Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Нейропротекторные свойства фенибута и его аналогов при алкогольном повреждении мозга

Актуальность. Алкоголизм является одной из самых актуальных общегосударственных и медицинских проблем современного общества (Авруцкий Г.Я., Недува А.А., 1988). Неумеренное потребление приводит к развитию поражений ЦНС различной степени тяжести, и имеется четкая корреляция актуализации патологического влечения с углублением дисфорических феноменов (Анохина И.П., 1997; Ерышев О.Ф. и соавт., 1997; Чирко В.В. и соавт., 1997; Kessler R.C. et al., 1997). Нарушение функционирования ЦНС выражается комплексом проявлений, наиболее значимыми из которых являются различной степени тяжести депрессивные состояния: расстройства памяти и дефициты поведения, развивающиеся вплоть до Корсаковского синдрома и полной деградации личности (Moss Н.В. et al., 1994). Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют, что однократное и хроническое потребление этанола приводит к нарушению высших интегративных функций мозга и эмоциогенной сферы. В основе данных нарушений лежат ангиопатии и гипоксии многофакторного генеза, первоначально носящие функциональный и обратимый характер, однако по мере прогрессирования токсического повреждения нервной ткани переходящие в стойкое нейродегенеративное заболевание.

В связи со всем вышеизложенным не вызывает сомнений актуальность активизации фармакологического поиска эффективных веществ, которые позволили бы оптимизировать комплексную терапию хронического алкоголизма.

ГАМК-эргическая система, по мнению большинства авторов, играет значительную роль в развитии алкоголизма, так как является одной из основных точек приложения в проявлении психотропных эффектов этанола (Korpi E.R., et al.,1992). Хроническое потребление алкоголя приводит, как правило, к ослаблению ГАМК-ергической передачи и снижению общей активности ГАМК-ергической системы, что связано с трансформацией ГАМК А / бензодиазепино-вого рецепторного комплекса, в частности, структурными вариациями подъе-диниц ГАМК-А рецептора на уровне РНК в клетках коры головного мозга

Devaud L.L., et al., 1997, Grobin A.C., et al., 1998) и снижением его чувствительности к эндогенным лигандам (Wu С.Н., et al., 1995). Через ГАМК А-рецепторы, опосредуется большинство эффектов этанола (Grobin А.С., et al., 1998). Эффекты этанола, опосредуемые через ГАМК-ергическую систему достаточно разнообразны, в частности, участие в формировании судорожной предрасположенности, двигательных и ориентировочно-исследовательских нарушений, мнестических и поведенческих расстройств и т.д.

В связи с этим на наш взгляд представляется обоснованным поиск эффективных веществ с нейропротекторной активностью в ряду производных гамма-аминомасляной кислоты, и, в частности, в ряду фенибута, который уже применяется в комплексной терапии алкоголизма.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение нейропротективного действия ряда новых производных фенибута при алкогольном повреждении мозга.

Для достижения этой цели был использован морфо-функциональный подход к оценке нейропротективных свойств исследуемых веществ, поставлены следующие задачи:

- выбрать наиболее активные соединения в ряду новых производных фенибута, обладающих нейропротективным действием при остром и субхроническом алкогольном отравлении;

- изучить нейропротекторную активность соединений, оказывающих наиболее выраженное защитное действие при остром и субхроническом алкогольном отравлении в условиях хронической алкоголизации;

- изучить влияние новых производных фенибута на морфологические изменения в мозге крыс при длительном потреблении алкоголя;

- изучить антигипоксическое действие соединений;

- изучить влияние соединений на гемореологию крови.

Научная новизна. Впервые изучено нейропротекторное действие новых производных ГАМК при алкогольном повреждении мозга. Из ряда новых производных фенибута выявлены два новых наиболее эффективных вещества, которые уменьшают нарушение мнестических функций, дефицит поведения, тревогу и депрессивную симптоматику, снижают выраженность дегенеративных процессов в мозге, вызванных острой, субхронической и добровольной хронической алкоголизацией.

Впервые проведена комплексная морфо-функциональная оценка влияния новых производных фенибута на мозг при хроническом потреблении алкоголя.

Практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического углубленного изучения новых производных фенибута с целью разработки на их основе новых эффективных нейропротекторных средств для лечения алкоголизма, предупреждения структурных и функциональных повреждений мозга, вызванных приемом алкоголя, снижения мотивации к приему этанола. Представленные результаты могут послужить основанием для целенаправленного поиска веществ с нейропро-тективными свойствами среди новых производных ГАМК и в частности, среди производных фенибута.

Положения, выдвигаемые на защиту. Новые производные фенибута — цитрат фенибута (РГПУ-147) и салицилат фенибута (РГПУ-189), оказывают выраженное нейропротекторное действие при остром, субхроническом и хроническом алкогольном повреждении мозга. РПГУ-147, РГПУ-189 оказывают антиамнестическое действие, сохраняют двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, снижают тревожность и повышенную эмоциональность, обладают антидепрессивным компонентом действия в условиях хронической алкоголизации. РГПУ-147, РГПУ-189 снижают мотивацию к приему алкоголя, нормализуют массу животных, сохраняя пищевую мотивацию. РГПУ-147, РГПУ-189 уменьшают деструктивные изменения нейронов коры, гиппокампа, таламуса и амигдалярного комплекса, вызванные добровольной хронической алкоголизацией. Есть основания предполагать, что исследуемые вещества (цитрат и салицилат фенибута) обладают ГАМК-эргическим механизмом действия. РГПУ-147, РГПУ-189 обладают противогипоксической активностью. РГПУ-147, РГПУ-189 уменьшают агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, оказывают корректирующее влияние на развитие синдрома повышенной вязкости крови при хронической алкоголизации.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на 6-ой региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, ноябрь 2001 г.); на 60, 61 открытых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского Государственного медицинского университета (Волгоград, апрель 2002, 2003 г.г.); на VIII, IX и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002, 2003 г.г.); на 1-ой научной конференции «Медицина будущего» (Сочи, ноябрь 2002 г.); докладывались на II съезде фармакологов (Москва, апрель 2003 г.).

Диссертация обсуждена на межкафедральных заседаниях в Волгоградском Государственном медицинском университете.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в которых отражено основное содержание исследования.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методов исследований (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3-6), обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 21 рисунком.

ВЫВОДЫ

1. Новые производные фенибута РГПУ-147, РГПУ-189, оказывают выраженное нейропротекторное действие при острой, субхронической и хронической алкоголизации, оказывают антиамнестическое действие, сохраняют двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, снижают тревожность и повышенную эмоциональность, обладают антидепрессивным компонентом действия.

2. Цитрат фенибута (РГПУ-147) и салицилат фенибута (РГПУ-189) значительно уменьшают вызванные хронической алкоголизацией дистрофические изменения в нейронах коры, гиппокампа, таламуса и амигдалярного комплекса, т.е. в структурах, подверженных значительному повреждению у животных контрольной группы.

3. Нейропротекторное действие соединений РГПУ-147 и РГПУ-189 в определенной мере может быть обусловлено снижением мотивации к приему алкоголя и уменьшению его потребления.

4. Все исследуемые производные фенибута оказывают выраженное антигипоксическое действие в условиях гипобарической и гиперкапнической гипоксии. Наиболее выраженное антигипоксическое действие оказывали соединения РГПУ-147 и РГПУ-189.

5. РГПУ-147, РГПУ-189 в концентрации 10 моль/л уменьшают агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, оказывают корректирующее влияние на развитие синдрома повышенной вязкости крови при хронической алкоголизации.

6.3. Заключение

Доказанное в настоящее время участие в реализации эффектов этанола и в формировании алкогольной зависимости практически всех нейромедиатор-ных систем ставит перед исследователем задачу по возможности более широкого изучения особенностей рецепторных и нерецепторных взаимодействий тестируемых веществ в сложной иерархии межнейрональных связей.

Однако, задачи данной работы ограничиваются экспериментальным подтверждением лишь основных, ведущих компонентов предполагаемого механизма действия новых веществ на центральные структуры, антигипоксиче-ское действие и улучшение реологических свойств крови.

Все исследуемые вещества оказывали антигипоксическое действие при гипобарической гипоксии, но наиболее выраженное антигипоксическое действие и при гипобарической и при гиперкапнической гипоксии оказывали соединения РГПУ-147, РГПУ-189. Миорелаксирующей активности вещества не показали.

Одним из основных параметров, определяющим микроциркуляцию крови является агрегация тромбоцитов, которая также играет немаловажную роль в процессах гемостаза (Riviere М., et al., 1997, Harrison P., 2000). Степень агрегации зависит как от функциональных свойств самих тромбоцитов, так и от факторов, содержащихся в крови (А.С. Духанин, 1998). Образующиеся агрегаты тромбоцитов могут с одной стороны способствовать внутрисосудистому свертыванию с высвобождением большого количества тромбоцитарных факторов свертывания и биологически активных веществ, а с другой стороны, закупоривая мелкие сосуды, вызывать стаз в системе микроциркуляции (Murphy N.P., et al., 1998). Выделяемые из тромбоцитов биологически активные вещества обладают как ауто, так и паракринной функцией, т.е. увеличивают агрегацию, как тромбоцитов, так и эритроцитов, что приводит к повышению вязкости крови.

Результатом изучения влияния производных ГАМК на функциональные свойства тромбоцитов был выявлен концентрационно-зависимый эффект всех соединения на агрегацию кровяных пластинок. Наибольшую активность изучаемые вещества проявили в концентрации Ю-3 моль/л, при этом по величине эффекта они лишь незначительно уступали препарату сравнения — пентокси-филлину. Таким образом, влияние на функцию тромбоцитов производных ГАМК может являться одним из механизмов улучшения микроциркуляции крови.»

Главными реологическими характеристиками эритроцитов являются процессы их агрегации и способность деформироваться в процессе циркуляции. Большинство авторов считают наиболее важным, с точки зрения причин возникновения гемореологических расстройств, процесс агрегации эритроцитов (Лиховецкая 3. М. и др., 1998, Meiselman H.J., et al., 2000). Повышенная агрегация эритроцитов приводит к окклюзии прекапилляров и капилляров эритроци-тарными агрегатами, медленному прохождению эритроцитов в узких участках русла, общему замедлению скорости периферического кровотока и, как следствие, к ишемии и тканевой гипоксии (Ройтман Е.В., 1998).

Агрегация эритроцитов сопровождается их повреждаемостью и выделением в кровь эритроцитарных факторов свёртывания, что может способствовать возникновению состояния гиперкоагуляции (Джанашия П.Х., 1998). Поскольку эти нарушения агрегации эритроцитов возникают в ранние сроки и являются наиболее лабильными, медикаментозное воздействие именно на этот показатель микроциркуляции может вызвать выраженный терапевтический эффект.

При изучении влияния производных ГАМК на индекс агрегации эритроцитов был также установлен концентрационно-зависимый эффект соединений на данный показатель. Однако, все соединения уступали по величине активности широко используемому в практике антиагреганту — пентоксифиллину. Полученные результаты исследований по влиянию веществ на основные реологические показатели крови in vitro определяют большой интерес к изучению их активности на экспериментальной модели алкоголизма, которая сопровождается выраженными нарушениями микроциркуляции (Kunitsyn V.G., et al., 1993, Marotta F., et al., 2001). Так, наблюдается резкое повышение вязкости крови при всех скоростях сдвига, гиперагрегация эритроцитов и тромбоцитов, отмечается тенденция к изменению резистивных свойств эритроцитов (Galea G., Davidson R.J., 1983, Panchenko L.F., Storozhok S.A., 1987).

Производные ГАМК корректирующее влияние на развитие синдрома повышенной вязкости крови. Так, наблюдалось статистически достоверное снижение основного интегрального гемореологического показателя - вязкости крови под влиянием изучаемых соединений. Наибольшую активность из производных ГАМК проявило соединение РГПУ-189, остальные соединения выраженный эффект показывали только при низких скоростях сдвига, что свидетельствует об их влиянии на процессы агрегации эритроцитов. Подтверждением данного предположения является достоверное снижение индекса агрегации эритроцитов у крыс-алкоголиков под влиянием производных ГАМК.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время низкая эффективность всех проводимых лечебных мероприятий в терапии алкоголизма многими авторами рассматривается как одна из важных проблем современной наркологии и фармакологии. Набор лекарственных средств для лечения алкоголизма и их эффективность с позиции предупреждения нейродегенеративных изменений мозга не достаточно (Нужный В.П., 1997, Немцов А.В., 2001, 2002). Так, транквилизаторы используются для коррекции тревожно-астенических и дисфорических расстройств в период лишения алкоголя (Kaplan H.J., Jack Е., 1983). Для купирования острых и хронических алкогольных психозов применяют нейролептики (Зеленина Е.В., 1998). Определенное место при лечении алкоголизма занимают ноотропные препараты, для которых описана возможность применения в комплексной терапии неврологических расстройств, вызванных острой и хронической алкогольной интоксикацией. Применение в клинике алкогольной болезни антидепрессантов обусловлено их способностью купировать депрессивные состояния, характерные для больных в период лишения алкоголя (Kaplan H.J., Sadock B.J., 1994), они нормализуют содержание моноаминов в большинстве эмоциогенных зон мозга (Lin N., Hubbard J.S., 1994). Этими группами в основном и ограничивается стандартный набор фармакологического воздействия.

Во главу всей проблемы алкоголизма психиатры-наркологи ставят подавление влечения к алкоголю, а также физической и психической зависимости от него, что считается и основным критерием излечения, в то время как основной причиной смертности больных алкоголизмом становится соматическая патология, в том числе такие тяжелые последствия хронической алкогольной интоксикации как хроническая энцефалопатия и, как следствие, снижение интеллектуальной функции мозга (Пауков B.C., 1996). Фоном и основным патогенетическим звеном этого полиорганного поражения организма является прогрессирующая микроангиопатия и обусловленная ею гипоксия, оказывающая выраженное повреждающее влияние на мембранные структуры клеток.

С точки зрения практической медицины наиболее перспективным следует считать разработку таких средств лечения, которые не только подавляли бы влечение к наркотику, но и одновременно оказывали защитное действие на тканевые структуры, учитывая универсальный механизм полиорганных повреждений при алкоголизме, что актуально для терапевтической клиники, до сих пор не имеющей эффективных способов комплексного противодействия возникновению при длительной повторной интоксикации этанолом органических изменений в органах и системах организма. Особо остро эта проблема стоит в стадии формирования алкоголизма (стадия пьянства), когда ни врачи, ни сами пациенты не связывают имеющиеся болезни с чрезмерным и длительным употреблением алкоголя. В то же время, многочисленными исследованиями показано, что именно в этой стадии возможно действительное излечение с точки зрения обратимости возникающих изменений в органах и тканях.

В связи с этим, целью настоящего исследования явилась попытка экспериментального обоснования возможности изучения нейропротекторных свойств новых производных ГАМК в период формирования алкогольной зависимости для снижения патологического влечения к алкоголю, профилактики развития физической и психической зависимости, а главное — для предупреждения органических изменений в тканях, способствующих по принципу порочного круга потенцированию и формированию необратимой полисистемной патологии, составляющей картину хронического алкоголизма. В этой картине важнейшей составляющей является нарушение функций ЦНС, что лежит в основе и патологического влечения, и толерантности, и физической и психической зависимости, а также является основным пусковым и поддерживающим звеном формирующегося при алкоголизме порочного круга патологических изменений.

Согласно литературным данным и учитывая многолетний опыт работы коллектива фармакологов кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского медицинского университета, производные ГАМК можно рассматривать как потенциально перспективный класс химических веществ в области разработки и создания психотропных и ангиотропных лекарственных средств, при этом особый акцент делается на благоприятном сочетании антиишемиче-ского, антигипертензивного, антипсихопатического и антистрессорного действия. Кроме того, показана важная роль ГАМК-ергической системы в развитии алкоголизма (Korpi E.R. et al., 1992; Hodge C.W., Сох A.A., 1998) и хорошие потенциальные возможности ГАМК-миметических препаратов в купировании симптомов алкогольной зависимости (Poldrugo F., Addolorato G., 1999; Kostow-ski W., Bienkowski P., 1999), в том числе фенибута (Ковалев Г.В., 1990).

Логично предположить, что такой комплекс эффектов будет представлять терапевтическую ценность для системного лечения алкоголизма, особенно при наличии дополнительно вытрезвляющего действия, на выявление которого и был направлен проведенный скрининг.

Учитывая вышесказанное, особый практический интерес с нашей точки зрения имеет прогнозирование наличия церебропротекторного действия (т.е. свойств защиты мозговой ткани от воздействия повреждающего действия этанола и его метаболитов) у новых производных ГАМК. Применение препаратов с нейропротективной активностью позволило бы существенно повысить эффективность терапии, предупредить прогрессирование полиорганной патологии и нейродегенеративных изменений мозговой ткани, улучшить как качество жизни больного, так и степень его биологической и социальной адаптации.

Для достижения поставленной цели был использован морфо-функциональный подход в исследовании церебропротекторного действия новых аналогов фенибута. Для оценки церебропротекторного действия веществ использовался комплексный подход, позволяющий судить о функциональном состоянии мозга до и после воздействия повреждающего фактора (хронической алкогольной интоксикации). Изучалось их влияние на основные показатели психофункционального состояния животных после воздействия повреждающего фактора: влияние исследуемых веществ на спонтанную двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, на процессы памяти и обучения, а также влияние на степень фобического компонента в поведении животных, на когнитивную деятельность после хронической алкоголизации и др., оценивались изменения этих показателей по сравнению с исходными и соответствующими показателями психофункционального состояния животных контрольной группы. Степень изменений психофункционального состояния животных позволяет судить о степени повреждения мозга, а сравнение этих изменении в контрольной и опытной группах - о наличии церебропротекторного действия вещества. После этого для проведения топической диагностики, дающей представление о степени защитного действия вещества на те или иные мозговые структуры, проводилось морфологическое изучение изменений в различных структурах головного мозга.

В исследование были взяты семь новых производных фенибута, синтезированных на кафедре органической химии Российского педагогического университета им. Н.И. Герцена (Санкт-Петербург) О.С. Васильевой, Б.М. Новиковым, Н.В. Усик под руководством профессора В.М. Берестовицкой.

Нейропротекторное действие исследуемых веществ при алкогольном повреждении мозга оценивалось при однократной (этаноловый наркоз), субхронической (принудительной) и хронической добровольной алкоголизации. Каждый из этих этапов исследования преследовал различные цели: первый - потенцирование или ослабление (вытрезвление) действия этанола, второй - степень повреждения и защиты при равных дозах алкоголя, третий - выраженность морфо-функциональных нарушений ЦНС в условиях четырёх месячной добровольной алкоголизации.

Оценка влияния новых фармакологических веществ на симптомы острой алкогольной интоксикации была проведена с использованием теста этанолового наркоза (Майский А.И., Салимов P.M., 2000). Полученные данные показали, что степень выраженности вызываемых веществами изменений и даже характер •' их действия оказались различными. Уменьшали продолжительность этанолового наркоза фенибут, РГПУ-147, РГТТУ-150, РГПУ-151, РГПУ-152 и РГПУ-189, наоборот, соединения РГПУ-149 и РГПУ-153 потенцировали наркотическое действие этанола, и поэтому были исключены из дальнейшего исследования.

Механизм вытрезвляющего действия соединений может включать не только специфические центральные, но и метаболические факторы, поэтому представлялось важным протестировать указанные выше вещества в условиях 7-дневной алкоголизации на психотропную активность по основным стандартным психофармакологическим методикам: условная реакция пассивного избегания, открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт, тест экстрапо-ляционного избавления, что позволило оценить влияние новых производных фенибута на мнестические функции, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, реакции тревоги, страха и беспокойства и когнитивную функцию животных. Эксперименты проводились на крысах после предварительной недельной принудительной алкоголизации с ежедневным введением раствора этанола в дозе 2,5 г/кг, создавая тем самым одинаковую токсическую нагрузку, ведущую к ухудшению и угнетению перечисленных функций ЦНС. Изучаемые вещества вводились ежедневно в дозе 1/30 от LD50 за 30 минут до введения этанола в течение недели. В дальнейшем для исключения влияния на показатели экспериментов проявлений алкоголь-депривационного эффекта проводилась отмена всех внутрибрюшинных инъекций, и животные в течение 7 дней выдерживались на стандартном пищевом рационе. В тестах (УРПИ, ОП, KJI, ТЭПИ) оценивался протективный эффект изучаемых веществ в отношении повреждающего действия алкоголя на функции ЦНС по сравнению снимаемых показателей в группах получавших фенибут и его производные с аналогичными показателями в группе контроля, животным которой вместо активной химической субстанции вводили физиологический раствор.

Для оценки повреждающего действия недельной принудительной алкоголизации на животных группы контроля была выделена исходная группа, которой физиологический раствор использовался и вместо этанола.

Результаты скрининга психотропной активности веществ продемонстрировали наличие антиамнестических, антидепрессивных и анксиолитических свойств у соединений с максимальным вытрезвляющим действием.

Таким образом, проведенный скрининг вытрезвляющей активности новых производных фенибута при острой алкогольной интоксикации позволил сделать суммарную оценку чувствительности центральной нервной системы к этанолу на фоне исследуемых веществ, а следовательно, прогнозировать их нейропротекторное действие. Проведенные эксперименты показали, что наиболее активными среди новых производных фенибута можно считать соединения РГПУ-147 (цитрат фенибута) и РГПУ-189 (салицилат фенибута), обладающие максимальным вытрезвляющим действием (сокращали время этанолового наркоза соответственно в 2,7 и 2 раза) и максимально защищающие мозг (по результатам функциональных тестов) от стрессирующего токсического воздействия принудительной недельной алкоголизации.

В отдельной серии экспериментов на тех же методиках (этаноловый наркоз и субхроническая алкоголизация) изучалась дозозависимость нейропротек-торного действия цитрата и салицилата фенибута. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что наиболее выраженной психотропной активностью в проведенных тестах (УРПИ, ОП, КЛ, ТЕПИ) соединения РГПУ-147 и РГПУ-189 обладают при использовании в дозе 1/30 от LD50, что можно считать обоснованием дальнейшее углубленное изучение новых производных фенибута именно в этой дозе в процессе хронической алкоголизации.

Для приближения экспериментальных данных по возможностям фармакологической коррекции мнестических и эмоциональных расстройств при хронической алкогольной интоксикации к возникающим в клинической практике проблемам терапии алкоголизма использована модель добровольной алкоголизации. Для этого использовались животные, склонные к употреблению алкоголя, которые предварительно выявлялись из общей популяции с помощью процедуры инициации по сахарозаместительной методике (Майский А.И., Салимов

P.M., 2000). Для изучения церебропротекторного действия исследуемых веществ в условиях хронической алкоголизации были отобраны только животные, потребляющие алкоголь в количестве не менее 5 г/кг в сутки. После распределения на 5 групп (исходная (контроль 1), контрольная и 3 опытных) в индивидуальном тесте было проведено определение среднегруппового среднесуточного потребления алкоголя для отслеживания влияния экспериментальных веществ на динамику потребления этанола.

Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют, что хроническое потребление этанола приводит к нарушению высших интегративных функций мозга (Maurice Т. et al., 1994). Первоначально этот процесс носит функциональный и обратимый характер (4-6 месяцев алкоголизации при экспериментальном алкоголизме), однако по мере прогрессирования токсического повреждения нервной ткани переходит в стойкое нейродегенеративное заболевание. В связи с этим, выбранные в нашей работе сроки алкоголизации (4 месяца) следует считать оптимальными для оценки динамики мнестических расстройств и степени выраженности нейропротективных свойств исследуемых соединений.

В последнее время доказана важная роль ГАМК-ергической системы в реализации эффектов этанола, в формировании адаптационных реакций нейромедиаторных систем при алкоголизме её участие в защите от экстремальных неблагоприятных воздействий.

На третьем этапе работы проводилась оценка антиамнестической активности препаратов РГПУ-189 и РГПУ-147, а также фенибута путем сравнения динамики мнестических функций животных опытных и контрольной групп с использованием методики выработки УРПИ со снятием показаний до введения соединений и после каждого месяца алкоголизации на фоне введения веществ. С целью исключение влияния фактора знакомой обстановки на поведенческие параметры в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «приподнятый крест-лабиринт» данные снимались с крыс исходной группы, а после трех месяцев алкоголизации - регистрировались в контрольной и опытных группах.

По результатам опыта установлено, что в контрольной группе животных латентный период захода в темный отсек неуклонно снижался по сравнению с аналогичными данными после обучения, достигнув к концу четвертого месяца алкоголизации уровня необученных животных, демонстрируя, таким образом, динамику угасания навыка УРПИ на фоне амнестического действия хронической алкогольной интоксикации. Постоянное увеличение в этой группе общего времени нахождения в темном отсеке и динамика изменений показателя количества заходов в темный отсек свидетельствует о повышении уровня тревожности животных.

В группах животных, получавших фенибут, РГПУ-189 и РГПУ-147, латентное время первого захода в темный отсек достоверно превосходило показатели контроля и незначительно уменьшалось в течение всего времени эксперимента. При этом вещества РГПУ-189 и РГПУ-147 превосходили фенибут по регистрируемому показателю в 1,7 и 1,4 раза соответственно по результатам итоговых измерений. Динамика изменений латентного периода в контрольной и опытных группах, получавших фенибут и его аналоги свидетельствует о более высокой степени сохранности у них памятного следа по сравнению с животными контрольной группы. Показатели общего времени нахождения в темном отсеке и количества заходов в него за время эксперимента не претерпели значительных изменений, что отражает выраженное защитное действие соединений в отношении общего уровня тревожности.

В тесте «открытое поле» установлено, что хроническая алкоголизация приводит к снижению спонтанной двигательной активности у всех групп животных, но наиболее выраженное снижение отмечалось у животных контрольной группы (в 4,75 раза); по сравнению с контролем этот показатель был достоверно выше у всех опытных групп животных.

Ориентировочно-исследовательская активность животных также снижалась, но была достоверно выше у групп животных, получавших РГПУ-189 и РГПУ-147 в сравнении с контрольной группой, в которой этот показатель снизился в 3,2 раза. Наблюдаемое в динамике эксперимента падение до нуля числа заходов в центральную зону и увеличение количества дефекаций в контрольной группе следует расценивать как проявление реакции страха, свидетельство повышенной эмоциональности и нарушение приспособительной реакции животных при помещении их в условиях новой обстановки. В то же время в группах животных, получавших вещества фенибут, РГПУ-189 и РГПУ-147, повышение уровня тревожности не отмечалось, что свидетельствует о его стабилизирующей и защитной роли в отношении процессов, ответственных за эмоциональный статус животных в условиях хронической алкоголизации.

В ходе экспериментов установлено, что длительная алкоголизация приводит к ухудшению когнитивной деятельности животных контрольной группы. Полученные в тесте «экстраполяционного избавления» данные позволяют считать, что после хронической алкоголизации у крыс контрольной группы, в сравнении с опытными наблюдалось значительное снижение скорости решения задачи избегания аверсивной среды. На фоне фенибута, веществ РГПУ-189 и РГПУ-147 практически все животные сохраняли способность к решению задачи избегания аверсивной среды по истечении времени эксперимента, в то время как в контрольной группе через три месяца алкоголизации количество не решивших задачу крыс составило более 80%.

Дополнительно регистрировался показатель общего времени иммобилизации (по аналогии с тестом форсированного плавания), по продолжительности которого можно судить о степени выраженности антидепрессивной активности исследуемых веществ. Однако, разное время нахождения животных в аверсивной среде не позволяет сравнивать непосредственно время иммобилизации, в связи с чем был рассчитан показатель доли иммобилизации (процент иммобилизации от времени решения задачи). Увеличение этого показателя по нашему мнению скорее свидетельствует о сохранности и преобладании в поведении животных мнестических и когнитивных процессов (чему способствует и установленный антифобический компонент действия исследуемых веществ) в противовес бессмысленной и случайной активной поисковой деятельности крыс в контроле. Многочисленные эпидемиологические и клинические данные указывают на высокую взаимосвязь между алкогольной зависимостью и депрессией (Conwell Y., 1996; Kessler R.C. et al., 1994; Hanna E.Z., Grant B.F., 1997), что косвенно подтверждают и результаты наших экспериментов.

Таким образом, полученные нами результаты отражают негативное влияние хронической алкогольной интоксикации на состояние высших интегратив-ных функций мозга, что отражается угнетением когнитивной функции, провоцированием депрессивных реакций, проявлением невротических и психопатических состояний (страх, тревога, беспокойство, напряжение и др. (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2000)). В то же время, тестируемые соединения (фенибут, и в ещё большей степени - РГПУ-189 и РГПУ- 147) достоверно уменьшают выраженность перечисленных последствий длительной алкоголизации.

Для подтверждения предполагаемых анксиолитических свойств исследуемых веществ была использована простая и доступная методика «приподнятого крест-лабиринта». Хроническое потребление алкоголя, провоцирующее состояние тревоги, страха, беспокойства, усиливает тенденцию предпочтения животными темных и закрытых пространств, что демонстрируют в нашем эксперименте животные контрольной группы, которые после алкоголизации в открытые рукава практически не выходят. Транквилизирующее действие препарата оценивается по увеличению числа заходов в светлые рукава и времени нахождения в них, без увеличения общего числа заходов. Оценивая перечисленные показатели, установлено, что фенибут, а также вещества РГПУ-189 и РГПУ-147 показывают отчетливый анксиолитический эффект, о чем свидетельствует достоверное увеличение количества заходов и времени нахождения крыс в открытых рукавах при незначительном снижении общей двигательной активности, что соответствует результатам, полученным в тесте «открытое поле». Наиболее выраженный эффект наблюдался у соединения РГПУ-189.

Предварительная рандомизация животных по количеству потребляемого алкоголя позволила установить наличие одинакового среднегруппового уровня потребления этанола после процедуры инициации алкогольной мотивации. Адаптационные нейрохимические и обменные изменения в процессе хронической алкоголизации, как известно, ведут к увеличению потребления алкоголя, что закономерно усиливает токсическую нагрузку на организм. Этот факт подтверждается в нашем исследовании при итоговом определении потребления этанола. Во всех экспериментальных группах отмечено увеличение уровня потребления этанола (максимально 60% от исходного). В то же время в группе животных, получавших физиологический раствор, этот показатель превышал первоначальные данные в 2,7 раза.

Сравнительные изменения в экспериментальных группах массы тела -показателя, косвенно характеризующего пищевую мотивацию крыс.

Под влиянием исследуемых соединений отмечалось незначительное увеличение веса, в отличие от контрольной группы, в которой животные отчетливо потеряли в весе. После алкоголизации среднегрупповой вес животных всех экспериментальных групп оказался достоверно выше контроля, что свидетельствует о сохранении пищевой мотивации у крыс, получавших во время алкоголизации фенибут и его производные РГПУ-147, РГПУ-189 и о подавлении пищевой мотивации у животных контрольной группы.

Таким образом, исследуемые вещества выраженно снижают алкогольную мотивацию, что может являться одним из факторов уменьшения прямого повреждающего действия этанола на структуры мозга. По этому эффекту соединение РГПУ-189 превосходит РГПУ-147 и фенибут, достоверно (в 2,3 раза) снижая уровень потребления этанола по сравнению с контролем. По результатам психофункциональных тестов подтверждена эффективность использования новых производных фенибута для лекарственной коррекции поведенческих и интеллектуально-мнестических расстройств, нарушенных длительным приемом алкоголя.

Можно предполагать, что протективная активность изучаемых веществ в указанных экспериментах органически детерминирована снижением клеточной дегенерации и сохранностью нейронных и межуточных структур. В связи с этим, на следующем этапе работы была проведена морфологическая оценка состояния нейрональных структур в динамике хронической алкоголизации с учетом влияния новых производных ГАМК.,

Проведенное микроскопическое исследование структур головного мозга животных подвергшихся алкоголизации - контрольной группы и групп животных которым вводились изучаемые соединения показало, что отмечается защитное действие вышеуказанных препаратов на цитоархетиктонику коры головного мозга, что подтверждается незначительным количеством нейронов находящихся в состоянии гидропической дистрофии, гиперхроматоза, по сравнению с животными контрольной группы. Следует так же отметить, что применение вышеуказанных препаратов (фенибут, РГПУ-147 и РГПУ-189) уменьшают явления дистрофии в нейронах гиппокампа во всех его отделах и на всем протяжении. Более выраженные дистрофические изменения наблюдаются в нейронных ансамблях гипоталамуса (паравентрикулярного и супраоптического ядер), и нейронных ансамблях стриопаллидарной системы отмечались в группах на фоне применения фенибута и его аналогов по сравнению с группой контроля. Таким образом изучаемые соединения оказывают защитное действие преимущественно на нейроны коры, гиппокампа, таламуса и амигдалярного комплекса.

На заключительной стадии фармакологического анализа новых производных фенибута с установленной церебропротекторной активностью были изучены некоторые аспекты их возможного нейропротективного механизма действия. .

В условиях хронической алкоголизации, могут наблюдаться нарушения микроциркуляции (эндотелиальная дисфункция сосудов, тромбоэмболические осложнения, повышение тонуса сосудов и т.д.) и, как следствие этого, развитие гипоксии нейронов различных отделов головного мозга (Мхеидзе Е.Г., Хита-ришвили М.Б., 1996; Анохина И.П., 1997; Crowder T.L., Ariwodola О.J., Weiner J.L., 2002). Литературные данные об антигипоксических свойствах и влиянии веществ с ГАМК-ергическим действием на тонус сосудов, агрегацию форменных элементов крови и её вязкость позволяют предположить, что нейропротек-тивное действие структурных аналогов фенибута может быть обусловлено улучшением микроциркуляции и их антигипоксическими свойствами.

Все исследуемые вещества оказывали антигипоксическое действие при гипобарической гипоксии, но наиболее выраженное антигипоксическое действие и при гипобарической и при гиперкапнической гипоксии оказывали соединения РГПУ-147, РГПУ-189. Миорелаксирующей активности вещества не показали.

Микроциркуляция в значительной мере определяется реологическими свойствами крови, а последнее агрегационными свойствами форменных элементов крови (эритроцитов и тромбоцитов), регидностью эритроцитов, вязкостью крови (Riviere М., et al., 1997, Harrison P., 2000). Степень агрегации зависит как от функциональных свойств самих тромбоцитов, так и от факторов свертывания, содержащихся в крови (Духанин А.С., 1998). Образующиеся агрегаты тромбоцитов могут с одной стороны способствовать внутрисосудистому свертыванию с высвобождением большого количества тромбоцитарных факторов свертывания и биологически активных веществ, а с другой стороны, закупоривая мелкие сосуды, вызывать стаз в системе микроциркуляции (Murphy N.P., et al., 1998). Выделяемые из тромбоцитов биологически активные вещества обладают как ауто-, так и паракринной функцией, т.е. увеличивают агрегацию, как тромбоцитов, так и эритроцитов, что приводит к повышению вязкости крови.

Результатом изучения влияния производных ГАМК на функциональные свойства тромбоцитов был выявлен концентрационно-зависимый эффект всех соединения на агрегацию кровяных пластинок. Наибольшую активность соединения проявили в концентрации Ю-3 моль/л, при этом по величине эффекта изучаемые вещества лишь незначительно уступали препарату сравнения - пен-токсифиллину. Таким образом, влияние на функцию тромбоцитов производных ГАМК может являться одним из механизмов улучшения микроциркуляции крови.

Главными реологическими характеристиками эритроцитов являются процессы их агрегации и способность деформироваться в процессе циркуляции. Большинство авторов считают наиболее важным, с точки зрения причин возникновения гемореологических расстройств, процесс агрегации эритроцитов (Лиховецкая З.М. и др., 1998; Meiselman H.J., et al., 2000). Повышенная агрегация эритроцитов приводит к окклюзии капилляров и прекапилляров эритроци-тарными агрегатами, медленному прохождению эритроцитов в узких участках кровеносного русла, общему замедлению скорости периферического кровотока и, как следствие, к ишемии и тканевой гипоксии (Ройтман Е.В., 1998).

Агрегация эритроцитов сопровождается их повреждаемостью и выделением в кровь эритроцитарных факторов свёртывания, что может способствовать возникновению состояния гиперкоагуляции (Джанашия П.Х., 1998). Поскольку эти нарушения агрегации эритроцитов возникают в ранние сроки данного патологического процесса и являются наиболее лабильными, медикаментозное воздействие именно на этот показатель микроциркуляции может вызвать выраженный терапевтический эффект.

При изучении влияния производных ГАМК на индекс агрегации эритроцитов был также установлен концентрационно-зависимый эффект соединений на данный показатель. Однако, все соединения уступали по величине активности широко используемому в практике антиагреганту — пентоксифиллину. Полученные результаты исследований по влиянию веществ на основные реологические показатели крови in vitro определяют большой интерес к изучению их активности на экспериментальной модели алкоголизма, которая сопровождается выраженными нарушениями микроциркуляции (Kunitsyn V.G., et al., 1993; Marotta F., et al., 2001). Так, наблюдается резкое повышение вязкости крови при всех скоростях сдвига, гиперагрегация эритроцитов и тромбоцитов, отмечается тенденция к изменению резистивных свойств эритроцитов (Galea G., Davidson R.J., 1983; Panchenko L.F., Storozhok S.A., 1987).

Производные ГАМК оказывают корректирующее влияние на развитие синдрома повышенной вязкости крови. Так, наблюдалось статистически достоверное снижение основного интегрального гемореологического показателя — вязкости крови под влиянием изучаемых соединений. Наибольшую активность из производных ГАМК проявило соединение РГПУ-189, остальные соединения выраженный эффект показывали только при низких скоростях сдвига, что свидетельствует об их влиянии на процессы агрегации эритроцитов. Подтверждением данного предположения является достоверное снижение индекса агрегации эритроцитов у крыс-алкоголиков под влиянием производных ГАМК.

Модель хронической добровольной алкоголизации, несомненно, наиболее приближена к условиям формирования алкоголизма в общечеловеческой популяции (Салимов P.M., 1990), однако она не позволяет четко дифференцировать степень влияния изучаемых веществ на мотивационную составляющую (влечение к алкоголю) и собственно нейротоксическое действие. Использование соединений РГПУ-147 и РГПУ-189 приводит к снижению влечения к алкоголю, в то же время, морфологическое исследование мозговых структур отражает снижение непосредственного повреждения различных мембранных структур коры* гиппокампа и амигдалярного комплекса. Вопрос первично-сти/вторичности возникновения нарушений психических функций и морфологических изменений нейронов мозга является теоретической проблемой для методической разработки более детального и глубокого исследования и может быть предметом дальнейшего изучения. Для практической медицины на стадии формирования алкоголизма (пьянство) интерес представляет именно влияние на процесс становления влечения к алкоголю, т.к. оно является базовым, основным условием развития алкоголизма, обеспечивающим постоянное и все возрастающее потребление алкоголя, что в свою очередь является единственным условием и причиной развития болезни (без алкоголя нет алкоголизма). Это особенно актуально, учитывая, что на начальной стадии обратимы все возникающие функциональные и даже структурные изменения в тканях. В связи с этим, логично предположить, что производные фенибута подавляя влечение к алкоголю снижают количества потребляемого животными этанола, и могут быть важной составляющей комплексной профилактики алкоголизма, кроме этого с нашей точки зрения, использование для лекарственной коррекции расстройств высшей нервной деятельности, вызванных длительным приемом алкоголя, эффективных аналогов ГАМК позволит замедлить нейродегенеративное повреждение нервной ткани, а, следовательно, улучшить состояние мнестиче-ских и когнитивных функций.