Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизм цитогенетической нестабильности при описторхозной инвазии

ПК Я $

„ - Ч •}

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЙ СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи КУДРЯЩЕВ Дмитрии Петрович

МЕХАНИЗМЫ ЦИТ0ГЕНЕТИЧ2СК0Я НЕСТАБИЛЬНОСТИ ПРИ ОПИСТОРХОЗНОЙ ИНВАЗКК

14.00.16 - "Патологическая физиология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

тетс-1992

Работа выполнена на кафедре биологии и генетики МВФ и кафед ра патологической физиологии Сибирского государственного медицт ского университета.

Научные руководители: д.б.н., профёссор Н.Н. Ильинских д.м.н., профессор В.В. Новицкий

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г.П. Гарганеев,

доктор медицинских наук, с.н.с. В,П. Шахов

Ведущая организация: Тюменский государственный медицинский институт.

Защита состоится ЦК>Н# 1992. г. в № час.

на заседании специализированного совета Д 084.28.02 при Сибирской государственном медицинском университете ( 634050, г. Томск, Московский тракт, 2 ).

• С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Сибирского государственного медицинского университета ( г. Томск, пр-т Ленина, 107 ).

Автореферат разослан "22. » МсЗ Я_ 199\2 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор Т.С. ФЕДОРОВА

АГС"------:.

: :r. - 2 -

^ ]

^^ л\ ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

CCPTI-UHfi |

Актуальность проблемы, Описторхоз - заболевание, вызываемое гельыинтами, паразитирующими в желчных протоках печени человека и некоторых животных. Данное заболевание относится к гельминтозом с природной очаговостыэ, в силу чего в ряде областей России описторхоз приобрел значение краевой патологии. Очаги огисторхо-за локализуются в поймах рек. По данным B.C. Мясоедова (1974), насчигиБается б автономных очагов описторхоза - бассейны Немана, Южного Буга, Днепра, Дона, Волго-Камский и Обско-Нртшяский. Наиболее крупным из них является Обско-Мртшский бассейн, где пора-жеиность населения данным гельминтозом достигает 86,5 % (Гене-цинская Т.А., 1978). В настоящее время в стране насчитывается более 2 млн человек, пораженных описторхозом, эта величина имеет тенденцию к росту (Павлов Б.А., 1990).

Показано, что описторхоз вызывает значительные изменения в гепагобилиарной системе (Ткаченко Н.П., 1977), является предрас-полагащим фактором острого, подострого и особенно хронического панкреатита, рака поджелудочной келезы, большого дуоденального соска и печени Шгмн A.A., 1973; Белозеров Е.С. и соавт., 1981). Описторхозной инвазией обусловлена высокая частота поражения желудочно-кишечного тракта: хронический гастрит, преимущественно с пониженной секрецией, симптоматическая язва желудка и двенадцатиперстной кишки, килородуоденит, хронический колит (Озе-рецковская H.H. и соавт., 1971, 1972). Описторхозная инвазия оказывает существенное отрицательное влияние на защитно-приспособительные силы организма (Белозеров Е.С. и соавт., 1981) и сопровождается значительным увеличением числа клеток с цитогенетическими нарушениями (Ильинских H.H.,.1976, 1981).

В то же вреия в литературе практически отсутствуют работы, рассматривающие механизмы онтогенетических нарушений, индуцируемых описторхозной инвазией. Совершенно очевидно, что описторхи на могут оказывать непосредственное влияние на генетический аппарат клеток организма, и индуцируете ими цитогенетические эффекты носят опосредованный характер. Рэзультаты изучения механизмов цитогенотической нестабильности при описторхозной инвазии позволят внести новые данные в существующие представления патогенезе описторхоза и uoiyr служить основой для разработки патогенетически обоснованных методов прогнозирования тяжести течения заболевания и эффективных способов его лечения.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить механизмы, приводящие к цитогенетической нестабильности при описторхозной ин вазии.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать цитогенетические нарушения при описторхозной инвазии у человека и зараженных описторхами золотистых хомяков.

2. Изучить активность ДНК-репаративной и иммунокомпетентной систем при описторхозной инвазии.

3. Изучить особенности онтогенетических нарушений, вызываемых действием некоторых ксенобиотиков на фоне выраженной описторхозной инвазии.

4. Оценить цитогенетическую активность дериватов марит олис-торхов (описторхина).

5. Исследовать активность микросомальных фракций клеток печени пораженных описторхами золотистых хомяков в биотрансформации ксенобиотиков в активные мутагены.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что подавление Т-системы иммунитета и увеличение биотрансформационной активности кикросом клеток печени при описторхозной инвазии приводят к возрастанию числа клеток с нарушениями структуры и числа хромосом, несмотря на Еысокую активность внутриклеточных систем ДНК-репарации. Показано также, что усиление биотрансформационной активности ыикросомальной фракции клеток печени при описторхозной инвазии приводит к существенному усилении мутагенных потенций некоторых ксенобиотиков. Впервые установлено, что цитогенетические изменения могут вызывать дериваты марит описторхов, а также микроорганизмы ( $а£топе££а ^/¡апип'ит ), локализующиеся в маритах описторхов. Дериваты описторхов и сальмонеллы способны также существенно изменять активность ДЩ-репаративных процессов и увеличивать число цитогенетических аберраций в лимфо-идных клетках периферической крови, что сопровождается выраженной депрессией Т-системы иммунитета.

Теоретическое и практическое значение. Полученные в настоя-» щем исследовании данные о фундаментальных механизмах возникновения цитогенетических нарушений при описторхозной инвазии вносят новые сведения в существующие представления о патогенезе описторхоза и могут служить основанием для разработки новых, патогенетически обоснованных подходов к терапии данного заболевания.

Результаты изучения цитогенетической активности дериватов марит огшсторхов и локализующихся в них сальмонелл должны учитываться специалистами при определении тактики лечения больных описторхозом, поскольку гибель и разрушение описторхов в процессе лечения больных описторхозом могут существенно усугубить цитогенетические последствия описторхозной инвазии. Практический аспект могут иметь и результаты исследования мутагенных потенций цитостатических препаратов и процессов их биотрансформации в клетках печени при описторхозной инвазии. Следует полагать, в частности, что лечение циклофосфаном онкологических больных на фоне описторхозной инвазии может привести к более выраженным цитогенегическим нарушениям, чем при использовании тиофосфамида и винкристина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Подавление Т-сиотемы иммунитета и усиление биотрансформационной активности микросом клеток печени при описторхозной инвазии приводят к увеличение числа клеток с нарушением структуры и числа хромосом, несмотря на высокую актиачость внутриклеточных систем ДНК-репарации.

2. Дерявати марит описгорхои и локализукциеся з них $Лур~ &тиПит обладают выраженным онтогенетическим эффектом. Механизм цитогенетического действия описторхина связан с угнетением Т-системы иммунитета.

3. Одасторхозная инвазия усиливает онтогенетический эффект цкклофосфана и не влияет-на мутагенные потенции тиофосфамида и винкристина.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на научном семинаре Томского отделения Всесоюзного общества генетиков (Томск,1988); на региональной конференции "Профессиональная патология в Восточных регионах страны и вопросы диспансеризации работающих" (Новокузнецк,1988); на Всесоюзной конференции "Фундаментальные науки - медицине и здравоохранению" (Иркутск,1989); на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" (Караганда,1990); на региональной конференции "Проблемы экологии человека в Сибири" (Новокузнецк, 1990); на Всесоюзном координационном совещании "Генетические последствия загрязнения окружающей среди мутагенными факторами" (Самарканд,1990); на Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы лекарственной токсикологии" (Москва,1990); на Всесоюэ-

ной конференции "Физиологические и медицинские вопросы нетрадиционных форм производственной деятельности человека"(Тюмень,199 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работ Структура и обьём работы. Диссертация оостоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы из 226 наименований, в том числе на 116 на иностранных языках. Материалы диссертации и; локены на 114 страницах машинописного текста, включая 2 рисунка и 22 таблицы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ В экспериментах (табл.1) использовали 850 половозрелых золо тастих хомяков-самцов массой 100-120 гр, 650 из которых заражали метацеркариями описторхов путем введения в глотку 50 метацер-кариев на особь. У золотистых хомяков изучали биогрансформаци-ониус активность микросомальных фракций клеток печени, полученных по методу А.А.Ерёминой и соавт. (1985) на базе Пермского НИ генетики и селекции микроорганизмов. Одновременно определяли количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови (8с&* п»иЗ , 1975), число клеток печени с нарушениями структуры ядра (Йадеор«Л,Ноыге, 1966), изучали ДНК-репаратижую активность лим-фоидных клеток крови (Засухкна Г .Д., 1975), Влияние ошсторхоз-ной инвазии на мутагенную чувствительность организма оценивали с помощью дакроядерного теста и путем анализа активности ДОС-репарации в дийфоидаых клетках крови у животных после введения цито-статических препаратов (щшлофосфан, тиофосфаыид, винкристин) и (или) описторхина.

Объектом цитогенатичаского обследования служили также культуры лимфоцитов крови здоровых доноров и больных описгорхоэок явдей, а также перевиваемая культура клеток золотистого хомяка ВНК-21. В культуре лимфоидных клеток определяли уровень ДНК-ре-паративной активности и биотрансфориадионнув активность микросомальных фракций клеток печени золотистых хомяков (Атея.1975) с использованием циклофосфана гак мутагенного фактора на штамме ТА-1538 ЪЪ^/итгит, любезно предоставленного в Пермском НИИ генетики и селекции микроорганизмов ст.науч.согр. А.А.Ерёминой.

В специальных сериях экспериментов на культурах клеток (лимфоциты человека я ВНК-21) изучали онтогенетическую активность дериватов марит описторхов и выделенных из них микроорганизмов, тестированных на кафедре микробиологии Тшенского мединститута проф. Г.В.Кондинским как £я£тсп*£Сл ЬцркппиЫит.

Таблица I

Логическая структура диссертационной работы.

Объекты и методы, использованные а работе.

Уровень Объекты

исследования Нетоди в уело ей ях ш VI го 3 УСЛОВИКУ Ц1VitГ0

здоровый больной сгастор- Х03СМ интакт-ный кнБазированный опистор-хаш лимфоциты человека клетки золотистого хомяка линия ВНК-21 штамм ТА-1533

Анализ на уроглэ ДНК-репаратав-ДК- иий анализ (гаепланосый синтез) + + +; Ц; В; Т;0 +; Д; В; Т; Щ 5*

Анализ на уроше отдельных генов тест Эймса Ц-ЛЦМ

Анализ на уровне генома и отдель- хрсыосошкгЯ ачмиэ + + 0

ных хромосом иикроядерный анализ + + + + +;Ц;1Ш; +:0:Ш +;Ц;Ш;5 +:0:0М

янализ на суо-клеточном и клеточном \ТЗОЕНЯХ цитологический и цитохимический енализ +■ + +; Ц; Ш + : 0: ОМ

Иммунологический анализ + т

Примечание: Обозначено + - без воздействия; Д, 0, 3, В, Т - после воздействия, соответственно, циклофосфаяом, описторхином,(дгригаты карит олисторхов), сальмонеллами, выделанными из ьарит описторхов, ишкристкном и тксфосфамидом; ¡1 - использованы микросомальнке фракции печени, выделенные от золотистых хомяков, зараженных опистсрхами.

Клинический раздел работы включает материалы хромосомного, иммунологического и ДНК-репаративного анализов клеток крови 21 больного описторхоэом (мужчины в возрасте 18-35 лет, не подвергавшиеся в течение 3 мес рентгзновскому облучению и лечению хи-MHonpenapaTavsi), впервые госпитализированных в клинику инфекционных болезней Томского медицинского института и 56 здоровых доноров-добровольцев аналогичного пола и возраста. Весь цифровой материал обрабатывали статистически с помощью t-критерия Стьюдента.

Автор выражает глубокую признательность зав.кафедрой инфекционных болезней Сибирского медицинского университета доценту A.B. Лепёхину за предоставленную возможность выполнения исследований в руководимой им клинике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Цитогенетические нарушения, активность систем ДНК-репарации и состояние иммунитета при описторхозной инвазии.

Установлено (рисЛА), что количество лимфоцитов с микроядрами в периферической крови у людей больных описторхозом (0,85+ 0,03%) значительно (р-с 0,001) превышало их содержание у здоровых доноров (0,60 ± 0,04%). Количество эритроцитов с микроядрами у больных также было достоверно повышено и достигало 0,40 ± 0,04$о при 0,25 ± 0,02$о у здоровых людей (р <0,01). Общее количество клеток с нарушениями в числе и структуре хромосом у людей с описторхозной инвазией значительно превышало их содержание у здоровых доноров. При этом число лимфоцитов с хромосомными разрывами соответствовало 1,3 ± 0,2$ (в контроле 0,3±0,1$; р < 0,001), с хроматидными разрывами - 3,4 t 0,9$ (1,0 ± 0,2Й; р < 0,05), с пробелами - 1,4 ± 0,2$ (0,7 ± 0,1$; р < 0,05), с обменами - 0,9± 0,1$ (0,2 ± 0,1$; р ■< 0,001). Количество лимфоцитов с гипоплоидиым набором хромосом у больных описторхозом (10,8 ± 0,85?) в 5 раз превышало соответствующие значения у здоровых доноров (2,1 ± 0,2$; р<0,001). Число клеток с гипер-плоидаыи кариотипом (2,1 ± 0,3$) также достоверно превышало их содержание в контроле (0,6 ± 0,2$; р < 0,01).

Количество эритроцитов с микроядраыи в периферической крови у золотистых хомяков (рис.ЦБ), инБазированных описторхами, в 2 раза превышало их содержание у интактных животных (0,27* 0,03$о) и достигало 0,54 i 0,Q5$o (р -< 0,001). Уровень гепатоцигов с

р в

щ 1 I Ш

Рис. I. Количество клеток с цитогенетическими нарушениями и индекс ДКК-репарами в лимфоцитах периферической крови при описторхозной У'.нразии ■

Л - количество клеток с цитогенетическнми нарушениями у людей, больных описгорхозом: I - эритроциты с шшроядрами, 2 - лимфоидные клетки с мккроядрами, 3 - клетки с хромосомными разрывают, .4 - хроматиднши разрывают, 5 - пробелами, 6 - обменами, 7 - гипоплоидешм, 8 - гиперплоид-' ш набором хромосом.

Б - количество клеток с цитогенетическими нарушениями у золотистых хомяков, инвазированних I - эритроциты с ммкроядрами, 2 - гепатошты с микроядрами, 3 - гногоядер-ные клетки.

В - индекс ДНК-репарации в лимфоцитах периферической крови у больных описторхозом ( I ) и золотистых хомяков, ннвази-рованных О.^Стсиз ( 2 ).

Во всех случаях белые столбики - контроль, закрашенные столбики - огшсторхозная инвазия. Достоверно значимые отличия от контроля отмечены звёздочками:Й - (р -с 0,001), X - (р 0,01),»й- - (р -с 0,05).

микроядрами у инвазированных животных (0,69 ± 0,04^) также достоверно превшал их содержание в контроле (0,40 i 0,06%; р< 0,01), при этом реэко возрастало (до 9,85 t 1,54% при 4,60 ± 0,78$ в контроле; р < 0,01) количество двух- и многоядерньи клеток.

Изучение изменения активности ДНК-репаративных процессов (рис.1В) в лимфоидных клетках периферической крови у золотистых хомяков выявило резкое (р < 0,001) увеличение индекса ДНК-репарации клеток у инвазированных животных (2,5 ± 0,5) по сравнению "с аналогичными показателями в контроле (0,60 ± 0,09). Статистически значимой разницы в величине этого показателя у людей,больных описторхозом (2,1 ± 0,2), и здоровых доноров (2,0 ± 0,1) выявлено не было (р > 0,5).

Кмлунологическое обследование людей с описторхозной инвазией показало (табл.2), что у больных с высоким уровнем эритроцитов с млкроядрамн общее число Б-лимфоцитов в периферической крое:: было в 2,5 раза вызе, чем у здоровых доноров (соответственно, 43,4 ± 1,255 и 17,3 ± 0,8%; р < 0,001), а количество Т--лимфоцитов оказалось, напротив, снииеиным и составляло (46,2± 1УА% при 70,2 í 2,3% у здоровых лиц; р < 0,001). При этом количество Т-супрессоров увеличивалось до 34,6 ± 1,83 (при 12,3 ± 0,0% в контроле; р < 0,001), а число Т-хелперов снижалось до 6,3 i 0,&¡í при 40,1 ± I,£fé у здоровкх доноров (р •< 0,001). Уровень сывороточных иммуноглобулинов у больных с описторхозной инвазией во всех случаях достоверно превьшал соответствующие значения в контроле: I¡¡ А - 289,4 i 12,3 мг/мл при 167,3 ± 8,9 иг/кл в контроле, Ig '■! - 212,6+14,2 мг/мл при III,6±IO,3 мгДи в контроле,Ig С - 1726,2 + 9,6 мг/мл при 1600,0 ± 9,0 мг/мл в контроле (ео всех случаях р <. 0,001). Обращало на себя шк-кстхс такно еннге.чке активности нормальных киллеров (до 26,3 ± 6,0^ при 63,7 ± 5,1% в контроле; р < 0,001) и возрастание угэ-кш циркулирующих иммунных комплексов (до 101,4 ± 7,9 при 54,3± -3,4 d контроле; р •< 0,001). Поглотительная активность нейтро-филоБ у больньас описторхозом людей оставалась в продолах nopj.oi-

- 68,4 ± 3,6/5 при 85,2 ±7,3% в контроле, однако способность их к элиминированию микроорганизмов оказалась достоверно сшшенной-

- до 24,6 i 2,1% при 50,2 ± 3,4% в контроле (р < 0,001).

Таблица 2

Показатели состояния иммунной системы у больных описторхоэом, X* >у>

Регистрируемый показатель

Больные описторхозок

Здоровые доноры

Количество розеткообра-зуюших клеток, %

В - лимфоциты 43,4 £1,2

Т - лимфоциты - 46,2 ±1,4 Т - хелперы 6,3±0,8

Т - супрессоры 34,6 ±1,8*

Уровень сывороточных иммуноглобулинов, мг/мл

к 289,4 ±12,3 ^

Н 212,61-14,2*

5 ' 1726,249,6 *

Фагоцитарный индекс, % 68,41-3,6 Завершенный фагоцитоз, % 24,6 £2,1* Уровень циркулирующих иммунных комплексов, усл.ед. 101,4 ¿7,9 Индекс цитотоксичности естественных клеток киллеров,

* 26,3*6,0

Й

17,3±0,8 70,212,3 40,1 ¿1,8 12,3±0,8

167,3 + 8,9 III,6410,3 1600,0 ± 9,0

85,2 £7,3 50,2 ±3,4

54,3-13,4

63,7±5,1

Примечание: звёздочкой отмечены достоверно значимые отличия от контроля ( р -с 0,001 ).

2. Генотоксическая, ДНК-репаративная и биотрансформационная активность микросомальных фракций печени при описторхоз-ной инвазии.

В тесте Эймса показано (рис 2А), что число ревертантов (му-тантно измененных колоний ЗДу^дакпчт) На чашку Петри при действии циклофосфана с использованием микросомальных фракций печени интактных золотистых хомяков составляло 140,3 > 2?,3. При сочетали ом действии цитостатика и микросомальной фракции животных, инБазированных за I мес до эвтаназии, величина этого показателя соответствовала 146,0 ± 32,7 (р > 0,5), а при совместном применении циклофосфана и микросомальной фракции хомяков, полученной через 6 мес после инвазирования описторхами, достигала 543,7* 30,3 (р < 0,001).

Количество клеток с микроядрами в культуре ВНН-21 (рис.2Б) при добавлении микросомальной фракции, полученной от интактных кивотных, соответствовало 0,32 ± 0,06$о (при 0,15±0,04%о в контроле; р>0,05), а при введении фракций животных, ин Базированных за 6 мес до проведения исследования - 0,33 ± 0,03%о (р-с 0,01). При добавлении циклофосфана в культуру ВНК-21 уровень клеток с микроядрами составил 0,31 ± 0,05$о, при сочзтенном действии циклофосфана и микросомальной фракции печени интактных животных -0,33 t 0,07%о (р> 0,1), печени золотистых хомяков, инвазирозан-ных за 6 мес до проведения исследования - 0,59±0,04%о (р-«0,001).

Количество клеток с микроядраии в культуре лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров после действия циклофосфана (рис.2В) составляло 1,6 ± 0,5% при 0,5 ± 0,3%, в контроле (р > 0,05). Содержание их после сочетанного действия циклофосфана и микросомальной фракции печени интактных животных соответствовало 2,5 ± 0,356 при 1,4 ± 0,3£ в контроле (р 0,05), а при действии циклофосфана и микросомальной фракции печени кивотных, инвази-рованкых за б мес до проведения исследования - 5,0 ± 0,35б при 2,8 ± 0,556 в контроле (р -г 0,01).

Анализ даК-репаратиетых процессов в лимфоидных клетках при действии микросомальных фракций показал (рис.2Г), что при добавлении в культуру клеток микросомальных фракций печени интактных животных индекс ,[ЩК-репарации соответствовал 2,2 ± 0,1 при 2,1 ± 0,2 в контроле (р ■> 0,1). При действии на культуру клеток микросомальных фракций, полученных от животных с 6-и месячным сроком описторхозной инвазии, величина этого показателя увеличивалась до 2.8 ± ОД (р < 0,01).

- и -

О 1 2

Рис. 2. Биотрансформационная активность шкросомалькых фракций печени при описторхозной инвазии.

А - число ревертантов в чашке Петри при сочетаннои действии циклофосфана и мякросомальных фракций печени интактнш: золотистых хомяков ( I ) и животных, инвазнрованных опистор-хи/.и за I мес ( 2 ) и б мес ( 3 ) до проведения исследования. Белые столбики - контроль ( без микросомальных фракций ).

В - количество клеток с микроядрами в культуре БНК-21 при действии циклофосфана ( 0 ) и сочетанном действии циклофосфана и еткросомальной фракции печени ннгактных животных ( I ) и инвазироваиных за 6 мес до проведения исследования (.2 ). Белые столбики - контроль (без циклофосфана )=

В - количество клеток с микроядрана з кульгург лимфоцитов периферической крови здорового донора. Обозначения те не, что и в Б.

Г - индекс ДОС-репарации в клетках культуры лимфоцитов перифер рической крови людей, больных опиагорхоэом, без добавления ( О ) и о добавлением микросомальных фракций печени интак-тных золотистых хомяков ( I ) и инБазированных за б мес до проведения исследования (22 ). X - достоверные отличия от контроля ( О ) й - достоверные отличия от контроля ( I )

Таким образом, микросомальные фракции, полученные от золотистых хомяков, зараженных описторхами, не только повышают мутагенную активность некоторых ксенобиотиков, но и сами способны оказывать датогенетический и ДМ-репаративный эффект.

3. Цитогенетические нарушения и состояние систем ДНК-репарации при действии дериватов мерит описторхов.

При изучении действия дериватов марит описторхов на культуру лимфоцитов периферической крови здоровых доноров (табл.3) -- выявлено увеличение количества клеток с нарушениями числа и структуры хромосом.

Таблица 3

Хромосомные нарудения в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров после действия дериватами из марит описторхов, X* т

Время экспо- Число клеток с хромосомными нарушениями Число хромосом с нарушениями

зиции , ч всего хромосомных разрывов хроматидных разрывов

0 (контроль) 1,9 ± 0,2 3,2 * 0,3 0,24 0,09 1,7+0,2 48 . 16,8 ± 0,9* 18,5±0,7* 4,5±0,6* 13,6+1,1*

Вреда экспозиции, ч Число клеток с измененным количеством хромосом Всего клеток с цитогенети-ческими нарушениям!

пгрг,. гипопаоид- гкперплоид-рсего них ных

0 (контроль) 2,6*0,2 1,9ЮД 0,6*0,1 '4,3 + 0,2 48 5,8*0,5* 3,8¿0,6* 1,0 + 0,1 21,210,6

Примечание: звёздочками отмечены достоверно значимые отличия от контроля: (Я ) - (р с 0,001), (« * ) -(р < 0,05).

Так, например, в результате 2-х суточной инкубации с дериватами число клеток с хромосомными нарушения:® в культуре лимфоцитов периферической крови возрастало *олее, чем в 8 раз ( до 16,8 + 0,9$ при 1,9 + 0,2$ в контроле; р< 0,001). При этом число лимфоцитов с разрывами хромосом составляло 4,5 - 0,06$ (в контроле 0,20 - 0,09$; р < 0,001), с хроматидаыми разрывами - 13,6 ± 1,1$ (1,7 - 0,2$; р •< 0,001). Общее число клеток с измененным количеством хромосом через 48 часов инкубации достигало 5,8 -0,5$ при 2,6 - 0,2$ в контроле (р < 0,001). При этом содержание лимфоцитов с; гипоглокдным каркотипом возрастало до 3,8 - 0,6$ при 1,9 - 0,1$ в контроле (р < 0,001), а клеток с г";.ерплоидным

набором хромосом - до 1,0±0,1% при 0,6 ±0,1% в контроле (р< 0,05). В результате воздействия дериватов марит описторхов возрастало общее число клеток с цитогенетичэсяими нарушениями - до 21,2± 0,6$ при 4,3± 0,9$ в контроле (р < 0,001).

Показано (табл.4), что при действии на культуру БНН-21 очищенного описторхина (пропущенного через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм) количество клеток с юпгроядрами составляло 4,83+О,ЗОЙ при 2,54 + 0,40% в контроле (р < 0,001). При действии неочищенного описторхина этот показатель равнялся 5,22 i 0,40$ (р < 0,001), а сальмонелл, выделенных из марит описторхов - 3,86 + 0,20$ (р ■< 0,05). Количество многоядерных гепато-цитов при действии очищенного описторхина составляло 5,60 ± 0,40% (р < 0,001), неочищенного ошсторхина - 5,64í 0,50% (р < 0,001), сальмонелл - 3,60 ± 0,30% (р < 0,001). Число клеток с "лопастным" ядром в культуре ШК-21 при действии неочищенного ошсторхина соответствовало 1,72 ± 0,30% при 0,54 + 0,20% в контроле (р < 0,05), содержание гепатоцитов с явлениям! кариорексиса - 1,08 ± 0,10% при 0,35 ± 0,20% в контроле (р < 0,05). Обцее число клеток з культуре BHK-2Z с нарушениями структуры ядра при действии очиценкого описторхина составляло 10„25 £ 0,70%, неочищенного - 12,62 ± 0,50%, сальмонелл - 8,46± 0,60% при 6,68 ± 0,30% э контроле (зо всех случаях р< 0,001).

Результаты изучения влияния сальмонелл, наделенных из марит описторхоя, на ДНК-репаративные процессы в лимфоидных клетках периферической крови золотистых хомяков представлены з табл.5.

Таблица 5

Индекс ДНК-репарации в лимфоидных клетках периферической кропи золотистых хомяков при действии дериватов марит опистор-хов (описторхин) и выделенных из них сальмонелл, Xtm

Вид воздействия Контроль Время воздействия стимулятором да£-репарации (УФ-лучи)

10 сек 15 сек

До воздействия После воздействия: Описторхина неочищенного Описторхина очищенного S. typfümurium 0,624 0,10 1,76 i 0,40 1,90 + 0,30 0,93 ± 0,20 0,70 + 0,10 0,92 i 0,09 £ 2,55 ± 0,40 2,76 i 0,30 * * 2,64 ± 0,50 2,92 + 0,50 хаи 2,23 + 0,20 2,35 ±0,20

Примечание: звёздочками отмечены достоверно значимые отличия опытных данных от интактаого контроля:% -- (р< 0,001);»» - (р < 0,05); К - отличия данных от контроля (до воздействия стимулятором ДНК-репарации, р < 0,001)„

При действии очищенного и неочищенного описторхина на культуру лимфоцитов периферической крови отмечалось резкое усиление способности клеток к восстановлению поврежденных участков ДНК о чем свидетельствовало увеличение индекса внепланового синтеза ДНК,, соответственно до 1,76 £ 0,40 (р < 0,05) и 1,90 ± 0,30 (р< 0,001) яри 0,62 ± 0,10 в контроле. При Ю- и 15-секундаой экспозиции УФ-облучения индекс ДДК-репарации при действии очищенного описторхина составлял, соответственно-'2,55± 0,40 (при 0,70 ± 0,10 в контроле; р< 0,001) и 2,76 ± 0,30 (0,92 ± С,09; р< 0,001), при действии неочищенного описторхина - 2,64 ± 0,50 (р < 0,001) и 2,92 ± 0,50 (р < 0,001). Величина индекса ДЩ--репарации в клетках культуры лимфоцитов золотистых хомяков пр»; введении сальмонелл в.аналошчньк условиях Уй-сблучения соответствовала 2,23 ± 0,20 (р < 0,001) и 2,35 ± 0,20 (р <: 0,001).

4. Особенности действия некоторых цитостатиков на состояние систем ДНК-репарации и хромосомный аппарат клеток при отастор-хозной инвазии.

Уровень вритроцитов с микроядраш у золотистых хомяков после введения циклофосфана (рис.ЗА) соотавлял 0,54 ± 0,02^о при 0,28 ± 0,0Э£ов контроле (р < 0,001). Величина этого показателя при действии тцофосфамида и вин кристина равнялась, соответственно 0,65 ± 0,055бо и 0,58 ± О.ОЭЗЕо (в обоих .случаях р<0,001). При введении циклофосфана кивотныи, инвазировашьм сгасторхами, количество эритроцитов с иикроядрами достоверно возрастало — до 0,67 ± 0,033?о (р <0,01), а при действии тиофосфамида и винкри-стина составляло, соответственно, 0,641 0,02%а к 0,61 ± 0,0А%о (в обоих случаях р > 0,5).

Индекс ДНК-репедативньк процессов в лимфоцитах периферической крови у инБазированных золотистых хомяков при действии циклофосфана (рис.ЗБ) возрастал до 2,40 ± 0,25 при 1,6 ± 0,1 в, контроле (р < 0,05). Достоверных изменений величины этого по-

Таблица 4

Число клеток с нарушениями структуры ядра (%) в культура ШК-21 при действии описторхина и выделенной из оюсторхов, 5.*урК|'тигш>я,$?*т

Вид воздействия клатки с никроядром многоядерныз клетки клетки с ка-риорексисом клетки с "лопастным ядром всего клеток с нарушениями структуры ядра

Контроль Описторхин очищенный Описторхин неочищенный 3. Ьц&пшпят 2,54 0,40 4,83 0,30 5,22 0,40 а» 3,86 0,20 2,30 0,10 ■Й- 5,80 0,40 5,64 0,50 3,60 0.30* 0,35 0,20 0,66 0,30 1,08 0,10 0,62 0,20 0,54 0,20 1,10 0,20 1,72 0,30 0,81 0,10 5,68 0,30 * 10,25 0,70 * 12,62 0,90 * 8,46 0,60

Примечание: обозначения те ке, что и в табл. 3

казателя при действии тиофосфамида и винкристина не обнаруживалось.

Количество лимфоидньос клеток с микроядрами (рис.ЗВ) -в культуре клеток здорового донора без введения ыикросомальной фракции соответствовало 0,5 + 0,2 %, а при введении в культуру шкросоыальной фракции печени животных с хронической формой описторхоза (6 мес) - 2,6 - 0,3 % (р < 0,001). Величина этого показателя при действии циклофосфана соответствовала 1,6 - 0,5 % <р 0,05), а при сочетанном применении цитостатика и микросомальной фракции-- 5,0 - 0,3 % (р< 0,001). Добавление в культуру лимфоидных клеток периферической крови вкикристина и тиофосфамида, равным образом как и их сочетанное действие с микросомальной фракцией, не выявило статистически значимых изменений индекса внепланового синтеза ДНК (рис.ЗВ).

Таким образом, , при описторхозной инвазии усиливается онтогенетический аффект циклофосфана и ке изменяются мутагенные потенции тиофосфамида и винкристина.

Полученные в настоящем исследовании данные показывают, что при описторхозе подавляется способность иммунной системы контролировать генетический гомеостаз организма, в связи с чем значительное число генетически измененных клеток не элиминируется лим-фоцит&ыи-кнллераш. Это, в свою очередь, способствует значительному накопление аберрантных клеток в организме. Иммунологические нарушения, выявленные у больных описторхозом людей, обуславливают возникновение приобретенного иммунодефицитного состояния, первопричиной которого является Т-супрессия, возникающая в результате специфического действия продуктов метаболизма паразитов на Т-систему иммунитета.

Результата шкроядерного анализа эритроцитов .и лимфоидных клеток периферической крови у больных описторхозом выявили более высокий процент клеток с микроядрами, по сравнению с их уровнем у здоровых доноров, что, по-видимому, не случайно, поскольку именно эти клетки в первую очередь устремляются к очагу описторхозной инвазии, где и подвергаются мутагенному воздействию опис-торхсв. У ин Базированных описторхами золотистых хомяков был отмечен высокий уровень клеток печени с микроядрами и полиплоидных гепатоцитов. Выявленные изменения генетического аппарата гепато-цитов у кнвазированных животных несомненно должны сказаться и на функциональных особенностях этих клеток. В этой связи, значительный интерес, на наш взгляд, привлекает система микросомального

0,6

Чр

«I

М

1

ш

ш

1 Ш\ '1

ГТ7Л5

Ж1

лШ

Ряс. 3. Особенности деПсгпш некоторых нитостатккоз ;;а состояние систем ДКС-репарагг-п! и хро:.:осо:;п;Н аппарат клеток при еписторхозной гигпзня.

Л - количество оритроцитоя с 1г:;фоядр:и.ги у иппазировглпых ст-сторхсми золотистых хохякоа.при де:":ств::и циклофосфопа ( I ), тио^осфамлдп ( 2 ) и глипфпстина ( 3 ).

В - индекс ДКК-рёпараш:п в л^гфсндных клетках кнпазпровзшяк опиеторхош золотистых хомяков при дейсткш цпклофосфглга ( I ), тиофосфилида ( 2 ) И п;:нкрист:та ( 3 ), В сбоих случаях белые столбики - контроль, закрсггсниыэ -- описторхозная гнпягия.

В - количество клеток с гикроя/ф?.";! в кул.ътуро лик.Допито в периферической кроги сдорэвого донора при дейсткга- сикло^ос-фа» а ( I ), таофосфэмида ( 2 ) и Е!шкр::ст;:.ча 13). БолыЛ столбик - контроль ( без !-в!крэсо.\:алыюП фракци! ), за:фа-шог.ный - совместно с м-.ифосомалыюй фракцией. - достовернее отличия от контроля.

окисления клеток печени, через ферментную цепь которой осуществляется биотрансформация большинства поступавших в организм ксенобиотиков. Показано, что микросомальная фракция, полученная от инвазированных хомяков с развитой стадией описторхоза, усиливает мутагенные потенции циклофосфана. Изучение мутагенного эффекта тиофосфамида и винкристина в культуре лимфоцитов в присутствии микросомальной фракции печени тБазированных животных не выявило достоверных изменений в уровне клеток с микроядрами, по сравнению с их содержанием при действии указанных цитостатиков без добавления микросои.

Анализ активности ДКК-репаративных систем в лимфоидных клетках зараженных описторхами штатных выявил резкое увеличение индекса стимуляции шепденового синтеза ДОК, что, на наш взгляд, можно рассматривать как свидетельство увеличения числа "брешей" в нитях ДНК и активации, в связи с этим, процессов их восстановления. Введение циклофосфана инвазированным описторхами животным во всех случаях стимулировало неплановый синтез ДНК в лимфоцитах периферической кроки, тогда как винкристин и тлофосфа-мид таким действием не обладали.

Установленный по итога!! исследования факт выраженного снижения мутагенной активности описторхина после прохождения через бактериальный фильтр может свидетельствовать о том, что способностью индуцировать генетические нарушения в клетках, наряду с самими описторхами, обладают и локализованные в них микроорганизмы, идентифицированные как

ВЫВОДЫ

1. Подавление Т-системы иммунитета и усиление биотрансформационной активности макросом клеток печени при описторхозной инвазии приводят к увеличению числа клеток с нарушениями числа и структуры хромосом, несмотря на высокую активность внутриклеточных систем ДОС-репарации.

2. Нарушения в имцунокомпетентной системе у больных хроническим описторхозом соцровоадаются увеличением числа Т-лимфоци-тов с нарушениями числа и структуры хромосом.

3. У зараженных описторхами золотистых хомяков увеличивается число гепатоцитов и эритроцитов с микроядрами, а также возрастает количество многоядеркых гепатоцитов.

4. Описторхозная инвазия и дериваты марит описторхов повша-ют активность аксцизионной ДЖ-репарацик в лимфоидных клетках

t

золотистых хомяков.

5. В культурах лимфоцитов человека и BHK-2I дериваты марит описторхов вызывают увеличение числа клеток с патологическими изменениями ядра (хромосомные аберрации, нарушения митоза, микроядра, кариорексис, дву- и многоядерность).

6. Микросоиальные фракции, выделенные из клеток печени золотистых хомяков, зараженных описторхами, усиливают цитогенетичес-кий эффект циклофосфана на генном (тест Эймса) и на хромосомном уровнях и не влияют на мутагенные потенции тиофосфамида и винк-ристина.

7. Сальмонеллы (S, iypfiímarittm ), выделенные из марит описторхов, обладают цитогенетическим эффектом и стимулируют систему ДНК-репарации клеток крови.

Список статей, опубликованных по теме диссертационной работа

1. Комплексное физиологическое и штогенетическое обследование рабочих-нефтянников и проблема диспансеризации // Профессиональная патология в Восточных регионах страны и вопросы диспансеризации работающих: Тез.докл.- Новокузнецк, I988.- С. 134-135 (ооавт. H.H.Ильинских, Я.Й.Перепечаев, А.М.Уразаев).

2. Hepatic microsomal enrames of G-oWish hamstezs infected ojítíi Opisthorchosis incTease great tu tfiemicaf mutagenesis // <3 ** ЯппилС meeting of E£tnS on Environmen -ta£ m«taqaties— Cardnoqenes. Greece-Rhodes, 1989.- p.ev (сами. N.N.ge^Msiißfi).

3. Действие описторхозной инвазии на цитогенетический аппарат человека и экспериментальных животных // Генетика человека и патология: Сб.науч.тр,- Томск, 1989.- С* 73 (соавт. H.H. Ильинских).

4. Цитогенетический аппарат и некоторые физиологические параметры здоровья у вахтовых райочих-нефгянкиков Сибири // Бюллетень СО АМН СССР.- 1989.- № б.- С. 41-43 (соавт. Н.Н.Ильинских, А.М.Уразаев, U.A.Медведев, Г.В.Потапова, Л.Я.Перепе-чаев).

5. Роль описторхозной инвазии з цитогенетических к иммунологических изменениях у человека и экспериментальных животных // Фундаментальные науки медицине и здравоохранение, часть П: Тез.докл.- Иркутск, 1989.- С. 83.

о. Функциональная активность макрофагов перитонеального экссудата золотистых хомяков ггри описторхсзной инвазии // Фундаментальные науки - медицине.- Томск,, 1989.- С. 137-139 (соавт. О.В.Кирпичава).

7. Комплексное физиологическое, иммунологическое и генетическое . обследование состояния здоровья рабсчих-исфтянников //"Там

же.- С. 108-115 (соавт. Н.Н.Ильинских, А.М.Уразаев, Д.Я.Пе-рвпечаев).

8. Методические подходы по БЬ'деленкю метацеркариев оппсторхов из рыбы и моделирование опмсторхоза на лабораторных животных // Тш.! ке.- С. 84.

9. Цитогенетические последствия описторхоза. // Там ке.- С. 41-44 (соавг. Н.Н.Ильинских, И.Д.Мсрченко).

10. Роль шкросом печени золотястьсс хомяков, зараженных опистор-хамл, в индукции гснетичаскнх нарушений /I Там же.- С. 19-21

11. Связь количества эритроцитов с шкроядоаки и иилунологачес-ким статусом человека // Цитология и генетика.- 1990,- Т.24, & 6,- С. 20-25 (соавт. Н.Н.Ипьинских, Л.Я.Поропечаав, И.Н. Ильинских).

12. Модификация мутагенного эффекта штостатичесшх препаратов на фоне ога'.сторхозной инвазии // Актуальные проблемы лекарственной токсикологии, часть И: Тез.докл.- П.,1990.- С. 156-157 (соавт. Н.Н.Ильинских),

13. Гннетические эффекты, индуцируемые описторха^.ш, у человека и экспериментальных животных // Методические и методологические! вопросы генетики: Тез.докл.- Томск, 1990,- С. 229-231 (соавт. Н.Н.Илькнских, И.Д.Марченко).

14. Индукция генетических поражений при действии описторхоиюй инвазии в связи с изменениями актишости мшсросом // Тем т,.е. - С. 232-234. '

15. Генетическое и физиологическое обследование вахтоык рабочих -нефтянников // Там же.- С. 239-246 (соавт. Н.Н.Нлышсхих, Л.Я.Перепечаев, А.Ы.Уразаев).

16. Описторхоз - фактор патогенетической нестабильности у человека и животных в условиях Обь-Иргкдакого бассоГа!а // Проблемы экологии человека е Сибири, часть 1У: Тез.докл.- Новокузнецк, 1990,- С. 123-12? (соавт, Н.Н.Илькнских, И.Д.Марченко) .

17. Изменение бмотрансфориациониой активности м{Гфосо;?алыых ферментов печени и цитогснетаческая нестабильность при опис-торхозе у человека и животных // Второй Всесоюзный съезд

медицинских генетиков: Тез.докл.- М.,1990.- С. 224 (соавт. H.H.Ильинских).

18. Генетические эффекты при действии химических лекарственных препаратов на клетки человека и животных на фоне метаболической активации микросомальных ферментов печени, индуцированной инвазией описторхами // Генетические последствия загрязнения о кружащей среды мутагенными факторами: Тез. докл.-- М., 1990.- С. 100-101 (соавт. Н.Н.Ильинских).

19. Мутагенные и канцерогенные процессы у человека и животных на фоне описторхозной инвазии // Эколого-генетический мониторинг состояния окружающей среды: Тез.докл.- Караганда, 1990.- С. 71 (соавт. Н.Н.Ильинских). __

20. Проблемы высокой мутагенной чувствительности при описторхозной инвазии // Проблемы токсикологии и прикладной экологии: Тез.докл.- Л., 1991,- С. 127 (соавт. А.А.Ерёкина, Н.Н.Ильинских) .

21. Опыт использования микроядерного теста при массовых обследованиях состояния здоровья людей // Там же.- С. 162 (соавт. H.H.Ильинских).

22. OpistfiereWs feHneuS — are pronators of oncogenesis and и»-tegenests// European devatopmentaC SioCoey conorese. Je-rusafem. tfujust i<-f£.- Israe£t<99i.-Pi03 (coautk H.H. JijfinsM/i).

23. Генетическое, иммунологическое и физиологическое обследование вахтовых рабочих-нефтяннихов // Физиологические и медицинские вопросы нетрадиционных форм производственной деятельности человека, часть I: Тез.докл.- Тюмень, 1991.- С. 62-64 (соавт. Н.Н.Ильинских, Л.Я.Перепечаев, И.Н.Ильинских).

24. Скрининг и мониторинг интенсивности соматического мутагенеза и канцерогенеза в городах азиатской части СССР // Эколого-генетический мониторинг состояния окружающей среды: Тез. докл.- Караганда, 1991.- С. 53 (соавт. Н.Н.Ильинских, A.C. Ксенц, Г.Г.Качушкина).