Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Обоснование и совершенствование диагностики прогрессирующего рака яичников

На правах рукописи

АНТОНЕЕВА 003466347

Инна Ивановна

ОБОСНОВАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКИ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО РАКА ЯИЧНИКОВ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

О 2 ДПР 2С29

Уфа-2009

003466347

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет Федерального агентства по образованию».

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Максимов Сергей Янович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Орлова Рашида Вахидовна

доктор медицинских наук, профессор Урманчеева Адель Федоровна; доктор медицинских наук Пушкарев Василий Александрович Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_» июня 2009г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.006.04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.Р.Рахматулдина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Рак яичников - пятая по частоте причина смерти от злокачественных новообразований среди женщин и наиболее частая причина смерти у всех больных с опухолями женских половых органов (Новикова Е.Г. с соавт., 2003; Jemal A.et al., 2007; Parkin D.M. et al., 2002.). Согласно данным, опубликованным в Eurocare-3 Studu, пятилетняя выживаемость больных раком яичников не превышает 29 - 30% ( Sant M. et al., 2003). По данным Jemal А. с соавт. (2007) эта цифра, несмотря на успехи хирургии и химиотерапии, остановилась на уровне 45%. Ежегодно в России регистрируется 11,7 тысяч злокачественных новообразований яичников и 7,3 тыс. летальных исходов из них (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2006; Мерабишвили В.М., 2004). Низкая выживаемость при раке яичников - следствие поздней диагностики. На сегодня в 70% случаев диашосцируется распространенная стадия заболевания (Урманчеева А.Ф., 2002; Charles N. et al., 2008; Kurian A.W. et al, 2005). Подобная ситуация будет сохраняться при одновременном возрастании показателей смертности, в связи с чем данная проблема приобретает также и социальное значение (Awada A., Klastersky J., 2004).

Основными причинами неэффективности усилий по улучшению отдаленных результатов лечения больных раком яичников являются отсутствие четких представлений об этиологии и патогенезе, патогномоничных симптомах для различных стадий заболевания, а также низкая эффективность лечения при III - IV стадиях (Жорданиа К.И., 2002; Паниченко И.В. с соавт., 2004). Расширение исследований в области биологии опухолевого роста при раке яичников может позволить выявить факторы, имеющие практическое значение для понимания патогенетических механизмов развития, метастазирования и рецидивирования опухоли, а также явиться теоретическим обоснованием для введения новых подходов к лечению данного заболевания.

Считается установленным, что необходимым условием роста и развития злокачественной опухоли является перестройка свободнорадикальных процессов в организме (Горожанская Э.Г. с соавт., 2001; Дейчман Г.И., 2000; Лю Б.Н., 2004; Пушкарев В.А., 2007; Франциянц Е.М., 1997; Якубовская Р.И., 2000). Однако в литературе отсутствуют данные о динамике изменения функционального состояния системы ПОЛ-АО при прогрессировашш рака яичников и о патогенетической взаимосвязи этой системы с формированием фенотипа неоплазмы на различных клинических стадиях рака яичников.

На сегодня представления о патогенезе онкологических заболеваний, основанные на постулате о чужеродности злокачественного новообразования, уже не являются

абсолютными. У онкологических больных показаны дисфункции клеточного звена иммунной системы, в частности, нарушение эффекторной функции Т-лимфоцитов и баланса «проопухолевых», «противоопухолевых» и «регуляторных» цитокинов (Антонов В.Г. с соавт., 2004; Бережная Н.М., 2000; Balkwill F., 2001; Shall C.F. et al., 2008). Врожденный иммунитет, по мнению ряда авторов, играет инструктивную и контролирующую роль в индукции специфического иммунитета (Дейчман Г.И.,2004; Huarte Е. et al., 2008; Sengupta S. et al., 2008).

Особый интерес представляет характер влияния взаимодействия опухолевых и иммунных клеток на протекающие в них метаболические процессы (Инжеватетш Е.В.с соавт., 2007). К основным свойствам всех злокачественных опухолей относят повышенную способность к пролиферации и утрату способности к апоптотической гибели (Копнин Б.П., 2006; Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002). Последнее, с одной стороны, способствует прогрессированию опухолевого процесса, а с другой - может стать причиной множественной лекарственной устойчивости (Абраменко И.В., Фильченков A.A., 2003). В связи с этим в последнее время уделяется большое внимание изучению молекулярных маркеров, характеризующих апоптоз и пролиферацию при различных злокачественных новообразованиях (Пожарисский K.M., Леенман E.H., 2000; Полушкина И.Н., 2002). Ведущую роль в развитии аноптоза и регуляции клеточной пролиферации играет природный тип гсна-онкосупрессора Wt р53 и кодируемый им ядерный белок р53 (Копнин Б.П., 2000). В значительной части злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в хромосоме 17 в области локализации гена-супрессора р53 (Копнин Б.П., 2004; Soussi Т. et al., 2000).

Одним из основных компонентов системы защиты клетки против факторов, вызывающих апоптоз, является Вс1-2, который ингибирует р53-зависимый и независимый апоптозные метаболические пути.

Таким образом, биологический портрет опухоли и установление его патогенетических взаимосвязей с иммунным, цитокиновым и метаболическим статусом организма на различных этапах профессирования неоплазмы позволит обосновать новые принципы диагностики степени распространения неоплазии и прогнозирования течения заболевания, а также оценить предполагаемую эффективность планируемой терапии.

Цель исследования

Обоснование и совершенствование диагностики прогрессирующего рака яичников на основе оценки взаимосвязи локальных морфофункциональных и метаболических сдвигов в

зоне первичной опухоли с системными расстройствами иммунного, цитокинового и метаболического статуса.

Задачи исследования

1. По данным современной мировой литературы и данным медико-статистических показателей, отражающих заболеваемость и смертность и т.д., обосновать необходимость проведения исследования, касающегося прогрессирующего рака яичников, на территории крупного промышленного региона (Ульяновская область).

2. Ретроспективно оценить значимость общепринятых диагностических методов обследования больных раком яичников для определения степени распространения злокачественного процесса.

3. Установить корреляционную связь между морфологическим и функциональным атипизмом опухолевых клеток, характером экспрессии иммуногистохимических онкомаркеров, степенью пролиферативной активности в паренхиме первичной опухоли со стадией рака яичников.

4. Изучить закономерности связей изменений ангиогенеза, морфо-функционального состояния микроциркуляторного русла, интенсивности развития некроза в паренхиме первичной опухоли рака яичников с характером метаболических сдвигов, в частности, активностью окислительно-восстановительных реакций и антирадикальной защиты клеток в зоне опухоли, а также в системном кровотоке и с изменением уровня цитокинов в крови в динамике прогрессирующих форм рака яичников.

5. Изучить патогенетическую значимость недостаточности неспецифических механизмов резистентности, связанной с количественным и качественным изменением нейтрофилов, а также характер и механизмы нарушения специфического клеточного звена иммунитета, обеспечиваемого Т-системой лимфоцитов и NK-клегками в динамике прогрессирующих форм рака яичников.

6. Установить взаимосвязь интенсивности экспрессии маркеров апоптоза лимфоцитов, а также дифференцировочных и активационных маркеров (СОэ, CD4, CD8j CD|6, CD25, HLA-DR, CD71, CD95) лимфоцитов крови со стадией распространения опухолевого процесса.

7. Выявить новые диагноститеческие критерии прогрессирующего рака яичников. Создать алгоритм диагностики прогрессирующего течения заболевания в соответствии с установлением патогенетической взаимосвязи морфо-

функциональных и метаболических сдвигов в зоне первичной опухоли, системных расстройств иммунного, цитокинового и метаболического статуса со стадией распространения опухолевого процесса. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом ИМЭиФК УлГУ «Патогенетические аспекты прогрессирования неоплазмы», номер горегистрации: 01200803757.

Научная новизна

На основании результатов клинико-лабораторных, биохимических, патоморфологических, иммунологических методов исследования впервые проведена сравнительная оценка характера и механизмов развития неоплазмы и взаимодействия ее с организмом на различных клинических стадиях рака яичников (РЯ).

Впервые показано, что к общим закономерностям нарушения метаболического статуса у больных раком яичников откосится локальное (в зоне неоплазии) и системное изменение функционального состояния системы ПОЛ-АО, коррелирующее со стадией патологического процесса.

Установлено, что ведущим патогенетическим фактором локальной и системной активации процессов свободнорадикального окисления является избыточное ПОЛ в опухолевых клетках, возникающее вследствие фактической гапероксии, связанной с нарушением митохондриального дыхания в неоплазме и усиливающееся в процессе прогрессирования РЯ. Динамика антиоксидантных ферментов при этом свидетельствует о возможности отбора вариантов опухолевых клеток, характеризующихся повышенным уровнем антиоксидантной активности.

Активация процессов липопероксидации сопровождается повышенной экспрессией протоонкогена bcl-2, что приводит к дальнейшему снижению скорости митохондриального дыхания, возрастанию рОг, усилению метастатического потенциала опухолевых клеток при прогрессировании РЯ.

Установлено, что при прогрессировании РЯ увеличивается количество атипических эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих mt р53, что позволяет предполагать как нарастание мутаций гена р53 в процессе прогрессирования первичной опухоли, так и отбор р53+ опухолевых клеток, обеспечивающих более агрессивное течете. При этом впервые показана корреляция усиления экспрессии шр53 с активацией неоангиогенеза в первичном опухолевом узле при прогрессировании РЯ.

Показано, что пролиферативная активность клеток овариального рака неодинакова на различных клинических стадиях заболевания. В фуппе раков яичников на III

клинической стадии показатели экспрессии РСЫА, Кл-67 и МИ достоверно и существенно превышали таковые в группе на I и II клинических стадиях и продолжали возрастать на IV клинической стадии заболевания, что позволяет предполагать в процессе прогрессирования РЯ появление клонов с высокой пролиферативной активностью. Одновременно имеет место снижение уровня инфильтрации первичного опухолевого узла. При этом снижение количества лимфоидных клеток в инфильтрате сопровождается уменьшением относительного количества плазматических клеток при нарастании числа макрофагов. Таким образом, показано, что лимфоидно-клеточная инфильтрация при раковых опухолях яичников весьма слабо выражена.

При оценке компонентов неспецифического естественного иммунитета показано существенное повышение содержания Нф периферической крови больных РЯ, нарастающее в динамике прогрессирования опухоли. Однако, на фоне увеличения абсолютного фагоцитарного индекса и абсолютного фагоцитарного числа имеет место снижение внутрилейкоцитарных катионных белков и уровня активности МПО — основных факторов, необходимых для завершенного фагоцитоза.

При оценке количества №С в периферической крови показано его возрастание при прогрессировании РЯ. Предполагается, что подобная динамика показателей естественной противоопухолевой защиты может свидетельствовать как о селекции резистентных к ней вариантов раковых клеток, так и о влиянии опухоли на дифференцировку предшественников и функциональное состояние эффекторных клеток.

Впервые показана динамика дифференцировочных и активационных маркеров лимфоцитов периферической крови, а также повышенная их чувствительность к спонтанному и индуцированному апоптозу, нарастающая в процессе развития неоплазмы.

Установлено, что в процессе прогрессирования РЯ неоплазма интегрируется в основные гомеостатические процессы макроорганизма благодаря использованию региональных и системных функций цитокинов. При этом ключевая роль принадлежит цитокинам с системными эффектами — 1И, ЮТ-а и ПТЧ-у. Существенными для усилепия биологического потенциала опухоли являются такие эффекты этих цитокинов, как стимулирование пролиферации опухолевых клеток и образования сосудов в зоне опухолевого роста.

Практическая ценность работы

Углубление существующих представлений о характере и механизмах развития системных метаболических расстройств на различных клинических стадиях РЯ, установление патогенетической взаимосвязи нарушений метаболического, иммунного,

цитокинового статуса и клеточного состава периферической крови со степенью распространения неоплазии позволило рекомендовать новые дополнительные диагностические критерии, которые могут быть использованы для адекватного стадирования и разработки схем терапии РЯ на различных клинических стадиях заболевания.

Применение кластерного анализа, где в качестве признака таксономии использовалась клиническая стадия заболевания по FIGO при прогрессировании РЯ, при оценке рутинных биохимических показателей крови позволило показать наличие 2-х стадий процесса изменения биохимической картины сыворотки крови. При этом стадии различны для больных, находящихся в репродуктивном периоде и в постменопаузе. Если у больных, находящихся в репродуктивном периоде 1-ая группа соответствует 1-ой клинической стадии по FIGO, а 2-ая группа включает больных, находящихся на II, III и IV клинической стадиях, то у больных, находящихся в постменопаузе, изменения биохимической картины крови происходят позже: 1-ая группа включает больных на I и 11-ой стадиях заболевания, а вторая - больных, находящихся на III и IV стадиях заболевания. Полученные данные могут был. использованы при оценке результатов руганных биохимических исследований крови больных РЯ.

Результаты исследования позволяют учитывать такие факторы внешней среды, как наличие геопатогенных зон, захоронений радиоактивных отходов и Чернобыльского следа в оценке заболеваемости РЯ и планировании профилактических мероприятий.

В диссертационном исследовании впервые рекомендован алгоритм диагностики паранеопластических сдвигов на Н-ой, Ш-ей и IV-ой стадиях заболевания по FIGO.

В качестве объективных критериев оценки паранеопластических расстройств на различных клинических стадиях РЯ рекомендован мониторинг содержания в плазме крови МДА, каталазы, ГР и КБ, МПО и ФЧ в Нф периферической крови.

Использование специально разработанной методом аппроксимации нелинейных функций формулы на основании ряда лабораторных показателей периферической крови позволит ориентировочно оценить I-II, III и IV стадии заболевания РЯ по FIGO.

Результаты исследования могут быть использованы в процессе преподавания патофизиологии, патанатомии, онкологии и клинической фармакологии при подготовке врачей, аспирантов и клинических ординаторов соответствующих специальностей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Данные современной литературы и результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о необходимости углублённого изучения проблем, касающихся

прогрессирующего РЯ на территории крупного промышленного региона (Ульяновская область).

2) Повышение пролиферативной активности ткани первичного опухолевого узла при низком уровне некротизирования на фоне значимого повышения уровня Вс1-2 и пи р53 в динамике прогрессирования определяет высокий злокачественный потенциал РЯ.

3) Неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ характеризуется снижением интенсивности митохондриалыюго дыхания, приводящего на фоне фиктивной гипоксии к фактической гипероксии, что сопровождается увеличением АФК, элиминация которых затруднена. В результате дисбаланс между прооксцдантными и антиоксидашными факторами существенно возрастает на 1-ой клинической стадии заболевания, сохраняется на уровне канцерогенеза на И-ой и Ш-ей стадиях, не достигая при этом уровня апопгоза и возвращается к уровню пролиферации (окислительного митогенеза) на 1У-0Й клинической стадии заболевания. При этом поддерживается высокий уровень кровоснабжения неоплазмы за счет возрастающих объема и плотности сосудов с дефектной или полностью отсутствующей сосудистой стенкой.

4) В динамике прогрессирования РЯ изменяется количество и функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови. На фоне снижения общего количества лейкоцитов увеличивается количество Нф, АФИ и АФЧ, но при этом статистически значимо снижается количество КБ и активность МПО в Нф, что свидетельствует о снижении способности к завершенному фагоцитозу.

5) У больных РЯ на фоне снижения общего количества Лф происходят значительные сдвиги в экспрессии на них как диффсренцировочных, так и активационных маркеров, коррелирующие с клинической стадией заболевания. При этом имеет место снижение СОз+ и СЭ4* лимфоцитов, увеличение СОв+, СО[б+, С025+, СБ?/ и С095+, свидетельствующее, как об активации и усилении пролиферации Лф, так и об усилении апоптоза лимфоидных клеток периферической крови. Последнее может быть связанно с «гиперреактивностью» их митохондрий, нарастающей в динамике прогрессирования опухоли.

6) Развитие РЯ закономерно сочетается с паранеопластическими расстройствами в виде изменения уровня функционирования системы ПОЛ-АО в плазме и эритроцитах, нарушения иммунного и цитокинового статуса, сдвигом клеточного состава периферической крови, коррелирующих со степенью распространения неоплазии.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), I Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005), IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященная 80-летию Института физиологии им.И.П.Павлова РАН «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкогинекологии» (Ростов-на-Дону, 2005), III Ассамблеи «Врач-провизор-пациент» (Санкт-Петербург, 2005), Международном конгрессе «Иммунитет и болезнь» («Immune-mediated Diseases. From Theory to Yherapy») (Москва, 2005), Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (МАЛО, Санкт-Петербург, 2006), VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006), XX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), 16"1 International conference "AIDS, Cancer and Public Health" (St. Petersburg 2007), Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007), Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепция болезней цивилизации» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Паллиативная медицина. Вчера. Сегодня. Завтра» (Москва, 2008), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008), на совместном заседании сотрудников кафедр лучевой диагностики, лучевой терапии и онкологии; госпитальной хирургии, анестезиологии, реаниматологии, урологии, травматологии и ортопедии; факультетской терапии; физиологии и патофизиологии; педиатрии; семейной медицины; общественного здоровья, здравоохранения и общей гигиены; общей биологии Ульяновского государственного университета (г.Ульяновск, 2009), на заседании кафедры онкологии с курсом ИПО Башкирского государственного медицинского университета (г.Уфа, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 91 печатная работа, из них 24 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 монографии.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных данных, заключения, выводов, и библиографического списка, который включает в себя 181 отечественных и 269 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 107 рисунками.

Материал и методы исследования

Настоящая работа выполнена на базе кафедр онкологии, физиологии и патофизиологии ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», Ульяновского областного клшшческого онкологического диспансера.

Материалом для диссертационного исследования послужили данные о 404 больных раком яичников, 36 больных раком тела матки и 24 больных с миомой матки, лечившихся в Ульяновском областном онкологическом диспансере в 1998-2007 гг.

Распределение больных по группам проведено в зависимости от клинической стадии заболевания в соответствии с классификацией FIGO. К первой группе были отнесены больные с 1-ой стадией РЯ - 70 человек; ко 2-ой группе - 41 больная со II стадией РЯ, к 3-ей группе - 162 больных с III стадией РЯ и 131 больная с IV стадией РЯ была отнесена к 4-ой группе. В качестве активного контроля были использованы результаты обследования 36 больных раком тела матки, находящиеся в I-III клинических стадиях заболевания.

При постановке диагноза, оценке степени распространения опухолевого процесса и характера неоплазии, а также в целях рандомизации обследуемых групп больных были использованы традиционные методы обследования; диагностика РЯ проводилась путем комплексного обследования больных, которое включало в себя бимануальное и ректовагинальное исследование, ультразвуковую томографию органов брюшной полости, малого таза и забрюшинного пространства, определение уровня опухольассоциированного маркера СА-125 в сыворотке крови, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, желудка и толстой кишки, цитологическое и гистологическое исследование материала. Обследование и лечение, а также оценка результатов проводилась в соответствии с принятыми методиками и программами, согласно стандартам ВОЗ.

В качестве критериев оценки метаболического статуса в плазме крови, эритроцитах и гомогенатах яичников определяли содержание малонового диальдегида (МДА) в тесте тиобарбитуровой кислоты (Андреева Л.И., 1989), активность каталазы (Карпищенко А.И.,

1999), глутатионредуктазы (ГР) (Асатиани B.C., 1969) и супероксиддисмутазы (СОД) (Дубинина М.И., 1988). В гомогенате определяли также активность цигохромоксидазы (ЦХО) по Vernon (цит. по Овезмурадовой, 1964) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (цит. по Т.П. Генинг, 1980).

Для оценки функционального состояния нейтрофилов (Нф) использовали цитохимические методы исследования. В клетках, выделенных из венозной крови, определяли активность мнелопероксидазы (МПО) (по Тодорову И., 1963); содержание катионных белков (КБ) (Шубич М.Г., 1974); пробу с восстановлением нитросинего тетразолия (НСТ) в спонтанном и стимулированном опсонизированными частицами зимозана вариантах теста проводили по А.А.Быковой (2003). Поглотительную способность Нф определяли с использованием суспензии дрожжей (Пигаревский В.Е., 1978). Рассчитывали фагоцитарный ивдекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ).

Для оценки клеточного звена иммунитета на лимфоцитах (Лф), выделенных из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте фиколл-верографина (плотность 1,007 г/мл) определяли дифференцировочные и активационные маркеры - CD3, CD4, CDs, CD16, CD27, CD70, CD95 - методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител производства «Сорбент».

Оценку спонтанного и ицдуцированного апопгоза Лф проводили методом проточной цитофлуориметрии. При этом использовали методы оценки изменений в ядре, в клеточной мембране, изменений величины митохоцдриального потенциала АТГП.

Концентрацию цитокинов: интерлейкин-1 (IL-1), интерферон-гамма (IFN-y) и фактор некроза опухоли (TNF-a) определяли в сыворотке крови методом твердого иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин», г.С-Петербург).

При исследовании оперативно удаленных опухолей яичников проводились морфологические и иммуногистохимические исследования новообразования. При этом проводилось измерение трех размеров, учитывалась локализация и характер роста. Морфометрический анализ ткани опухоли включал:

- исследование паренхимы новообразования;

- исследование стромы новообразования;

- исследование сосудистого русла;

- исследование некрозов;

- исследование лимфоидноклеточной инфильтрации новообразования.

Квангиметрию составляющих опухоли осуществляли в 10 произвольных полях

зрения на микроскопе «Reichzt Polivar 2» фирмы «Leika» с план-объективом FJ АРО 10x0,30, совмещенным с цифровой видеокамерой JVC разрешением 800x600 пикселей при

помощи анализаторов цифрового изображения «Quantiment 500е» («Leika»),

Гистохимические препараты опухолевой ткани окрашивали обычными способами и проводили иммуногистохимические исследования. При оценке пролиферативной активности использовали моноклональные антитела к антигену ядер пролиферирующих клеток PCNA и к негистонному белку Ki-67. Использовали коммерческие антитела фирм Novocastra и Dako. В иммуногистохимической оценке экспрессии rat р53 использовали мышиные моноклональные антитела р53, клон DO-7, Ig G2b (М7001 DakoCytomation) в разведении 1:100 при времени экспозиции 60 мин. Критерием положительной реакции считалась окраска 10% и более ядер опухолевых клеток. Вс1-2 обнаруживался с помощью моноклональных антител к bcl-2, клон Bcl-2/100/D5. IgGi (NCL-bcl-2 Novocastra) в разведении 1:80 при инкубации 60 мин. Положительной считалась реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10% опухолевых клеток.

Статистическая обработка данных производилась с использованием параметрических (1-критерш"1 Стьюденга) и непараметрических методов математической статистики (критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса, коэффициент корреляции Спирмеиа) и регрессионного анализа при помощи компьютерных программ Microsoft Excel и Stata 6.0., а также кластерным анализом, используя компьютерную программу S'-PLTJS'-2000.

Результаты исследования и их обсуждение

Статистический анализ заболеваемости раком яичников в Ульяновской области за период 1999-2005 гг. позволил установить следующее.

Динамика заболеваемости раком яичников, равно как и смертности от него в Ульяновской области имеют стабильную и, особенно выраженную для заболеваемости, тенденцию роста. Средний возраст больных на момент установки диагноза колеблется от 51 года до 67 лет. Распределение по возрасту нормальное.

Методическая основа актуариального метода - предположение о дожитии до конца анализируемого i-летнего срока, либо '/г от числа выбывших, либо всех этих больных, является неточной и приводит к существенному завышению результатов. В связи с этим в качестве критерия при оценке онкоэпидемиологических данными использовали срок жизни с момента установки диагноза. Было установлено, что срок жизни с момента установки диагноза у больных в Ульяновской области варьирует от 3,3 до 30,2 месяцев. Значимость района проживания при этом не является существенной.

На момент постановки диагноза 1-II клинические стадии по FIGO имели 30,3% больных раком яичников; III стадию- 30,2% и IV стадию 39,5%. Достоверно меньшую

продолжительность жизни с момента установки диагноза имели больные, находящиеся в IV клинической стадии заболевания по сравнению с больными в I, II и III клиническими стадиями, а также больные с III стадией по FIGO по сравнению с больными, в I стадии. Стадия FIGO имеет высокую значимость для прогноза срока жизни с момента установки диагноза. А вот общая эффективность сгадировэния с использованием классификации TNM обусловлена позицией «М». Значимость критериев «Т» и «N» для прогноза сроков жизни с момента установки диагноза незначительна. При этом сроки жизни с момента установки диагноза слабо коррелируют с возрастом, в котором был установлен диагноз.

В зависимости от гистологической структуры опухоли у больных раком яичников в Ульяновской области за период 1999-2005гг. 35% были отнесены к серозному гистологическому типу, 28%- к мущгаозному, 19%- к эндометриоидному, 16%- к мезонефроидному, 16%- неклассифицируемые и 2%- злокачественная опухоль Бреннера. Процент морфологического подтверждения диагноза в соответствии с международной гистологической классификацией в рассматриваемой группе больных составил 70,4%. Наибольший срок жизни с момента установки диагноза наблюдается у больных с серозным раком, наименьший - у больных с муцинозным раком яичников. Значимость гистотипа опухоли для прогноза срока жизни с момента установки диагноза достаточно высокая.

Показано также, что среди злокачественных эпителиальных опухолей яичников в Ульяновской области высоко-, средне- и низкодифференцированные формы встречаются практически с одинаковой частотой (30,7%, 33,6% и 35,7% соответственно). При этом одновременно со снижением уровня дифференцировки опухоли наблюдается увеличение степени распространения опухолевого процесса. Однако, в целом, значимость дифференцировки для прогноза срока жизни с момента установки диагноза не является существенной.

Среди леченных в Ульяновском областном онкологическом диспансере в период 1999-2005гт. в течение периода наблюдения у 21,9% больных был обнаружен рецидив заболевания, представленный метастазами различной локализации.

В целях выявления факторов риска развития РЯ, в частности возрастного фактора и репродуктивного анамнеза, а также предшествующей или сопутствующей гениталыгой и экстагенигальной патологии, характера и степени распространения неоилазии яичников, проведен ретроспективный анализ 404 историй болезней и результатов собственных исследований. При изучении возрастной характеристики больных раком яичников, обращала на себя внимание более частая встречаемость заболевания у женщин в возрастной группе 50-69 лет, причем большую часть больных составили пациентки 50-59

лет. В группах младше 30 лет и старше 70 лет количество пациенток составляло соответственно 3 и 4 пациентки.

Анализируя менструальную функщво больных раком яичников, следует отметить, что наибольшее количество больных в изученной группе наблюдалось в постмепопаузалыюм периоде. Именно в этот период возникает выраженный гормональный дисбаланс, подавляется продукты эстрогенов в яичниках, активизируется конверсия андрогенов в эстрогены в жировой ткани, печени. Характер сопутствующей гениталыюй патологии у больных раком яичников не отличался на различных стадиях заболевания. Наиболее часто, вне зависимости от стадии заболевания, у больных раком яичников диагностировались хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и сердечно-сосудистые заболевания.

При изучении характера жалоб пациенток, мы также не обнаружили пагогшмоничной клинической симптоматики. В большинстве своем больные 1-П стадий жалоб не предъявляли (57%), 43% пациенток беспокоили периодические боли, дискомфорт внизу живота. Больные распространенным раком яичников предъявляли жалобы на увеличение живота в объеме, одышку, слабость, затрудненное мочеиспускание и дефекацию.

Всем больным раком яичников было проведено эхографическое исследование гениталий. Однако, ретроспективно сопоставляя результаты УЗИ исследования и данные, полученные при лапаротомии, мы обнаружили расхождение в оценке объема, местоположения, целостности капсулы злокачественного новообразования яичников в 28% случаев, преимущественно у больных со II (16случасв) и III (41 случай) стадиями процесса.

У всех больных РЯ оценивали общие и биохимические показатели крови. Результаты изложены в диссертации. Установлено отсутствие статистически значимой разницы этих показателей на различных клинических стадиях заболевания.

Всем больным с подозрением на рак яичников было произведено исследование крови на уровень онкомаркера СА125.

При этом, не выявлено корреляции между уровнем онкомаркера СА125 и стадией злокачественного процесса у первичных больных раком яичников.

Несмотря на обилие разнообразных методов диагностики, основным до сих пор остается гистологическое исследование биоптата яичника, которое может дать точный ответ о характере и структуре опухоли, а, следовательно, определюъ дальнейшую тактику ведения данной больной, основные методы лечения в применении к конкретному случаю и прогноз.

Таблица 1

Распределение обследуемых больных по гистологическому типу опухоли

Гистотип Число больных Из них с соответствующей стадией заболевания

Г-Н III IV

Абс.число % Абс.число % Абс.число %

Серозная 130 40 36 47 29 43 32,8

Эндометриоидная 100 25 22,5 44 27,1 31 23,66

Муцинозная 76 24 21,6 28 17,2 24 18,3

Светолоклеточная 37 14 10,6 14 8,6 9 5,5

Неклассифицируемая 55 7 6,3 25 15,4 23 17,5

Злокачественная опухоль Бреннера 5 1 0,9 4 2,4 0

Таблица 2

Распределение больных раком яичников по степени дифференцировки опухоли и стадии заболевания.

Степень дифференц. опухоли Число больных Из них с соответствующей стадией заболевания

1-И III IV

Абс. число % Абс. число % Абс. число %

Высокая 118 49 41,5 52 44,06 17 14,4

Умеренная 133 43 32,3 57 42,8 33 24,8

Низкая 134 15 11,19 52 38,8 67 50

Недиффер. 19 0 - 7 36,8 12 63,2

Из анализа данных таблицы 2 следует, что среди больных ранними стадиями заболевания (1-Н) высокодифференцированные формы опухоли составили 41,5%, а низкодифференцированные только 15%.

У больных с далеко зашедшей стадией заболевания (IV), напротив, низкодифференцированные формы существенно преобладали над высокодифференцированными (50% против 11,19%). Следовательно, одновременно со снижением уровня дифференцировки опухоли наблюдается увеличение степени распространения опухолевого процесса.

Таким образом, на основании результатов общепринятых клинико-лабораторных, патоморфологических и инструментальных методов обследования, можно заключить, что

значимыми при определении стадии распространения злокачественного процесса в яичниках являются данные о размерах, локализации и гистологического строения опухоли, наличии или отсутствии отдаленных метастазов.

Данные литературы свидетельствуют о том, что «естественная история роста опухоли», которая позволила бы индивидуализировать лечение и повысить его эффективность, остается малоизученной (Моисеенко В.М., 2004). Показано, что существенную роль в определении биологического портрета опухоли играет изучение морфологических параметров, а также маркеров пролиферации и апоптоза в неоплазме первичного опухолевого узла Морфологический анализ неоплазмы первичного опухолевого узла (результаты представлены в диссертации) позволил установить, что, в целом, большинство раков яичников не соответствует одному гистологическому типу, а содержит смесь папиллярных, крибриформных, гириформных, морулярных образцов роста; обнаруживает смесь светлых, темных и плоских клеток. Ввиду смешанности гистологических типов опухолей определение степени дифференцировки раковых клеток представляет определенную сложность. Паренхима раковых опухолей яичников составляла большую часть изученных новообразований; средний ее объем без учета сосудов и некрозов составил 68,2%. Несмотря на то, что для опухоли понятие функции не может рассматриваться как эквивалент функции нормальной ткани, способность ее выживать и прогрессивно расти будут определяться в том числе и количеством ее функционально активных клеточных элементов.

На морфологических препаратах по классическим методикам прирост может документироваться изучением митотической активности (рис. 1).

Рис. 1 Митоз раковых

клеток яичника (окраска гематоксилин-эозином, микрофото, х!200)

Рис. 2. Высокая активность РСЫА в зонах инвазии рака яичника в строму (микрофото, хЮО).

Рис. 3. Единичные клетки Кл 67+ в недифференцированном раке яичника (микрофото, хбОО).

е^ №

Рис. 4. Единичные клетки Вс1-2+ в мелких железах (микрофото, хЗОО).

Рис.5. Кл 67 в клетках

мелких желез эндометриоидного рака яичника (микрофото, хЗОО).

Рис.6. Массивный некроз с захватом, как

стромы, так и паренхимы опухоли при раке яичников (окраска гематоксилин-эозином, микрофото, хЮО).

Рис.9. 100% активность РСЫА в железах рака яичника (микрофото, хЮО).

Рис.7. Высокая Рис. 8. Высокая

активность Ю 67 в интенсивность PCNA в

зонах инвазии рака папиллярных отделах

яичника в строму эндометриоидного рака

(микрофото, хЮО). яичника

(микрофото, хЗОО).

С помощью современных методов иммуногистохимии эти параметры еще более точно определяются путем применения маркеров РСЫА и Кг 67. Оба маркера относятся к нуклеарным и обнаруживаются в ядрах исследуемых клеток. Результаты оценки этих

показателей в ткани первичного опухолевого узла на различных клинических стадиях РЯ представлены на рис. 10.

90^

О К1-67 я РСМА □ Мит индекс

Рис.10. Гистограмма пролиферативной активности раковых клеток в раковых опухолях яичников на различных клинических стадиях заболевания

Исследование некрозов в раковых опухолях яичников обнаружило крайне неравномерный их характер (рис.11). В случаях массивных некрозов некротизированию подвергались как паренхима, так и строма с сосудами. Количественные показатели представлены в табл.3.

| м Массивный некроз я Некроз раковых клеток Суммарный некроз ] Рис. 11. Объем массивных некрозов в раковых опухолях яичников

Объем массивных некрозов в раковых опухолях яичников.

Таблица 3

Показатель М т Кв.

Массивный некроз, % 8,5 1,4 1,5

Некроз РК, % 3,4 0,54 0,75

Суммарный некроз, % 14,9 1,43 1,7

Проведенные исследования показали, что PCNA наиболее интенсивно выявляется в папиллярных новообразованиях, в мелких железах и участках инвазивного роста (рис.8).

На 1 и II клинических стадиях заболевания уровень PCNA демонстрирует значительные колебания от 18 % до 32%. Что касается Ki-67, то в результате проведенных исследований было установлено, что на I клинической стадии заболевания количество Ki-67+ -клеток невелико и составляет порядка 5,4±0,63% (рис.3). Расположение этих клеток не имеет выраженных закономерностей. Ki-67+ -клетки располагаются разрозненно и, как правило, единичны. Однако, имеется устойчивая тенденция к увеличению таких клеток в мелких железах (рис.5). В группе раковых опухолей яичников II стадии указанные тенденции сохранялись, количество Ki-67+ клеток составляла уже 10,2±0,66%.

При прогрессировании неоплазмы (III стадия) обнаруживается тенденция к усилению экспрессии Ki-67 (47,0±4,12%) (рис.7) и PCNA (рис.8).

Исследование раковых опухолей яичников IV стадии показало сохранение высокой пролиферативной активности: экспрессия Ki-67 в ряде случаев достигала 58%, а PCNA -100% (рис.9).

Результаты исследования по оценке экспрессии иммуногистохимического маркера Вс!-2 атипическими эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ представлены на рис.12.

Показано, что количество опухолевых клеток, экспрессирующих Вс1-2, статистически значимо возрастает. При этом корреляционная связь со стадией высокая (г=0,6255). Усиление антиапоототического фактора при прогрессировании РЯ объясняет, в частности, высокий злокачественный потенциал этих новообразований (рис.12).

При оценке стромы раковых опухолей яичников и эпителиально-стромальных взаимоотношений в первичном опухолевом узле при РЯ установлено, что объем стромы колеблется в зависимости от объема паренхимы и составляет 12,57t 1,5%. Клеточный состав стромы характеризовался преобладанием молодых форм фибробластов и фиброцитов (рис. 13).

Эпигелиально-сгромальные взаимоотношения при РЯ характеризовались наличием разрывов, либо отсутствием базальной мембраны, разграничивающей эпителиальные и стромальные компоненты. Это, с одной стороны, облегчает в случае рыхлой соединительной стромы процесс продвижения раковых комплексов. В то же время в зоне контакта раковых и стромальных клеток начинают активно пролиферировать фибробласты и создается плотный пограничный вал. Со степенью зрелости и

выраженностью соединительнотканной стромы взаимосвязаны неоаншогенез и уровень кровоснабжения раковых опухолей.

I в I стадия ■ II стадия □ III стадия о IV стадия |

Рис. 12. Уровень экспрессии Вс1-2 атипичными эпителиальными клетками при РЯ в динамике прогрессирования заболевания

ш Средние Фб. ■ Большие Фб. о Молодые Фб. □ Фиброциты ■ Объем стромы

Рис. 13. Соотношение различных типов фибробластов в серозных РЯ.

В результате проведенных исследований было установлено, что неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ имеет, в целом, высокий уровень кровоснабжения; при этом объем кровеносных сосудов и их плотность возрастают в процессе прогрессирования опухоли (рис. 14).

IV стадия

«24,43

III стадия

И22'71

N1 стадия

§¡(20,4

13,81

|Ш Обьем сосудов, % а Плотность сосудов на 1мм2 опухоли | Рис. 14. Параметры сосудистого русла первичной опухоли при РЯ на различных клинических стадиях заболевания

При этом длина сосудов положительно коррелирует с объемом стромы (г=+0,573) и числом средних (г=+0,265) и гиперактивных больших фибробластов (г=+0,327).

Уровень кровоснабжения определяет в значительной степени и питание раковых клеток, что не может не сказаться на соотношении между гликолитическим и аэробным метаболизмом в них. В результате исследования активности мембраносвязанных митохондриальных ферментов СДГ и ЦХО в опухолевой ткани было установлено снижение их активности в динамике нрогрессирования опухоли (рис. 15).

[мцхо -ч-(ЗДр|

Рис. 15. Гистограмма распределения СДГ и ЦХО в неоплазме первичного опухолевого узла у больных РЯ в зависимости от клинической стадии заболевания

Подобная динамика активности мембраносвязанных митохондриальных ферментов может свидетельствовать о нарастающей гипоксии опухолевых клеток, которая может

быть результатом неполноценного кровоснабжения, особенно глубинных участков опухоли. Однако, по мнению рядов авторов (Лю Б.М., 2004), митохондрии опухолевых клеток дефектны и, как следствие, речь идет в них о так называемой «фиктивной» гипоксии, или фактической гипероксии.

Таблица 4

Уровень МДА, активность каталазы, ГР и СОД в неоплазме первичного опухолевого узла у больных раком яичников в зависимости от клинической стадии

заболевания.

Изучаемы Рак яичников

е I стадия II стадия III стадия IV стадия

показатели п М±ш Р п М±ш Р п М±т Р п М±ш Р

сод, 13 110,93± р<0, 5 92,92± р<0, 33 136,67± р<0, 7 105,79 р<0,

у.е7г 1,14 001 0,73 001 1,02 001 ±0,73 001

Р)<0, Р1<0 Р1<0

001 ,001 ,001

МДА, 11 493,0±6, р<0, 9 642,3±1 р<0, 36 703,3±1,1 р<0, 1 340,8± 1,27 р<0,

мкм оль/г 41 001 ,33 001 5 001 0 001

Р1<0, Р1<0 Р1<0

001 ,001 ,001

Катал аза, И 21,2±1,2 р>0, 9 23,4±1, р>0, 36 26,9±0,94 р<0, I 16Д±0,69 р<0,

моль/с-г 3 5 12 5 001 0 001

Р1>0, р,<0 Р1<0

5 ,001 ,001

ГР, И 26,8±0,9 р<0, 9 29,4±1, р>0, 36 32,8±0,62 р<0, 1 21,4±0,92 р<0,

мкмоль/с- 7 001 04 5 001 0 001

г Р1<0, Р1<0 р,<0

001 ,001 ,001

Примечание : «р» - рассчитано по отношению к показате лю при миоме матки

«Р1» - рассчитано по отношению к показателю на предыдущей стадии заболевания

Усиление гликолиза и ослабление аэробного метаболизма связывают с отсутствием активности белка р53 (Вегкаас) К. е! а), 2006). На сегодня описано около 2000 типов

миссенс мутаций р53, которые обеспечивают подавление его функций и потому подвергаются селекции в клетках опухолей (Натгоип О. а а1, 2006). В наших исследованиях показано увеличение экспрессии р53 опухолевыми клетками в динамике прогрессирования РЯ (рис.16).

У мутантного р53 появляются так называемые новоприобрегенные функции, направленные на дальнейшее повышение злокачественности клегок и на приобретение устойчивости к противораковой терапии (Вепваас! К. е! а1, 2006; \Veisz Ь. е1 а1, 2007). Одним из следствий недостаточности р53 может быть также повышение уровня внутриклеточных кислородных радикалов (Векаас! К. е1 а1, 2006)

В результате проведенных нами исследований установлено повышение уровня ПОЛ в опухолевых клетках, нарастающее с 1-ой по 111-ю клинические стадии заболевания (табл.4).

Следствием фактической гнпероксии является переход системы ПОЛ-АО на 111 стадии заболевания в «специализированный» диапазон, характерный для канцерогенеза и затем, в отдельных зонах опухоли, окислительного цитолиза. Это подтверждается наблюдаемой динамикой антиоксидантных ферментов в опухолевой ткани (табл.4).

IV стадия Ш стадия 11 стадия I стадия

О 10 20 30 40 50 60 70 ао

Рис. 16. Гистограмма уровня экспрессии mt р53 атипичными эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ.

Считается установленным, что у больных РЯ имеет место значительная иммунодепрессия, затрагивающая, в основном, Т-, NK-клсточное и фагоцитарное звенья иммунитета. Однако, не существует единой точки зрения на динамику показателей специфической и неспецифической защиты организма при прогрессировании заболевания.

В результате проведенных исследований мы установили, что общее количество лейкоцитов периферической крови статистически значимо снижается на 1-Ш клинических стадиях заболевания и возрастает на 1У-0Й стадии (рис 17).

IV стадия III стадия И стадия I стадия Доноры

I ЕЗ Lei х109/л и НфхЮЭ/л □ ЛфхЮШЛ □ NK Х109/л [

Рис. |7. Гистограмма изменений общего количества лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и NK периферической крови больных РЯ на различных клинических стадиях

заболевания

При этом общее количество Нф периферической крови статистически значимо возрастает при прогрессировании опухоли (рис.17), однако цитотоксичность Нф, как кислородзависимая, так и кислороднезависимая снижается (рис. 18). Последнее, на фоне возрастания АФИ и АФЧ (данные изложены в диссертации), может свидетельствовать о снижении способности Нф периферической крови к завершенному фагоцитозу.

Доноры I стадия II стадия III стадия IV стадия

Рис. 18. Гистограмма распределения активности МПО и уровень КБ нейтрофилов периферической крови больных РЯ на различных клинических стадиях заболевания

В ходе исследований также было установлено возрастание CD]6+ Лф при прогрессировали! опухолевого процесса. Абсолютное количество NIC при этом изменялось статистически не значимо (табл.5). Подобная динамика может свидетельствовать в пользу гипотезы о селекции NK-резистентных вариантов опухолевых клеток при развитии РЯ. Полученные нами результаты подтверждают данные о существенном изменении иммунного статуса при прогрессировали РЯ. Прежде всего было установлено снижение общего количества Лф периферической крови, прогрессирующее в ходе развития опухолевого процесса. На фоне снижения общего количества Лф происходит снижение относительного количества Т-Лф (СПз+) и их субпопуляции (CÖ4*) при одновременном увеличении CrV-клеток (табл.5).

По данным ряда авторов (Yang Т. et al., 2007), прогрессирующий РЯ поддерживает высокую пролиферативную активность CDg^-T-клеток.

Анализ динамики экспрессии на Лф периферической крови активационных маркеров показал коррелирующее со стадией увеличение CD25+, CD?/ и CD«* клеток (табл.6).

Наблюдаемая динамика экспрессии дифференцировочных и активационных маркеров на Лф периферической крови может свидетельствовать о нарушении специфических механизмов иммунологической защиты при прогрессировании РЯ. В пользу такого утверждения свидетельствуют и полученные данные о нарастании чувствительности Лф периферической крови к спонтанному и индуцированному апоптозу in vitro в динамике опухолевой прогрессии (данные изложены в диссертации).

В результате проведенных исследований установлено, что у Лф доноров снижение величины A4' и появление ФС на поверхности клеток происходит в первую очередь и практически одновременно. Упорядоченная фрагментация ДНК начинается несколько позже (результаты изложены в диссертации).

Снижение ДТ и экспрессия ФС на поверхности лимфоцитов больных РЯ в указанные сроки инкубации были достоверно более выражены, по сравнению с Лф доноров, и нарастали при прогрессировании опухоли. Процесс упорядоченной фрагментации ДНК в этих Лф начинался раньше, чем в Лф доноров, усиливался в процессе опухолевой прогрессии и у больных в Vl-й клинической стадии заболевания более чем в 3 раза превышал показатели для Лф доноров (графический материал представлен в диссертации).

Инкубация с дексаметазоном (Дн) индуцировала в Лф вышеперечисленные изменения. Однако их динамика и степень выраженности в Лф доноров и в Лф больных РЯ были различными. Было установлено, что снижение ДЧ' при инкубации с Дн в Лф

больных РЯ было существенно и достоверно более выражено, нежели в Лф здоровых женщин, и нарастало в динамике опухолевой прогрессии.

Выявленная обратная зависимость между падением ДЧ', как спонтанным, гак и Дн-индунированным, и появлением молекул ФС на поверхности Лф свидетельствует в пользу высказанной ранее гипотезы (Бойчук C.B., Антонеева И.И., 2007), согласно которой экспрессия ФС на поверхности Лф происходит только при снижении ДЧ*.

Исследования показали четкую обратную зависимость между величиной ДЧР и уровнем экспрессии ФС. Выявлено, что Лф с нормальной величиной митохондриалыюго потенциала практически не экспрессируют ФС на своей поверхности. Снижение ДЧ1, как спонтанное, так и индуцированное Дн, предшествует появлению ФС на поверхности Лф.

Дн также индуцировал фрагментацию ДНК Лф больных РЯ после 72 часов инкубации. В Лф доноров этот процесс начинался несколько позже, после 96 часов инкубации. При этом количество клеток с упорядоченной фрагментацией ДНК было несколько выше среди Лф больных по сравнению с Лф доноров и больных на 1-И-й стадиях и резко возрастало у больных в III-IV-й клинической стадии заболевания.

Аналогичные различия в изменении этого показателя апоптоза имели место и при 120 часах инкубации лимфоцитов с Дн.

Инкубация Лф с индуктором апоптоза ФГА вызвала более выраженные, нежели инкубация с Дн, изменения изучаемых параметров на всех сроках инкубации. При этом достоверно выше, по сравнению с донорами, в Лф больных РЯ было падение ДЧ", экспрессия ФС и фрагментация ДНК. Наблюдаемые изменения были также достоверно более выражены у больных с III-IV-й клиническими стадиями заболевания по сравнению с Лф больных М1-й стадии.

Следующим фактором, способным оказать влияние на запуск процессов апоптоза, является наличие на клеточной поверхности специализированных «рецепторов смерти», к которым относятся Fas-рецепторы (CD95). Наличие на клеточной поверхности рецепторов данного семейства определяет готовность клетки к Fas-индуцированному апоптозу при контакте с соответствующим лигандом. Данные рецепторы опосредуют важнейший сигнальный путь запуска апоптоза такими различными факторами, как цитокины, свободные радикалы, гормоны, цитосгатики, моноклональные антитела (airm-Fas) и другие специфические лиганды (Райхлин Н.Т., Райхлин А Н., 2002).

Таблица 5

Экспрессия дифференцировочных маркеров на Лф периферической крови больных раком яичников, находящихся в репроду ктивном

периоде

\ Показатель Всего Ьа-М'/л Всего Лф, % СБз, % С04, V. С1)„% со„, %

\ п М±т Р 'л М±т Р п М±т Р п М±ш Р п М±т Р п М±т Р

Групп» \ обследований»

доноры 40 6,9± 0,03 40 39,7± 0,20 40 64,2± 0,61 40 40,3± 0,41 40 15,7± 1,32 40 16,2± 1,12

I стадия РЯ 29 6,0± 0,07 р<0,001 29 33,8± 0,60 р<0,001 29 63,9± 0,42 Р>0,5 29 39,7± 0,84 р>0,5 29 25,9± 0,83 р<0,001 29 17,04± 0,92 р>0,5

II стадия РЯ 26 6,05± 0,07 р<0,001 р,>0,5 26 34,4± 0,90 р<0,001 р,Х),05 26 61,3± 0,50 р<0,001 Р1>0,05 26 31,6± 0,52 р<0,001 р,<0,001 26 25,1± 0,62 р<0,001 р,>0,5 26 18,71± 1,13 р<0,001 р,>0,5

III стадия РЯ 40 6,2± 0,04 р<0,001 р,<0,001 40 32,6± 0,30 р<0,001 р,<0,001 40 56,4± 0,82 р<0,001 Р1<0,001 40 29,4± 0,53 р<0,001 р,<0,001 40 23,8± 1,34 р<0,001 р,>0,5 40 22,69± 0,76 рс0,001 Р(<0,001

IV стадия РЯ 34 7,1± 0,06 р<0,001 р,<0,001 34 28,4± 0,80 р<0,001 р,<0,001 34 52,8± 0,73 р<0,001 р ,<0,001 34 30,1± 0,91 р<0,001 р,>0,5 34 23,0± 1,40 р<0,001 Р,>0,5 34 19,0± 1,10 рс0,001 р,<0,001

Примечание: р - относительно соответствующих показателей у доноров;

Р! - относительно соответствующих показателей на предыдущей клинической стадии заболевания.

Таблица 6

Экспрессия активационных маркеров на Лф периферической крови больных раком яичников, находящихся в репродуктивном периоде

\Показате \ ль Всего ЬеНО'/л Всего Лф, % ст5,% НЬА-ВН, % С071, % СВ95, %

\ п М±т Р п М±т Р п М±т Р 11 М±т Р п М±т Р п М±га Р

ГруАпа обследов анных\

доноры 40 6,9±0 .03 - 40 39,7±0 ,20 - 40 9,2±0, 40 - 40 17,8±0 ,63 - 40 7,2±0, 91 - 40 60,3±1,2 5 -

I стадия РЯ 29 6,0±0 ,07 р<0,00 1 29 33,8±0 ,60 р<0,00 1 29 16,8±0 ,51 р<0,00 1 29 21,7±0 ,42 р<0,00 1 29 11,3±0 ,60 р<0,00 1 29 63,7±2,6 0 р>0,5

II стадия РЯ 26 6,1±0 ,07 р<0,00 1 Р1>0,5 26 34,4±0 ,90 р<0,00 1 р,>0,5 26 18,1±0 ,83 р<0,00 1 Р1>0,5 26 19,0±0 ,74 р>0,5 р,<0.00 1 26 16,4±0 ,82 р<0,00 1 р,<0,00 1 26 67,3±1,8 4 р<0,00 1 р,>0,5

III стадия РЯ 40 6,2±0 ,04 р<0,00 1 Р1>0,5 40 32,6±0 ,30 р<0,00 1 Р1<0,00 1 40 22,б± 1 .10 р<0,00 1 р,<0,00 1 40 23,4±0 ,90 р<0,00 1 Р1<0,00 1 40 19,3±0 ,74 р<0,00 1 р,<0,00 1 40 71,0*1,3 1 р<0,00 1 р,<0,0 01

IV стадия РЯ 34 7,1±0 ,06 р>0,5 р!<0,00 1 34 28,4±0 ,80 р<0,00 1 Р!<0,00 1 34 23,4±0 ,9 р<0,01 р,>0,5 34 18,5±0 ,84 р>0,5 р,<0,00 1 34 21,0±0 ,83 р<0,00 1 Р1<0,00 1 34 73,2±2,7 4 р<0,00 1 Р1>0,5

Примечание: р - относительно соответствующих показателей у доноров;

Р] - относительно соответствующих показателей на предыдущей клинической стадии заболевания.

В результате проведенных исследований было установлено, что экспрессия CD95 имела место на 66,5±11,2% клеток доноров и на 65,8±9,3% Лф больных РЯ в 1-й стадии, 68,4±8,7% - во П-й стадии, 74,1*10,9% - в Ш-й стадии и 75,0-1-13,7% - в IV-й клинической стадии заболевания. Разница между показателями статистически незначима. Более впечатляющими были результаты оценки величины изменений в ядре и клеточной мембране после инкубации лимфоцитов с aiira-Fas-AT. Было показано, что если дня Лф доноров величины A4', экспрессии ФС и фрагментации ДНК достоверно не отличаются от таковых при инкубации без amn-Fas-AT, то для Лф больных РЯ вышеуказанные показатели достоверно и существенно превышают таковые как при «чистой инкубации», так и при инкубации с Дн и ФГА.

Таким образом, снижение A4' Лф при использовании индукторов апоптоза может свидетельствовать об обязательном участии митохондрий в процессах программированной клеточной гибели Лф. Полученные данные позволяют говорить о том, что снижение A41 является наиболее ранним признаком апоптоза Лф, который, возможно, способен инициировать другие его проявления. Полученные нами данные также свидетельствуют о повышенной чувствительности Лф больных РЯ к апоптозу, что может быть обусловлено, как «гиперреактивностью» их митохондрий, так и изменениями в экспрессии про- или антиапоптогенных белков, участвующих в каскаде реакций Fas-опосредованнога апоптоза. При этом чувствительность Лф к апоптозу нарастает в динамике опухолевой прогрессии.

В большинстве случаев развития неоплазмы наблюдаются морфологические проявления иммунобиологических реакций. Выраженность этих реакции, по данным ряда авторов, значимо коррелирует с прогнозом заболевания (Han L.Y., 2008; Shah С.А. et al., 2008). В результате проведенной нами оценки лимфоидноклеточной инфильтрации оперативно удаленных опухолей больных РЯ было установлено, что в целом интенсивность ЛИКИ в раковых новообразованиях яичников низкая. В отдельных опухолях наблюдается образование краевого лимфоидно-клеточного вала. Лимфоидные клетки, составляющие инфильтрат, разнообразные по морфологическому составу; в основе лежат Лф и плазматические клетки (рис. 19,20,21).

Исследование ЛПКИ опухолей различного гистологического строения не обнаружило особенностей. Было показано отчетливое снижение уровня инфильтрации при снижении дифференцировки опухолевых клеток. При оценки ЛПКИ в динамике прогрессировала РЯ показано значительное ее снижение (табл.7).

Сегментояде

рные лейкоциты; Плазматичес 3,10% кие клетки; 22,10%

Макрофаги,МВГ^^Н лф. й250% 12,30% ^^

Рис.19. Соотношение различных лнмфоидных клеток в инфильтрате раковых опухолей яичников

Таблица 7

Уровень лимфоидноклеточиой инфильтрации опухолей яичников на разных стадиях рака

яичников

Показатель 1 стадия 2 стадия 3 стадия 4 стадия

Лф, кл на 1мм" Оп 317,5±67 227,4± 107* 210,7±130 178,7±108*

Примечание: * - данные, достоверно различающиеся с данными предыдущей

стадии.

Рис. 20. Лимфоидные клетки на Рис. 21. Плазматические клетки в

границе строма - паренхима рака яичника инфильтрате стромы рака яичника

(гематоксилин-эозин, микрофото, хЮО). (гематоксилин-эозин, микрофото, хЮО).

Таким образом, слабая выраженность ЛПКИ при прогрессировали РЯ, возможно, в определенной степени отражает ее неспособность к реализации противоопухолевого иммунитета.

Считается установленным факт развития цигокиновой дисрегуляции в условиях роста опухоли. Итогом взаимодействия цитокинов и опухолевых клеток во многих случаях является усиление роста последних.

Анализ динамики содержания основных провоспалительных цитокинов IL-ip и TNF-a, а также IFN-y при РЯ позволил установит существенное и достоверное их увеличение в плазме крови как по сравнению с донорами, так и в динамике прогрессирования заболевания (рис.22).

Рассматривая роль цитокинов в развитии локальных эффектов при прогрессировании РЯ, в первую очередь следует показать их влияние на образование de novo сосудов в зоне опухолевого роста, расширение и нарушение проницаемости этих сосудов (рис.22), стимуляцию пролиферации и блокирование апоптоза опухолевых клеток (рис.23).

контроль ! стадия II стадия III стадия IV стадия

ЕИЯ11-1 шщз TNF-a

ка IFN-y —*—сосна 1мм2 опухоли

—н—V сосудов.%

Рис.22. Гистограмма изменений параметров сосудистого русла первичного опухолевого узла и содержания провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, ТЫГ-и и ШИ-у) в крови при РЯ на различных клинических стадиях заболевания

Как следует из данных рис. 11, возрастание уровня провоспалительных цитокинов (1Ь-1(3, ТЫК-и и коррелирует с увеличением атипичных клеток РЯ,

экспрессирующих Вс1-2 и пц р53 в динамике опухолевой прогрессии.

33

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

I стадия II стадия III стадия IV стадия

и»ц_-1|3 .-,:„,j TNF-a ежа и-м-у

—л—PCNA -*- Ki-67 -*-Мит. индекс

Рис.23. Гистограмма пролиферативной активности и митотического индекса раковых клеток первичного опухолевого узла и содержания провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, Т№'-а и №N-7) в крови при РЯ на различных клинических стадиях заболевания

Данные о корреляционных связях уровня провоспалительных цитокинов с показателями пролиферативной активности, апоптоза и параметрами микроциркуляторного русла при прогрессировании РЯ изложены в диссертации.

с; £

50 О

I стадия II стадия III стадия IV стадия

■»IL-1P ss»TNF-a sssalFN-y essPCNA Ki-67 Мит. индекс*—Bcl-2,% -*-р53,%

Рис.24. Гистограмма уровня экспрессии пй р53 и Вс1-2 ати1тч!шми эпителиальными клетками первичного опухолевого узла и содержания провоспалительных цитокинов (1Ь-1 р, ТЫ1'-а и !ГМ-у) в крови при РЯ на различных клинических стадиях заболевания

Таким образом, наиболее значимыми для усиления биологического потенциала опухоли являются такие эффекты провоспалительных цитокинов как стимулирование пролиферации опухолевых клеток, образование сосудов в зоне опухолевого роста и усиление экспрессии антиапоптотических белков.

Рис.25. Схема алгоритма дополнительных лабораторных исследований для дифференциации стадий рака яичников по FIGO.

В результате проведенных исследований было определено порядка 40 показателей плазмы крови, эритроцитов, лимфоцитов, нейгрофилов, морфологии и функционального состояния ткани первичного опухолевого узла с целью создания биологического портрета

опухоли и оценки взаимоотношений ee с макроорганизмом на различных клинических стадиях заболевания.

Анализ всех данных, полученных в результате диссертационного исследования, позволил установить отсутствие показателей, позволяющих провести дифференциальный диагноз I и И стадий РЯ по FIGO.

Существенные различия уровня КБ, МПО и ФЧ Нф периферической крови (результаты статистического анализа изложены в диссертации) позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью использовать их для дифференциально! о диагноза 1-Й и III стадий РЯ.

Нам также удалось установить несколько показателей, которые резко и очень значимо изменяются при переходе от Ш к IV стадии. Результаты статистического анализа изложены в диссертации. Это каталаза, ГР и МДА плазмы крови.

На основании полученных результатов предлагается алгоритм дополнительных лабораторных исследований для дифференциации стадий рака по FIGO (рис.25).

При одновремешюм определении вышеуказанных лабораторных показателей представляется возможным применение специально разработанной формулы, полученной методом аппроксимации нелинейных функций, для ориентировочной оценки стадии заболевания по FIGO.

Дифферснцировочный коэффициент:

П,

х й_ £ <4. Е а-

„ . . CNI . . . Cr,

к= __+ _+ __

п, П2 п3

где i - число повторов теста (i>l);

С 1.3 — показатели маркеров у больного (КБ, МПО и ФЧ) в Нф периферической крови при уточнении I-II и III стадий;

МДА, ГР и каталаза плазмы крови при уточнении III и IV стадий); Cni-з - показатели соответствующих маркеров у здоровых.

Таким образом, на основании результатов диссертационного исследования предлагается алгоритм диагностики прогрессирования течения заболевания РЯ и формула для расчета дифференцировочного коэффициента нри уточнении клинической стадии заболевания.

Выводы

1. Динамика заболеваемости раком яичников, равно как и смертности от него в Ульяновской области имеет стабильную и, особенно выраженную для заболеваемости, тенденцию роста. При этом уровень заболеваемости, в 4 раза превышающий средний по области и по России в целом, наблюдается в районах, входящих в геопатогенную зону и имеющих захоронения радиоактивных отходов.

2. Прогрессирование раковых опухолей яичников сопровождается повышением пролиферагавной активности неоплазмы. При низком уровне некротизирования статистически значимое повышение уровня Вс1-2, свидетельствующее об увеличении антиапоптотического фактора, в сочетании с высоким уровнем mt р53 в динамике прогрессирования первичной опухоли объясняет высокий злокачественный потенциал и может служить прогностическим критерием рака яичников.

3. Ведущим патогенетическим фактором при прогрессировали первичной опухоли при раке яичников является локальная в зоне неоплазмы гипероксия, обусловленная нарастающей дефективностью митохондрий и способствующая отбору клонов опухолевых клеток с высоким уровнем антиоксидантной активности.

4. Реакция Нф периферической крови на развитие опухоли в организме при раке яичников зависит от стадии процесса. При этом наблюдается уменьшением КБ, МПО, особенно выраженное на поздних этапах роста, и коррелирующее со «всплеском» свободно-радикальных процессов в плазме и эритроцитах. Количество NK (CD«;+) клеток в периферической крови нарастает с 1-ой по HI-ю клиническую стадию заболевания, что может быть связано с селекцией NK-резистенгаых вариантов опухолевых клеток либо анэргией NK.

5. У больных раком яичников происходят значительные изменения в экспрессии как дифференцировочных, так и активационных маркеров лимфоцитов, заключающиеся в прогрессирующем снижении уровня экспрессии CD3, CD4 и, соответственно, возрастании уровня экспрессии CDs, CDi6, CD25, CD71, CD95 и HLA-DR. Показана повышенная чувствительность таких лимфоцитов как к спонтанному, так и к индуцированному апоптозу, нарастающая в динамике опухолевой прогрессии и обусловленная как «гиперреаетивностью» их митохондрий, так и изменениями в экспрессии про- и антиапогггогешшх белков, участвующих в каскаде реакций Fas-опосредовалного апоптоза.

6. В сыворотке крови больных раком яичников в процессе прогрессирования неоплазмы повышение уровня провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-a и IFN-y

коррелирует с усилением пролиферативной активности и повышением митотического индекса опухолевых клеток, усилением нсоангиогенеза в зоне опухолевого роста, а также повышением экспрессии антиапоптотнческого белка Вс1-2 и мутантного гена р53, белковый продукт которого определяет злокачественный потенциал опухоли.

7. Одновременное определение в Нф периферической крови уровня КБ, активности МПО и спонтанного НСТ-тсста позволяет с высокой точностью дифференцировать II и III стадии РЯ (чувствительность 97%, специфичность 93%); одновременное определение в плазме крови МДД, каталазы и ГР позволяет аналогичным образом дифференцировать III и IV стадии РЯ. При одновременном определении ряда лабораторных показателей (МДА, каталазы и ГР в плазме крови и КБ, МПО и ФЧ в Нф) представляется возможным использование специально разработанной формулы для ориентировочной оценки стадии заболевания по FIGO.

Практические рекомендации

1. В комплекс обследования женщин, имеющих злокачественные эпителиальные опухоли яичников, для облегчения процедуры стадировация следует включать:

При дифференцировочной диагностике II и III стадии по FIGO определение в Нф периферической крови уровня КБ, активности МПО и спонтанного НСТ-теста;

При дифференциальной диагностике III и IV стадий по FIGO определение в плазме крови МДА, каталазы и ГР.

Использование вышеуказанных показателей позволит рассчитать дифференцировочный коэффициент для уточнения клинической стадии заболевания.

2. При разработке схем молекулярно-направленной терапии, имеющей специфической мишенью рецепторы и сигнальные пути транедукщга, контролирующие клеточную пролиферацию, апопгоз и ангиогенез в раковых опухолях яичников, следует учитывать:

В процессе нрогрсссироваиия рака яичников опухоль гиперэкспрессирует белок мутантного гена р53, а, следовательно, трансфекция диким типом р53 может являться эффективной стратегией для генной терапии, особенно в III-IV стадиях заболевания.

Использовании анти-ангиогенезных препаратов имеет смысл уже на II стадии заболевания, так как неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ имеет высокий уровень кровоснабжения; а объем и плотность кровеносных сосудов возрастают при прогрессировали!! опухоли.

Возрастание уровня в плазме крови в динамике прогрессировать! РЯ

предполагает, что использование экзогенного 1РЫ при проведении иммунотерапии целесообразно на ранних стадиях заболевания и внутрибрюшинным способом введения.

Антиоксидантная терапия с целью коррекции паранеопластических процессов в плазме крови и в эритроцитах целесообразна на II и Ш-ей клинических стадиях РЯ, поскольку именно в этот период имеет место активация свободнорадикальных процессов, не компенсируемая увеличением АО активности крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Всего по теме диссертации опубликовано 91 работР, из них наиболее значимые:

1. Антоиеева, И.И. Уровень перекисного окисления липидов и ферментативное звено антноксндантпон системы плазмы крови, эритроцитов и опухолевой ткани при раке яичников //Вестник новых медицинских технологий. - 2005. - №2. - С.13-14.

2. Аитонеева, И.И. Метаболизм кислорода в эпителиальной опухолевой ткани яичников /И.И.Антонеева, Т.П.Генинг //Вестник Самарского гос. университета. -2005. - №6(40). - С.158-166.

3. Аитонеева, И.И. Перекисное окисление липидов и ферментативное звено антиоксидантной системы крови при раке яичников //Казан, мед. журнал. - 2006. -№3. - С.213-215.

4. Антоиеева, И.И. Кластерный анализ в оценке лабораторных показателен крови больных раком яичников /И.И.Антонеева, Л.А.Казакова //Клин. лаб. диагност. - 2006. - №5. - С.36-39.

5. Антоиеева, И.И. Межнуклеоеомальная фрагментация ДНК в опухолевой ткани при раке яичников /И.И.Антонеева, Д.Р.Арсланова //Паллиативная мед. и реабил. - 2006. - №2. -С.5.

6. Антоиеева, И.И. Анализ заболеваемости раком яичников в Ульяновской области //Казан, мед. журнал. - 2007.- №2. - С.160-162.

7. Аитонеева, И.И. Динамика фагоцитарной активности пейтрофилов периферической крови в процессе опухолевой прогрессии при раке яичников //Вестник новых медицинских технологий. -2007, Т. XIV, ЛИ, С.119-120.

8. Антоиеева, И.И. Аноптогенное действие неоплазмы на лимфоциты крови /И.И.Антонеева, С.В.Бойчук //Аллергология и иммунология. - 2007, т.8, №1, С.78.

9. Антонесва, 11.11. Анализ срока жшии с момента установки диагноза больных раком яичника в Ульяновской области за период 1999-2005гг //Вопросы онкологии. -2007, №4, C.393-39S.

10. Антонесва, H.H. Нейтрофильные граиулоцктм в динамике прогрессии рака яичников / И.И.Акютева, Т.П.Генннг //Клиническая лаб. диагностика. — 2007, №8, С.43-46.

11. Антонесва, 11.11. Заболеваемость населения Ульяновской области раком яичников //Акушерство и гинекология. - 2007. - №6. - С.75-76.

12. Антонсева, 11.11. Цитокиновый статус больных раком яичников /И.ИЛнтонеева, Н.Ф.Емельянцсва ^Паллиативная медицина и реабилитация. -2007. - JV»4. - С.44-47.

13. Антонеева, 11.11. Роль естественных киллерных клеток (CD16) при прогресснрованин рака яичников /И.И.Антонеева, Л.В.Понизипкова //Паллиативная медицина и реабилитация. - 2007. - №4. - С.16-18.

14. Антонеева, 11.11. Заболеваемость населения Ульяновской области раком яичников //Энидем. и инфекционные болезни. - 2007. - №6. - С.75-76.

15. Антонеева, И.И. Днфференцпровочныс н активационпые маркеры лимфоцитов периферической крови больных раком яичников в динамике опухолевой прогрессии /М1ед. иммунология. - 2007. - Т9. - Л«6. - С.643-649.

16. Антонеева, И.И. Динамика уровня цитокинов в кропи больных раком янчннков при нрогрессированни опухоли //Вестник РУДН. Серия: Медицина.- 2007. -№6.- С. 479-482.

17. Антонесва, И.И.' Спонтанный и индуцированный аноптоз лимфоцитов периферическом крови больных раком яичников /И.И.Антонеева, С.В.Бойчук //Медицинская иммунол. - 2007. - Г.9. - №2-3. - С.272.

18. Антонеева, И.И. Количественная характеристика компонентов стромы при раке яичников /Н.И.Антоиесва, С.Б.Нетров //Морфол. ведомости. - 2008. - №1-2- -С.210-212.

19. Антонеева, И.И. Кислородзависмая антимикробная система нейтрофилов в динамике развития рака яичников //Казанский мед. журнал. - 2008. - Т.89. - №4. -С.476-478.

20. Антонеева, И.И. Рак яичников в Ульяновской области //Российский онкологический журнал. - 2008. - №1. - С.46-48.

21. Антонеева, И.И. О патогенетической взаимосвязи процессов липоперокендации ферментативного звена антиоксидантной системы неоплазмы и

функционального состояния нейтрофилов асцитической жидкости при прогрессировании рака яичников у крыс /И.И.Аитонеева, Т.В.Абакумова, Д.Р.Арсланова, Н.П.Чесиокова //Вестник новых медицинских технологий. - 2008. -№4. - СЛ6-17.

22. Антонеева, H.H. Закономерности количественных изменений NK-клеток, нейтрофильных лейкоцитов и их рецепторного статуса на поздних клинических стадиях рака яичников /И.И.Антонеева, Т.В.Абакумопа, Н.П.Чесиокова //Аллергология и иммунология. - 2008. - Т.9. - JVs3. - С324-325.

23. Антонеева, И.И. Функциональное состояние и рецепторный статус нейтрофилов периферической крови и их взаимосвязи с процессами липопероксидации на поздних стадиях рака яичников /И.И.Антонеевой, Т.В.Абакумовой, Н.П.Чесноковой //Вестник Тверского государственного университета. - 2009. - JVsl.

24. Антонеева, И.И. Экспрессия маркеров апоптоза и пролиферации в динамике прогрессировать неоплазмы при раке яичников /И.И.Антоиеева, С.Б.Петров //Пат. физиол. и эксперимент, терапия. - 2008. - №4. - С.6-7.

25. Антонеева, И.И. Механизмы дексаметазон-ивдуцированного апоптоза лимфоцитов при раке яичников /И.И.Антонеева, С.В. Бойчук //Известия высших учеб. Заведений. Поволжский регион. Мед. науки. - 2006. - №1. -С.3-10.

26. Антонеева, И.И. Система ПОЛ-ангиоксидант яичников в процессе онтогенетической адаптации /И.И.Антонеева, Д.Р.Арсланова //Вестник Томского гос. универ.-2006.-№21.- С.И-12.

27. Антонеева, И.И. Факторный анализ рецидивов рака яичников в Ульяновской области //Нижегородский мед. журнал. - 2006. - №8. - С. 91-94.

28. Antoneeva, 1.1. Biological Properties Neoplasm in Dynamics of a Tumoral Progression at a Cancer Ovary Abstracts 16л International conference "AIDS, Cancer and Public Health" p. 106, St. Petersburg (May 28 - June 01 2007) Русский ж. «СПИД, рак и общественной здоровье», 2007. - Т. 11. - №1. - С. 106.

29. Антонеева, И.И. Спонтанный апоптоз лимфоцитов больных раком яичников /И.И.Антонеева, С.В. Бойчук //Бюллетень сибирской медицины. -2007. - №2. - С.8-11.

30. Антонеева, И.И. Пролиферативная активность неоплазмы при прогрессировании рака яичников /И.И.Антонеева, С.Б. Петров //Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2007. - №3. - С.3-10.

31. Антонеева, И.И. Цитокиновый спектр сыворотки в процессе развития неоплазмы //Альманах современной науки и образования. - 2007. - №6(6). - С.13-16.

32. Антонеева, И.И. Динамика цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1, ИФН-у) у больных раком яичников в процессе развития неоплазмы //Сибирский консилиум. Медико-фармацевтический журнал. - 2007. - №7(62). - С.23-24.

33. Литоиеева, И.И. Фенотип опухоли в динамике ее прогрессии при РЯ в репродуктивном периоде и постменопаузе //Клинич.геронтология. - 2007. - №10. - С. 14-Antoneeva I.I. Functional morphology of tumor vessels in ovarian cancer /1.1. Antoneeva, S.B.Pctrov //European goumal of natural history. - 2008. - №1. - P.79-80.

34. Антонеева, И.И. Роль опухолевого супрессора р53 в возникновении ангиогешгаго фенотипа неоплазмы при прогрессировании рака яичников /И.И.Антонеева, С.Б.Петров //Саратовский научно-медицинский журнал. - 2008. - №1. - С.29-33.

35. Антонеева, И.И. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичников /И.И.Антонеева, С.Б.Петров //Онкология. -2008. - Т. 10. - Х°2. - С.234-237.

36. Антонеева, И.И. Опухолевые сосуды при рахе яичников /И.И.Антонеева, С.Б.Пстров //Медлайн-экспресс. - 2008. - №4 (198). - С.25-27.

37. Антонеева, И.И. Статистика рака яичников в Ульяновской области 1999-2005гг. -Ульяновск.-2006.-59с.

38. Антонеева, И.И. Иммунопатология и иммунотерапия рака яичников. - Ульяновск, 2007г. - 143с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО - антиоксидантная система AT - антитела

АФИ - абсолютный фагоцитарный индекс АФК - активные формы кислорода АФЧ - абсолютное фагоцитарное число ГР - глутатион-редуктаза Дн - дексаметазон КБ - катионные белки

ЛПКИ - лимфоиднопдазмоклеточная инфильтрация

Лф - лимфоциты

МДА - малоновый диальдегид

МИ - митотический индекс

МПО - миелопероксидаза

HCT — нитросиний тетразолий

Нф - нейтрофилы

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РЯ - рак яичников

СДГ - сукцинатдегндрогеназа

СОД - супероксиддисмутаза

ФГА — фитогемагглютинин

ФС - фосфатидилсерии

ФЧ - фагоцитарное число

ЦХО - цитохромоксидаза

Ду- митохондриальный потенциал

IFN - интерферон

IL - шггерлейкив

NK - нормальные киллеры

TNF - фактор некроза опухоли

Инна Ивановна Лнтонеева

ОБОСНОВАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКИ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО РАКА ЯИЧНИКОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени дош-ора медицинских наук

Подписано в печать 16.03.2009г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 2,41. Заказ №9/146.

Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО «Вектор-С» 432045, Ульяновск, ул.Промышленная, 51а.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Рак яичников — пятая по частоте причина смерти от злокачественных новообразований у женщин и наиболее частая причина смерти больных с различными опухолями женских половых органов [14, 290, 368]. Согласно данным, опубликованным в Eurocare-3 Studu, пятилетняя выживаемость больных раком яичников не превышает 29 — 30% [393]. По данным Jemal А. с соавт. [290], эта цифра, несмотря на успехи хирургии и химиотерапии, остановилась на уровне 45% [251]. Ежегодно в России регистрируется 11,7 тыс. злокачественных новообразований яичников и 7,3 тыс. летальных исходов из них [114, 124, 152]. Низкая выживаемость при раке яичников — следствие поздней диагностики. На сегодня в 70% случаев диагностируется распространенная стадия заболевания [312, 227]. Подобная ситуация будет сохраняться при одновременном возрастании показателей смертности, в связи с чем данная проблема приобретает также и социальное значение [193].

Основными причинами неэффективности усилий по улучшению отдаленных результатов лечения больных раком яичников являются отсутствие четких представлений об этиологии и патогенезе, патогномоничных симптомах различных стадий заболевания, а также низкая эффективность лечения при III — IV стадиях [126]. Расширение исследований в области биологии опухолевого роста при раке яичников позволит выявить факторы, имеющие практическое значение для понимания патогенетических механизмов развития, метастазирования и рецидивирования опухоли, а также явится теоретическим обоснованием для введения новых подходов к лечению данного заболевания.

Считается установленным, что необходимым условием роста и развития злокачественной опухоли является перестройка свободнорадикальных процессов в организме [42, 162, 98, 181, 54]. Однако в литературе отсутствуют данные о динамике изменения функционального состояния системы ПОЛ-АО при прогрессировании рака яичников и о патогенетической взаимосвязи этой системы с формированием фенотипа неоплазмы на различных клинических стадиях рака яичников.

На сегодняшний день представления о патогенезе онкологических заболеваний, основанные на постулате о чужеродности злокачественного новообразования, уже не являются абсолютными.

У онкологических больных показаны дисфункции клеточного звена иммунной системы, в частности, нарушение эффекторной функции Т-лимфоцитов и баланса «проопухолевых», «противоопухолевых» и «регуля-торных» цитокинов [178, 399, 196, 142]. При этом выраженность и механизмы развития иммунодепрессии, свойственной любому онкологическому заболеванию, различны на различных этапах прогрессирования опухоли [75, 116].

Врожденный иммунитет, по мнению ряда авторов, играет инструктивную и контролирующую роль в индукции специфического иммунитета [55, 287, 398]. Особый интерес представляет характер влияния взаимодействия опухолевых и иммунных клеток на протекающие в них метаболические процессы.

К основным свойствам всех злокачественных опухолей относят повышенную способность к пролиферации и утрату способности к апоптотиче-ской гибели [82, 140]. Последнее, с одной стороны, способствует прогресси-рованию опухолевого процесса, а с другой - может стать причиной множественной лекарственной устойчивости [1]. В связи с этим в последнее время уделяется большое внимание изучению молекулярных маркеров, характеризующих апоптоз и пролиферацию при различных злокачественных новообразованиях [134, 135]. Ведущую роль в развитии апоптоза и регуляции клеточной пролиферации играет природный тип гена-онкосупрессора Wt р53 и кодируемый им ядерный белок р53 [80]. В значительной части злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в хромосоме 17 в области локализации гена-супрессора р53 [81, 406].

Одним из основных компонентов системы защиты клетки против факторов, вызывающих апоптоз, является Вс1-2, который ингибирует р53-зависимый и независимый апоптозные метаболические пути.

Таким образом, биологический портрет опухоли и установление его патогенетических взаимосвязей с иммунным, цитокиновым и метаболическим статусом организма на различных этапах прогрессирования неоплазмы позволит обосновать новые принципы диагностики степени распространения неоплазии и прогнозирования течения заболевания, а также оценить предполагаемую эффективность планируемой терапии.

Цель исследования — обоснование и совершенствование диагностики прогрессирующего рака яичников на основе оценки взаимосвязи локальных морфофункциональных и метаболических сдвигов в зоне первичной опухоли с системными расстройствами иммунного, цитокинового и метаболического статуса.

Задачи исследования

1. По данным современной мировой литературы и данным медико-статистических показателей, отражающих заболеваемость и смертность и т.д., обосновать необходимость проведения исследования, касающегося прогрессирующего рака яичников, на территории крупного промышленного региона (Ульяновская область).

2. Ретроспективно оценить значимость общепринятых диагностических методов обследования больных раком яичников для определения степени распространения злокачественного процесса.

3. Установить корреляционную связь между морфологическим и функциональным атипизмом опухолевых клеток, характером экспрессии им-муно-гистохимических онкомаркеров, степенью пролиферативной активности в паренхиме первичной опухоли со стадией рака яичников.

4. Изучить закономерности связей изменений ангиогенеза, морфо-функционального состояния микроциркуляторного русла, интенсивности развития некроза в паренхиме первичной опухоли рака яичников с характером метаболических сдвигов, в частности, активностью окислительно-восстановительных реакций и антирадикальной защиты клеток в зоне опухоли, а также в системном кровотоке, и с изменением уровня цитокинов в крови в динамике прогрессирующих форм рака яичников.

5. Изучить патогенетическую значимость недостаточности неспецифических механизмов резистентности, связанной с количественным и качественным изменением нейтрофилов, а также характер и механизмы нарушения специфического клеточного звена иммунитета, обеспечиваемого Т-системой лимфоцитов и №С-клетками в динамике прогрессирующих форм рака яичников.

6. Установить взаимосвязь интенсивности экспрессии маркеров апоп-тоза лимфоцитов, а также дифференцировочных и активационных маркеров (С03, СЭ4, СБ8, СБ 16, СБ25, НЬА-ОЯ, СО?ь СБ95) лимфоцитов крови со стадией распространения опухолевого процесса.

7. Выявить новые диагноститеческие и прогностические критерии прогрессирующего рака яичников. Создать алгоритм диагностики прогрессирующего течения заболевания в соответствии с установлением патогенетической взаимосвязи морфо-функциональных и метаболических сдвигов в зоне первичной опухоли, системных расстройств иммунного, цитокинового и метаболического статуса со стадией распространения опухолевого процесса.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом Института медицины, экологии и физической культуры УлГУ «Патогенетические аспекты прогрессировать неоплазмы», номер госрегистрации - 01200803757.

Научная новизна

На основании результатов клинико-лабораторных, биохимических, па-томорфологических, иммунологических методов исследования впервые проведена сравнительная оценка характера и механизмов развития неоплазмы и взаимодействия ее с организмом на различных клинических стадиях рака яичников (РЯ).

Впервые показано, что к общим закономерностям нарушения метаболического статуса у больных раком яичников относится локальное (в зоне неоплазии) и системное изменение функционального состояния системы ПОЛ-АО, коррелирующее со стадией патологического процесса.

Установлено, что ведущим патогенетическим фактором локальной и системной активации процессов свободнорадикального окисления является избыточное ПОЛ в опухолевых клетках, возникающее вследствие фактической гипероксии, связанной с нарушением митохондриального дыхания в не- ' оплазме и усиливающееся в процессе прогрессирования РЯ. Динамика анти-оксидантных ферментов при этом свидетельствует о возможности отбора вариантов опухолевых клеток, характеризующихся повышенным уровнем ан-тиоксидантной активности.

Активация процессов липопероксидации сопровождается повышенной экспрессией протоонкогена Вс1-2, что приводит к дальнейшему снижению скорости митохондриального дыхания, возрастанию р02, усилению метастатического потенциала опухолевых клеток при прогрессировании РЯ.

Установлено, что при прогрессировании РЯ увеличивается количество атипических эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих мутантный р53, что позволяет предполагать как нарастание мутаций гена р53 в процессе прогрессирования первичной опухоли, так и отбор р53+ опухолевых клеток, обеспечивающих более агрессивное течение. При этом впервые показана корреляция усиления экспрессии тр53 с активацией неоангиогенеза в первичном опухолевом узле при прогрессировании РЯ.

Показано, что пролиферативная активность клеток рака яичников неодинакова на различных клинических стадиях заболевания. В группе опухолей на III клинической стадии показатели экспрессии РСЫА, Кл-67 и МИ достоверно и существенно превышали таковые в группе I и II клинических стадий и продолжали возрастать при IV клинической стадии заболевания, что позволяет предполагать появление клонов с высокой пролиферативной активностью в процессе прогрессирования РЯ. Одновременно имеет место снижение уровня инфильтрации опухоли. При этом снижение количества лимфоидных клеток в инфильтрате сопровождается уменьшением относительного количества плазматических клеток при нарастании числа макрофагов.

При оценке компонентов неспецифического естественного иммунитета показано существенное повышение содержания Нф периферической крови больных РЯ, нарастающее в динамике прогрессирования опухоли. Однако на фоне увеличения абсолютного фагоцитарного индекса и абсолютного фагоцитарного числа имеет место снижение внутрилейкоцитарных катионных белков и уровня активности МПО - основных факторов, необходимых для завершенного фагоцитоза.

При оценке количества №С в периферической крови показано его возрастание при прогрессировании РЯ. Предполагается, что подобная динамика показателей естественной противоопухолевой защиты может свидетельствовать как о селекции резистентных к ней вариантов злокачественных клеток, так и о влиянии опухоли на дифференцировку предшественников и функциональное состояние эффекторных клеток.

Впервые показана динамика дифференцировочных и активационных маркеров лимфоцитов периферической крови, а также повышенная их чувствительность к спонтанному и индуцированному апоптозу, нарастающая в процессе развития неоплазмы.

Установлено, что в процессе прогрессирования РЯ, неоплазма интегрируется в основные гомеостатические процессы организма благодаря использованию региональных и системных функций цитокинов. При этом ключевая роль принадлежит цитокинам с системными эффектами — 1Ь-1, ТЫБ-а и ШЫ-у. Существенными для усиления биологического потенциала опухоли являются такие эффекты этих цитокинов, как стимулирование пролиферации опухолевых клеток и образования сосудов в зоне опухолевого роста.

Практическая ценность работы

Углубление существующих представлений о характере и механизмах развития системных метаболических расстройств на различных клинических стадиях РЯ, установление патогенетической взаимосвязи нарушений метаболического, иммунного, цитокинового статуса и клеточного состава периферической крови со степенью распространения неоплазии позволило рекомендовать новые дополнительные диагностические критерии, которые могут быть использованы для адекватного стадирования и разработки схем терапии РЯ на различных клинических стадиях заболевания.

Применение кластерного анализа, где в качестве признака таксономии использовалась клиническая стадия заболевания по FIGO при прогрессиро-вании РЯ при оценке рутинных биохимических показателей крови позволило показать наличие двух стадий процесса изменения биохимической картины сыворотки крови. При этом стадии различны для больных, находящихся в репродуктивном периоде и в постменопаузе. Если у больных, находящихся в репродуктивном периоде, 1-я группа соответствует 1-й клинической стадии по FIGO, а 2-я группа включает больных, находящихся на II, III и IV клинических стадиях, то у больных, находящихся в постменопаузе, изменения биохимической картины крови происходят позже: 1-я группа включает больных на I и И-й стадиях заболевания, а 2-я - больных, находящихся на III и IV стадиях заболевания. Полученные данные могут быть использованы при оценке результатов рутинных биохимических исследований крови больных РЯ.

Результаты диссертационного исследования, свидетельствующие о том, что в районах, располагающихся в зонах геотектонических разломов и имеющих радиоактивное загрязнение в результате аварии на Чернобыльской АЭС или захоронений радиоактивных отходов, имеет место резкое и статистически значимое увеличение заболеваемости и смертности при спородиче-ских формах РЯ. Последнее позволяет предполагать характер вероятностной причинности вышеуказанных факторов при заболевании РЯ и учитывает их при планировании и проведении профилактических мероприятий.

Результаты исследования позволяют учитывать такие факторы внешней среды, как наличие геопатогенных зон, захоронений радиоактивных отходов и Чернобыльского следа в оценке заболеваемости РЯ и планировании профилактических мероприятий.

В диссертационном исследовании впервые рекомендован алгоритм диагностики паранеопластических сдвигов на П-й, III-й и IV-й стадиях заболевания по FIGO.

В качестве объективных критериев оценки паранеопластических расстройств на различных клинических стадиях РЯ рекомендован мониторинг содержания в плазме крови МДА, каталазы, ГР и КБ, МТТО и ФЧ в Нф периферической крови.

Использование специально разработанной методом аппроксимации нелинейных функций формулы на основании ряда лабораторных показателей периферической крови позволит ориентировочно оценить I — II, III и IV стадии заболевания РЯ по FIGO.

Результаты исследования могут быть использованы в процессе преподавания патофизиологии, патанатомии, онкологии и клинической фармакологии при подготовке врачей, аспирантов и клинических ординаторов соответствующих специальностей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Данные современной литературы и результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о необходимости углублённого изучения проблем, касающихся прогрессирующего РЯ на территории крупного промышленного региона (Ульяновская область).

2) Повышение пролиферативной активности ткани первичного опухолевого узла при низком уровне некротизирования на фоне значимого повышения уровня Вс1-2 и mt р53 в динамике прогрессирования определяет высокий злокачественный потенциал РЯ.

3) Неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ характеризуется снижением интенсивности митохондриального дыхания, приводящего на фоне фиктивной гипоксии к фактической гипероксии, что сопровождается увеличением АФК, элиминация которых затруднена. В результате дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно возрастает на 1-й клинической стадии заболевания, сохраняется на уровне канцерогенеза на П-й и Ш-й стадиях, не достигая при этом уровня апоптоза и возвращается к уровню пролиферации (окислительного митогенеза) на 1У-й клинической стадии заболевания. При этом поддерживается высокий уровень кровоснабжения неоплазмы за счет возрастающих объема и плотности сосудов с дефектной или полностью отсутствующей сосудистой стенкой.

4) В динамике прогрессировать РЯ изменяется количество и функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови. На фоне снижения общего количества лейкоцитов увеличивается количество Нф, АФИ и АФЧ, но при этом статистически значимо снижается количество КБ и активность МПО в Нф, что свидетельствует о снижении способности к завершенному фагоцитозу.

5) У больных РЯ на фоне снижения общего количества Лф происходят значительные сдвиги в экспрессии Лф как дифференцировочных, так и акти-вационных маркеров, коррелирующие с клинической стадией заболевания. При этом имеет место снижение С03+ и С04+-лимфоцитов, увеличение С08+,

СБ25+, С071+ и СИ)у5+, свидетельствующее, как об активации и усилении пролиферации Лф, так и об усилении апоптоза лимфоидных клеток периферической крови. Последнее может быть связанно с «гиперреактивностью» их митохондрий, нарастающей в динамике прогрессирования опухоли.

6) Развитие РЯ закономерно сочетается с паранеопластическими расстройствами в виде изменения уровня функционирования системы ПОЛ-АО в плазме и эритроцитах, нарушения иммунного и цитокинового статуса, сдвигом клеточного состава периферической крови, коррелирующих со степенью распространения неоплазии.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), I Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005), IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкогинекологии» (Ростов-на-Дону, 2005), III Ассамблеи «Врач-провизор-пациент» (Санкт-Петербург, 2005), Международном конгрессе «Иммунитет и болезнь» («Immune-mediated Diseases. From Theory to Yherapy») (Москва, 2005), Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (МАЛО, Санкт-Петербург, 2006), VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006), XX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), 16й1 International conference «AIDS, Cancer and Public Health» (St. Petersburg 2007), Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007), Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: концепция болезней цивилизации» (Москва, 2007), научно-практической конференции «Паллиативная медицина. Вчера. Сегодня. Завтра» (Москва, 2008), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008), на совместном заседании сотрудников кафедр лучевой диагностики, лучевой терапии и онкологии; госпитальной хирургии, анестезиологии, реаниматологии, урологии, травматологии и ортопедии; факультетской терапии; физиологии и патофизиологии; педиатрии; семейной медицины; общественного здоровья, здравоохранения и общей гигиены; общей биологии Ульяновского государственного университета (г. Ульяновск, 2009), на заседании кафедры онкологии с курсом ИПО Башкирского государственного медицинского университета (г. Уфа, 2009).

По материалам диссертации опубликована 91 печатная работа, из них 24 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 монографии.

237 ВЫВОДЫ

1. Динамика заболеваемости раком яичников, равно как и смертности от него, в Ульяновской области имеет стабильную и особенно выраженную для заболеваемости тенденцию роста. При этом уровень заболеваемости, в 4 раза превышающий средний по области и по России в целом, наблюдается в районах, входящих в геопатогенную зону и имеющих захоронения радиоактивных отходов.

2. Прогрессирование раковых опухолей яичников сопровождается повышением пролиферативной активности неоплазмы. При низком уровне нек-ротизирования статистически значимое повышение уровня Вс1-2, свидетельствующее об увеличении антиапоптотического фактора, в сочетании с высоким уровнем пй р53 в динамике прогрессирования первичной опухоли объясняет высокий злокачественный потенциал и может служить прогностическим критерием рака яичников.

3. Ведущим патогенетическим фактором при прогрессировании первичной опухоли при раке яичников является локальная в зоне неоплазмы ги-пероксия, обусловленная нарастающей дефективностью митохондрий и способствующая отбору клонов опухолевых клеток с высоким уровнем антиок-сидантной активности.

4. Реакция Нф периферической крови на развитие опухоли в организме при раке яичников зависит от стадии процесса. При этом наблюдается уменьшение КБ, МПО, особенно выраженное на поздних этапах роста, и коррелирующее со «всплеском» свободно-радикальных процессов в плазме и эритроцитах. Количество ЫК (СБ^*) клеток в периферической крови нарастает с 1-й по Ш-ю клиническую стадию заболевания, что может быть связано с селекцией МС-резистентных вариантов опухолевых клеток либо анэргией Ж.

5. У больных раком яичников происходят значительные изменения в экспрессии как дифференцировочных, так и активационных маркеров лимфоцитов, заключающиеся в прогрессирующем снижении уровня экспрессии CD3, CD4 и, соответственно, возрастании уровня экспрессии CD8, CD16, CD25, CD71, CD95 и HLA-DR. Показана повышенная чувствительность таких лимфоцитов как к спонтанному, так и к индуцированному апоптозу, нарастающая в динамике опухолевой прогрессии и обусловленная как «гиперреактивностью» их митохондрий, так и изменениями в экспрессии про- и антиапоп-тогенных белков, участвующих в каскаде реакций Fas-опосредованного апоптоза.

6. В сыворотке крови больных раком яичников в процессе прогресси-рования неоплазмы повышение уровня провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-a и IFN-y коррелирует с усилением пролиферативной активности и повышением митотического индекса опухолевых клеток, усилением неоангио-генеза в зоне опухолевого роста, а также повышением экспрессии антиапоп-тотического белка Вс1-2 и мутантного гена р53, белковый продукт которого определяет злокачественный потенциал опухоли.

7. Одновременное определение в Нф периферической крови уровня КБ, активности МПО и спонтанного НСТ-теста позволяет с высокой точностью дифференцировать П-ю и Ш-ю стадии рака яичников (чувствительность 97%, специфичность 93%); одновременное определение в плазме крови МДА, каталазы и ГР позволяет аналогичным образом дифференцировать Ш-ю и IV-ю стадии рака яичников. При одновременном определении ряда лабораторных показателей (МДА, каталазы и ГР в плазме крови и КБ, МПО и ФЧ в Нф) представляется возможным использование специально разработанной формулы для ориентировочной оценки стадии заболевания по FIGO.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В комплекс обследования женщин, имеющих злокачественные эпителиальные опухоли яичников, для облегчения процедуры стадирования следует включать:

1.1. При дифференцировочной диагностике II и III стадии по FIGO определение в Нф периферической крови уровня КБ, активности МПО и спонтанного НСТ-теста;

1.2. При дифференциальной диагностике III и IV стадий по FIGO определение в плазме крови МДА, каталазы и ГР.

Использование вышеуказанных показателей позволит рассчитать диф-ференцировочный коэффициент для уточнения клинической стадии заболевания.

2. При разработке схем молекулярно-направленной терапии, имеющей специфической мишенью рецепторы и сигнальные пути трансдукции, контролирующие клеточную пролиферацию, апоптоз и ангиогенез в раковых опухолях яичников, следует учитывать:

2.1. В процессе прогрессирования рака яичников опухоль гиперэкспресси-рует белок мутантного гена р53, а, следовательно, трансфекция диким типом р53 может являться эффективной стратегией для генной терапии, особенно в III-IV стадиях заболевания.

2.2. Использование анти-ангиогенезных препаратов имеет смысл уже на II стадии заболевания, так как неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ имеет высокий уровень кровоснабжения; а объем и плотность кровеносных сосудов возрастают при прогрессировании опухоли.

2.3. Возрастание уровня IFN-y в плазме крови в динамике прогрессирования РЯ предполагает, что использование экзогенного IFN при проведении иммунотерапии целесообразно на ранних стадиях заболевания и внутрибрюшинным способом введения.

2.4. Антиоксидантная терапия с целью коррекции паранеопластических процессов в плазме крови и в эритроцитах целесообразна на II и Ш-ей клинических стадиях РЯ, поскольку именно в этот период имеет место активация свободнорадикальных процессов, не компенсируемая увеличением АО активности крови.