития рака молочной железы. У носителей СЖЖМе1е9,10(5кЬ) гена СНЕК2 повышен риск возникновения рецидива и прогрессирования заболевания.

5. Выявлены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса гена ТР5Ъ между больными раком молочной железы и группой контроля. Установлено, что маркером высокого риска возникновения злокачественного новообразования молочной железы является генотип *Ал^72/*Рго72 (011 = 1,81), а маркером низкого риска - генотип *А^72/*А^72(ОЯ = 0,48).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У женского населения в группе риска необходимо определять генетические маркеры развития рака молочной железы, такие как мутации 5382тзС гена ВЯСАХ, 1У82+Ю>А и СНЕК2йе\е9,Щ5кЪ) гена СНЕК2, и полиморфизм Я72Р гена 7Р53.

2. Учитывая высокую вероятность развития билатерального поражения молочной железы у больных, являющихся носителями мутации гена ВЯСА1, рекомендуется более тщательное диспансерное наблюдение и проведение расширенного комплекса обследования.