Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Нейрофармакологическое изучение оригинального ноотропного и нейропротективного дипептида ноопепт на моделях болезни Альцгеймера

со

На правах рукописи

Цаплина Анна Павловна

НЕЙРОФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРИГИНАЛЬНОГО НООТРОПНОГО И НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО ДИПЕПТИДА НООПЕПТ НА МОДЕЛЯХ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА.

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003460438

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Островская Рита Ушеровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мирзоян Рубен Симонович

доктор биологических наук, профессор Каменский Андрей Александрович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

М i ahí /?

Защита состоится ' 2009 г. в 'часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01 ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан^ * 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук ЕЛ. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Спорадическая болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее значимой причиной старческого слабоумия. Каждые 5 лет после 65-летнего возраста частота этого заболевания удваивается. Число больных, одномоментно страдающих БА в мире по данным современных статистик достигает 26 млн. человек (Fern et al., 2005). Общая численность больных, страдающих выраженными формами БА в России, приближается к 1,4 млн. человек.

Болезнь Альцгеймера представляет собой сложный комплекс различных патогенных процессов, основными из которых являются накопление амилоидных бляшек и нейрофибрилл, дефицит холинергической системы мозга, снижение количества ростовых факторов, гибель нейронов и нарушение когнитивных функций. Данные процессы тесно взаимосвязаны, развитие одного из них активизирует остальные. Совокупность патогенетических факторов БА характеризуется отношениями "замкнутого круга", в котором все факторы связаны закономерностями прямой и обратной связи (Longo et al, 2004; Гаврилова, 2005; Shelat et al., 2008). Оптимальный сценарий терапии БА должен состоять в применении препаратов, влияющих одновременно на несколько основных патогенетических звеньев заболевания. Другим важным требованием к этим веществам является отсутствие токсических эффектов при длительном превентивном применении. Это требование обусловлено необходимостью начала терапии на самых ранних этапах аккумуляции ß-амилоида, когда клинические проявления БА еще не диагностируются -на фазе мягкого когнитивного нарушения (МКН), представляющего собой промежуточную стадию между "успешным" старением и деменцией, и обуславливающего повышенный риск развития деменции в течение ближайших 3-5 лет. Таким разнонаправленным действием в сочетании с низкой токсичностью могут обладать пептиды, как многокомпонентные регуляторы эндогенной природы. Известно, что практическое применение пептидов в качестве лекарственных препаратов затруднено их низкой биологической устойчивостью. В качестве рациональных подходов к преодолению этих затруднений описаны такие приемы как использование активных фрагментов сложных пептидов, модификация их структуры, например введением D-изомеров аминокислот, стабилизирующих группировок (Ашмарин 1984 и др.; Каменский, 1984; Мясоедов и др., 1990; Левицкая 1994; Дубынин, 2006).

Оригинальный подход, развиваемый в НИИ Фармакологии РАМН в течение более чем двух десятилетий, может быть охарактеризован как дизайн дипептидов на основании

имитации структуры непептидного нейротропного средства (Гудашева и др., 1985). В случае поиска веществ, улучшающих когнитивные функции, в качестве непептидного прототипа выбран стандартный ноотроп, пирацетам, а в качестве пептидного -вазопрессин (АВП), точнее его основной метаболит, АВП 4-9. Из серии производных ацил-пролил-глицинов, синтезированной на основании этого подхода (Gudasheva et al., 1996, Seredenin et al., 1995), был отобран для более подробного изучения этиловый эфир М-фенилацетил-Ь-пролилглицина (соединение ГВС-111, ноопепт). Детальное экспериментальное изучение этого соединения выявило наличие у него совокупности ноотропных и нейропротекгавных эффектов (Островская и др., 2002; Ostrovskaya et al, 2004). Последующее клиническое изучение Ноопепта, выполненное в рамках I, II и Ш фаз, на больных с МКН цереброваскулярного и постгравматаческого генеза показало, что препарат оказывает отчетливое терапевтическое действие на основные проявления психоорганического синдрома, ослабляя когнитивные нарушения и оказывая анксиолитическое действие (Незнамов и др., 2006; Горшунова и др., 2008; Аведисова и др., 2008). Учитывая также тот факт, что ноопепт обладает многокомпонентным нейропротекгавным действием и усиливает выработку антител к р-амилоиду (Ostrovskaya et al, 2007), представляет интерес изучить его эффект при более тяжелых формах когнитивной недостаточности, в частности при БА. Для оценки перспективности этих исследований необходимо изучить эффект препарата на экспериментальных моделях БА. Известно, что моделирование спорадической БА осуществляется с помощью хирургических и инъекционных моделей (Van Dam, 2006), притом последняя группа является наиболее информативной (Гуляева и др., 2002; Степанычев и др., 2004). Цель исследования. Целью данного исследования являлось комплексное изучение поведенческих и нейрохимических эффектов ноопепта на следующих типах моделей БА: введение В-амиломдного пептида 25-35 в ядра Мейнерта, моделирование холинергического дефицита, введение диабетогенного токсина стрептозоцина.

Основные задачи исследования.

1. Исследование эффекта ноопепта при нарушениях когнитивных функций, вызванных введением амилоидного пептида 25-35 в ядра Мейнерта.

2. Изучение влияния ноопепта на когнитивные способности животных в условиях холинергического дефицита различного характера.

3. Сравнение эффектов диабетогенного токсина стрептозоцина при системном и внутримозгового введении.

4. Изучение когнитивных эффектов ноопепта на отобранной модели воздействия стрептозоцина.

5. Оценка влияния ноопепта на экспрессию нейротрофических факторов N0? и ЕЮ№ в коре головного мозга и гиппокампе у интактных животных и после воздействия стрептозоцина.

6. Исследование влияния ноопепта на выраженность оксидативного стресса в условиях стрептозоциновой модели.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что ноопепт ослабляет амнестическое действие амилоида 25-35, введенного в ядра Мейнерта. Этот эффект проявляется как в условиях профилактического введения, так и при введении на фоне развившейся патологии. В последнем случае он продемонстрирован в условиях введения препарата, начатого спустя 15 дней после нанесения повреждающего воздействия, что свидетельствует о большом "терапевтическом окне" действия препарата на этой модели. При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии ВАЬВ/с и С57ВЬ/61 показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта. На двух моделях пространственной ориентации и памяти (водный лабиринт и трехкамерная версия УРПИ) показано, что нарушение этих процессов более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов. Разработана модель хронического холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина (с последующей отменой) мышам линии ВАЬВ/с. Выполнено сравнительно изучение эффекта диабетогенного токсина стрептозоцина в условиях его системного (внутрибрюшинного) введения и введения в желудочки мозга. Поскольку при системном введения стрептозоцина развивается гипергликемия, а при его введении в желудочки мозга сохраняется нормальный уровень глюкозы в крови, модель внутрижелудочкого введения является предпочтительной. Показано, что стрептозоцин вызывает снижение экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе и накопление продукта перекисного окисления липидов - МДА. Установлено, что ноопепт ослабляет изученные метаболические эффекты стрептозоцина и сопутствующий поведенческий дефицит, проявляющийся в отношении долговременной памяти.

Научно-практическая значимость. Предложенные экспериментальные подходы расширяют методологию изучения веществ эффективных для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний. Совокупность выявленных эффектов ноопепта, направленных на некоторые базовые механизмы БА, свидетельствует о целесообразности изучения эффективности препарата у больных БА (начальные и умеренные формы). Личный вклад автора. Автором были самостоятельно выполнены все эксперименты, по нижеизложенным методикам. Обработаны результаты и сформулированы выводы. Апробация работы. Диссертация апробирована на межлабораторном заседании лабораторий психофармакологии, фармахокинетики, нейрохимической фармакологии ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН 19 января 2009 года. Материалы диссертационной работы докладывались на российских и международных конференциях: Научной конференция "Физиология и медицина", Санкт-Петербург, 2005.; International Symposium "Hippocampus and Memory", Pushchino, Russia, 2006; 1П съезде фармакологов «Фармакология-практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; IV Российской научно-практической конференции «Болезнь Альцгеймера и когнитивные нарушения в пожилом возрасте: достижения в нейробиологии и терапии», Москва, 2008.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 9 статей в рецензируемых журналах и 3 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, содержит 33 рисунка и 2 таблицы. Библиографический указатель включает 155 публикаций, из них 42 русских и 113 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на мышах-самцах инбредных линий C57BL/6J, BALB/c, (питомник «Столбовая» РАМН) весом 20-23 г (всего 164) и самцах беспородных крысах и крыс Вистар массой 250-350 г (всего 201). Животные содержались в пластиковых клетках размером 30x70x40 см по 6-8 в каждой при естественном освещении и получали комбикорм фирмы МЭСТ и воду ad lib.

В работе использованы следующие фармакологические препараты и анализаторы: субстанция Ноопепт, синтезированная в Институте фармакологии ТА. Гудашевой и

сотрудниками, вводимая в дозе 0.5 мг/кг в/бр; блокатор мускаринового типа холинергических рецепторов скополамин (Sigma) (1мг/кг п/к); блокатор никотинового типа холинергических рецепторов мекамиламин (Sigma), 2 мг/кг п/к; диабетогенный токсин стрептозоцин (Sigma), 3 мг/кг в боковые желудочки мозга с обеих сторон или в/бр 200 мг/кг; В-Амилоид 25-35 (Sigma) вводили в ядра Мейнерта с обеих сторон (2 мина животное).

Методы тестирования когнитивных способностей. Водный лабиринт (ВЛ). В настоящей работе использовали модифицированный вариант теста Морриса (Лильп и др., 1997). Два протокола ведения экспериментов (при предварительном ознакомлении с бассейном и без него) описаны ранее (Бельник и Островская, 2007).

Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) Использовано два варианта экспериментальных установок: широко используемый 2-х камерный (Буреш и Бурешова, 1991) и 3-х камерный (протокол эксперимента описан в статье Иноземцева и др., 2007).

Использованные модели БА I. Введение амилоидного пептида 25-35 (Ав 25-35) в ядра Мейнерта. Крыс случайным образом делили на 4 группы. Крысам первой группы (пассивный контроль) вводили физиологический раствор в ядро Мейнерта; введение проводилось на стереотаксическом аппарате после предварительной наркотизации (пентобарбитал 50 мг/кг в/бр) по координатам: АР-1,4; L-2,7; Н-8,7 (Paxinos and Watson, 1998); через 15 дней после операции ежедневно вводили физиологический раствор в/бр в течение 7 дней; крысам второй группы (активный контроль) вводили Ар 25-35 (2 мкг на животное) с двух сторон в ядра Мейнерта, через 15 дней начинали ежедневное введение физиологического раствора в/бр, продолжавшееся 7 дней; крысам третьей группы (опыт, лечение) вводили Ар 25-35 в ядра Мейнерта, через 15 дней после этого начинали ежедневное введение ноопепта (0,5 мг/кг в/бр), продолжавшееся 7 дней; крысам четвертой группы (опыт, профилактика) вводили ноопепт (0,5 мг/кг в/бр.) в течение 7 дней - после чего вводили Ар 25-35 в ядро Мейнерта. Через 15 дней всех крыс обучали и тестировали на двухкамерной установке УРПИ.

П. Моделирование холинергического дефицита.

А. Острое введение холиноблокаторов мышам. Через 30 мин после однократного помещения мышей BALB/c в заполненный водой бассейн с видимой платформой (ознакомление) их случайным образом делили на 3 группы: мышам первой группы

(пассивный контроль) вводили физиологический раствор в/бр, второй (активный контроль)- скополамин (1 мг/кг, п/к) или мекамиламин (2 мг/кг, п/к), третьей (опыт) -ноопепт (0,5 мг/кг в/бр) и скополамин (1 мг/кг, п/к.) или ноопепт и мекамиламин (2 мг/кг, п/к). Через сутки мышей тестировали в BJI: в течение 5 последовательных предъявлений оценивалось время поиска мышами скрытой платформы.

Б. Однократное введение холиноблокаторов крысам. За 15 мин до начала обучения в установке УРПИ крыс делили на 3 группы: крысам первой группы (пассивный контроль) вводили физиологический раствор в/бр, второй (активный контроль)-скополамин (1 мг/кг, п/к) или мекамиламин (2 мг/кг, п/к), третьей (опыт) - ноопепт (0,5 мг/кг в/бр) и скополамин (1 мг/кг, п/к) или ноопепт и мекамиламин (2 мг/кг, п/к). Через сутки крыс обучали, а через 24 часа тестировали на трехкамерной установке УРПИ.

В Хроническое введение холиноблокатора. Мышей линии BALB/c делили на 3 группы: мышам первой группы (пассивный контроль) вводили физиологический раствор в/бр., второй (активный контроль) в течение первых 14 дней ежедневно вводили скополамин (1 мг/кг, п/к), затем в течение 7 дней - физиологический раствор в/бр; мышам третьей группы (опыт) в течение 14 дней вводили скополамин, а последующие 7 дней - ноопепт (0,5 мг/кг, в/бр.). После этого мышей обучали и тестировали в BJIM.

III Введение диабетогенного токсина стрептозоиина.

А. Внутрибрюшинное введение стрептозоиина. Мышей линии BALB/c случайным образом делили на 3 группы: мышам первой группы (пассивный контроль) в течение 7 дней вводили физиологический раствор в/бр, второй (активный контроль) -стрептозоцин (200 мг/кг, в/бр), а в последующие 6 дней - физиологический раствор в/бр.; мышам третьей группы (опыт) вводили стрептозоцин (200 мг/кг, в/бр) далее, в течение 6 дней- ноопепт (0,5 мг/кг в/бр). После этого мышей обучали и тестировали в ВЛМ.

Б. Введение стрептозоиина в желудочки мозга: оиенка состояния памяти в тесте УРПИ. Крыс делили на 3 группы: крысам первой группы (пассивный контроль) производили двустороннее введение раствора Рингера в боковые желудочки мозга. Введение проводилось после предварительной наркотизации нембуталом (40 мг/кг в/бр.) по координатам АР -1,5; L- 2; Н-3,5 (Paxinos and Watson, 1998), далее, в течение 7 дней производили ежедневное введение физиологического раствора в/бр.; крысам второй группы (активный контроль) производили двустороннее введение стрептозоцина в боковые желудочки мозга, из расчета 3 мг/кг, растворенного в растворе Рингера, далее, в

течение 7 дней производили ежедневное введение физиологического раствора в/бр; крысам третьей группы (опыт) производили двустороннее внутрижелудочковое введение стрептозоцина, а в последующие 7 дней - ежедневное введение ноопепта (0,5 мг/кг в/бр). Через сутки крыс обучали и тестировали на установке УРПИ. После проведения тестирований, у крыс серий А и Б определяли содержание глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены, на приборе One Touch Ultra.

В. Внутрижелудочковое введение стрептозоиина (исследование биохимических параметров)1. Крыс случайным образом делили на 3 группы: крысам первой группы (пассивный контроль) в течение 14 дней производили ежедневное введение физиологического раствора в/бр, после этого животным проводили двустороннее внутрижелудочковое введение раствора Рингера далее, в течение 14 дней производили ежедневное введение физиологического раствора в/бр; крысам второй группы (активный контроль) в течение 14 дней - ежедневное введение физиологического раствора в/бр, после этого - двустороннее внутрижелудочковое введение стрептозоцина в дозе 3 мг/кг., далее, в течение 14 дней- ежедневное введение физиологического раствора в/бр; крысам третьей группы (опыт), в течение 14 дней - ежедневное введение ноопепта (0,5 мг/кг в/бр), после этого - двустороннее внутрижелудочковое введение стрептозоцина в дозе 3 мг/кг., затем, в течение 14 дней производили ежедневное введение ноопепта (0,5 мг/кг в/бр). Через 28 дней после начала эксперимента крыс забивали декапитацией.

а. Определение уровня экспрессии генов BDNF и NGF. Выделение тотальной РНК производилось с помощью реагента TRYzol (Invitrogen, США). Оценка экспрессии генов BDNF и NGF в ткани гишгокампа и коры больших полушарий проведена с использованием метода Нозерн-блот анализа (Elder et al., 1981).

б. Измерение уровня окисления липидов. Оценка уровня окисления липидов в ткани гишгокампа и коры больших полушарий проведена с помощью фотометрического измерения концентрации малонового диальдегида (Ikatsu et al., 1992).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в пакете программ Biostat с помощью непараметрических и непараметрических критериев: Манна-Уитни, Стьюдента, ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Эксперименты выполнены совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН и лаборатории биохимии Института Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

В соответствии с задачами исследования ноопепт был изучен на перечисленных выше моделях БА, воспроизводящих различные аспекты патогенетических механизмов этого заболевания.

I. Изучение влияния поопепта на обучаемость и память у крыс, нарушенные введением амилоидного пептида Aß 25-35 в ядра Мейнерта.

Известно, что основным компонентом сенильных бляшек при БА является амилоид (1-42). Его нейротоксические эффекты воспроизводятся гидрофобным С-терминальным фрагментом, ß- амилоидом 25-35 (Liao et al., 2007). Введение Aß 25-35 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта вызывает распространенные дегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе (Giovannelli et al., 1995; Harkany et al., 1998). На этой модели исследовалась способность ноопепта противодействовать развитию нарушений памяти, вызванных введением амилоида. Для оценки обучаемости и памяти использовалась двухкамерная установка теста УРПИ, в которой оценивались латентный период захода в темную камеру при обучении (ЛП1) и тестировании (ЛП2). Непараметрический дисперсионный анализ ANOVA выявил достоверные различия между четырьмя исследуемыми группами в величинах ЛП1: Н(3, N= 37)=17.75858; р = 0.0005, а также в величинах ЛП2: Н(3, N=37)=l 0.42004, р =0.0153. Анализ величин ЛГИ с использованием теста Mann-Whitney выявил увеличение этого показателя в группе активного контроля по сравнению с пассивным (р=0.0014), что свидетельствует о снижении ориентировочно-исследовательской активности при введении Aß 25-35. Группы профилактики и лечения не отличались от ложной операции, а также между собой, но достоверно отличались от активного контроля. Эти данные указывают на то, что ноопепт при обоих режимах введения устраняет снижение двигательной активности, вызванное ß-амилоидом. Анализ величин ЛП2 выявил достоверное снижение этого показателя в группе активного контроля по сравнению с пассивным (р=0.008), что свидетельствует об амнестическом эффекте ß-амилоида, введенного в ядра Мейнерта. При профилактическом введении ноопепта значение показателя ЛП2 было достоверно выше, чем в группе активного контроля (р=0.02) и не отличалось от аналогичного показателя в пассивном контроле. В группе лечения значение ЛП2 также было выше, чем в активном контроле: (р=0.041) и не отличалось от величины, наблюдаемой в пассивном контроле. Достоверных различий между группами профилактики и лечения обнаружено не было.

#

Т #

w # т .....

щ

11

§

1

Контроль р-амилойд лечение профилактика

* -р < 0.05 от пассивного контроля, # - р < 0.05 от активного контроля

Рис.1 Ноопепт в условиях лечебного и особенно профилактического введения

ослабляет амнестический эффект (5 - амилоида 25-35 (по показателю ДЛП).

Анализ величин ДЛП (ЛП2-ЛП1) выявил снижение его значения в группе

активного контроля относительно пассивного контроля. В группе профилактического введения ноопепта значение А ЛП было достоверно выше, чем в группе активного контроля, при этом оно не отличалось от аналогичного показателя в пассивном контроле. В группе лечения показатель ДЛП также значительно превосходил аналогичный показатель группы активного контроля (р=0.0089). Различий между группами профилактики и лечения обнаружено не было, хотя по средним показателям профилактическое введение было более эффективным, чем лечебное (Рис 1). Полученные данные свидетельствуют о способности ноопепта противодействовать развитию когнитивных нарушений, вызванных амилоидным пептидом.

II Эффект ноопепта на моделях холинергического дефицита. А. Влияние ноопепта на обучаемость и память мышей линий BALB/c, нарушенные однократным введением скополамина или мекамиламина в тесте водного лабиринта. При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии BALB/c и C57BL/6J показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта. Одним из существенных различий в биохимических характеристиках этих линий является более низкий уровень ацетилхолина в гиппокампе мышей линии BALB/c (Ingram et al, 1980), и это может играть роль в развитии дефицита долговременной памяти у мышей этой линии, устраняемого ноопептом. Для получения более прямых доказательств способности ноопепта ослаблять выраженность холинергического дефицита были

выполнены эксперименты на мышах линии ВАЬВ/с, которым вводился блокатор М-холинорецепторов, скополамин, либо блокатор Н-холинорецепторов, мекамиламин.

Нарушения, вызванные однократным введением скополамина. При используемом способе обучения (с предварительным ознакомлением) мыши контрольной группы тратят на поиск платформы одинаковое время как через 24 часа после обучения, так и через 10 суток. В группе мышей с введением скополамина отыскание платформы занимало больше времени, чем у мышей контрольной группы, хотя по ходу 5-ти предъявлений происходило укорочение этого времени. При воспроизведении навыка через 10 дней мыши, которым вводили скополамин, также затрачивали на отыскание платформы больше времени, чем мыши контрольной группы (Рис. 2). Введение ноопепта одновременно со скополамином устраняла негативное действие последнего на долговременную память.

Нарушения, вызванные мекамиламином. Как и в предыдущем эксперименте, в группе мышей с введением холиноблокатора отыскание платформы занимало больше времени, чем у мышей кошрольной группы. При воспроизведении навыка через 10 дней мыши, которым вводили мекамиламин, затрачивали на отыскание платформы больше времени, чем мыши контрольной группы. Введение ноопепта одновременно с мекамиламином снижает негативное действие холиноблокатора на долговременную память (Рис 2). При этом было показано, что мекамиламин повышает время поиска «фытой платформы в меньшей степени, чем скополамин: отношение длительности ЛП поиска платформы при первом предъявлении через 10 дней к последнему предъявлению через 24 часа составляло 27 и 20 сек для мекамиламина и 40 и 20 сек для скополамина (Рис 2). После выявления эффективности ноопепта на моделях холинергического дефицита у мышей было изучение эффекта ноопепта на другом виде экспериментальных животных, крысах и на другой модели пространственной памяти - вариант трехкамерной установки для УРПИ.

Б. Влияние ноопепта на память у крыс, нарушенную холиноблокаторами. Амнезия, вызванная скополамином. В первой серии экспериментов оценивалась способность ноопепта оказывать антиамнестатический эффект на крыс, которым вводили скополамин. Латентный период захода в темный отсек во время обучения был практически одинаков, и составлял в среднем 10-15 сек (рис. 3). Это говорит об исходной гомогенности всей экспериментальной выборки. При тестировании животных

контрольной группы через 24 часа после обучения латентный период захода в темную камеру (ЛП2) был достоверно выше, чем при обучении (ЯП1) (р<0,01). При отставленном тестировании через 14 дней латентный период захода в темную камеру (ЛПЗ) был меньше, чем ЛП2, что свидетельствует о некотором забывании (р<0,05) (Рис. 3). В группе животных, которым предварительно вводился скополамин, ЛП 2 захода в темную камеру был резко снижен по сравнению с контрольными животными (р<0,01) (рис.3). Уменьшение ЛП в группе скополамина относительно контрольных животных наблюдалось и при отставленном тестировании (р<0,01) (рис.3). В группе крыс, которым после скополамина вводили ноопепт, при тестировании через 24 часа отмечено повышение ЛП захода в темную камеру по сравнению с группой активного контроля (рис. 3). При отставленном тестировании на 14-ые сутки эффект ноопепта проявился наиболее ярко: ЛПЗ у крыс группы "ноопеш+скополамин" превышал этот показатель не только для группы активного контроля (р<0.01), но даже и для пассивного контроля (р<0.05) (рис. 3).

При тестировании большая часть контрольных животных оставалась в центральном, освещенном, отсеке, несколько крыс зашли в "безопасный" отсек, и лишь небольшая часть зашла в "опасный отсек". Кпбо (показатель предпочтения безопасного отсека: отношение числа заходов в "безопасный" отсек к числу заходов в "опасный" отсек) для этой группы составляло 3. В группе животных, которым вводился скополамин, наблюдался дефицит пространственной памяти, что заключалось в значительном снижении количества животных, оставшихся в центральном отсеке. Более того, животные не различали опасный и безопасный отсек и с одинаковой частотой посещали оба отсека (Кпво=1). Введение ноопепта приводило к увеличению количества животных, оставшихся в центральном отсеке, и к снижению количества крыс, зашедших в правый отсек, в сравнении с группой крыс, которым вводился скополамин (Кпбо=2)- В целом, отмечено положительное влияние ноопепта на пространственный компонент памяти в сравнении с группой активного контроля - которым, вводился скополамин.

.введение препарогов

12343 12348

Предъявление (тссгарозакяе через 24ч.) Предъявление (теслфовгяие через 10 дней)

12345 12345

Предьявдеяие (тестирование через 24ч.) Пр^дьяале звг (тествро вавяе через 10 дней)

*- р<0,05 от пассивного контроля, # - р<0,05 от активного контроля. Рис.2. Результаты прохождения теста ВЛ мышами ВАЬВ/с, подвергнутыми введению холиноблокаторов: скополамина - верхний график, мекамиламина-нижний.

* - р<0,01 относительно контроля при тестировании,** - р<0,01 относительно контроля при отставленном тестировании, & - р<0,0! относительно скополаминз при отставленном тестировании, # - р<0.05 относительно контроля при отставленном тестировании

Рис. 3. Влияние ноопепта на обучаемость и память, нарушенные скополамином (слева) и мекамиламином (справа).

Амнезия, вызванная мекамшамином. Как и в предыдущем эксперименте, было зарегистрировано эффективное обучение контрольной группы: через 24 часа ЛП (р<0,01) отличался от изначального. Крысы, которым вводился мекамиламин, обучались хуже животных контрольной группы. При тестировании через 24 часа и через 14 дней ЛП захода в темную камеру в этой группе был достоверно (р<0,01) ниже, чем в контрольной группе (Рис. 3). Таким образом, нарушение Н-холинергической передачи также вызывает нарушение воспроизведения УРПИ. Введение ноопепта вместе с мекамиламином практически полностью устраняет амнестический эффект блокатора Н-холинорцепторов уже через 24 часа (р<0,01). Через 14 дней ЛП захода в темный отсек у группы, получавшей мекамиламин и ноопепт, выше ЛП группы активного контроля (р<0,01). При тестировании большая часть контрольных животных оставалась в центральном, освещенном, отсеке, несколько крыс зашли в "безопасный" отсек, и наименьшая часть зашла в "опасный отсек". В группе животных, которым вводился мекамиламин, наблюдался дефицит пространственной памяти, что заключалось в снижении количества животных, оставшихся в центральном отсеке. Животные данной группы не различали опасный и безопасный отсек и с одинаковой частотой посещали оба отсека (Кпбо=')- Введение ноопепта приводило к достоверному увеличению

количества животных, оставшихся в центральном отсеке (р<0,05), но только к незначительному снижению количества крыс, зашедших в правый отсек, в сравнении с группой крыс, которым вводился мекамиламин (для данной группы опыт Кгшо=1,1)-Таким образом, в этих экспериментах ноопепт показал большую эффективность при устранении дефицита пространственного компонента памяти, вызванного введением скополамина, чем при устранении дефицита, вызванного введением мекамиламина.

В. Влияние ноопепта на способность к обучению в водном лабиринте, нарушенную длительным введением скополамина. Выбор данного типа холиноблокатора связан с тем фактом, что блокаторы М-холинорецепторов вызывают более выраженное нарушение пространственной памяти, чем блокаторы Н-холинорецепторов (МаиЬасЬ, 2003), что согласуется с данными, полученными в настоящей работе. Ранее на крысах была разработана модель, основанная на хроническом введении скополамина и показана способность ноопепта устранять амнестический эффект хронического введения скополамина в тесте УРПИ (Островская и др., 2001). В нашей работе была поставлена задача разработать модель длительного введения скополамина на других объектах-мышах линии ВАЬВ/с и использовать в качестве показателя когнитивного дефицита не УРПИ или УРАИ, как в предшествующих исследованиях, а тест водного лабиринта в качестве показателя пространственной ориентации и памяти - функции, наиболее рано поражаемой при БА. Было показано, что 14-ти дневное введение скополамина с последующей (7-ми дневной отменой) ведет к выраженному ухудшению способности животных к обучению в данном тесте (Рис. 4).

Непараметрический дисперсионный анализ АЫОУА показал что, в группе мышей с длительным введением скополамина отыскание платформы занимало достоверно больше времени, чем у мышей контрольной группы (р<0,01). Введение ноопепта после отмены скополамина практически полностью снимает негативное действие последнего на долговременную память.

12346 1 2 3 4 5

Предъявление (тестирование через 24ч.) Предъявление (тестирование через 10 дней)

* -р < 0.05 от пассивного контроля, # - р < 0.05 от активного контроля

Рис.4. ЛП отыскания скрытой платформы в тесте водного лабиринта (с предварительным ознакомлением) мышами линии ВАЬВ/с на модели длительного введения скополамина.

Ш. Изучение влияния нооиепта на моделях, основанных на введении диабетогенного токсина стрептозоцина.

При оценке метаболических эффектов стрептозоцина применяется два метода его введения: внутрибрюшинный (МамсЬсЯ е1 а1., 2003) и внутримозговой (Ье81ег-Со11 е! а1., 2006; ваНитс-Ре^ю й а1., 2007). В наших экспериментах для изучения поведенческих и нейрохимических эффектов ноопепта также применялись эти методы введения стрептозоцина. На первом этапе был изучен эффект стрептозоцина, введенного внутрибрюшинно.

А. Изучение эффекта ноопепта на мышах, подвергшихся внутуибрюшинному введению стоептозоиина.

Однократное внутрибрюшинное введение стрептозоцина в дозе 200 мг/кг ведет к выраженным нарушениям обучаемости в тесте водного лабиринта.

*- достоверное отличие от контрольной группы, р<0,05, # - достоверное отличие от группы мышей, которым вводили только скополамин, р<0,05

Рис.5. Отыскание скрытой платформы в тесте водного лабиринта (с предварительным ознакомлением).

Как показал непараметрический дисперсионный анализ АЖ)УА, в группе мышей с введением стрептозоцина отыскание платформы занимало достоверно больше времени, чем у мышей контрольной группы (р<0,01), (Рис.5). Введение ноопепта после стрептозоцина практически полностью снимает негативное действие токсина на пространственную ориентацию и долговременную память.

Известно, что при таком способе введения стрептозоцин разрушает р - клетки поджелудочной железы, что проявляется в развитие гипергликемии (8гкиёе№, 2001). В наших экспериментах у животных группы пассивного контроля уровень глюкозы составлял 5±0.5 ммоль/л, а у животных, которым внутрибрюшинно вводился стрептозоцин, уровень сахара возрос до 26±2.1 ммоль/л. Поскольку стрептозоцин не способен проникать через ГЭБ, его негативное влияние на обучаемость при системном введении может быть связано хотя бы частично с повышением уровня глюкозы в крови. Для выявления избирательных центральных эффектов стрептозоцина был применен метод его введения в желудочки мозга.

Б. Оценка эффекта ноопепта после внутрижелудочкового введения стрептозоиина. Введение стрептозоцина в желудочки мозга крыс приводило к отчетливому амнестическому эффекту в тесте УРПИ: если в группе пассивного контроля латентный период захода в темный отсек составлял 128,6 ±18,9, введение стрептозоцина приводило к снижению латентного периода до 55,6±15,0 сек. У крыс, которым вводился стрептозоцин и ноопепт, латентный период захода в темный отсек повышался практически до контрольного уровня (108,6± 17,6 сек). Уровень глюкозы в крови крыс после введения стрептозоцина не повышался и составлял 5±0,5 ммоль/л.

В. Изучение метаболических эффектов стрептозоиина, вводимого в желудочки мозга; оценка эффектов ноопепта

а. Дефицит нейротрофических Факторов. Показано что, через 14 дней после введения стрептозоцина наблюдается снижение ростовых факторов в гиппокампе, экспрессия ЫйИ понижалась на 16±5%, а экспрессия ЕШ№ на 12±4% (рис 6). При этом уровень ростовых факторов в коре больших полушарий оставался практически неизменным. Тот факт, что снижение экспрессии генов нейротрофических факторов под влиянием стрептозоцина выражено в гиппокампе, находится в полном соответствии с представлениями о значении снижения синтеза нейротрофинов в гиппокампе как фактора, который возникает уже при развитии МКН, предшествующей наступлению БА, и нарастает по мере ее прогрессирования. Введение ноопепта позволило сохранить нативный уровень экспрессии гена ВО№. Уровень экспрессии гена ИйР оказался даже выше контрольного на 32±7%.

* -р < 0.05 от пассивного контроля, # - р < 0.05 от активного контроля Рис. 6. Ноопепт устраняет дефицит нейротрофических факторов в гиппокампе, вызванный введением стрептозоцина в желудочки мозга

Для проверки сравнительной чувствительности коры больших полушарий и гиппокампа к ноопепту была поставлена дополнительная серия экспериментов, в которой изучалось влияние ноопепта на экспрессию обоих нейротрофических факторов у интактных животных. Было показано, что при введении ноопепта интактным животным экспрессия обоих нейртрофических факторов повышалась в гиппокампе, но практически не изменялась в коре больших полушарий.

б. Оксидативный стресс. Важным аспектом БА является гибель нейронов из-за высокого уровня в тканях мозга активных форм кислорода и других свободнорадикальных молекул (Roberson and Mucke, 2006). В полном соответствии с литературными данными в нашем эксперименте через 28 дней после введения стрептозоцина отмечалось приблизительно двукратное возрастание содержания МДА в тканях мозга. У крыс, которым вводился ноопепт, уровень МДА был близок к контрольным показателям (Рис.7).

* -р < 0.05 от пассивного контроля, # - р < 0.05 от активного контроля

Рис. 7. Ноопепт устраняет активацию перекисного окисления, вызванную

стрептозоцином.

Таким образом, ноопепт препятствовует развитию оксидативного стресса, вызванного введением стрептозоцина в желудочки мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проводилось нейрофармакологическое изучение оригинального ноотропного и нейропротекгнвного дипептида ноопепт на 3-х типах моделей спорадической формы БА: введение АВ 25-35 в ядра Мейнерта, моделирование холинергического дефицита, введение диабетогенного токсина стрептозоцина. Для оценки эффекта ноопепта использовался следующий набор тестов: классический тест УРПИ, 3-х камерная модификация теста УРПИ, тест водного лабиринта и методы исследования биохимических параметров тканей мозга. На модели с введением Ар 25-35 показана способность ноопепта противодействовать развитию когнитивных нарушений (тест УРПИ), вызванных действием этого амилоидного пептида. Обнаружена высокая эффективность препарата как в условиях профилактического введения, так и при введении на фоне развившейся патологии. Установлена способность ноопепта устранять нарушения пространственной памяти, вызванные введением блокатора м-холинорецепторов скополамина, и блокатора н-холинорецепторов мекамиламина. Как в тесте водного лабиринта, так и на трехкамерной версии УРПИ показано, что нарушения пространственной памяти более выражены на фоне блокады мускариновых, чем никотиновых холинорецепторов. На разработанной модели длительного холинергического дефицита, вызванного введением скополамйна мышам линии ВАЬВ/с, продемонстрирован когнитивный дефицит в тесте водного лабиринта и выявлена способность ноопепта устранять его. Показано, что при введении диабетогенного токсина стрептозоцина в желудочки мозга крыс отмечается нарушение долговременной памяти, снижение экспрессии генов нейротрофических факторов ВВ№ и N0? и накопление МДА в тканях мозга. Ноопепт восстанавливает нарушенную память, предотвращает развитие окислительного стресса и усиливает экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе как на фоне действия диабетогенного токсина, так и у интактных животных.

Таким образом, показано, что ноотропный и нейропротективный препарат ноопепт противодействует развитию целого ряда патогенных процессов, характерных для МКН и БА. Полученные данные могут служить предпосылкой для проведения клинической оценки препарата с целью предотвращения перехода МКН в начальные и умеренные формы болезни Альцгеймера.

выводы.

1. Выявлена способность Ноопепта противодействовать амнестическому эффекту нейротоксического гидрофобного С-терминального фрагмента Р- амилоида , АР 25-35, вводимого в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта. Показано, что нормализующий эффект Ноопепта в отношении памяти проявляется как в условиях профилактического введения препарата, так и при введении на фоне развившейся патологии.

2. Установлено, что мыши линии ВАЬВ/с характеризуются худшей долговременной памятью, чем мыши С57ВЪ/61 и что этот дефицит устраняется введением ноопепта. В опытах на мышах и крысах показано, что нарушение пространственной ориентации и долговременной памяти более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов.

3. На разработанной модели хронического холинергического дефицита у мышей Ва1Ь/С, вызванного 14-ти дневным введением скополамина (с последующей отменой в течение 7 дней) продемонстрировано нарушение пространственной ориентации и долговременной памяти в тесте водного лабиринта. Ноопепт полностью устраняет вызываемые скополамином нарушения пространственной ориентации и памяти.

4. Когнитивный дефицит, вызванный системным введением диабетогенного токсина стрептозоцина, протекает на фоне гипергликемии. Нарушение памяти, развивающееся при его введении в боковые желудочки мозга, не сопровождается повышением содержания глюкозы в крови, что свидетельствует о центральном избирательном механизме возникающей при этом патологии. Ноопепт устраняет дефицит памяти в тесте УРПИ, вызванный введением стрептозоцина.

5. Стрептозоцин при внутрижелудочковом введении снижает экспрессию генов ВБОТ и N0? и вызывает накопление малонового диальдегида в тканях мозга. Ноопепт предотвращает окислительный стресс, вызванный стрептозоцином, и усиливает экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе.

6. Полученные данные могут служить предпосылкой для проведения клинических исследований ноопепта в качестве средства многофакторной терапии, предотвращающего переход мягких когнитивных нарушений (МКН) в начальные и умеренные формы болезни Альцгеймера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бельник (Цаплнна), А.П. Применение трехкамерной модификации модели УРПИ для оценки действия ноотропных и анксиолитических препаратов [Текст] / А,П. Бельник, К.С. Ус // Сборник тезисов научной конференции "Физиология и медицина", Санкт-Петербург, 21-24 апреля 2005 г., С. 13.

2. Belnik (Tsaplina), А.Р. The effect of dipeptidal cognition enhancer noopept (GVS-111) on the hippocampus-dependent behavior of mice of different strains. [Текст] / A.P.Belnik, I.I. Poletaeva, R.U. Ostrovskaya // Abstr. of the International Symposium "Hippocampus and Memory", Pushchino, Russia. - 14-17 may 2006, - P. 60.

3. Бельник (Цаплипа), А.П. Дипешвдный препарат ноопепт устраняет вызванный скополамином дефицит пространственной памяти у мышей BALB/C [Текст] / А.П. Бельник, Р.У. Островская, И.И. Полетаева // Бюллетень эксперимент, биологии и медицины. - 2007.- Т. 143, № 4. - С. 407-410.

4. Иноземцев, А.Н. Изучение условного рефлекса пассивного избегания в модифицированной трехкамерной установке [Текст] / А.Н. Иноземцев, А.П. Бельник (Цаплина), Р.У. Островская. // Экспер. и клин, фармакол. - 2007.-Т. 70, №2.-С. 67-69.

5. Бельник (Цаплина), А.П. Поведение мышей разных линий - модификация под влиянием ноопепта [Текст] / А.П. Бельник, Р.У. Островская, И.И. Полетаева // Журнал Высшей нервной деятельности. - 2007. - Т. 57, №5. - С. 597-601.

6. Бельник (Цаплина), А.П. Зависимые от генотипа особенности поведения мышей в когнитивных тестах; влияние ноопепта [Текст] / А.П. Бельник, Р.У.Островская, И.И. Полетаева // Журнал Высшей нервной деятельности. - 2007.- Т. 57, N 6 .- С. 701-724

7. Бельник (Цаплина), А.П. Оригинальный дипептидный препарат, ноопепт, устраняет нарушения памяти, вызванные у крыс блокаторами н- и м -холинорецепторов [Текст] / А.П. Бельник, К.С.Ус, Р.У.Островская, ТЛ.Гудашева, ТЛ. Воронина Н Материалы III съезда фармакологов России «Фармакология-практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г.// Психофармакология и биологическая наркология. - 2007 г. - Т.7. - С. 1609-1610.

8. Островская, Р.У. Эффективность препарата «Ноопепт» при экспериментальной модели болезни Альцгеймера (когнитивный дефицит, вызванный введением р-амилоида 25-35 в базальные ядра Мейнерта крыс) [Текст] / Р.У. Островская, А.П. Бельник (Цаплина), З.И. Сторожева // Бюллетень эксп. биологии и медицины. -2008.-Т. 146,№7. -С.84-88.

9. Радионова, КС. Оригинальный ноотропный препарат «Ноопепт» устраняет дефицит памяти, вызванный блокадой М- и Н-холинорецепторов у 1фыс [Текст] / К.С, Радионова, АЛ. Бельник (Цаплина), Р.У. Островская // Бюллетень эксп. биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 7.- С. 65-68.

Ю.Островская, Р.У. Ноопепт стимулирует экспрессию NGF и BDNF в гиппокампе крысы [Текст] / Р.У. Островская, Т.А. Гудашева, А.П. Цаплина, Ю В Вахитова, М Х.Салимгареева, Р. С. Ямиданов, С.Б. Середенин // Бюллетень эксп. биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 9. - С. 309-312.

П.Островская, Р.У. Оригинальный дипептидный препарат ноопепт: механизм действия и перспективы применения при когнитивном дефиците [Текст] / Р.У. Островская, А.П.Цаплина, Т.А. Гудашева // Материалы IV Российской научно-практической конференции «Болезнь Альцгеймера и когнитивные нарушения в пожилом возрасте: достижения в нейробиологии и терапии» Москва, 4-5 июня 2008 г. - С. 18-29

12. Островская, Р.У. Эффективность ноотропного и нейропротективного дипептида ноопепт на стрептозоциновой модели болезни Альцгеймера у крыс [Текст] / Р.У. Островская, А.П.Цаплина, Ю.В. Вахитова, МХСалимгареева, P.C. Ямиданов. // Экспер. и клин, фармакол. -2009.-, принята к печати.

Список сокращений:

БА - болезнь Альцгеймера, УРПИ - условная реакция пассивного избегания, МКН-мяпсие когнитивные нарушения, АВП-аргинин-вазопрессин, BJI- водный лабиринт Морриса, ЛП- латентный период, Кпбо- коэффициент предпочтения безопасного отсека, NGF- nerve growth factor, фактор роста нервов, BDNF-brain-derived neurotrophic factor, нейротрофический фактор головного мозга, МДА-малоновый диальдегид, п/к -подкожно, в/бр внутрибрюшинно.

Для заметок

Заказ № 117. Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность проблемы. Спорадическая болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее значимой причиной старческого слабоумия. Каждые 5 лет после 65-летнего возраста частота заболевания БА удваивается. В мире каждый год в ряды больных БА вливается новые 4.6 миллионов человек, а число больных, одномоментно страдающих БА в мире по данным современных статистик достигает 26 млн. человек (Ferri et al., 2005). Общая численность больных, страдающих БА, в России приближается к 1,4 млн. человек.

Болезнь Альцгеймера представляет собой сложный комплекс различных патогенных процессов, основными из которых являются накопление амилоидных бляшек и нейрофибрил, дефицит холинергической передачи, гибель нейронов, снижение количества ростовых факторов, нарушение когнитивных функций. Данные процессы тесно взаимосвязаны, развитие одного из них активизирует остальные. Совокупность патогенетических факторов БА характеризуется отношениями "замкнутого круга", в котором все факторы связаны закономерностями прямой и обратной связи (Longo et al, 2004; Гаврилова, 2004; Shelat et al., 2008). В связи с этим терапевтические воздействия на течение болезни Альцгеймера должны быть направлены на поиск возможностей разорвать этот замкнутый круг в максимальном количестве звеньев. Оптимальный сценарий терапии должен состоять в применении препаратов, влияющих одновременно на несколько основных патогенетических звеньев заболевания. Другим важным требованием к этим препаратам является отсутствие токсических эффектов при длительном превентивном применении. Это требование обусловлено необходимостью начала терапии на самых ранних этапах аккумуляции бета-амилоида, когда клинические проявления БА еще не диагностируются — на фазе мягкого когнитивного нарушения (МКН), представляющей собой промежуточную 4 стадию между "успешным" старением и деменцией, и обуславливающей повышенный риск развития деменции в течение ближайших 3-5 лет. Таким разнонаправленным действием в сочетании с низкой токсичностью могут обладать пептиды, как многокомпонентные регуляторы эндогенной природы. Известно, что практическое применение пептидов в качестве лекарственных препаратов затруднено ввиду их низкой биологической устойчивости. В качестве рациональных подходов к преодолению этих затруднений описаны такие приемы как использование активных фрагментов сложных пептидов, модификация их структуры, например введением D-изомеров аминокислот, стабилизирующих группировок (Каменский и др., 1989; Ашмарин и др. 1997; Мясоедов и др., 1999; Гривенников, 2006).

Оригинальный подход, развиваемый в НИИ Фармакологии РАМН в течение более чем двух десятилетий, может быть охарактеризован как дизайн коротких пептидов на основании имитации структуры непептидного нейротропного средства (Гудашева и др., 1985). В случае поиска веществ, улучшающих когнитивные функции, в качестве непептидного прототипа выбран стандартный ноотроп, пирацетам, а в качестве пептидноговазопрессин (АВП), точнее его основной метаболит, АВП 4-9. Из синтезированной на основании этого подхода серии производных ацилпролил-глицинов (Gudasheva et al., 1996, Seredenin et al 1995) был отобран для более подробного изучения этиловый эфир КГ-фенилацетил-Ь-пролилглицина соединение ГВС-111, ноопепт). Детальное экспериментальное изучение этого соединения выявило наличие у него совокупности ноотропных и нейропротективных эффектов (Ostrovskaya et al., 1994; Островская и др.,

2002). Последующее клиническое изучение Ноопепта, выполненное в рамках

I, II и III фаз, на больных с мягкими когнитивными нарушениями цереброваскулярного и посттравматического генеза, показало, что препарат оказывает отчетливое терапевтическое действие в отношении основных проявлений психоорганического синдрома, ослабляя когнитивные нарушения и оказывая анксиолитическое действие (Бочкарев и др., 2008; Незнамов и др., 5

2007; Аведисова и др., 2007). Учитывая также тот факт, что ноопепт обладает многокомпонентным нейропротективным действием и усиливает выработку антител к Р-амилоиду (Ostrovskaya et al, 2007), представляет интерес изучить его эффект при более тяжелых формах когнитивной недостаточности, в частности при БА. Для оценки перспективности этих исследований необходимо исследовать эффект препарата на экспериментальных моделях БА. Известно, что моделирование спорадической БА осуществляется с помощью хирургических и инъекционных моделей (Van Dam, 2006), при том последняя группа является наиболее информативной (Степаничев и др., 2002).

Целью данного исследования являлось комплексное изучение поведенческих и нейрохимических эффектов ноопепта на следующих типах моделей БА: введение В-амиломдного пептида 25-35 в ядра Мейнерта, моделирование холинергического дефицита, введение диабетогенного токсина стрептозоцина.

Основные задачи исследования.

1. Изучение эффекта ноопепта при нарушениях когнитивных функций, вызванных введением амилоидного пептида 25-35 в ядра Мейнерта.

2. Изучение влияния ноопепта на обучаемость и память животных в условиях холинергического дефицита различного характера.

3. Сравнение эффектов диабетогенного токсина стрептозоцина при системном и внутримозговом введении.

4. Изучение когнитивных эффектов ноопепта на отобранной модели воздействия стрептозоцина.

5. Оценка влияния ноопепта на экспрессию нейротрофических факторов NGF и BDNF в коре головного мозга и гиппокампе у интактных животных и после воздействия стрептозоцина.

6. Исследование влияния ноопепта на выраженность оксидативного стресса в условиях стрептозоциновой модели.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что ноопепт ослабляет амнестическое действие амилоида 25-35, введенного в ядра Мейнерта. Этот эффект проявляется как в условиях профилактического введения, так и при введении на фоне развившейся патологии. В последнем случае он продемонстрирован в условиях введения препарата, начатого спустя 15 дней после нанесения повреждающего воздействия, что свидетельствует о большом "терапевтическом окне" действия препарата на этой модели. При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии BALB/c и C57BL/6J показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта. На двух моделях пространственной ориентации и памяти (водный лабиринт и трехкамерная версия УРПИ) показано, что нарушение этих процессов более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов. Разработана модель хронического холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина (с последующей отменой) мышам линии BALB/c. Выполнено сравнительно изучение эффекта диабетогенного токсина стрептозоцина в условиях его системного (внутрибрюшинного) введения и введения в желудочки мозга. Поскольку при системном введения стрептозоцина развивается гипергликемия, а при его введении в желудочки мозга сохраняется нормальный уровень глюкозы в крови, модель внутрижелудочкого введения является предпочтительной. Показано, что стрептозоцин вызывает снижение экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе и накопление продукта перекисного окисления липидов - МДА. Установлено, что ноопепт ослабляет изученные метаболические эффекты стрептозоцина и сопутствующий поведенческий дефицит, проявляющийся в отношении долговременной памяти.

Научно-практическая значимость. Предложенные экспериментальные подходы расширяют методологию изучения веществ эффективных для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний. Совокупность 7 выявленных эффектов ноопепта, направленных на некоторые базовые механизмы БА, свидетельствует о целесообразности изучения этого препарата у больных Б А (начальные и умеренные формы).

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ.

1. Выявлена способность Ноопепта противодействовать амнестическому эффекту нейротоксического гидрофобного С-терминального фрагмента (3- амилоида , А(3 25-35, вводимого в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта. Показано, что нормализующий эффект Ноопепта в отношении памяти проявляется как в условиях профилактического введения препарата, так и при введении на фоне развившейся патологии.

2. Установлено, что мыши линии BALB/c характеризуются худшей долговременной памятью, чем мыши C57BL/6J и что этот дефицит устраняется введением ноопепта. В опытах на мышах и крысах показано, что нарушение пространственной ориентации и долговременной памяти более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов.

3. На разработанной модели хронического холинергического дефицита у мышей Balb/C, вызванного 14-ти дневным введением скополамина (с последующей отменой в течение 7 дней) продемонстрировано нарушение пространственной ориентации и долговременной памяти в тесте водного лабиринта. Ноопепт полностью устраняет вызываемые скополамином нарушения пространственной ориентации и памяти.

4. Когнитивный дефицит, вызванный системным введением диабетогенного токсина стрептозоцина, протекает на фоне гипергликемии. Нарушение памяти, развивающееся при его введении в боковые желудочки мозга, не сопровождается повышением содержания глюкозы в крови, что свидетельствует о центральном избирательном механизме возникающей при этом патологии. Ноопепт устраняет дефицит памяти в тесте УРПИ, вызванный введением стрептозоцина.

5. Стрептозоцин при внутрижелудочковом введении снижает экспрессию генов BDNF и NGF и вызывает накопление малонового диальдегида в тканях мозга. Ноопепт предотвращает окислительный стресс, вызванный стрептозоцином, и усиливает экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе.

6. Полученные данные могут служить предпосылкой для проведения клинических исследований ноопепта в качестве средства многофакторной терапии, предотвращающего переход мягких когнитивных нарушений (МКН) в начальные и умеренные формы болезни Альцгеймера.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе в соответсвии с поставленной целью было выполнено изучение эффекта ноопепта на моделях БА и выявлены следующие свойства данного препарата:

• способность оказывать противодействие негативным эффектам (3-амилоида 25-35, введенного в ядра Мейнерта, в отношении обучаемости и памяти,

• возможность устранять негативные эффекты холиноблокаторов на когнитивные функции,

• способность устранять амнестические эффекты стрептозоцина (введенного в желудочки мозга),

• противодействовие снижению экспрессии нейротрофических факторов, вызванных стрептозоцином,

•способность предотвращать развитие окислительного стресса, вызванного стрептозоцином.

Представляет интерес проанализировать характер патологии, воспроизводимой данными моделями и механизмы действия ноопепта в этих условиях.

Наиболее характерным признаком БА является образование в тканях мозга амилоидных бляшек (Harkany et al., 1998; Yamaguchi et al., 1998; Citron,

2004). Известно, что основным компонентом таких бляшек при БА является амилоид (1-42) (Whitson et al., 1990). Его нейротоксические эффекты воспроизводятся введением гидрофобного С-терминального фрагмента, рамилоид 25-35 (Liao et al., 2007). Показано, что введение Ар 25-35 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта вызывает распространенные дегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе, проявляющиеся в различных формах когнитивных дефицитов (Giovanelli et al., 1995; Harkany et al., 1998). Выполненное нами исследование подтвердило

97 описанное ранее нарушение воспроизведения УРПИ в условиях билатерального введения Р- амилоида 25-35 в базальные ядра Мейнерта у крыс. В предыдущих работах (Giovanelli et al., 1995; Harkany et al., 1998) было показано, что нейродегенеративные изменения в ядре Мейнерта, фронтальной коре и гиппокампе начинают проявляться через 1 неделю после введения р- амилоида 25-35 и длятся еще до 4-х недель. Этим морфологическим данным полностью соответствуют результаты наших поведенческих экспериментов, показавших, что при обучении через 4 недели после введения Р- амилоида имеется резко выраженная амнезия в тесте УРПИ. Важным результатом проведенных исследований было обнаружение высокой эффективности ноопепта в условиях его профилактического введения. При этом следует отметить длительное "последействие" нормализующего эффекта ноопепта: интервал между окончанием введения препарата и тестированием сохранения памятного следа в тесте УРПИ составляет 24 дня. Несколько менее выраженный, но достаточно четкий нормализующий эффект ноопепта отмечен и в условиях лечебного введения ноопепта, начатого спустя 15 дней после нанесения повреждающего воздействия. Полученные факты свидетельствуют о том, что для действия ноопепта на данной модели характерна большая широта "терапевтического окна".

Показано, что при введении Р- амилоида 25-35 в гиганто-клеточные базальные ядра Мейнерта происходит уменьшение количества холинергических нейронов и снижается высвобождение ацетилхолина нейронами префронтальной коры и гиппокампа (Giovanelli et al., 1995; Harkany et al., 1998). В работах Сторожевой З.И. и соавторов было показано, что введение р- амилоида в ядра Мейнерта ведет к угнетению активности холинацетилтранферазы (Storozheva et al., 2008). Ранее в экспериментах на изолированных нейронах виноградной улитки показано, что ноопепт в широком диапазоне концентраций (10"6 — 10"11 М) усиливает реакцию на микроионтофоретическое подведение ацетилхолина к нейрону. Поскольку ноопепт не влияет на активность ацетилхолинэстеразы, было высказано предположене, что его холино-позитивный эффект реализуется на постсинаптическом уровне. (Островская и др., 2002). Это действие препарата может быть одной из причин эффективности этого дипептида в отношении мнестического дефицита, вызванного введением р амилоида 25-35. В реализации этого эффекта, возможно, играет роль также и описанная ранее (Ostrovskaya et al., 2007) способность ноопепта усиливать выработку антител к Р- амилоида 25-35.

Одним из важнейших функциональных расстройств, наблюдаемых при МКН и БА, является поражение холинергической системы мозга, которое приводит к развитию нарушения пространственной ориентации и памяти (Coyle et al., 1983; Lawrence and Sahakian, 1998; Tong and Hamel, 1999). Важно отметить, что выраженность этих нарушений коррелирует с тяжестью заболевания (Ritchie et al., 2004). В связи с наличием электрофизиологических доказательств холинопозитивного эффекта ноопепта представлялось целесообразным изучить его действие в отношении поведенческих нарушений, возникающих при дефиците холинергической системы различной степени выраженности.

Для оценки влияния препарата на слабовыраженные формы холинергической недостаточности было выполнено сравнение пространственной ориентации и памяти в тесте водного лабиринта Мориса у двух линий мышей (BALB/c и C57BL/6J) с различной активностью холинергической системы. Известно, что мыши линии BALB/c характеризуются меньшим содержанием ацетилхолина в тканях мозга (в частности в коре больших полушарий и гиппокампе), чем мыши линии C57BL/6J (Ingram and Corfman, 1980). При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии BALB/c и C57BL/6J показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта.

Но поскольку исследуемые линии мышей отличаются не только по развитию холинергической системы, но также и по большому числу признаков, затрагивающих мембранные рецепторы, гены, кодирующие белки, отвечающие за обмен различных медиаторов, и гены белков, участвующих в формировании мозга (Ingram and Corfman, 1980), для более избирательного моделирования нарушения холинергической системы были проведены эксперименты с острой и хронической блокадой холинергических рецепторов. В экспериментах на мышах использовалась линия BALB/c, исходя из данных о большей выраженности эффекта нопепта у мышей этой линии в экспериментах, проведенных в водном лабиринте. Было показано, что ноопепт способен полностью устранять дефицит пространственной памяти, вызванный введением как блокатора М-холинорецепторов, скополамина, так и блокатора Н-холинорецепторов, мекамиламина. Следует подчеркнуть, что в данной серии экспериментов скополамин в большей степени, чем мекамиламин, повлиял на пространственный компонент обучения. Полученные данные о более выраженном влиянии М-холиноблокаторов на пространственную память согласуются с данными других исследователей (Maubach, 2003).

Близкие данные были получены при изучении эффектов Н- и М-холиноблокаторов мекамиламина и скополамина крысам, тестируемым в 3-х камерной модели УРПИ, позволяющей оценить пространственный компонент памяти животного. Показано, что введение обоих холиноблокаторов привело к существенному нарушению долговременной памяти.

Таким образом, при введении крысам блокаторов М- и Н-холинорецепторов наблюдается сходный эффект, но препарат ноопепт был более эффективен в отношении нарушения пространственного компонента памяти, вызванного скополамином, чем мекамиламином.

Ранее была разработана модель, основанная на хроническом введении скополамина крысам (Островская и др., 2001). В данной работе была

100 поставлена задача разработки модели хронического холинергического дефицита на других объектах-мышах. Хроническое введение скополамина проводилось в специально разработанном нами режиме: 14-ти дневное введение с последующей 7-дневной отменой вызывало у мышей отчетливое амнестическое действие, которое было нами выявлено в тесте водного лабиринта. Ранее в опытах на крысах было показано, что непосредственно после окончания длительного введения скополамина имеет место не ухудшение, а даже улучшение воспроизведения памятного следа. Предполагается, что вследствие длительной блокады холинергических рецепторов происходит включение механизмов обратной связи: развивается начальное повышение плотности и аффинности холинорецепторов (Loullis et al 1983). Развитие амнезии через несколько дней после отмены скополамина рассматривается как следствие холинергического дефицита в результате ускоренного связывания наличного ацетилхолина. Амнезия, вызванная длительным воздействием скополамина, рассматривается как модель ускоренного старения, а продемонстрированная эффективность холинопозитивных веществ (амиридин и такрин) (Буров и др., 1991), подтверждает информативность данной модели. В выполненных ранее исследованиях в качестве теста для выявления когнитивного дефицита использовался тест УРПИ (Буров и др., 1991; Островская и др., 2002) и тест УРАИ (Гарибова и др., 2005). Нами впервые применялся тест водного лабиринта в качестве показателя состояния когнитивных функций в условиях хронической блокады мускаринового типа холинорецепторов. Результаты наших экспериментов не только подтвердили возможность моделирования аналогичного холинергического дефицита на мышах, но и демонстрировали высокую эффективность ноопепта на этой модели. Таким образом, ноопепт способен противодействовать развитию нарушения когнитивных функций при различных нарушениях холинергической системы, в том числе и при нарушениях, носящих длительный характер, которые могут рассматриваться как модель БА.

В литературе описаны попытки лечения БА с помощью холинопозитивных препаратов. Как правило, для этого применялись селективные ингибиторы ацетилхолиноэстеразы, которые замедляют деактивацию ацетилхолина после его выхода в синаптическую щель (Roberson and Mucke, 2006). Позитивное действие на холинергическую систему ноопепта не исчерпывается изменением чувствительности нейронов к ацетилхолину. Основной причиной дисфункции холинергической системы при БА является не снижение синтеза ацетилхолина, а гибель нейронов данной системы. В связи с этим особое значение имеет наличие у ноопепта выраженных нейропротекторных свойств (Chen et al., 2000; Островская и др., 2002; Pealsman et al., 2003).

Деградация нейронов холинергической системы тесно связана с еще одним патогенетическим механизмом БА - снижением количества в тканях мозга, в особенности гиппокампа, нейротрофических факторов (Siegel and Chauhan, 2000). Транспорт таких важных факторов, как NGF и BDNF осуществляется по нейронам холинергической системы, поэтому деградация этих нейронов влечет за собой развитие дефицита ростовых факторов. С другой стороны, недостаток ростовых факторов провоцирует гибель нейронов холинергической системы (Tuszynski., 2002; Longo et al., 2004). Таким образом, недостаток ростовых факторов приводит к процессу гибели нейронов, развивающемуся по принципу положительной обратной связи.

В настоящее время имеются данные о способности ноотропного препарата пептидной природы семакса усиливать экспрессию двух основных нейроторфических факторов NGF и BDNF в гиппокампе и, в меньшей степени, в коре больших полушарий (Shadrina et al., 2001). Учитывая эти данные, а также исходя из выявленной способности ноопепта (Чепкова и др., 1995) облегчать длительную. гиппокампальную потенциацию электрофизиологический эквивалент памяти (Lynch, 2004), представляло интерес изучить возможное влияние ноопепта на экспрессию этих факторов.

Принимая во внимание тот факт, что как ноотропные, так и

102 нейропротективные эффекты реализуются в условиях длительного введения препаратов, специальный интерес представляло изучение этого эффекта ноопепта в условиях однократного и длительного введения.

Выполненные эксперименты показали, что однократное введение ноопепта способно существенно стимулировать выработку обоих нейроторфических факторов в гиппокампе уже через 45 минут после введения. Экспрессия этих факторов в коре больших полушарий так же повысилась, но незначительно. В условиях хронического введения это повышение синтеза факторов в гиппокампе сохранялось, притом усиление экспрессии мРНК NGF выражено заметнее, чем BDNF.

Имеются данные о том, что дефицит нейротрофических факторов именно в гиппокампе играет ведущую роль в развитии когнитивной недостаточности и что признаки гипотрофии гиппокампа имеют место не только при развитой БА, но уже и на этапе мягких когнитивных расстройств, предшествующих переходу в это заболевание (Peterson et al., 2001). Исходя из этого, можно предположить у данного препарата способность поддерживать нормальный уровень нейротрофических факторов при МКН, и снижать дефицит данных факторов при БА, замедляя, таким образом, необратимые процессы деградации нейронов. Однако для более корректного исследования способности препарата повышать синтез нейротрофических факторов необходимо оценить его действие не на интактных животных, а на животных с поражением ЦНС, сходным с БА.

Обе описанные выше модели БА обладают одним важным недостатком

- они моделируют только одно определенное проявление заболевания, токсическое действие р-амилоида и холинергический дефицит соответственно. Известно, что при таких многофакторных заболеваниях, каким является БА, все патогенные процессы тесно взаимосвязаны. Поэтому для разработки и тестирования препаратов, которые могут эффективно замедлять прогрессирование патологии при этом заболевании, необходимо использование экспериментальных моделей, наиболее полно

103 воспроизводящих комплекс компонентов его патогенетических механизмов. В последнее время внимание исследователей начала привлекать модель спорадической БА, основанная на введении диабетогенного токсина стрептозоцина (2-Дезокси-2-(((метилнитрозоамин)карбонил)амино)-Бглюкопираноза).

При внутриже луд очковом введение стрептозоцина наблюдается:

• Образование амилоидных бляшек (Sharma et al., 2002; Lester-Coll et al. 2006),

• Накопление нейрофибрилл (Sharma et al., 2002),

• Гибель нейронов и клеток микроглии (Shoham et al., 2003),

• Нарушение сигнального пути нейротрофических факторов (Salkovic-Petrisic et al., 2007),

• Развитие оксидативного стресса (Lester-Coll et al. 2006),

• Выраженная деградация холинергической системы мозга (Blokland and Jolles, 1993; Sonkusare et al., 2005),

• Нарушение когнитивных способностей, в особенности пространственной памяти (Sonkusare et al., 2005).

Идея использования данного вещества для моделирования БА возникла на основании представлений о спорадической болезни Альцгеймера, как о заболевании, этиологически сходном с сахарным диабетом (Lester-Coll et al., 2006). Этими авторами сформулировано понятие о спорадической БА, как о диабете 3-го, мозгового, типа.

Приступая к разработке стрептозоциновой модели БА, мы исходили из того, что в литературе описано два типа воздействия стрептозоцина -системное введение (Manschot et al., 2003) и введение в желудочки мозга (Sharma et al., 2002; Lester-Coll et al., 2006; Salkovic-Petrisic et al., 2007).

Наши исследования были начаты с использования модели с внутрибрюшным введением стрептозоцина (200 мг/кг, однократно). В тесте водного лабиринта было показано, что в этом случае происходит выраженное нарушение пространственной памяти у мышей. При этом введение ноопепта практически полностью нивелировало негативное действие стрептозоцина на пространственную память. После введения препарата у испытуемых животных отмечалось повышение уровня сахара (с 5±0.5 до 26±2.1 нмоль/мл), что согласуется с данными о диабетогенном действии стрептозоцина. При этом введение ноопепта не приводило к значимому снижению уровня глюкозы в крови. По всей видимости, ноопепт оказывает действие на когнитивные способности за счет воздействия непосредственно на процессы в тканях мозга, не связанных с изменением уровня глюкозы. Поскольку стрептозоцин при внутрибрюшинном введении не проникает через ГЭБ, для выявления эффектов, оказываемых препаратом на клетки мозга, был применен метод внутрижелудочкового введения препарата. Этот метод позволяет более точно воспроизводить комплекс биохимических изменений, происходящих в тканях мозга при БА (Lester-Coll et al., 2006; Salkovic-Petrisic et al., 2007).

Применяя метод введения стрептозоцина в желудочки мозга, мы показали, что выявленные изменения поведения и метаболизма мозговой ткани протекали на фоне нормального уровня сахара в крови (5,5 нмоль/мл). Это полностью соответствует представлениям о том, что стрептозоцин в условиях его внутрижелудочкового введения не оказывает системного влияния на функции поджелудочной железы и все эффекты этого воздействия реализуются на уровне головного мозга ЦНС. (Lester-Coll et al., 2006).

Используя метод УРПИ, мы показали, что введение стрептозоцина в желудочки мозга вызывает у крыс глубокие нарушения обучаемости и долговременной памяти при отставленном тестировании. В наших экспериментах введение крысам в желудочки мозга стрептозоцина приводило к снижению латентного периода захода в темный отсек, что свидетельствует об амнестическом эффекте этого токсина. У крыс,

105 подвергшихся действию стрептозоцина и леченых ноопептом, латентный период захода в темный отсек был близок к значениям контрольной группы.

Как указывалось ранее, среди большого количества метаболических нарушений, сближающих модель внутрижелудочкого введения стрептозоцина с БА, ведущую роль играют дефицит нейротрофических факторов и оксидативный стресс, обусловленный нарушением энергетического обмена. В связи с этим в задачу нашего исследования входило изучение влияния стрептозоцина на эти показатели мозгового метаболизма и выявление эффекта ноопепта на указанные нарушения. На первом этапе исследования было необходимо подобрать условия, при которых снижение экспрессии ростовых факторов наиболее выражено. В серии экспериментов, в которой определение проводилось через 4 недели после введения стрептозоцина в желудочки мозга, в тканях гиппокампа отмечалось некоторое повышение экспрессии нейротрофических факторов. В то же время в экспериментах, в которой забой крыс осуществлялся через две недели после введения стрептозоцина в желудочки мозга, наблюдается снижение по сравнению с контрольной группой, экспрессии ростовых факторов в гиппокампе. Полученные нами данные о фазовом характере изменения экспрессии нейротрофических факторов в условиях внтрижелудочкового введения стрептозоцина находятся в полном соответствии с данными, описанными в статье Hellweg et. al., 1994, в которой также отмечалось первоначальное снижение экспрессии, сменяющееся ее повышением спустя 3-4 недели после введения стрептозоцина.

В связи с преобладанием литературных данных о том, что уже на ранних фазах БА и даже в предшествующем ей периоде мягких когнитивных нарушений имеет место снижение скорости синтеза нейротрофических факторов в гиппокампе, дальнейшие эксперименты были выполнены на модели двухнедельной версии эксперимента. Как следует из рис. 28, в группе животных, которым через 14 дней после стрептозоцина вводился ноопепт, имело место усиление экспрессии NGF в гиппокампе. Что касается

106 экспрессии гена BDNF, его уровень доходил только до показателя пассивного контроля. Более низкая выраженность эффекта ноопепта в отношении экспрессии ростовых факторов в коре больших полушарий на стрептозоциновой модели согласуется с данными, полученными нами на интактных животных.

Таким образом, в данной работе показана способность ноопепта избирательно восстанавливать нарушенную стрептозоцином экспрессию генов NGF и BDNF в гиппокампе. В этих экспериментах был выявлен еще один очень интересный факт, данные изменения касались только гиппокампа, но не затрагивали кору головного мозга. Такое избирательное действие в отношении нейротрофических факторов гиппокампа хорошо согласуется с известными из литературы данными о том, что дефицит нейротрофических факторов уже на начальных фазах БА выражен именно в гиппокампе (Coyle et al., 1980).

Одним из важных механизмов гибели нейронов при БА, как и при синдроме Дауна является высокий уровень в тканях мозга активных форм кислорода и других свободнорадикальных молекул (Pratico, 2008). Ранее уже были получены данные о способности ноопепта противодействовать гибели клеток, обусловленной избытком свободных радикалов в культурах тканей, полученных от плодов с диагностированным синдромом Дауна (Pelsman et al., 2003).

Показано, что после введения стрептозоцина количество в тканях гиппокампа малонового диальдегида (МДА), образующегося при перекисном окислении липидов, существенно повышается. У животных, леченных ноопептом, содержание МДА было достоверно ниже группы активного контроля, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии ноопепта на стрептозоциновой модели БА.

Как следует из полученных результатов, ноопепт противодействует не только описанным метаболическим нарушениям, вызванным

107 стрептозоцином, но также и поведенчскому эффекту этого воздействия — амнестическому эффекту в тесте УРПИ и нарушению пространственной ориентации и памяти в тесте водного лабиринта. Анализируя возможные механизмы нормализующего действия ноопепта в условиях данной модели, можно полагать, что он развивается за счет следующих выявленных ранее свойств этой молекулы: ноопепт усиливает экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе (Островская и др., 2008), подавляет перекисное окисление (Pealsman 2003), проявляет холиносенсибилизирующее действие (Островская и др., 2001), ослабляет высвобождение глютамата (Ус и др., 2006), и, наконец, вызывает усиление выработки антител к бета-амилоиду (Ostrovskaya et al., 2007). Таким образом, анализ совокупности перечисленных эффектов ноопепта позволяет заключить, что действие этого дипептида направлено на ключевые механизмы данной модели спорадической болезни Альцгеймера.

В целом полученные в настоящей работе данные свидетельствуют об эффективности изучаемого ноотропного и нейропротективного дипептида, ноопепта, на выбранных моделях БА, которые воспроизводят основные патогенетические механизмы этого заболевания.

В настоящее время можно считать сформировавшимся представление о мягком когнитивном снижении, (МКН) как промежуточной стадии между нормальным старением и начальной фазой болезни Альцгеймера. Известно, что уже на этапе МКН имеет место развитие целого ряда патоморфологических изменений в мозговой ткани; часть из них отличается от картины БА чисто количественно (Belleville et al., 2007). Поскольку нельзя с полной уверенностью предсказать, перейдет ли данный больной из МКН в БА, в настоящее время применяется стратегия превентивиной терапии. Суть этой стратегии изображает рис.32, где нижняя кривая отражает прогрессирование заболевания при отсутствии лечения, верхняя кривая — это идеальный сценарий терапии (пока, к сожалению отсутствующий), а промежуточные кривые отражают различные темпы замедления прогрессирования с помощью правильно подобранной терапии. о с о

3 о с 3

Cure

Maintenance

Symptomatic arid neuroprotective benefit Slowing of disease progression Symptomatic benefit Disease progression

Time

Рис. 32 Варианты динамики БА при различных видах терапии (Debby Van Dam, 2006)

Существуют некоторые объективные тесты, которые повышают вероятность правильного предсказания и своевременного начала превентивной терапии, в частности из биохимических маркеров наиболее информативным является присутствие у больного аполипротеина АроЕ4+. Препарат ноопепт был исследован в центре психического здоровья РАМН на 20 больных в возрасте от 50 до 80 лет с синдромом мягких когнитивных нарушений. К окончанию 3-х месячного курса лечения ноопептом положительный амнестический эффект отмечался у 70 % больных, притом по 5-ти из 9-ти оценочных когнитивных шкал было достоверное улучшение. Кроме того было обнаружено, что клинический эффект ноопепта был выше у

9-ти больных, которые имели генотип АроЕ4+ ,то есть относились к группе высокого риска по развитию БА в ближайшие 3-5 лет (Рис. 33).

1 г 1 . Г г1г. 11-1 1 г1 г! 1 L. У

J-/ J ч® / У

J? о*'

Л.® 1я группа ■ 2я группа

Рис. 33 Сравнение терапевтической эффективности ноопепта по разности средних показателей между тестовыми оценками к моменту окончания и до начала терапии у пациентов с АроЕ 4(-) (1 группа), и АроЕ 4(+) (2 группа) генотипами (цитировано по статье Гавриловой и соавт., 2008).

При рассмотрении полученных результатов в совокупности с выявленными ранее свойствами ноопепта, а также данными о низкой токсичности этого дипептида, обусловленной его способностью метабол изироваться до эндогенных веществ (циклопролилглицин и фенилуксуная кислота), можно заключить, что эту дипептидную молекулу следует рассматривать как препарат с множественными мишенями воздействия, так называемый multitarget drug. Полученные данные могут служить предпосылкой для проведения более масштабных исследований с длительным превентивным применением препарата у людей, страдающих МКН, с целью предотвращения их перехода в начальные и умеренные формы болезни Альцгеймера.