Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Нейрохимическое изучение механизма действия антиконвульсантов - ламотриджина и карбамазепина

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

\ 0 И Е:3

КОСАЧЕВА Елена Сергеевна

НЕЙРОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ АНТИКОНВУЛЬСАНТОВ - ЛАМОТРИДЖИНА И КАРБАМАЗЕПИНА

14.00.25. - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Лаборатории нейрохимической фармакологии НИИ

>

фармакологии РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор С.Б.Ссредеиин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

член-корреспондент РАМН, профессор К.С. Раевский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор мед. наук, профессор Т-А-Вороиима доктор мед. иаук, профессор В.В.Яснецов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Центр химии лекарственных средств -

ВНИХФИ МЗ РФ

Защита диссертации состоится "_"_1996 г. в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д.001.25.01 в НИИ фармакологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул.Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии РАМН

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е.А. Вальдмаи

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эпилепсия - сложное по этиологии и патогенезу нервно-психическое заболевание, характеризующееся повторными судорожными проявлениями, соматическими нарушениями, изменениями личности (В.А.Карлов, 1990; Е.И.Гусев и Г.С.Бурд, 1994). По докладу экспертов исследовательской группы ВОЗ (Женева, 1980) эпилепсия и другие судорожные расстройства относятся к числу наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы: эпилепсией в мире страдает около 50 миллионов человек (Т.А.Воронина, 1994; Brodie & Dichter, 1996). Заболеваемость эпилепсией варьирует в широких пределах, составляя в среднем от 10 до 220 человек на 100 000 паселекия (Delgado-Escueta et al., 1986; Shorvon, • 1990). Заболевание охватывает все возрастные группы населения, однако наиболее высокий процент заболевших отмечается в детском возрасте; затем от 15 до 65 лет частота заболевания сохраняется примерно па одпом уровне и снова повышается в старших возрастных группах (В.Г.Ротштейн и соавт., 1987; Brodie & Dichter, 1996). Широкая распространенность и прогредиентное течение заболевания делают проблему лечения эпилепсии актуальной не только с медицинской, но и с социальной точки зрения. . - . ...

Современные возможности лечения эпилепсии с применением существующих противосудорожных средств не снижают актуальности проблемы. Существующие методы лечения данного заболевания недостаточно эффективны и позволяют получить значительное улучшение, реже, прекращение клинических проявлений эпилепсии пе более чем у 5070% больных; у 25% больных лекарственная терапия оказывается не эффективной. Существует категория больных эпилепсией, резистентных к фармакотерапии, а имеющиеся в настоящее время лекарственные средства не лишены многочисленных побочных эффектов и зачастую вызывают осложнения (В.А.Карлог. 19SÖ; Т.А.Воронина, 1994). Необходимо отметить, что механизмы действия современных антиконвульсантов, в особенности па нейрохимическом, клеточном и молекулярном уровнях изучены недостаточно, что существенно затрудняет их рациональное применение в клинике с одной стороны и поиск веществ с принципиально новым механизмом действия с другой (Meldrum, 1994).

В последние годы в клинической практике появились новые представители аптиконвульсантов, к числу которых относится, в частности, производное триазина ламотриджин (ламиктал), обладающее оригинальным профилем клинического действия (Е.И.Гусев и Г.С.Бурд, 1994; Г.О.Бакунц и соавт., 1995; Upton, 1994; Burstein, 1995). Широкое использование при лечении эпилепсии и некоторых других заболеваний находит производное иминостильбена карбамазепин, отличающийся ■> по своему фармакологическому профилю от других антиконвульсантов (М.Д.Машковский, 1993; Rogawski & Porter, 1990). В свете сказанного изучение нейрохимических основ механизма действия ламотриджнна, карбамазепина как и других оригинальных противосудорожных веществ нового поколения представляет несомненную актуальность.

К настоящему времени накоплен ряд сведений об участии различных нейромедиаторных систем мозга в развитии судорожных состояний. Вовлечение той или иной системы зависит от локализации эпилептогепного очага и генетически детерминированных нейрохимических связей данной структуры с другими отделами головного мозга (Г.Н.Крыжановский, 1991). Наибольший интерес в этом плане представляют две системы аминокислотной пейропередачи: возбуждающая, нсйромедиаторами которой являются глутамат и аспартат и тормозная, использующая в качестве нейропередатчиков гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК) и глицин (К.С.Раевский и В.П.Георгиев, 1986; К.С.Раевский, 1989; 1990; Lodge, 1988; Meldrum, 1990; 1994). Показано, что повышение концентрации возбуждающих нейромедиаторов или уменьшение содержал!:;! тормозных кгйромедиаторов в центральной нервной системе (ЦНС) может привести к нарушению стабильности мембранных потенциалов, развитию сверхчувствительности нейронов, появлению спонтанных пароксизмальных разрядов. В сзязя с этим представляется важным изучить участие данных нейромедиаторных систем в механизме действия известных противосудорожных веществ, что позволит проводить целенаправленный синтез новых антиконвульсантов с заданным нейрохимическим профилем.

Известно, что одним из важных звеньев эпилептогенеза является усиление процессов перекисного окисления липндов (ПОЛ) мембран нервных клеток (Е.В.Никушкин и Г.Н.Крыжановский, 1987; Е.В.Ншсушкин, 1989). В связи с этим представлялось интересным изучить показатели ПОЛ при

моделировании эйилептиформной активности, а также проанализировать их изменения при действии антиконвульсантов.

Для исследований механизма действия противоэпилентических веществ большой интерес представляют генетические судорожные модели, которые во многих отношениях имитируют те или иные клинические проявления эпилепсии и, в связи с этим, многими исследователями рассматриваются как наиболее адекватные по сравнению с другими моделями судорожных состояний (Jobe, 1981; Chapman et al., 1991; 1995). Одной из таких моделей, удобной для исследования поведенческих и нейрохимических показателей судорожного припадка, а также для изучения эффектов противоэпилентических веществ является аудиогенная эпилепсия у крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), выведенной на кафедре высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (Л.В.Крушинский и Л.Н.Молодкина, 1960; А.Ф.Семиохина и соавт., 1993).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение в сравнительном плане поведенческих, нейрохимических и нейрофизиологических механизмов, лежащих в основе противосудорожного действия антиконвульсантов ламотриджина, карбамазепина и вальпроата натрия, занимающих ведущее положение в современной фармакотерапии эпилепсии.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Охарактеризовать состояние нейромедиаторных систем мозга по содержанию возбуждающих и тормозных аминокислот, моноаминов и их метаболитов, а также йнтенсивность ПОЛ в структурах мозга крыс линии КМ по сравнению с аналогичными параметрами крыс линии Вистар, не чувствительных к звуковому воздействию.

2. Изучить противосудорожную эффективность ламотриджина в сравнении с карбамазепином и вальпроатом натрия на модели аудиогенной эпилепсии у крыс КМ.

3. Оценить «состояние аминацидергических и моноаминергических

ч.

нейромедиаторных систем мозга крыс линии КМ на высоте развития аудиогенного судорожного припадка, а также изменения в этих системах

при действии противосудорожных веществ - ламотриджина и карбамазепина.

4. Изучить параметры интенсивности ПОЛ в структурах мозга крыс при действии антиконвульсантов на модели аудиогенной эпилепсии.

5. Изучить влияние ламотриджина и карбамазепина на развитие судорожного припадка и содержание ГАМК в мозге крыс на модели ГАМК-дефицитных судорог, вызванных введением ингибитора глутаматдекарбоксилазы, тиосемикарбазида.

6. Исследовать возможные нейрофизиологические механизмы действия ламотриджина и карбамазепина на эффективность глутаматергической синаптической передачи в переживающих срезах гиппокампа крысы.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы нейрохимические особенности мозга крыс линии КМ с генетически обусловленной эпилептиформной реакцией на звуковое раздражение. Показано, что крысы этой линии отличаются более высоким содержанием глутамата и аспартата в продолговатом мозге и более низким уровнем глицина в гшшокампе, ГАМК и таурина в продолговатом мозге. Впервые проведено изучение механизма действия нового противоэпилептического препарата ламотриджина в сравнении с известным антикопвульсантом карбамазепином на различных судорожных моделях. На модели аудиогенной эпилепсии и ГАМК-дефицитных судорог показано, что ламотриджин в отличие от карбамазепина вызывает менее выраженные изменения в структуре судорожного припадка, оказывая вместе с тем более селективное влияние на его тоническую фазу. Обнаружено, что па пике тонической экстензии ламотриджин вызывает отчетливое снижение уровня аспартата и глутамата в стриатуме крыс КМ, при этом уровень глицина в гиппокампе и продолговатом мозге, а также содержание ГАМК в стриатуме возрастает. Изучение влияния ламотриджина на показатели ПОЛ п эндогенной антиоксидантной системы показало, что его эффект проявляется преимущественно в увеличении содержания а-токоферола в мозге крыс с аудиогенной эпилепсией.

Впервые проанализировано влияние ламотриджина и карбамазепина на эффективность глутаматергической "синаптической передачи в переживающих срезах гиппокампа. Показано, что ламотриджин и

карбамазепин угнетают глутаматергическую передачу в поле СА-1 нейронов гиппокампа, причем ламотриджин в этом отношении более активен.

Научно-практическое значение работы. Полученные результаты свидетельствуют о патогенетической роли дисбаланса нейромедиаторных аминокислот, моноаминов и их метаболитов, а также активации ПОЛ в развитии аудиогенного судорожного припадка у крыс линии КМ. Охарактеризованы нейрофизиологические и нейрохимические особенности механизма действия ламотриджина - антиконвульсанта нового поколения на различных моделях судорог. Установленные в данной работе отличия в механизме действия ламотриджина, определяющие своеобразие фармакологического профиля этого вещества в сравнении с известными антиконвульсантами, могут иметь важное значение в плане уточнения показаний для применения ламотриджина в клинике эпилепсии, а также для поиска новых веществ с оригинальным профилем противосудорожного действия.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международном симпозиуме по нейропсихотропным препаратам (Москва, 1994), П Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995); Международной школе молодых ученых по нейробиологии (Санкт-Петербург, 1995); на межлабораторном семинаре НИИ фармакологии РАМН (Москва, 1996). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Представленная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 163 отечественных и зарубежных источников. .Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на 250 крысах-самцах линии Вистар и 95 крысах-самцах линии Крушинского-Молодкиной массой 180-240 г (для методики переживающих срезов мозга использовали крыс-самцов Вистар массой 120150 г). В работе были использованы следующие вещества: ламотриджин (Wellcome, Великобритания), карбамазепин (AWD, Германия), вальпроат натрия (Германия), тиосемикарбазид (Россия). Определение содержания моноаминов и их метаболитов

Содержание мопоаминов и их метаболитов определяли методом ВЭЖХ/ЭД па хроматографе LC-304T (В AS, West Lafayette, США),

снабженным инжектором Rheodyne 7X25 и амперометрическим детектором LC-4B с ячейкой TL-5 (Bruntlett, 1980). Выделенные структуры мозга крыс размельчали в гомогенизаторе "стекло-тефлон" (0,2 мм) при скорости вращения пестика 3000 об/мин. Гомогенизацию осуществляли в 0,1 н НСЮ4 с добавлением в качестве внутреннего стандарта диоксибензиламина (ДОБА) в количестве 100 нг/мл. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали и фильтровали центрифугированием через целлюлозные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм в течение 1 мин на низкооборотной центрифуге (BAS, США). 20 мкл фильтрата наносили на аналитическую колонку (3x150мм, С18, омкм, МНПП "Элсико", Москва) методом прямой инъекции. НА, ДОФУК, ДА, ГВК, 5-ОИУК и 5-ОТ разделяли на термостатируемой при 45°С колонке с использованием в качестве подвижной фазы 0,1 M цитратно-фосфатного буфера, содержащего 0,3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила (рН 3,6). Определение моноаминов . и их метаболитов осуществляли на стеклоуглеродном электроде при потенциале +0,8 В против Ag/AgCl электрода сравнения. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,7 мл/мин (И.И.Мирошниченко, 1988; В.С.Кудрин и соавт., 1994). Определение содержания нейромедиаторных аминокислот

Содержание тормозных (ГАМК, глицин, таурин) и возбуждающих (аспартат, глутамат) нейромедиаторных аминокислот определяли методом ВЭЖХ/ЭД по Pearson, et al. (1991). Перед анализом ткань гомогенизировали в 20 объемах ОДн НС104 с 0,1% метабисульфитом натрия, центрифугировали 10 мин при 10 000 g. К 50 мкл супернатанта добавляли 50 мкл 0,01 мг/мл внутреннего стандарта L-гомосерина в 0,2н и 25мкл о-фтальальдегид-сульфитного реактива в ОДМ боратном буфере (рН 9,5) для деривации аминокислот. ГАМК, таурин, глицин и аспартат в концентрации 0,1 мг/мл' и глутамат в концентрации-0,2 мг/мл в ОДн НСЮ4 использовали в качестве стандартной смеси для калибровки прибора. Через 20 мин после инкубации при комнатной температуре, 5 мкл смеси наносили на колонку ДИАКАМ (3x150мм, Cjgi 5мкм, МНПП "Элсико", Москва), изократического хроматографа НЖХ (СКВ, ИОХ, РАН). Регистрацию продуктов разделения проводили на электрохимическом детекторе LC-4B (BAS, США)' при +850 мВ на стеклоуглеродном электроде против электрода сравнения Ag/AgCl. Мобильная фаза состояла из 0,05 M фосфатного буфера (рН 5,6) с 0,025 мМ ЭДТА и 2,5% метанола.

Определение сопепжания а-токофслола и продуктов ПОЛ

Содержание а-тскоферола (ТФ) в гомогенатах ткани мозга определяли спектрофлуориметрическим методом в гексановом экстракте (Duggan, 1959; Б.В.Давыдов и .П.П.Голиков, 1984). В том же гексановом -экстракте спектрофотометрически измеряли уровень продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК). Количество общих липидов определяли фосфованилиновым методом с использованием стандартного набора реактивов "Lachema". Определение содержания ТБКРП проводили спектрофотометрическиы методом (Ohkawa et al., 1979) при длине волны 532 нм на спектрофотометре "Aminco".

Изучение эффективности глутаматергпческой синаптической передачи в переживающих срезах гиппокампа

Срезы гиппокампа мозга крыс (самцы линии Вистар массой 120-150 г) толщиной 340-360 мкм приготовляли по стандартной методике (О.В.Годухин и соавт., 1995) и суперфузировали раствором Кребса-Рипгера следующего состава (мМ): NaCl-124; КС1-3; MgS04-2; CaClr2; NaHC03-26; KH2P04-1.25; глюкоза-10; карбогон 02/С02 - 95% / 5% в камере погруженного типа при

скорости протекающей жидкости 2 мл/мип, t=31° С. Для стимуляции коллатералей Шаффера использовали бнполярный нихромовый электрод, который помещали в радиальный слой поля СА-1 нейронов гиппокампа. Отведение электрической активности осуществлялось с помощью 2 х стеклянных микроэлектродов, заполненных суперфузионной средой, которые помещали в радиальный слой и на границу радиального и пирамидного слоев поля СА-1. Вызванные ответы через усилитель и плату АЦП выводились в виде графиков на экран монитора ПК IBM386DX\40 и записывались на жесткий диск компьютера. Данные обрабатывались с помощью оригинальной программы по алгоритму (Tolliver & Pellmer, 1987) в режиме ' off-line. Ламотриджин и карбамазепин растворяли в суперфузионной среде в концентрациях Ю-6, 10"5, 10"4, 10"3 М (карбамазепин предварительно растворяли с ДМСО) и последовательно проводили 10-минутные экспозиции срезов средой суперфузии, содержащей изучаемые вещества в концентрациях от Ю-6 до 10"3 М. Модель аудиогенной эпилепсии.

Аудиогенную эпилепсию моделировали и изучали на крысах линии КМ, для которых характерно наличие генетически обусловленной зпилептиформной реакции на звуковое раздражение. Крыс подвергали акустическому воздействию в звукоизолированной камере размерами 30x55x45 см в течение 90 сек (сила звука 120 дб). Для оценки наблюдаемого эффекта использовали следующие количественные показатели аудиогенной реакции: латентный период возникновения двигательного возбуждения в ответ на звуковое воздействие (в сек), интенсивность судорожного припадка (в баллах' от 0 до 4) и характер судорожной реакции (одно- или двухволновый) (А.Ф.Семиохина и соавт. 1993). При подборе животных в опытные группы отбирали только крыс с . одноволновой реакцией и максимально выраженным припадком (4 балла). По окончании поведенческих экспериментов животных декапитировали, извлекали мозг и на холоду в течении 3-5 мин выделяли височную кору, стриатум, гиппокамп и продолговатый мозг.

Модель ГАМК-деФипитных судорог, вызванных введением ингибитора глутаматдекарбоксилазы. тиосемикарбазида (ТСЮ.

ТСК вводили подкожно в дозе 30 мг/кг крысам линии Вистар. Ламотриджин (20 мг/кг, в/б) и карбамазепин (15 мг/кг, в/б) вводили животным через 15 мин после введения ТСК. Регистрировалось время возникновения двигательного возбуждения и начала судорожного припадка. На пике клоннческих судорог животных декапитировалп, извлекали мозг и на холоду выделяли префронтальную кору, стриатум и гиппокамп. Статистическая обработка данных.

Данные представлены в виде М+ш. Результаты экспериментов обрабатывали статистически по U-критерию Манна-Уитни и t-критершо Стъюдента.

Отдельные этапы данного комплексного исследования выполнены при консультативном и техническом участии к.м.н. В.С.Кудрина, к.б.н. В.Г.Башкатовой, к.б.н. Л.А.Маликовой, м.н.с. Г.Ю.Вицковой, (лаборатория нейрохимической "фармакологии НИИФ РАМН), к.б.н. И.Б.Федотовой,' к.б.н. А.Ф.Семиохиной (МГУ им. М.В.Ломоносова), д.м.н. Б.В.Дывыдова (НИИСП им. Н.В.Склифосовского)', м.н.с. С.В.Калеменева, д.б.н. О.В.Годухина (ИТЭБ РАН), которым автор приносит свою искреннюю благодарность.

Результаты исследования

Состояние пенромедиаторпых систем и показатели ПОЛ в мозге крыс КМ

В первом разделе исследования изучалось состояние нейромедиаторных систем по содержанию возбуждающих и тормозных аминокислот, моноаминов и их метаболитов, а также интенсивность ПОЛ в структурах мозга крыс линии КМ, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам, по сравнению с аналогичными параметрами крыс линии Вистар, не чувствительных к звуковому воздействию. Было обнаружено, что у животных линии КМ наблюдается выраженный дисбаланс' в содержании тормозных и возбуждающих нейромедиаторных аминокислот (Таблица 1). Так, уровень возбуждающих аминокислот аспартата и глутамата оказался более высоким (на 35-39% соответственно) в продолговатом мозге крыс КМ по сравнению с крысами Вистар, что согласуется с представлением об инициирующей роли этой структуры в генезе аудиогенной эпилепсии (А.Ф.Семиохина и П.Цурита, 1974; А.Ф.Семиохина -и соавт., 1993). Значительные различия выявлены в содержании тормозных аминокислот в структурах мозга крыс КМ и Вистар. Так, уровень всех трех изучавшихся тормозных аминокислот ГАМК, глицина и таурина оказался повышенным в височной коре крыс КМ. Более высокое содержание ГАМК также было выявлено и в стркатуме крыс данной линии. В то же время в продолговатом мозге, структуре, функционально важной для развитая аудпогенного припадка, содержание ГАМК н таурина у крыс линии КМ было значительно сниженным по сравнению с животными Вистар, в то время как уровень глицина - повышен. Интересно отметить, что уровень глицина оказался сниженным в гшшокампе, являющемся" областью мозга с низким судорожным порогом. По-видимому, повышенное содержание возбуждающих нейропередатчиков в продолговатом мозге и сниженный уровень тормозных медиаторов в продолговатом мозге и гшшокампе крыс КМ могут играть роль детерминант повышенной предрасположенности животных этой линии к аудиогенной эпилепсии.

Результаты опытов по определению содержания моноаминов и их метаболитов в . различных структурах мозга крыс линии Вистар и КМ приведены в Таблицах 2 и 3. Установлено, что животные линии КМ в

состоянии покоя отличаются от крыс линии Вистар более высоким уровнем 5-ОТ (за исключением стриатума) и его метаболита 5-ОИУК в структурах мозга (Табл. 2), что в делом согласуется с результатами, опубликованными ранее (В.М.Дорофеев, С.П.Подсосов, 1971). Более высоким оказалось и соотношение 5-ОИУК\5-ОТ, характеризующее скорость метаболического кругооборота (обновления) серотонина в этих структурах мозга. Показано, что в стриатной системе крыс, предрасположенных к аудиогенным судорогам, содержание ДА и ДОФУК повышено на 25 и 31%, в то время как уровень НА и ГВК снижен на 29 и 47% соответственно (Табл. 3).

. Таблица 1.

Содержание возбуждающих и тормозных нейроиеднаторпых аминокислот в структурах мозга крыс линий Вистар и Крушинского-Молодкиной

Линия Аспартат Глутамат ГАМК Глицин Таурин

животных

ВИСОЧНАЯ КОРА

ВИСТАР 4.06+0.07 4.37+0.15 1.47+0.01 0.57+0.04 5.40+0.07

КМ без ■ *** ±* **

судорог 4.07+0.48 4.44+0.10 2.16+0.15 0.76+0.05 6.21+0.19

ГИППОКАМП

ВИСТАР 1.60+0.07 5.00+0.81 1.79+0.11 0.83+0.07 5.53+0.33

КМ без ***

судорог 1.63+0.21 7.16+1.05 1.58+0.08 0.62+0.04 6.34+0.49

СТРИАТУМ

ВИСТАР 3.04+0.07 11.32+0.62 2.93+0.17 3.49+0.11 10.81+0.48

КМ без **

судорог 4.03+0.60 12.17+0.98 5.49+0.58 3.68+0.58 10.28+0.95

ПРОДОЛГОВАТЫЙ МОЗГ

ВИСТАР 2.34+0.08 3.25+0.25 1.40+0.10 3.67+0.16 2.23+0.09

КМ без *** *** *** X ***

судорог 3.16+0.04 4.54+0.30 0.90+0.05 5.49+0.6 4 1.11+0.09

Примечание: Данные- выражены- в мкмоль/г ткани (М+Б.Е.М., п=5-6); звездочками показана достоверность различий при сравнении показателей для крыс линии КМ и Вистар; * - Р<0.05, ** - Р<0.01, - Р<0.001 (Ь критерий Стьюдента).

Таблица 2.

Содержание 5-ОТ и 5-ОИУК в структурах мозга крыс Вистар и Крушинского-Молодюшой

5-ОТ 5-ОИУК 5-ОИУК/5-ОТ

Структура мозга ВИСТАР КМ без судорог ВИСТАР КМ без' . судорог ВИСТАР КМ без судорог

Височвая кора Гиппокамп 0.59+0.02 0.47+0.02 * 1.16+0.08 * 1.30+0.09 0.28+0.02 0.67+0.05 2.87+0.17 * 4.59+0.55 0.47+0.03 1.43+0.15 2.51+0.11 * 3.33+0.28

Продолговатый мозг Стриатум 1.36+0.17 0.58+0.03 * 3.73+0.20 * 0.38+0.06 2.04+0.22 0.77+0.07 * 10.37+0.46 * 0.96+0.13 1.50+0.18 1.33+0.09 * 2.75+0.19 ★ 3.79+0.31

Примечание: Обозначения те же, что в Таблице 1.

Следует отметить, что соотношение ГВК/ДА в стриатуме крыс КМ ниже аналогичного показателя животных линии Вистар, что может указывать на более низкую скорость .оборота ДА в этой структуре. (для показателя ДОФУК/ДА это различие незначимо). Таким образом, во всех исследованных структурах мозга крыс КМ содержание о-ОТ и ДА оказалось выше, а уровень НА в стриатуме значительно ниже соответствующих показателей крыс Вистар, что свидетельствует о существенных отличиях в состоянии моноаминершчсской передачи у крыс, предрасположенных к аудиогенной эпилепсии.

Таблица 3.

Содержание НА, ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме крыс линий "Вистар и Крушинского-Молодкиной

Линия животных НА ДА ДОФУК ГВК ДОФУК/ ДА ГВК/ДА

ВИСТАР КМ без . судорог 0.14+0.01 * 0.10+0.01 6.95+0.58 * 8.70+0.66 0.88+0.03 1.15+0.09 0.79+0.06 * 0.42+0.07 0.14+0.01 0.12+0.01 0.10±0.01 * 0.05+0.01

Примечание: Обозначения те же, что в Таблице 1.

При изучении интенсивности ПОЛ в структурах мозга крыс с аудиогенной эпилепсией было обнаружено, что содержание ТБКРП в височной коре и стриатуме у крыс КМ в состоянии покоя значительно выше, чем у крыс линии Вистар, что указывает на исходно более высокий уровень ПОЛ в мозге крыс, генетически предрасположенных к развитию аудиогенной судорожной реакции (Табл. 4).

Таблица 4.

Содержание ТБКРП в структурах мозга крыс линий Вистар и Крушинского-Молодкиной

Линия животных ВИСОЧНАЯ КОРА ГИППОКАМП СТРИАТУМ

ВИСТАР КМ без судорог 123.40+9.40 •к 135.55+16.43 189.30+6.90 198.13+17.32 151.83+10.54 201.03+13.53

Примечание: Данные выражены в нмоль/г ткани; * - Р<0.05 ^-критерий Стьюдента).

Влияние антшсонвульсаптов па развитие аудиогенной судорожной реакции у крыс линии КМ

Следующим этапом работы явилось изучение влияния аятнконвулъсантов на поведенческие характеристики крыс с аудиогенной эпилепсией. Ламотриджин в широком диапазоне доз (5-40 мг/кг) вызывал умеренное снижение интенсивности судорог, предупреждая преимущественно тонический компонент аудпогенного судорожпого припадка, птш этом практически не влияя на клонические судороги (Рис. 1, А). Карбамазепин б исполъзоваипом диапазоне дез (7,5-30 мг/кг) эффективно предупреждал развитие судорожного припадка, при этом у 15% крыс наблюдались двухволновые реакции, а у 37% крыс при дозе карбамазепина 30 мг/кг было отмечено, полное отсутствие реакции на звук (Рис. 1, В). Эффект вальпроата натрия (120-300 мг/кг) • был сходен с действием карбамазепина (Рис. 1, С). Таким образом, эффект антиконвульсантов проявлялся в увеличения латентного периода

двигательной реакции, уменьшении интенсивности судорожного припадка, появлении двухволновых реакций, что может свидетельствовать об усилении тормозных процессов. Существенными отличиями эффекта ламотриджина от двух других антиконвульсантов явилось избирательное угнетение тонико-экстензорного компонента судорожного припадка и отсутствие двухволновых реакций у крыс КМ в ответ на звуковую стимуляцию, что может рассматриваться как дополнительное свидетельство, более высокой селективности действия препарата.

Влияние ламотриджина и карбамазешша на содержание возбуждающих и тормозных нейромедиаторных аминокислот в структурах мозга крыс .КМ

На высоте развития аудиогенного судорожного припадка у крыс КМ наблюдались выраженные изменения в содержании нейромедиаторных аминокислот по сравнению с состоянием покоя. Так, в продолговатом мозге уровни возбуждающих аминокислот аспаратата и глутамата, а в стриатуме и глллокампе - глутамата оказались достоверно сниженными по сравнению с теми же показателями в структурах мозга крыс, находящихся в состоянии покоя. Кроме того, развитие судорожного припадка сопровождалось значительным снижением содержания ГАМК во всех структурах мозга крыс КМ, в то время как, уровень глицина повышался в гиппокампе и снижался в стриатуме. Значимых изменений в содержании таурина не было отмечено. Таким образом, в целом развитие судорожного припадка у крыс КМ сопровождалось значительными сдвигами в содержании как возбуждающих (в большей степени глутамата), так и тормозных (ГАМК, глицин) аминокислот (Рис. 2).

Введение карбамазепина (15 мг/кг) и ламотриджина (20 мг/кг) вызывало статистически достоверное снижение содержания возбуждающих аминокислот аспартата и глутамата в стриатуме „крыс КМ (Рис. 2). При этом карбамазепин оказывал более выраженное влияние на уровень тормозных аминокислот, значительно увеличивая содержание ГАМК и глицина во всех исследованных структурах мозга крыс КМ. Введение ламотриджина также вызывало повышение концентрации тормозных аминокислот, однако, оно проявлялось не во всех исследованных структурах мозга: уровень глицина-был повышен в гиппокампе и продолговатом мозге, в то время как содержание ГАМК только в стриатуме.

КОНТРОЛЬ 5МГ/ЖТ иш/ж, »»г/» « "г/"

КОНТРОЛЬ

„..^«лжина (А) карбДмазепипа (В) и волыгроата

Р№ ГТ « л»™™«» период аудиогапого

натрия (С) »» " липпя Крушлпского-Молодкипон.

судорожного припадка у ** судорог (в баллах), черные -

Заштриховать»> —» ; 'С(УВЛ Рсек)! М±т, ,„-10-12,. латентный период двягательнш у о5 ^ отпошевию к

Достоверность отличии опытных групп, п)ИмР латентного

„™,,1п- * - по интенсивности судорог, ""

п^Года двигательной реакции (I - критерий Сгьюдента).

120

100 •

1 ВО -

о 60 -

и

Й'

40 -

г?

го -

о -

1-,

АСПЛРТАТ

ГАМК

ГЛУТЛМЛТ

глицин

к «

о р.

го

180 160 -140 -

1 го • 100 -80 -60 40 -

го -о

п,

Рис. 2. Влияние ламотриджина (20 мг/кг, в/С) и карбамазешша (15 мг/кг, в/б) на содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в структурах мозга крыс лпшш КМ. 1-гилпокамп, 2-продолговатый мозг, 3-стриатум, 4-внсочиая кора. За 100% приняты значения аминокислот у крыс КМ без судорог, приведенные в Таблице 1. Белые столбики - крысы КМ иа высоте судорожного припадка, черные - крысы КМ с карбамазепином, заштрнховашшые -крысы КМ с ламотриджином. М+т, п-7-8. * - достоверность различий при сравнении показателей для крыс КМ на высоте припадка с данными для крыс КМ без судорог; + - достоверность различий при сравнении данных для крЫс КМ с судорогами с данными для крыс КМ с ламотриджином или карбамазепином (I - критерий Стыоденто).

Влияние ламотриджипа и карбамазепипа па параметры перекиспого окисления лшшдоп и уровень а-токоферола в структурах мозга крыс КМ

На стадии максимальной выраженности аудиогенного судорожного припадка - пике тонической экстензии у крыс КМ содержание ТФ оказалось достоверно сниженным в височной коре, стриатуме и продолговатом мозге (на 21, 27 и 23% соответственно) по сравнению с крысами Вистар (Рис. 3). Напротив, уровень ДК у крыс КМ оказался значительно повышенным во всех исследованных структурах мозга (Рис. 3).

При изучении влияния антиконвульсантов на данные параметры было показано, что ламотриджин в большей степени влиял на содержание ТФ, а карбамазепнн на образование первичных продуктов ПОЛ - ДК (Рис. 4). Полученные данные могут свидетельствовать о том, что ламотриджин оказывает определенное опосредованное влияние на лшшдную фазу клеточной мембраны нейронов. Возрастание уровня ТФ при отсутствии достоверного снижения концентрации ДК может быть обусловлено либо увеличением синтеза природных антиоксидантов (типа а-токоферола, каротинола, убихинона), либо преимущественным ускорением ферментативного пути деградации перекисей, либо иными путями, связанными с изменением основных физико-химических характеристик биомембран.

Влияние ламотриджипа и карбамазешгаа па развитие судорожного припадка и содержание ГАМК в мозге крыс па модели ГАМК-дефицитных судорог, вызванных введением ингибитора глутаматдекарбоксилазы тиосемикарбазида (ТСК)

Введение крысам ТСК (30 мг/кг) вызывало у всех животных возникновение ярко выраженных клонических судорог, при этом тонической экстензии не наблюдалось. Наступление первого ложного клонуса происходило через 60-75 мин от момента введения ТСК. Первый истинный клонус отмечался через 5-10 мин после гсзнпкновения первого ложного клонуса. Максимальная интенсивность клонических судорог . наблюдалась через 80-90 мин от момента введения ТСК, что коррелирует с динамикой снижения уровня ГАМК в мозге, обусловленного ингибированием синтеза нейромедиатора.

3.0 -I

о _ _ е£ 2.Э -

ч и

с о

О

<

2.0 -1.5 -

V 1.0 -с*

0.5

а-ТОКОФЕРОЛ

О

4.5 п 4.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 -О

Л

1

ДИЕНОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ

височная кора

стриатум

продолговатыи мозг

Рис. 3. Содержание а-токоферола и диеновых конъюгатов в структурах мозга крыс линий Вистар (белые столбики) и КМ па высоте развития судорожного припадка (черные столбики). М+ш, (п=7-8). - • достоверность различий при сравнении показателей для крыс линии Вистар с данными для крыс КМ на высоте припадка (1 - критерий Стьюдеита).

180 -] 160 -140 -

к

о 120 Н

а

н

о 100 («

° 80 60 Н 40 20 0

а-ТОКОФЕРОЛ

*

Т

140 л

120 -

е 100 и

ч

о с.

к 80 о

о 60

40 -

20 -

ДИЕНОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ

т

* т

височная кора

продолговатый мозг

Рис. 4. Влияние ламотриджняа и карбамазедина на содержание а-токоферола и диеновых кон-ьюгатов в структурах мозга крыс линии КМ. Ламотриджин (Белые столбики), карбамазепин (черные столбики). М+ш, (п-7-8). Данные выражены в % к контролю (крысы КМ на высоте припадка. Рис. 3). * - достоверность различий при сравнении эффектов веществ по отношению к данным для крыс КМ на высоте припадка (I -критерий Сгьюдента).

Карбамазепин, введенный в дозе 15 мг/кг через 15 мин после введения ТСК полностью предупреждал возникновение клонических судорог, в то время как ламотриджин в дозе 20 мг/кг оказывал менее аыраженнос влияние на клонический компонент припадка на модели ГАМК-дефицитных судорог. Результаты опытов по изучению влияния ламотриджина и карбамазепина на уровень ГАМК в различных структурах мозга крыс линии Вистар на модели ГАМК-дефицитных судорог представлены на Рис. 5. В наших опытах содержание ГАМК у контрольных животных составило в гиппокампе - 1.41+0.02, префронтальной коре - 1.64+0.01, стриатуме -3.73+0.04 мкмоль/г ткани. Эффекты фармакологических веществ оценивали по отношению к уровню ГАМК у контрольных животных. Введение ТСК приводило к значительному снижению содержания ГАМК во всех структурах мозга крыс, при этом наиболее выраженное уменьшение уровня ГАМК наблюдалось в стриатуме (до 35% от контроля). На фоне введения ламотриджина и карбамазепина содержание ГАМК в префронтальной коре и стриатуме оказалось статистически достоверно более высоким (Рис. 5). Следует отметить, что в гиппокампе уровень ГАМК при введении аптиконвульсантов не изменялся. Таким образом, на дайной модели эпилептической активности оба вещества оказались способны предупреждать снижение содержания ГАМК в структурах мозга крыс. Интересно отметить, что ламотриджин как и карбамазепин увеличивает уровень ГАМК, при этом практически не угнетая клонические судороги.

Влияние ламотриджина и карбамазепина на глутаматергическуто синаптическую передачу в переживающих срезах гшшокампа

Известно, что одной из специфических функций нейронов в мозге является синаптическая передача сигнала с одного нейрона на другой. ^ Поэтому наличие синаптического ответа в нейронах является необходимым условием их нормальной активности. В специальной серии экспериментов было предпринято изучение влияния ламотриджина и карбамазепина на эффективность глугаматергической передачи х пережигающих . срезах гиппокампа.

Для оценки эффективности синаптической передачи в данной работе были исследованы три связанных с ней этапа:

о -I

о -

Рис. 5." Влияние ламотриджина и 'карбамазепина на содержание ГАМК в структурах мозга крыс на модели ГАМК-дефицнтных судорог, вызванных введением ТСК. 1- гиппокамп, 2- префронтальная кора, 3- стриатум. Данные выражены в % к контролю. Судорожный припадок (белые столбики); ламотриджин, 20 мг/кг, в/б (черные столбики); карбамазепин, 15 мг/кг, в/б (заштрихованнные столбики). М+т, п=5-б. * - достоверность различий при сравнении показателей для крыс КМ на высоте припадка по отношению к контролю; + - достоверность различий при сравнении эффектов веществ с данными для крыс КМ на высоте припадка ^ - критерий Стъюдента).

1. Измерение амплитуды пресинаптического полевого (относящегося к группе нейронов) спайка в ответ на электрический стимул.

2. Измерение амплитуды и тангенса угла наклона полевого ВПСП в ответ на синалтический спайк.

3. Измерение амплитуды полевого постсинаптического спайка в ответ на ВПСП.

Анализ концентрационной зависимости влияния ламотриджина на амплитуду ПрС показал, что при иптенсивностях стимула, вызывающих ПрС максимальной амплитуды, действие ламотриджина проявляется в виде достоверного снижения амплитуды ответа уже в концентрации Ю-5 М. Более

120

♦ - контроль В - 10° м а - ю-5 М . х- 1(И М

О 5 10 15 20 25 30 35

СИЛА СТИМУЛА (У)

Рис. 6. Влияние ламотриджина на зависимость амплитуды пресинаптического спайка от силы стимула.

выраженный эффект (до 70% от контроля) наблюдался прп • концентрации КИМ ламотриджина (Рис. 6). При удалении вещества из среды амплитуда ответов восстанавливалась до нормальных значений. В отличие от ламотриджина эффект карбамазепина на амплитуду ПрС в концентрациях 10"6 и 10"5М оказался статистически не значимым. Однако в концентрации 1СИМ карбамазепин достоверно снижал амплитуду полевого ПрС (Рис. 7). Таким образом, влияние ламотриджина на возбудимость пресинаптических волокон имело выраженный концентрационно-зависимый характер во всем исследованном диапазоне, а эффект карбамазепина проявлялся только при концентрации 10'4М. Анализ кривых зависимости скорости изменения пВПСП от амплитуды ПрС в Б^гасЦа^т и ПС от пВПСП показал, что ламотриджин оказывает влияние на передачу в синапсе, но не влияет на постсинаптическое звено. Анализ соответствующих кривых для карбамазепина показал, что этот препарат значительно уступает ламотриджину по действию на синаптическую передачу, не оказывая влияния на генерацию ПС. На уровне пресинаптических волокон, эффект карбамазепина оказался достоверным лишь при концентрации 1СИМ. При концентрации 10"3М оба антиконвульсайта практически полностью подавляли электрическую активность нейронов в поле СА-1 срезов гиппокампа.

Таким образом, ламотриджин и карбамазепин оказывают общее угнетающее действие на возбудимость нейронов в поле СА-1 гиппокампа. В системе коллатерали Шаффера/комиссуральные волокна - пирамидные нейроны поля СА-1 гиппокампа и ламотриджин и карбамазепин (последний лишь в высокой концентрации) снижают возбудимость пресинаптических аксонов и эффективность передачи в глутаматных синапсах, но не оказывают существенного влияния на генерацию потенциалов действия в популяции постсинаптических нейронов. При этом влияние ламотриджина па цресинапгические волокна было копцентрационпо-зависимым, в то время как снижение эффективности сзтаптической передачи не зависело от концентрации препарата. Влияние карбамазепина па эти компонента нейропальной сети проявлялось только в концентрация 10"4 М.

« и 100

о

л

и

и

о « 80

И

о

с^ 60

У

а

И

л к 40

г? м

¡3

в е 20

•3

0

¿У

♦ X

X

I

Я ♦

X

♦ - контроль

М - 10° м

А - Ю-5 М

Х- Ю-4 м

10 15 20 25 30 35 40 45

\

СИЛА СТИМУЛА (V)

Рис. 7. Влияние карбамазепина на зависимость амплитуды пресинаптического спайка от силы стимула.

выводы

1. На модели аудиогенной эпилепсии ламотриджин, карбамазепин и вальпроат натрия достоверно уменьшают интенсивность судорог и увеличивают латентный период двигательной реакции. В отличие от карбамазепина и вальпроата натрия, ламотриджин вызывает менее выраженные изменения в структуре аудиогенного судорожного припадка, оказывая вместе с тем более селективное влияние на его тоническую фазу.

2. На высоте развития судорожного припадка как ламотриджин, так и карбамазепин вызывают отчетливое снижение уровня аспартата и глутамата в стриатуме крыс КМ. При этом карбамазепин" значительно повышает содержание ГАМК и глицина во всех структурах мозга крыс, ламотриджин увеличивает уровень глицина в гихшокампе и продолговатом мозге, содержание ГАМК повышается только в стриатуме.

3. Ламотриджин в большей степени влияет на состояние эндогенной антиоксидантной системы, значительно увеличивая содержание а-токоферола в структурах мозга крыс с аудиогенной эпилепсией. В этих же условиях карбамазепин вызывает снижение содержания продуктов ПОЛ в мозге крыс КМ.

4. Ламотриджин, в отличие от карбамазепина, в меньшей степени влияет на клонический компонент припадка на модели ГАМК-дефицитных судорог, при этом оба вещества способны предупреждать снижение содержания ГАМК в структурах мозга крыс, наблюдаемое при этом виде судорог.

5. Ламотриджин и карбамазепин угнетают глутаматергическую синаптическую передачу в поле СА-1 нейронов гиппокампа, по-видимому, влияя как на пресинаптический компонент передачи, так и на постсиналтическую возбудимость пирамидных нейронов. Особенностью ламотриджияа оказалось его способность, по-разному воздействовать на пресиналтнческое и постсипаптическое звено глутаматергпческой передачи.

Список сокращении:

5-ОТ - 5-окситриптамип, серотонин

5-ОИУК - 5-оксииндолуксусная кислота

ВПСП - возбуждающий ».остсинаптический потенциал

БЭЖХ/ЭД - высокоэффективная жидкостная хроматография с

электрохимической детекцией

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГВК - гомованилиновая кислота

ДА - дофамин

ДК - диеновые конъюгаты

ДОФУК - диоксифенилуксусная кислота

КМ - крысы лпнии Крушинского-Молодкиной

НА - норадреналин

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПрС - пресиналтический спайк

ПС - популяционный спайк

ТБКРП - продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой ТСК - тиосемикарбазид ТФ - а-токоферол

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К.С.Раевскин, В.Г.Башкатова, В.С.Кудриз, Л.А.Маликова, Е.С.Косачева, Г.Ю.Вицкова, А.Ф.Семиохика, И.Б.Федотова. Содержание нейромедиаторкых аминокислот и продуктов перекисного окисления липидов в мозге крыс, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам. // Нейрохимия. - 1995. - Т. 12. - Вып. 4. - С. 47-54.

2. В.С.Кудрин, В.Г.Башкатова, Е.С.Косачева, Л.А.Маликова, И.Б.Федотова, А.Ф.Семиохина, Б.В.Давыдов, К.С.Раевский. Влияние антиконвульсантов на нейрохимические и поведенческие характеристики крыс с аудиогенной эпилепсией. // В сб. тез. 2-то Российского национального конгресса: "Человек и лекарство". - М. - 1995. - С. 104.

3. V.G.Bashkatova, V.S.Kudrin, L.A.Malikova, E.S.Kosacheva, I.B. Fedotova, A.F.Semiokhina. and K.S. Rayevsky. Transmitter amino acids, lipid peroxidation and antioxidant defense mechanisms in the brain of rats with audiogenic epilepsy. // J. Neurochem. - 1995. - Vol. 65. - P. 191.

4. Kosacheva E.S. The neurochemical and behavioral parameters of the rat strain with audiogenic epilepsy: the effects of carbamazepine. // Neurokhimia. - 1995. - Vol. 12. - N 2. - P. 66.

5. K.S.Rayevsky, V.G.Bashkatova, V.S.Kudrin, L.A.Malikova, E.S.Kosacheva, G.U.Vitskova, I.B. Fedotova and A.F.Semiokhina. Audiogenic epilepsy in rats as a model of oxidative brain damage: neurochemical alterations and effect of anticonvulsant drugs. // International Symposium on Oxidative Stress, Apoptosis and Brain Damage. - Pittsburgh, USA. - 1995. - P. 9.

6. V.G.Bashkatova, V.S.Kudrin, L.A.Malikova, E.S.Kosacheva and K.S.Rayevsky. Audiogenic epilepsy in rats as a model of oxidative brain damage: neurochemical alterations and effect of Lamotrigine and Carbamazepine. // Workshop "Oxidative Stress: Molecular mechanisms and pathophysiological concequences of. oxidative damage in membranes and lipoproteins". - Seggau Castle, Austria. - 1996. - P - 5.

7. И.Б.Федотова, А.Ф.Семиохина, Е.С.Косачева, В.Г.Башкатова, К.С.Раевский. Влияние ламотриджина и карбамазепина на развитие аудиогенной судорожной реакции у крыс линии Крушинского-Молодкиной. // Эксперим. и клин, фармакология. - 1996. - Т. 59. - № 6. -С. 9-12. /7/ _